CN113278652B - 增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增加Survivin表达的CAR‑T细胞并联合IL‑15在制备抗肿瘤药物中的应用，属于医学领域。具体公开一种核酸构建体，其结构为：car‑（2A）‑e，car表示嵌合抗原受体核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，Survivin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过试验验证白细胞介素‑15通过PI3K/Akt途径调节Survivin基因的表达，从而调节CAR‑T细胞中TSCM细胞群的形成，以实现抗肿瘤作用，这为细胞存活和Tscm的产生提供了新的见解，并为其在过继细胞治疗中的快速应用奠定基础。

Description

增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药 物中的应用
技术领域
本发明涉及医学领域，特别是涉及一种增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
白细胞介素-15（IL-15）与白细胞介素-2（IL-2）在细胞因子受体生物学上的相似性引起了人们的广泛关注。IL-15和IL-2是一类常见的细胞因子,参与T细胞分化和稳态的调节[1]。它们具有许多共同的生物学活性，可能是因为它们具有IL-2受体复合物的共同成分。共同的活性包括活化的T细胞和NK细胞的生长和迁移，以及诱导B细胞的增殖和分化[2]。IL-15和IL-2受体均为异三聚体复合物，该复合物由IL-2的β和γc亚基以及特异性的α亚基组成[1]。由于IL-2具有很强的扩增T细胞和刺激T细胞功能的能力，是最早用于临床癌症试验的细胞因子。然而，IL-2的较强毒性副作用限制了其应用。最近，因其IL-15低毒在临床上使用得到进一步加强，并且有报道过表达IL-15或给予rIL-15可以保护小鼠免受各种感染[3,4]。
T细胞激活是适应性免疫应答的核心，而IL-15是所有这些检查点的主动控制器中的关键角色之一。IL-15促进原始和记忆性CD8+T细胞的存活[5]，并增强CD4+和CD8+T细胞的交叉启动以及TEM细胞和CD44hi或CD122hi记忆性CD8+T细胞的增殖[6]。在免疫反应的收缩期，IL-15通过KLRG1和CD127的表达调节T细胞亚群[7]。它通过抑制IL-2诱导的激活诱导的效应T细胞的细胞死亡来维持记忆T细胞反应，在体内给予rIL-15保护了大多数效应T细胞[8]。值得注意的是，在没有宿主影响时，IL-15的存在为长期维持记忆CD8+ T细胞对特异Ag的记忆提供了信号[9]。而且，IL-15在攻击过程中重新激活记忆性CD8+ T细胞，因此成为疫苗的一个有吸引力的选择[10]。通过改变CCR7和CD62L的表达，IL-15调节T细胞迁移，这是对抗感染的关键条件[11]。
对于T细胞的发育、分化和激活机制，大量数据指出PI3K-Akt-mTOR通路是调节的关键[12]。活化的AKT磷酸化关键靶点，通过抑制Bcl-2家族促凋亡成员而促进细胞存活。mTOR是PI3K/Akt信号转导的重要下游效应子之一，它是一种丝氨酸/苏氨酸促进细胞存活和增殖的蛋白质翻译所需的蛋白激酶[13]。
Survivin是PI3K/Akt信号通路的另一个下游靶点，是一种进化上保守的真核蛋白质，对细胞分裂至关重要，并通过拮抗半胱天冬酶活性发挥凋亡抑制剂的作用[14,15]。因此，它作为一个潜在的肿瘤治疗靶点受到了广泛的关注。此外，Survivin在发育过程中[16]和增殖的成体细胞中表达[17]，特别是激活的T淋巴细胞[18]和自我更新的干细胞中表达[19]。因此，Survivin是活跃增殖细胞的标志物。
CAR是一种合成分子，通过特异性识别肿瘤细胞上表达的表面蛋白诱导T细胞产生以根除肿瘤，这些表面蛋白由连接到铰链、跨膜和细胞内信号结构域的细胞外肿瘤抗原结合结构域组成[20]。表达CAR-T细胞（CAR-T cells）可以通过胞外结构域的单链可变片段（single chain variable fragment, scfv）直接识别肿瘤相关抗原,然后被胞内信号转导激活,释放多种细胞因子,如穿孔素、颗粒酶、干扰素y等,诱导肿瘤细胞凋亡[21,22]。然而，有大量临床前和临床证据表明，CAR-T细胞易衰竭和持久性差，这限制了免疫疗法的有效性[23]。
而CAR-T细胞治疗是近年来发展迅速的一种过继免疫治疗技术。如何提高抗肿瘤免疫细胞的有效性和远期疗效，对于提高细胞免疫治疗的疗效至关重要。TSCM具有抗原特异性记忆、初始T细胞的干细胞样特征、体内长期存活等特点，具有潜在的临床应用价值。IL-15作为一种重要的免疫刺激因子，与IL-15受体结合后，可促进产生具有过继免疫细胞治疗潜能的记忆T细胞，并可配合CAR-T细胞的抗肿瘤作用，有效增强CAR-T细胞的肿瘤侵袭性和抗肿瘤作用的持久性。许多文献报道CAR-T细胞可通过IL-15信号转导形成记忆干细胞表型，从而形成长期持久性。但其具体作用机制尚未见报道。早期研究表明，一些经典的癌基因如Survivin和C-myc在调节CD8+记忆T细胞的形成中起着重要作用。Survivin基因的表达可受PI3K/Akt通路调控。基于文献研究和前人研究，研究IL-15对CAR-T细胞细胞存活的影响及其作用机制，对于利用IL-15进行细胞免疫治疗实现抗肿瘤作用以及相关药物筛选具有重要的现实意义。
参考文献如下：
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发明内容
本发明的目的是提供一种增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过CAR-T细胞可与细胞因子IL-15结合，促进TSCM细胞群的形成和Survivin基因的表达，从而起到长期抗肿瘤作用。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种核酸构建体，所述核酸构建体具有如下所示结构：car-（2A）-e，其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，所述Survivin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
优选的是，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向肿瘤抗原，所述肿瘤抗原为膜抗原CD19，所述自剪切序列为P2A，“-”表示连接相邻核苷酸的磷脂键或连接肽。
本发明还提供一种重组载体，包括所述的核酸构建体。
本发明还提供一种宿主细胞，其含有所述的重组载体或者染色体中整合有外源的所述的核酸构建体。
本发明还提供一种药物组合物，其包括药学上可接受的载体以及所述的核酸构建体、所述的重组载体或所述的宿主细胞。
优选的是，还包括细胞因子IL-15。
本发明还提供如所述的核酸构建体、所述的重组载体或所述的宿主细胞的应用，应用于制备抗肿瘤药物或者制剂中。
优选的是，所述肿瘤包括白血病或者实体瘤。
优选的是，所述宿主细胞包括T细胞、CAR-T细胞、TCR-T细胞或CAR-NK细胞。
本发明还提供一种制备不同受体修饰的T细胞或NK细胞的方法，包括以下步骤：将所述的核酸构建体、或所述的重组载体导入待修饰的T细胞或NK细胞内，构建不同受体修饰的T细胞或NK细胞，其中，所述不同受体包括CAR和TCR。
本发明公开了以下技术效果：
本发明从细胞核分子水平上研究了IL-15和CAR-T协同抗肿瘤的作用机制，通过实验验证发现，首先，IL-15可以增加CAR-T细胞对多种细胞系的活化和细胞毒性；IL-15通过增加TSCM的百分率而增强CAR-T细胞的存活。其次，发现IL-15可激活一种重要的抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的蛋白survivin。进一步分析表明，IL-15通过PI3K/Akt途径激活survivin，过表达survivin证实survivin促进CAR-T细胞存活。上述结果表明，IL-15促进T细胞存活和抗肿瘤作用的分子机制与Tscm的形成和PI3K/Akt/Survivin信号通路活性的调节有关。因此，本发明公开的内容可为细胞存活和Tscm的产生提供新的见解，并为其在过继细胞治疗中的快速应用奠定基础。另外，本发明是全球首次在CAR-T领域的实际运用，是CAR-T技术的重大突破。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为流式检测CD19-CAR-T细胞的CAR的转染效率，PBMC作为对照；
图2为CAR-T细胞分别与IL-2或IL-15培养14天的实验流程简图；
图3为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）6小时，流式检测CD107a在T细胞表面的表达；
图4为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，用Elispot试剂盒检测T细胞中的IFNγ的表达；
图5为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，上清保留，用ELISA试剂盒（Thermo）检测T细胞IFNγ的释放；
图6为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（1:1）24小时，收集细胞，流式检测肿瘤细胞残留；
图7为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）48小时或72小时，收集细胞，Western blot检测颗粒酶A、颗粒酶B的表达；
图8为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），每七天计数；
图9为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T用CFSE（10 µM）染色，与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）72小时，流式检测T细胞增殖；
图10为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），第7天细胞周期检测；
图11为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），第14天细胞周期检测；
图12为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）24小时，流式检测CD132在T细胞表面的表达；
图13为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），第7天和14天流式检测Tscm的比例；
图14为分别用IL-15或IL-2培养EphA2-CAR-T后，EphA2-CAR-T用CFSE（10 µM）染色，与靶细胞U373细胞共培养（10:1）72小时，流式检测T细胞增殖；
图15为分别用IL-15或IL-2培养EphA2-CAR-T后，用Elispot试剂盒检测T细胞中的IFNγ的表达；
图16为分别用IL-15或IL-2培养EphA2-CAR-T后，EphA2-CAR-T与靶细胞U373共培养（2:1），用RTCA检测T细胞对靶细胞的杀伤功能；
图17为分别用IL-15或IL-2培养EphA2-CAR-T后，EphA2-CAR-T与靶细胞U373共培养（2:1），流式检测T细胞对靶细胞的杀伤功能；
图18为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）48小时和72小时，提取RNA，PCR检测survivin mRNA的表达；
图19为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）72小时，收集蛋白，Western blot检测survivin的表达；
图20为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）72小时，同时加入ly294002（10 µM），收集蛋白，Western blot检测P-AKT的表达；
图21为分别用IL-15或IL-2培养CD19-CAR-T后，CD19-CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1）72小时，同时加入ly294002（10 µM），收集蛋白，Western blot检测survivin的表达；
图22为survivin-CD19-CAR的结构示意图；
图23为T细胞转入survivin-CD19-CAR后，CAR-T与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），每7天记录细胞增殖情况；
图24为用IL-15培养CD19-CAR-T或Survivin CD19-CAR-T细胞，与靶细胞Nalm-6共培养（10:1），第7天流式检测Tscm的比例。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例
一、材料和方法
1、实验材料
细胞系：人Nalm-6细胞系，U373细胞系和逆转录病毒包装细胞系PG13购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。所有这些细胞均保存在含有10%胎牛血清（Biosera）和10,000IU/ml青霉素/10,00微克/毫升链霉素（EallBio Life Sciences）的RPMI-1640(Lonza)或DMEM(Lonza)中。所有细胞在5%CO2，95%空气，37℃加湿培养箱中培养。
2、实验方法
用逆转录病毒转染PBMCs转染CD19-CAR-T细胞，与Nalm-6(CD19阳性)肿瘤细胞共培养。分别刺激IL-2、IL-15。通过mRNA和蛋白水平检测CAR-T细胞Survivin表达，流式细胞术检测CAR-T细胞凋亡和表面标志物。检测CAR-T细胞PI3K/Akt磷酸化水平。最后构建Survivin CD19-CAR-T细胞，考察IL-15联合CAR-T细胞对肿瘤的治疗作用。
(1) CAR-T细胞的产生
用梯度离心法分离健康供者外周血单个核细胞（PBMCs）。用抗CD3和抗CD28颗粒刺激外周血单个核细胞中的T细胞，然后用逆转录病毒感染，具体为：0.5 ml Retronectin（15 ug/ml） 加入12孔板，室温避光孵育2 h。弃掉上清，加入0.5% human AB血清（PBS配制），培养30min,弃掉上清。加入0.5 ml T细胞（1.6×106/ml ）与0.5ml病毒液体，用封口膜封闭孔板，700g，离心1h后，放入37℃培养箱培养，获得抗原特异性的基因修饰T细胞。7天后，CAR-T细胞在含0.5%正常人AB血清的X-VIVOTM15无血清培养系统孵育24h，然后在含5%GemCellTM人血清AB的X-VIVOTM15培养基中扩增，加入IL-2(138 U/ml）或IL-15(10 ng/ml）培养7天后，对CAR-T细胞表达标志物进行流式检测，鉴定T细胞亚群的比例。本研究获得了北京世纪坛医院机构评审委员会的批准，并获得了所有参与者的知情同意。
（2）流式细胞术
流式细胞术在FACSCanto Plus仪器（BD Biosciences）上进行，数据分析使用FlowJo V.10(FlowJo，LLC)。用APC-Cy7标记的小鼠抗人CD3抗体（BD Biosciences）,FITC标记的小鼠抗人CD8抗体（BD Biosciences）,BV421标记的小鼠抗人CD4抗体（BDBiosciences）,BV605标记的小鼠抗人CD45RO（BD Biosciences），PE-Cy7标记的小鼠抗人CCR7（BD Biosciences）,Alexa Fluo 700标记的小鼠抗人CD27（BD Biosciences），PE-Cy5标记的小鼠抗人CD95（BD Biosciences）和山羊抗小鼠IgG（Fab特异性）F(ab')2用AlexaFluor700标记的小鼠抗人EphA2(R&D系统）染色GBM细胞，流式细胞术检测细胞表面EphA2的表达。
（3）细胞毒性测定
在96孔板中，CAR-T细胞以不同的效应靶比(E:T)与靶细胞共培养4或24小时后，收集细胞，并使用流式细胞仪（BD FacsCanto II Plus）通过表面标记检测肿瘤细胞。
（4）增殖测定
CD19刺激的CD8+CAR-T细胞和CAR-survivin T细胞与IL-2或IL-15共培养。第0天、第7天、第14天、第21天和第28天，采用Vi-CELL细胞活力分析仪，通过台盼蓝排除法进行活细胞计数。
（5）细胞周期测定
将CAR-T细胞(1×106)重新悬浮于300µL PBS中，然后用体积为1 ml的70%乙醇固定。10分钟后，用PBS洗涤细胞3次，室温下用PI/RNase染色缓冲液（BD Biosciences）染色15分钟，再用流式细胞仪分析。
（6）PCR检测
PCR检测通过IL-2和IL-15刺激后CAR-T细胞中Survivin的表达。按照制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）从CD8+ CAR-T细胞中提取总RNA。使用Nanodrop One分光光度计(Thermo Fisher Scientific)测量RNA的数量和纯度。本研究只考虑只有吸光度测量值合适的样品(A260/A280为～2.0，A260/A230为1.9-2.2)。利用高容量cDNA逆转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific）合成cDNA。
利用5'-TTGAATCGCGGGACCCGTTGG-3'（正向引物）和5'-CAGAGGCCTCAATCCATGGCA-3'（反向引物）引物扩增survivin基因。用引物5'-GTCATCCCTGAGCTGAACGG-3'（正向引物）和5'-TGGGTGTCGCTGTTGAAGTC-3'（反向引物）扩增的GAPDH作为对照。
（7）免疫印迹检测
细胞用PBS洗涤三次，然后用RIPA缓冲液提取蛋白质。蛋白质样品用Pierce BCA蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）定量，然后在十二烷基硫酸钠(SDS)/巯基乙醇样品缓冲液中变性。样品（10微克）在15%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离,电泳转印到聚偏氟乙烯膜（Millipore）上。将该膜与兔抗人survivin(abcam)、兔抗人P-AKT(CST)、兔抗人颗粒酶A(abcam)、兔抗人颗粒酶B(abcam)在4°C下孵育过夜，然后用HRP结合的山羊抗兔二抗/鼠二抗（Santa Cruz Biotechnology）室温孵育1小时，化学发光反应的检测使用ECL试剂盒（Thermo Fisher Scientific）进行。加入抑制剂Ly294002 (10 uM)抑制PI3K/AKT通路检测survivin的表达。
（8）统计分析
使用Graphpad Prism 8.0.2进行图形和统计分析。数据采用t检验分析，以p值<0.05为显著性；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；不是很明显。所有实验至少重复三次。
3、结果
（1）IL-15促进抗原刺激CAR-T细胞的杀伤作用
从健康供体PBMCs中分离原代T细胞，并用anti-CD3/CD28 beads刺激。2天后，用基于CD19特异性单抗的编码CAR的逆转录病毒载体感染T细胞。用流式细胞术检测转导效率，结果显示54.5%的细胞表达CD19特异性CAR（图1)。为了评估IL-2和IL-15对T细胞功能的不同影响，分离后，CAR-T细胞分别与IL-2(138U/ml)(CAR-T/IL-2)或IL-15(10 ng/ml)(CAR-T/IL-15)培养14天（图2)。
用CD19阳性细胞系(Nalm-6)，并研究CAR-T细胞的激活状况。用流式细胞术检测CD107a的表达，结果显示：IL-15增加CD8+ T细胞表面的CD107a表达（图3)。通过Elispot和ELISA检测，发现与CAR-T/IL-2相比，CAR-T/IL-15在细胞内（图4)和在培养基中（图5)产生更多的IFNγ表达。此外，还检测了CAR-T细胞的抗肿瘤活性。经流式检测，CAR-T/IL-15细胞对肿瘤细胞表现出较强的细胞毒性（2.2%肿瘤细胞残留），而CAR-T/IL-2的抗肿瘤活性较弱（53.5%肿瘤细胞残留）（图6)。随后检测代表T细胞活化水平的颗粒酶A和颗粒酶B的蛋白表达。图7显示IL-15随时间延长促进颗粒酶A和颗粒酶B的表达；未加细胞因子培养的CAR-T细胞，颗粒酶A和颗粒酶B表达最低。
（2）IL-15在抗原刺激下促进T细胞增殖及Tscm的形成
由于IL-15和IL-2是细胞增殖相关的细胞因子，我们直接用细胞计数来测定IL-15和IL-2对细胞增殖的影响。
用Nalm-6每隔7天刺激CAR-T细胞，结果显示CAR-T/IL-15细胞具有较高的生长速率（图8和图9)。
细胞周期的流式细胞术分析显示，在第7天，约21.67%的CAR-T/IL-15细胞处于细胞分裂S期，而约16.07%的CAR-T/IL-2细胞处于细胞分裂S期（图10)。随着时间的延长，细胞增殖能力略有下降，分别有15.3%和9.7%的细胞细胞分裂S期阶段（图11)。
接下来检测CAR-T细胞的表型变化。CD132是IL-2和IL-15的共同受体，在IL-15的诱导下表达显著上调（图12)。对代表CAR-T细胞长期持久性能力的Tscm细胞(CD45RO-CCR7+CD27+CD95+)进行了研究,结果表明,与IL-2相比，IL-15促进了CD8+CAR-T细胞中Tscm细胞的形成（分别为1.08%和0.31%）（图13)，表明CAR-T/IL-15细胞具有向多亚群分化和自我更新的能力。
（3）IL-15介导效应在不同靶向CAR-T细胞中被观察到
为了确定CAR-T/IL-15细胞观察到的表型和功能特征是否可推广到其他CAR，使用胶质瘤靶向的EphA2-CAR-T细胞进行了类似的研究，该细胞利用4-1BB共刺激结构域。与IL-2培养的细胞相比，用IL-15培养的EphA2-CAR-T细胞消耗较少，细胞增殖更高（图14)。与CD19-CAR-T细胞相似，用IL-15培养的EphA2-CAR-T细胞表现出更多的多功能表型，产生更多的IFNγ（图15)。同时，实时细胞生长监测(RTCA)系统和GFP-Luc检测结果显示，EphA2-CAR-T/IL-15细胞抗肿瘤活性增强（图16和图17)。
（4）IL-15通过激活PI3K/Akt信号通路上调Survivin的表达
为探讨IL-15对CAR-T细胞有较好的增殖作用，采用高通量RNA测序技术检测IL-2和IL-15培养的CAR-T细胞差异表达基因。研究发现，在上调基因中，选择了一种进化上保守的、对细胞分裂至关重要的、能抑制细胞死亡的真核蛋白survivin进行进一步研究，分别用IL-15和IL-2培养后，PCR和Western blot检测survivin的表达。
结果表明，IL-2和IL-15在抗原刺激下均可上调CAR-T细胞中survivin 的mRNA水平和蛋白的水平（图18和图19)。由于PI3K/Akt通路与刺激细胞增殖和生长有关，本研究探讨了IL-15诱导survivin的作用机制。结果显示，IL-2或IL-15激活了CAR-T细胞的PI3K/Akt通路，IL-15具有增强作用（图20)。为了证实IL-15诱导的survivin表达增加是通过PI3K/Akt途径，使用PI3K/Akt途径抑制剂ly194002，结果表明ly294002抑制survivin的表达（图21)。
（5）随时间延长，Survivin促进CAR-T细胞增殖
利用过表达系统进一步证实了survivin对CAR-T细胞的增殖作用。构建连接到CAR的survivin基因（图22)，并将survivin和CAR共表达质粒转导到T细胞中。每隔7天进行两轮特异性抗原刺激，分析细胞增殖情况。直接细胞计数显示过表达survivin可以随时间的延长促进CAR-T细胞（图23)。
根据上述结果，构建survivin CD19-CAR-T细胞，考察IL-15联合CAR-T细胞对肿瘤的治疗作用。
（1）分别克隆CD19-CAR基因（核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示）和survivin基因（核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）
根据CD19-CAR的碱基序列由生物公司合成cDNA，并以此为模板，利用表1所示的引物CD19-CAR-F和CD19-CAR-R，扩增CD19-CAR基因；以义翘神州购买的Survivin基因的cDNA为模板，利用表1所示引物Survivin-F和Survivin-R，扩增survivin基因：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
扩增反应体系如表2所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
扩增反应程序如表3所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
上述得到的扩增产物，通过同源重组（ClonExpress II One Step Cloning kit）的方法，按照表4所示连接体系连接到载体SFG载体上，37℃，反应30 min，构建survivin和CAR共表达质粒survivin CD19-CAR。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
上述扩增得到的CD19-CAR核苷酸序列（SEQ ID NO：1）如下：
1 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg
61 atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga
121 gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag
181 aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc
241 ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg
301 gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc
361 ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct
421 ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg
481 ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt
541 gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt
601 agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac
661 tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac
721 tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga
781 acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta
841 gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt
901 cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg
961 gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg
1021 agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc
1081 aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag
1141 ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag
1201 ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct
1261 gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag
1321 aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc
1381 aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc
1441 cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc
CD19-CAR基因表达的蛋白，其氨基酸序列（SEQ ID NO：3）如下所示：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
Survivin基因核苷酸序列（SEQ ID NO：2）如下：
1 atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct
61 acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag
121 gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc
181 ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat
241 tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa
301 tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag
361 aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc
421 atggattga
Survivin基因表达的蛋白，其氨基酸序列（SEQ ID NO：4）如下所示：
MGAPTLPPAWQPFLKDHRISTFKNWPFLEGCACTPERMAEAGFIHCPTENEPDLAQCFFCFKELEGWEPDDDPIEEHKKHSSGCAFLSVKKQFEELTLGEFLKLDRERAKNKIAKETNNKKKEFEETAEKVRRAIEQLAAMD
（2）将上述构建的survivin和CAR共表达质粒survivin CD19-CAR转导到T细胞中，每隔7天进行两轮特异性抗原刺激，分析细胞增殖情况。直接细胞计数显示过表达survivin可以随时间的延长促进CAR-T细胞。
除此之外，由于IL-15促进Tscm细胞的生成，为了验证IL-15是通过诱导survivin的表达从而促进了Tscm细胞的生成，将CD19-CAR-T细胞和survivin CD19-CAR-T细胞分别用特异性抗原（CD19）阳性细胞Nalm-6（CD19-CAR-T细胞与特异性抗原（CD19）阳性细胞Nalm-6、survivin CD19-CAR-T细胞与特异性抗原（CD19）阳性细胞Nalm-6均以10:1混合共培养）刺激7天后，对Tscm细胞(CD45RO-CCR7+CD27+CD95+)在T细胞中的比例进行了研究。
结果表明，与CD19-CAR-T相比，survivin CD19-CAR-T中有更多的Tscm细胞的形成（分别为1.12%和0.09%）（图24)，表明CD19 CAR-T细胞过表达survivin后具有向多亚群分化和自我更新的能力。
由于IL-15可以诱导survivin在CAR-T细胞中高表达，因此，此实验结果证明IL-15联合CAR-T细胞对抗肿瘤功能的可行性。
另外，上述所用的CAR-T细胞不限于通过基因工程构建的survivin CD19-CAR-T细胞，还可以为用于基因治疗领域的其他的T细胞、CAR-T细胞、TCR-T细胞或者CAR-NK细胞，通过结合survivin基因所构建的重组细胞；或者为所有基因工程改造的人类细胞，包括T细胞、NK细胞、IPSC细胞等，这些细胞通过基因改造过表达survivin基因。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
序列表
<110> 卡瑞济（北京）生命科技有限公司
<120> 增加Survivin表达的CAR-T细胞并联合IL-15在制备抗肿瘤药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840
gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900
cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cagagtgaag1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1467
<210> 2
<211> 429
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgggtgccc cgacgttgcc ccctgcctgg cagccctttc tcaaggacca ccgcatctct 60
acattcaaga actggccctt cttggagggc tgcgcctgca ccccggagcg gatggccgag 120
gctggcttca tccactgccc cactgagaac gagccagact tggcccagtg tttcttctgc 180
ttcaaggagc tggaaggctg ggagccagat gacgacccca tagaggaaca taaaaagcat 240
tcgtccggtt gcgctttcct ttctgtcaag aagcagtttg aagaattaac ccttggtgaa 300
tttttgaaac tggacagaga aagagccaag aacaaaattg caaaggaaac caacaataag 360
aagaaagaat ttgaggaaac tgcggagaaa gtgcgccgtg ccatcgagca gctggctgcc 420
atggattga 429
<210> 3
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu
260 265 270
Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr
275 280 285
Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro
290 295 300
Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu
305 310 315 320
Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
325 330 335
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
340 345 350
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
355 360 365
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 4
<211> 142
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp
1 5 10 15
His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala
20 25 30
Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr
35 40 45
Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu
50 55 60
Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His
65 70 75 80
Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu
85 90 95
Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys
100 105 110
Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala
115 120 125
Glu Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp
130 135 140

Claims (8)

1.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体具有如下所示结构：car-（2A）-e，其中，car表示嵌合抗原受体编码多核苷酸序列，2A表示自剪切序列，e表示功能性融合蛋白编码序列，所述功能性融合蛋白的编码基因为Survivin基因，所述Survivin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域特异性靶向肿瘤抗原，所述肿瘤抗原为膜抗原CD19，所述自剪切序列为P2A，“-”表示连接相邻核苷酸的磷脂键或连接肽。
2.一种重组载体，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸构建体。
3.一种宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求2所述的重组载体或者染色体中整合有外源的权利要求1所述的核酸构建体。
4.一种药物组合物，其特征在于，其包括药学上可接受的载体以及权利要求1所述的核酸构建体、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的宿主细胞；所述药物组合物还包括细胞因子IL-15。
5.如权利要求1所述的核酸构建体、权利要求2所述的重组载体或权利要求3所述的宿主细胞的应用，其特征在于，应用于制备抗肿瘤药物或者制剂中。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括白血病或者实体瘤。
7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞包括T细胞、CAR-T细胞、TCR-T细胞或者CAR-NK细胞。
8.一种制备不同受体修饰的T细胞或NK细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1所述的核酸构建体、或权利要求2所述的重组载体导入待修饰的T细胞或NK细胞内，构建不同受体修饰的T细胞或NK细胞，其中，所述不同受体包括CAR和TCR。
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