KR20110139363A

KR20110139363A - 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법

Info

Publication number: KR20110139363A
Application number: KR1020100059400A
Authority: KR
Inventors: 김한수; 김현옥
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2011-12-29
Also published as: KR101232128B1

Abstract

본 발명은 성숙 수지상 세포의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포는 다양한 척도에서 종래의 수지상 세포보다 역가가 크게 개선되어 그 면역 기능이 우수하므로, 다양한 수지상 세포 백신을 제조하는 데 바람직하게 사용될 수 있다.

Description

면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법{Method for Preparing Mature Dedritic Cell with Excellent Immune Activity}

본 발명은 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법에 관한 것이다.

수지상 세포(dendritic cell)는 가장 강력한 항원 전달 세포(Antigen presenting cells)로서, 혈액, 골수, 림프절, 피부, 중추 신경계 등 외부물질과 접촉이 빈번한 조직과 기관에 극소량으로 생체 내 존재하지만 T 세포 면역을 조절하는 기능이 매우 뛰어나기 때문에(Steinman, R. M.,Ann. Rev. Immunol . 9:271(1991); Schuler, G., and R. M. Steinman., J. Exp . Med . 186:1183(1997); Banchereau, J., and R. M. Steinman., Nature , 392:245(1998)) 암 또는 병원균의 특이 항원에 대한 면역을 유도하거나 접촉과민 반응, 조직 이식 거부반응, 알레르기 반응, 자가 면역질환 등 과도한 면역반응을 조절하기 위한 임상 연구에서 예방 및 치료용 세포 백신으로서 가치가 매우 크다.

인체의 세포성 면역기능을 강화하기 위하여 말초 혈액 유래 단핵구 (monocytes) 또는 말초 혈액, 제대혈, 골수의 조혈모세포로 부터 사이토카인을 활용하여 체외 세포 배양(ex vivo culture)을 통해 수지상세포의 분화를 유도하고 있다. 수지상세포의 분화는 크게 두 단계로 구분되며, 1 단계는 단핵구, 조혈모세포와 같은 전구세포로부터 형질적, 기능적으로 미성숙 단계의 수지상세포로의 분화를 유도한 것이며, 2 단계는 이들 미성숙 수지상세포를 용도에 맞도록 형질적, 기능적으로 성숙 시키는 분화물질을 이용한 성숙 수지상세포의 제작이다. 특히 2단계에서 제조된 수지상세포의 형질과 기능을 분화물질을 통해 조절함으로써, 체내 투여하는 세포백신이 면역 강화 또는 면역 억제와 같은 명확하게 구별되는 기능을 수행할 수 있다.

두 번째 단계(수지상세포의 성숙단계)는 병원성 입자에 대한 면역 반응의 유도에 필수적인 요소이며, 그 기전에 대한 이해는 성공적인 백신의 제조에 기반을 제공한다. 면역반응의 시작을 위해 미성숙 수지상세포는 림프조직으로 항원을 보유한 채로 이동하기 전에 먼저 병원체(항원)를 탐식하고 인식한 다음 활성화되고 분화되는 과정이 필요하다. 미성숙 수지상세포들은 항원을 흡수(endocytosis)하고 처리(processing)하는데 있어서는 효과적이지만 MHC 분자에 의한 항원 제공 능력은 낮은 것으로 보고되고 있다(Labeur, M. S., B. Roters, B. Pers, A. Mehring, T. A. Luger, T. Schwarz, and S. Grabbe., J. Immunol . 162:168(1999)). 반면에 성숙 수지상세포의 경우 흡수, 처리 능력이 약하지만 MHC 분자와 보조 활성인자를 미성숙 세포에 비해 세포 표면에 높게 발현하는 것으로 알려져 있다. 따라서 수지상세포의 분화를 적절히 체외에서 조절하여 암 면역에 최적의 조건을 구하는 것이 중요하다.

현재까지 다양한 분화유도 인자들의 활용을 통한 세포면역 기능성 강화를 위한 수지상세포의 제조 방법이 제시되어 왔다. 감염에 의해 형성된 염증 부위에서 발현되는 사이토카인의 조합인 사이토카인 칵테일(cytokine cocktail), 감염성 인자들이 공통적으로 보유하는 분자 패턴(pathogen-associated molecular pattern, PAMP) 또는 이들에 대한 수용체의 리간드(toll like receptor ligands), 독성이 제거된 멸균된 세균, 괴사를 유도한 암세포 등이 분화 유도 물지로 많이 활용되고 있다(Huang Q, Liu D, Majewski P, Schulte LC, Korn JM, Young RA, Lande ES, Hacohen N. Science, 294:870(2001)). 인위적으로 체외에서 제조한 미성숙 수지상세포의 성숙을 유도하기 위해 LPS, 폴리(I:C)(poly(I:C)), LTA, CpG, flagellin 등 세균이나 바이러스 유래의 성분 또는 그에 상응하는 합성분자를 단일 또는 다양한 조합으로 이용하여 TLR 막 단백질을 자극할 경우, 종래의 단일 분화유도 인자 보다 매우 효율적으로 수지상세포의 기능을 개선하는 것이 보고되고 있다(Kim S, Kim HO, Kim HJ, Lee K, Kim HS. Clin Exp . Immunol . 154:365(2008)). Th1 면역세포를 가동하는 암면역을 위해서는 수지상세포로부터 IL-12의 분비가 필요조건이다(Trinchieri G, Nature Rev. Immunol . 3:133(2003)). 이러한 정보들이 수지상세포를 이용한 암면역을 위해 유용하게 활용되었다(Mailliard RB, Lotze MT. Clin Cancer Res 7:980s8s(2001); Jongmans W, Tiemessen DM, van Vlodrop IJ, Mulders PF, Oosterwijk E. J Immunother 28:480(2005); ten Brinke A, Karsten ML, Dieker MC, Zwaginga JJ, van Ham SM. Vaccine 25:7145(2007); Kim S, Kim HO, Kim HJ, Lee K, Kim H-S. Clin Exp Immunol 154:365(2008); Boullart ACI, Aarntzen EHJG, Verdijk P, Jacobs JFM, Schuurhuis DH, Benitez-Ribas D, et al. Cancer Immunol Immunother 57:1589(2008)).

그러나, 다양한 방법론의 개선이 체외 분석에서는 기능 개선으로 확인된 반면(Salcedo M, Bercovici N, Taylor R, Vereecken P, Massicard S, Duriau D, et al. Cancer Immunol Immunother 55:819(2006); Schuler G, Schuler-Thurner B, Steinman RM. Curr Opin Immunol 15:138(2003)), 인체에서 암 백신으로 활용한 임상연구에서는 기대에 크게 미치지 못한 성과를 보이고 있다(Song SY, Kim H-S. Yonsei Med J 45S:48(2004); Lesterhuis WJ, Aarntzen EH, de Vries IJ, Schuurhuis DH, Figdor CG, AAdema GJ, et al. Crit Rev Oncol Hematol 66:118(2008)). 그 원인으로는 체외 제조한 수지상세포들이 세포성 면역의 유도에 필수적인 IL-12의 생산이 매우 낮고, 체내 투여되었을 때 생존률과 이동성이 낮으며, 암이 분비하는 사이토카인과 같은 전신성 면역역제에 의한 수지상세포의 기능 상실 등으로 보고되고 있다(Yang L, Carbone DP. Adv Cancer Res 92:13 (2004); Pinzon-Charry A, Maxwell T, Prato S, Furnival C, Schmidt C, Lopez JA. Neoplasia 7:1123(2005)). 따라서, 암 면역 치료를 위해 수지상세포의 기능, 이동성, 생존력의 강화를 통해 보다 효과적으로 체내에서 암면역을 유도할 수 있는 기술의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 면역 치료에 활용할 수 있는 수지상 세포의 기능을 강화시키기 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과, 특정 분화유도인자 조합을 시간차를 두고 순차적으로 적용하여 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 경우 면역 기능이 크게 개선됨을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 제조한 성숙 수지상 세포를 이용하여 면역 기능이 우수한 수지상 세포 백신을 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 미성숙 수지상 세포를 취득하는 단계; 및 (b) 상기 취득한 미성숙 수지상 세포를 사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C)(Polyinosinic:polycytidylic acid)의 조합으로 자극하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명자들은 면역 치료에 활용할 수 있는 수지상 세포(dendritic cell: DC)의 기능을 강화시키기 위하여 예의 연구 노력하였고 그 결과, 특정 분화유도인자 조합을 시간차를 두고 순차적으로 적용하여 미성숙 수지상 세포의 성숙을 유도하는 경우 면역 기능이 크게 개선됨을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 미성숙 수지상 세포를 취득하는 단계(a)는 DC 전구 세포를 함유하는 적합한 조직 공급원으로부터 DC 전구 세포를 분리하거나 또는 미성숙 DC를 제조하는 방법에 의해 취득할 수 있다. 미성숙 DC를 제조하는 방법이란, 전구세포를 시험관내에서 분화시켜 미성숙 DC를 생산하는 방법을 말하며, 상기 전구세포는 적합한 조직 공급원으로부터 유래한 혈액 단일핵 세포(mononuclear cell) 또는 조혈모세포일 수 있으며, 상기 적합한 조직 공급원이란 골수, 말초 혈액 및 제대혈 등일 수 있다. 본 명세서에서 용어 “혈액 단일핵 세포(mononuclear cell)”는 혈액에서 발견되며 1개의 핵을 갖는 모든 세포를 의미하는 것으로서, 예를 들어, 단핵구(monocyte), T 세포, B 세포, NK 세포 및 순환중의 수지상 세포 등을 포함하는 것이다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면, 상기 미성숙 수지상 세포는 말초혈액의 단핵구, G-CSF 구동화한 말초혈액의 단핵구, 성분헌혈에서 폐기되는 백혈구제거용 필터에서 회수한 단핵구 또는 제대혈이나 골수의 조혈 모세포로부터 유래된 것이고, 보다 바람직하게는 단핵구로부터 유래된 것이다. 단핵구로부터 수지상 세포를 유도하는 방법이 보다 바람직한 이유는 조혈 모세포를 사용하는 방법에 비해 비교적 적은 노력과 짧은 시간에 대량의 균질한 수지상세포를 얻을 수 있기 때문이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 단핵구는 말초혈액으로부터 확보한 것이다. (말포혈액, 구동화, 조혈모세포, LRS chamber 등) 말초 혈액이나 제대혈 또는 골수의 단핵구나 조혈모세포로부터 미성숙 수지상 세포를 얻는 방법은 단핵구나 조혈모세포와 같은 전구세포를 순수 분리하여 수지상 세포로 분화 유도시키는 과정으로 실시될 수 있고, 또한 혈액 성분내의 다른 세포들로부터 분리되지 않은 혼합세포의 형태로서 상기한 전구세포들의 수지상세포로의 분화를 유도 시키는 과정으로 실시될 수도 있다.

상기 다양한 조직 공급원으로부터 유래한 전구세포를 성장 및 분화를 촉진하는 유효량의 성장 인자로 처리하면, 미성숙 DC로의 분화를 유도할 수 있다. 조혈모세포를 미성숙 DC로 분화시키기 위해서는 다양한 사이토카인, 즉 TNF-α, GM-CSF, Flt3 리간드, CD40L, 줄기세포인자(stem cell factor), TGF-β의 조합이 사용될 수 있다. 혈액 단일핵 세포를 미성숙 DC로 분화시킬 때에는 분반술로 얻어진 말초혈 단핵구나 말초혈 세포를 플라스틱 표면에 부착시키거나, (Percoll 등의 농도 구배를 이용한 세포의 밀도차로 농축한 단핵구 또는) CD14 자기 비드 및 자기 세포 분리기를 이용하여 단구를 분리한 후, GM-CSF와 IL-4를 함께 사용하여 6-7일간 배양 후 미성숙 DC를 취득할 수 있다.

본 발명의 특정 구현 예에 따라 본 발명의 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다:

말초혈액으로부터 백혈구를 농축하고, 이를 피콜-하이패크(Ficoll-Hypaque)와 같은 밀도 구배 용액으로 플라즈마층과 적혈구층으로부터 유리시켜 단일핵 세포층 (mononuclear cells)를 얻는다.

수확한 단일핵 세포는 2차례의 세척으로 비세포성 입자와 잔류 농도구배 물질을 제거한 다음 적절한 배지나 완충액(예: RPMI 1640, AIM-V, X-vivo, Cell Gro, HBSS 등)에 부유시킨 다음 단핵구를 선택적으로 얻는다.

단핵구를 선택적으로 얻기 위해서는 자성 입자가 부착된 단핵구에 선택적으로 결합하는 항체(예: CD14) 또는 단핵구를 제외한 나머지 세포군에 부착하는 항체들과 저온(4℃)에서 15-30분간 배양한 다음, CD14를 이용할 경우는 컬럼에 세포를 통과 시킬 때 양성 순수분리(positive selection) 방식으로 자기장에 의해 잔류한 세포를 순수 분리하거나, 음성 제거 분리(negative depletion) 방식으로 단핵구를 제외한 모든 세포들이 컬럼에 잔류하고 단핵구만 컬럼을 통과하도록 하여 농축하는 방식을 활용할 수 있다. 또한, 단핵구가 다른 세포들에 비해 월등한 부착성 형질을 이용하여 배양용기에서 1-2시간 배양한 다음 부착한 세포만을 잔류시키는 것으로 단핵구를 분리할 수도 있다.

그런 다음, 단핵구를 수지상 세포로 분화 유도한다. 수지상세포로 분화시키기 위하여 적합한 사이토카인이 포함되어 있는 배양액으로 단핵구를 배양한다. 이용되는 사이토카인은 GM-CSF(Granulocyte macrophage colony stimulating factor) 와 IL-4(interleukin-4)일 수 있다. 경우에 따라서는 flt-3 리간드, 인터페론-알파, IL-13 등과 같은 사이토카인을 추가하거나 IL-4와 대치할 수도 있다. 가장 보편적으로 이용되는 사이토카인은 GM-CSF 와 IL-4의 혼합물이다. 첨가되는 사이토카인의 적합한 양은 수지상 세포로의 분화를 하는 데 충분한 양으로서 각 연구자의 실험실에서 경험적으로 선택하여 선호되고 있는 양이며, 이는 일반적으로 각기 100 U/㎖-1000 U/㎖ 또는 10 ng/㎖ -500 ng/㎖ 의 농도로 제조사에 따라 다양하게 적용되고 있다.

제 1 차 배양 기간은 사이토카인을 사용하여 진행할 경우 통상적으로 5일 이상이고, 바람직하게는 5-6일간이다. 초기 배양 기간에서는 새 배양액을 3일째 추가 공급하는 것이 일반적이다.

일반적으로, 단핵구의 배양 농도는 연구자에 따라, 배양용기의 규격, 배양액에 따라 다르며, 바람직하게는 5 x 10⁵내지1 x 10⁶ 세포/㎖ 또는 1 x 10⁵내지 3 x 10⁵ 세포/㎖을 이용한다. 이러한 분화 과정에서 획득한 수지상세포를 미성숙 수지상세포(immature dendritic cells)이라 한다.

본 발명의 (b)단계는 상기 (a)단계에서 취득한 미성숙 수지상 세포를 사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C)의 조합으로 자극하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계이다.

상기 본 발명에서 사용되는 사이토카인 칵테일이란, 감염에 의해 형성된 염증 부위에서 공통적으로 발현되는 다양한 사이토카인을 조합한 인간 사이토카인 표준 칵테일을 의미하며, 이는 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2(Prostaglandin E2)의 혼합 형태(Jonuleit H, Kuhn U, Muller G, Steinbrink K, Paragnik L, Schmitt E, et al., Eur J Immunol 27:3135(1997)이거나 이에 기반한 변형일 수 있다. 또한, 본 발명의 사이토카인 칵테일로는 상업적으로 판매하고 있는 인간 사이토카인 표준 칵테일을 사용할 수도 있다.

본 발명의 바람직한 일 구현예에서, 상기 사이토카인 칵테일은 IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2 및 poly(I:C)로 구성된 것을 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 사이토카인 칵테일 및 상기 폴리(I:C)는 시간 간격을 두고 순차적으로 상기 미성숙 수지상 세포에 적용되는 것을 특징으로 한다. 이는 생체에서 성공적으로 진행되는 수지상세포의 초기 활성화와 분화 과정이 염증신호-TLR 리간드의 순으로 시간차를 두고 진행된다는 원리를 체외 배양에 적용한 것으로서, 종래의 염증신호 단독, TLR 리간드 단독, 또는 이들 두가지 자극을 동 시간에 한꺼번에 투입하는 방식으로부터 벗어나, 이렇게 시간차를 두어 수지상세포를 자극하도록 할 경우 수지상세포의 세포면역 유도 기능이 더욱 크게 개선되는 장점이 있다.

본 발명의 더욱 바람직한 구현예에 따르면, 상기 사이토카인 칵테일은 상기 폴리(I:C)의 적용에 앞서 상기 미성숙 수지상 세포에 적용되고, 상기 시간 간격은 10분 내지 24시간인 것을 특징으로 하며, 가장 바람직하게는 5시간 내지 7시간이다.

본 발명의 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계(b)는 본 발명의 사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C)의 조합을 사용하여 수행됨을 특징으로 하지만, 이와 더불어 일반적으로 이용되는 분화인자를 추가적으로 사용하여 수행 될 수도 있다. 일반적으로 이용되는 분화인자로는 IFN-γ, LPS, 펩티도글리칸, LTA(Lipoteichoic acid), CpG 올리고뉴클레오타이드, 재조합 수용성 CD40 리간드(sCD40L), SEB (Staphylococcal enterotoxin B), SAC(staphylococcus auresu Cowan type I, heat inactivated, formalin-fixed), 모노포스포릴 리피드 lipid A, 이미퀴모드(imiquimod), R484 등이 있으며, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분화 유도 인자들은 단독, 혼합, 또는 순차적인 적용으로 수지상세포의 분화 유도에 활용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포를 제공한다. 상기 방법에 따라 제조한 본 발명의 성숙 수지상 세포는 염증신호-TLR 리간드의 조합 중 특히 사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C)의 조합을 선택하고, 또한 이들을 다양한 시차를 두고 제공하여 분화 유도된 것으로서, 다양한 척도에서 종래의 수지상 세포보다 역가가 크게 개선된 점을 그 특징으로 하며, 다양한 수지상 세포 백신을 제조하는 데 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포 및 항원을 공동 배양하는 단계를 포함하는 항원이 적재(loading)된 수지상 세포 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 방법으로 제조한 수지상 세포 백신을 제공한다.

수지상 세포를 백신으로 제조하기 위해서는 타겟 항원을 수지상 세포에 적재하는 과정이 필요하다. 일반적으로 미성숙 DC는 식작용이나 수용체를 통한 세포 내 이입(endocytosis)을 통하여 항원을 포획하여, 세포 내의 일련의 과정을 통하여 항원을 가공후 MHC에 항원 펩티드를 적재하여 T 림프구에 제시하게 된다. 항원을 가공하는 과정과 함께 DC는 점점 성숙하게 되어 식작용과 세포 내 이입에 사용되는 수용체를 잃고, MHC class I, II, 보조자극 분자, 세포유착 분자의 발현이 증가 되고, 새로운 케모카인 수용체를 발현하여 주변 림프절의 T림프구가 풍부한 지역으로 이동하여 T 림프구에 항원을 제시함으로써 T 림프구 면역반응을 일으키게 된다. 이렇게 미성숙 DC에 백신의 타겟 항원을 탑재하기도 하지만, 본 발명의 수지상 세포 백신의 제조방법은 상기에서 성숙 인자에 의해 분화된 면역 기능이 우수한 성숙 DC를 이용하는 것에 그 특징이 있으며, 성숙 수지상 세포 및 항원을 공동 배양하는 방법에 의해 항원을 적재하여 수지상 세포 백신을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 항원은 펩타이드 항원 인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 항원은 암세포 표면의 암 항원인 것을 특징으로 한다. 상기 암의 종류로는 뇌하수체선종, 신경교종, 뇌종양, 상인두암, 후두암, 흉선종, 중피종, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 대장암, 간암, 췌장암, 췌내분비종양, 담낭암, 음경암, 요관암, 신세포암, 전립선암, 방광암, 비호지킨성림프종, 골수이형성증후군, 다발성골수종, 형질세포성종양, 백혈병, 소아암, 피부암, 난소암, 자궁경부암 등이 있으나, 반드시 이에 제한 되는 것은 아니다.

대부분의 인체 암은 상당량의 암-연관 항원(tumor-associated antigens)을 표현함에도 불구하고 개체의 면역 감시를 피해 나간다. 이는 우선 암 항원의 특성과 관련이 있다. 암 항원은 대부분 태생기 동안 표현되거나, 정상세포에서 발현되기도 하는 자가 항원의 일부이거나, 면역반응 유발 정도가 매우 약한 항원이며, 때로는 그 에피토프가 다량의 다당류에 의하여 숨겨져 있어 항원으로 인지되지 못하기 때문이다. 이런 암 항원들이 인지될 수 있는 경우에도 항원으로서 T 림프구에 제시되는 데에는 또 다른 장애가 있다. 암세포에 의한 MHC 발현이 저조하거나, 암 항원이 암세포 내에서 불완전하게 처리되어 MHC 분자와 약하게 결합하여 제시되거나, 아예 제시되지 못하는 경우이다. 또한 대부분의 암세포는 항원제시에 필수적인 보조자극 분자(costimulatory molecules)를 표현하지 못하기 때문에 효과적으로 T 림프구 면역반응을 유도할 수 없다.

본 발명의 수지상 세포 백신은 면역 기능이 우수한 본 발명의 성숙 수지상 세포를 사용하여 암 항원을 매우 효과적으로 T 림프구에 제시하므로, 상기 언급한 암 항원이 세포 내에서 제대로 제시되지 못하는 문제점을 근본적으로 해결하는 장점이 있다. 즉, 암세포 표면의 암 항원을 본 발명의 면역 기능이 우수한 성숙 수지상 세포에 적재하여 수지상 세포 암백신을 제조하는 경우, 암세포 혹은 암 항원을 인식하여 암세포를 제거할 수 있는 암-특이 세포살해 T 림프구(cytotoxic T lymphocytes, CTL)를 매우 효과적으로 생성시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 성숙 수지상 세포의 제조방법을 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포는 다양한 척도에서 종래의 수지상 세포보다 역가가 크게 개선되어 그 면역 기능이 우수하므로, 다양한 수지상 세포 백신을 제조하는 데 바람직하게 사용될 수 있다.

도 1은 다양한 분화 인자의 조합에 의해 성숙 유도된 수지상 세포 자극에 의한 MLR 결과 그래프이다. 가로축은 수지상세포 : T세포 의 다양한 비율(1 : 20 내지 1 : 1280)을 나타낸다.
도 2는 다양한 분화 인자의 조합에 의해 성숙 유도된 수지상 세포의 FACS를 이용한 형질 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 다양한 분화 인자의 조합에 의해 성숙 유도된 수지상 세포의 IL-12와 IL-10 분비 능력을 나타내는 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 수지상 세포의 순차적 자극의 시기와 자극원의 종류를 대표적으로 요약한 개요도이다.
도 5는 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 표면 형질을 보여주는 FACS 분석 결과 그래프이다.
도 6은 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 항원전달 능력을 MLR로 측정하여 분석한 결과 그래프이다.
도 7은 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 IL-12와 IL-10 분비능을 나타내는 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 8의 A는 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포 백신의 케모카인 수용체 CCR7과 CXCR4의 발현을 보여주는 FACS 분석 결과 그래프이다. B는 수용체 CCR7의 리간드인 CCL21에 의한 수지상 세포의 주화성 능력을, C는 수용체 CXCR4의 리간드인 CXCL12에 의한 주화성 능력을 transwell을 활용하여 분석한 결과 그래프이다.
도 9의 A는 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포에 의해 자극 받아 증식한 CD4 T 세포군의 종류를 파악하기 위해 세포내 IFN-γ 및 IL-4의 발현 비율을 FACS 분석한 결과 그래프이며, 도 9b는 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포에 의해 자극 받아 IFN-γ를 생산하는 CD4 T 세포군의 비율을 대조군과 비교하여 요약한 그래프이고, 도 9c 본 발명의 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포에 의해 자극 받아 증식한 CD4 T 세포군에 의해 생산된 IFN-γ의 총량을 ELISA로 분석한 그래프이며, 도 9d는 HLA-A2 유전형을 갖는 혈액 기증자로부터 수지상 세포에 MART-1₂₆₃₅합성 펩타이드(ELAGIGILTV)를 도입한 다음 순차적 자극 방법으로 성숙시킨 수지상세포를 이용하여 동일인의 CD8 T 세포를 4주간 주 1회 자극을 반복 한 다음 유도된 IFN-γ를 분비하는 세포 독성 T 림프구의 수를 ELISPOT으로 분석한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포가 T 세포로부터 추가적인 자극을 받을 경우 매우 효과적으로 IL-12를 발현하는 것을 ELISA로 분석한 그래프이다.
도 11은 본 발명의 순차적 자극 방법에 의해 제조된 수지상 세포가 추가 자극이 없는 환경이나 GM-CSF와 IL-4가 제공되는 환경에서 종래의 방식에 의해 제작된 수지상세포에 비해 표현 형질 의 안정성이 뛰어남을 FACS 분석한 다음 수치화한 그래프이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명 하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 말초혈액 단핵구로부터 수지상세포의 분화 유도

본 발명에서 사용하는 혈액세포는 사람의 말초혈액으로부터 백혈구 분반 시술(Leukapheresis)을 거친 백혈구 농축액 또는 전혈(Whole blood)로 부터 확보하였다. 단일핵 세포는 파이콜-하이패크(Ficoll-Hypaque) 농도구배를 이용한 원심분리를 통해 확보하였으며, 단일핵 세포들 중의 단핵구는 말초혈액에서 CD14-MACS(Miltenyi Biotec, Germany)를 이용하여 분리하였다. 이 경우 말초혈액 단핵구를 사람의 항체로 항체수용체를 블록킹(blocking)한 다음 초미세 금속 파편이 접속된 항-인간 CD14 항체(CD14-microbeads)와 15-30 분간 4℃에서 염색하였다. 염색 후 세포를 원심분리하여 세척하고 이를 자기장이 적용되는 컬럼(column)에 적용하여 항 CD14 항체가 부착된 세포들을 자기장에 의해 컬럼에 부착시키고 다른 세포들은 방출되도록 하였다. 부착된 세포를 자기장으로부터 격리하여 수집하여 1회 세척한 후 세포 수를 결정하였다.

단핵구는 10% 우혈청, 10 mM 글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신(Life Technologies, Grand Island, NY)을 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유 시킨 다음 6 웰, 100 mm 조직배양 플레이트 또는 75 cm₂ 배양용 플라스크에 5 x 10⁵ 세포/㎖의 농도로 배양을 시작하였다.

단핵구에서 수지상세포로 분화 유도를 위해 배지에 GM-CSF(100 ng/㎖, BD-Pharmingen, San Diego, CA) 및 IL-4(20 ng/㎖, Peprotech, Rocky Hill, NJ)을 첨가하여 배양하였다. 배양 3일째 50%의 배지를 동일한 농도의 이들 성장인자를 함유하는 신선한 배지로 교체하여 주었다. 6일째에 비부착성 세포를 수집하여 원심 분리한 후 이들을 GM-CSF(600 U/㎖)와 IL-4(100 U/㎖)를 함유하는 배지에서 사이토카인 칵테일(IL-1β(10 ng/㎖, BD Biosciences, San Jose, CA), IL-6(10 ng/㎖, BD Biosciences), TNF-α(10 ng/㎖, Peprotech), PGE2(10 ng/㎖, Sigma) 및 폴리(I:C)(20 ng/㎖, Sigma)), 폴리(I:C)(20 ㎍/㎖, Sigma Chemical Co), IFN-α(10 ng/㎖, Peprotech), sCD40L(Soluble CD40 ligand, 1 ㎍/㎖, Peprotech), LTA(lipoteichoic acid, 10 ㎍/㎖, Sigma), Peptodoglycan(PGN, 10 ㎍/㎖, Sigma)과 같은 분화유도 인자를 단독 또는 다양한 조합으로 2일간 추가 배양하여 성숙(maturation)을 완료하였다.

1-1. 수지상세포의 항원제공 능력 비교

기능적으로는 미성숙 수지상세포보다 다양한 분화유도인자로 자극한 수지상세포들이 5-100배 이상 강력한 항원제공 능력을 보유함을 MLR(mixed lymphocyte reaction)로 확인하였다. 항원제공세포로서의 수지상세포의 기능은 T림프구 증식(T cell proliferation assay)에 의해 확인하였다.

첫째, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 여러 분화유도 인자의 조합으로 48시간 분화시킨 수지상세포를 3000 Rad로 방사선 조사한 다음 접종하고 여기에 다른 사람에게서 추출한 T 림프구(2 x 10⁵ 세포/웰)를 첨가하여 37℃, 습도 95%, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기에서 5일간 배양한 다음 최종 16시간 동안 방사성 동위원소(삼중수소)로 표지된 티미딘(³H-thymidine 0.5 μCi/well, NEN, Boston, MA)로 표지하여 배양하였다. 배양 후 수지상세포의 자극에 의한 T 림프구의 증식 정도를 염색체 상의 티미딘 방사선 잔류량을 측정하여 결정한다. 대조군으로는 자극받지 않은 T 림프구, PHA(10 ㎍/㎖, Sigma)에 의해 자극 받은 T 림프구 및 방사선 조사된 수지상세포의 3 군으로 하였다.

시험군으로는 분화인자의 조건을 달리하여 제작된 수지상세포를 10⁴개, 2.5 x 10³개, 6.25 x 10²개 또는 1.56 x 10²개로 세포수로 양을 달리하여 2 x 10⁵개의 T 세포가 들어있는 웰 플레이트에 첨가함으로써 DC(수지상세포) 대 T 세포 비율이 1:20, 1:80, 1:320 또는 1:1280이 되도록 하였다. 그리고 RPMI 1640 배지를 사용하여 동일하게 각 배양의 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 채워 주었다. 이어, 5일 동안 37℃, CO₂ 배양기에서 배양을 한 후, 0.5 μCi [³H]티미딘(NEN, Boston, MA)을 첨가하여 16시간 동안 배양을 계속하였다. 각 DC 대 T 세포 비율 당 세 개의 배양을 반복 실시하였다. 최종일에 세포 수확기(SKATRON Inc, Norway)로 세포를 자동 수거한 후 방사선 동위원소 측정기(Liquid Scintillation Counter, LS6000, Beckman)로 세포에 잔류한 [³H]티미딘의 cpm(counter per minute) 값을 측정하였다. 도 1은 상기 조건에서 배양한 각 세포들의 항원 제공능력을 MLR로 항원제공세포들의 능력을 분석한 결과이다. 오픈 원형(○)은 미성숙 수지상세포에 의한 반응군의 증식을, 솔리드 원형(●)은 6일간 배양한 미성숙 수지상세포를 2일간 추가로 사이토카인 칵테일로 분화시킨 성숙 수지상세포에 의한 반응군의 증식을 그리고 다양한 단일 또는 조합의 분화인자에 의해 48시간 동안 분화유도한 성숙수지상세포들에 대한 반응군의 증식을 여러 도형으로 나타내었다.

도 1에서 볼 수 있듯이, 수지상세포 분화유도 인자를 처리하지 않은 미성숙수지상 세포의 양을 1:20까지 넣어주어도 동종 T 세포의 증식을 효과적으로 유도하지 못하였으나, 다양한 분화유도인자에 의해 성숙한 수지상세포의 넣어준 수에 의존적으로 T 세포의 증식이 효과적으로 유도됨을 알 수 있다. 이와 같은 결과는 T 세포 증식이 수지상세포의 성숙도에 의존적 반응임을 입증하는 것이다.

또한, 보다 중요하게는 도 1에서 볼 수 있듯이, 폴리(I:C)와 사이토카인 칵테일의 조합으로 처리된 수지상세포가 각각의 분화인자 단독 또는 다른 조합의 분화유도 인자로 자극한 수지상세포 보다 항원전달에 의한 T 세포 증식 유도 능력이 월등히 높음을 알 수 있다.

1-2. 분화유도인자에 의해 성숙된 수지상세포의 표현형질 비교

상기한 방식으로 말초 혈액 단일핵 세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell)로 부터 단핵구(monocytes)-유래 수지상세포들이 체내의 수지상세포와 유사한 형질과 능력을 가졌는지를 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson)를 통해 확인하였다. 형질확인을 위해서 형광색소가 부착된 백서에서 제작된 항 인간 단일클론항체들로 염색한 후 유세포 분석기를 통해서 표현형질을 확인하고 그 결과를 도 2에 나타내었다.

수지상세포에 단일 또는 다양한 조합의 분화유도인자를 처리하고 48시간 성숙한 수지상세포를 수거하여 FITC(fluorescein isothiocyanate) 및 PE(R-phycoerythrin)로 접합된 항체(PE-접합-CD80(BD-Pharmingen), PE-접합-CD83(BD-Pharmingen), PE-접합-CD86(BD-Pharmingen), FITC-접합-HLA-DR(BD-Pharmingen) 항체, FITC-접합-CD1a(BD-Pharmingen), FITC-접합-CD40 (BD-Pharmingen))를 수지상세포에 처리하고 15분 동안 4℃에서 반응을 시켰다. 이어, PBS로 세척을 하고, FACS(CytomicsTM Flow Cytometer(Beckman Coulter, Fullerton, CA))를 사용하여 세포 표면 형질을 분석하고, 데이터는 WinMDI (Scripps Institute, La Jolla, CA)로 처리한 다음 평균 형광강도(MFI: mean fluorescence Intensity)를 측정하였으며 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 볼 수 있듯이, 미성숙 수지상세포는 CD1a를 많이 발현하는 반면 다른 성숙 수지상세포의 기능에 관계되는 막 단백질의 발현이 상대적으로 낮거나 없다. 반면에 성숙 수지상세포는 항원제공 단백질인 HLA-DR, 보조활성인자인 CD40, CD80 및 CD86 등을 강하게 발현하며 CD83도 발현함을 알 수 있다.

다양한 분화유도 인자로 성숙한 수지상세포의 형질 분석결과 폴리(I:C) 및 사이토카인 칵테일의 조합이 사이토카인 칵테일 단독과 유사한 표현형질을 보유함을 확인 할 수 있었다.

1-3. 수지상세포가 분비하는 사이토카인 IL-10과 IL-12의 분석

수지상세포는 성숙화 조건(분화유도인자의 종류)에 따라 유도되는 면역 반응의 방향성(polarity 반응 유형) 및 크기가 결정된다. 따라서 미성숙 수지상세포를 상기한 방식으로 48시간 배양한 다음 배양액에 분비된 IL-10과 IL-12의 양을 측정하여 배양된 수지상세포가 보유하는 T 세포의 면역 방향성과 크기를 예측할 수 있다.

배양된 수지상세포의 배양액은 분석을 수행하기 전에 20℃에 동결 보존하였다. IL-12(p70)과 IL-10의 정량은 ELISA 키트(BD Biosciences)를 제조사의 권장 방식에 따라 진행하였다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 수지상세포 분화유도 인자를 처리하지 않은 경우 세포성면역 유도에 필수적인 IL-12의 분비가 검출되지 않았으며, 사이토카인 칵테일을 포함한 대부분의 조합에서 매우 낮은 IL-12의 분비가 검출되었다. 반면에 폴리(I:C)와 펩티도글리칸 또는 폴리(I:C)와 사이토카인 칵테일의 조합에서는 매우 높은 함량의 IL-12가 분비됨을 알 수 있다. 체액성 면역을 촉진하고 세포성 면역을 억제하거나 면역관용(immune tolerance)을 유도하는 것으로 알려진 IL-10도 비슷한 양상으로 폴리(I:C)와 펩티도글리칸 또는 폴리(I:C)와 사이토카인 칵테일의 조합에서 높게 발현되나 폴리(I:C)와 사이토카인 칵테일의 조합이 폴리(I:C)와 펩티도글리칸의 조합에 비해 상대적으로 낮은 IL-10 분비를 하는 것을 알 수 있다.

또한, 보다 중요하게는 도 3에서 볼 수 있듯이, 현재 가장 임상시험에 많이 활용되는 수지상세포 분화인자인 사이토카인 칵테일 단독으로는 매우 낮은 정도의 IL-12를 분비하며, 폴리(I:C) 및 사이토카인 칵테일의 조합이 가장 높은 Il-12 분비능을 보유함을 알 수 있다.

실시예 2: 본 발명의 순차적 자극에 의한 수지상세포의 성숙

상기한 분화유도 조건에서 가장 효과적인 것으로 확인된 폴리(I:C) 및 사이토카인 칵테일의 조합을 수지상세포의 성숙과정에 순차적으로 처리하기 위해 도 2와 같이 미성숙 수지상세포에 1차로 폴리(I:C) 또는 사이토카인 칵테일을 처리 한 다음 6시간, 12 시간 및 24시간 경과 후 나머지 분화인자를 처리하는 순차적 자극을 진행하였다.

폴리(I:C)를 먼저 0시간에 처리하고 순차적으로 사이토카인 칵테일을 6, 12 및 24시간 후 처리한 경우를 각각 P0/C6, P0/C12 및 P0/C24로 표기하고, 사이토카인 칵테일을 먼저 0시간에 처리하고 폴리(I:C)를 6, 12, 24시간 후 처리한 경우를 각각 C0/P6, C0/P12 및 C0/P24로 표기하였으며, 대조군으로는 사이토카인 칵테일 단독 또는 폴리(I:C) 및 사이토카인 칵테일의 동시 투여군(C0/P0)을 활용하였다.

실시예 3: 본 발명의 방법과 기존 방법에 의한 수지상세포 비교

상기한 방식으로 순차적으로 성숙시킨 수지상세포들이 기존의 방식에 비해 표현 형질적, 항원제공 능력, 사이토카인 생산 능력, 주화성 인자(chemokines)에 대한 반응성, 자극 받은 T 세포의 면역 방향성과 크기, 특정 항원에 대한 선택적 면역반응성, 세포의 생존능 및 추가적인 수지상세포의 분화유도인자에 의한 추가적인 반응성 등을 확인하여 체내의 수지상세포와 유사한 형질과 능력을 가졌는지를 유세포 분석기(flow cytometry, Becton Dickinson)를 통해 확인하였다. 형질확인을 위해서 형광색소가 부착된 백서에서 제작된 항사람 단일클론항체들로 염색한 후 유세포 분석기를 통해서 표현형질을 확인하였다.

3-1. 수지상세포 표현 형질 비교

수지상세포에 상기한 분화유도인자(사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C))를 동시 또는 순차적으로 처리하고 총 48시간 동안 성숙한 수지상세포를 수거하여 FITC (fluorescein isothiocyanate) 및 PE(R-phycoerythrin)로 접합된 항체(PE-접합- CD80(BD-Pharmingen), PE-접합-CD83(BD-Pharmingen), PE-접합-CD86 (BD-Pharmingen), FITC-접합-HLA-DR(BD-Pharmingen) 항체, FITC-접합-CD1a (BD-Pharmingen), FITC-접합-CD40(BD-Pharmingen))를 수지상세포에 처리하고 15분 동안 4℃에서 반응을 시켰다. 이어, PBS로 세척을 하고, FACS(CytomicsTM Flow Cytometer(Beckman Coulter, Fullerton, CA))를 사용하여 세포 표면 형질을 분석하고, 데이터는 WinMDI(Scripps Institute, La Jolla, CA)로 처리한 다음 평균 형광강도(MFI: mean fluorescence Intensity)를 측정하였으며 그 수치를 도 5에 나타내었다.

도 5에서 볼 수 있듯이, 사이토카인 칵테일과 폴리(I:C) 동시 처리군 (C0/P0)또는 폴리(I:C)를 선처리하고 사이토카인 칵테일을 후 처리한 모든 군 (P0/C6, P0/C12 및 P0/C24)에 비해 사이토카인 칵테일을 선 처리하고 폴리(I:C)를 후 처리한 군(C0/P6, C0/P12 및 C0/P24)들에서 성숙 수지상세포의 표현 형질들이 월등함을 알 수 있다. 특히 C0/P6가 다른 군(C0/P12 및 C0/P24)에 비해 상대적으로 수지상세포의 형질 마커의 발현을 더 효과적으로 유도하고 있다.

3-2. 수지상세포의 항원제공 능력 비교

본 발명의 상기한 방식으로 순차적으로 자극한 수지상세포들의 항원제공 능력은 MLR로 확인 하였다. 항원제공세포로서의 수지상세포의 기능은 T 림프구 증식 (T cell proliferation assay)에 의해 확인하였다.

첫째, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 순차적 자극으로 총 48시간 분화시킨 수지상세포를 3000 Rad로 방사선 조사한 다음 접종하고 여기에 다른 사람에게서 추출한 T 림프구(2 x 10⁵세포/웰)을 첨가하여 37℃, 습도 95%, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기에서 5일간 배양한 다음 최종 16시간 동안 방사성 동위원소(삼중수소)로 표지된 티미딘(³H-thymidine, 0.5 μCi/well, NEN, Boston, MA)로 표지하여 배양한 다음 수지상세포의 자극에 의한 T 림프구의 증식 정도를 염색체 상의 티미딘 방사선 잔류량을 측정하여 결정하였다. 대조군으로는 자극받지 않은 T 림프구, PHA(10 ㎍/㎖, Sigma)에 의해 자극 받은 T 림프구, 방사선 조사된 수지상세포의 3 군으로 하였다.

시험군으로는 P0/C6, P0/C12, P0/C24, C0/P6, C0/P12 및 C0/P24를, 대조군으로는 C0/P0의 조합으로 자극한 수지상세포를 10⁴개, 2.5 x 10³개 또는 6.25 x 10²개의 세포수로 양을 달리하여 2 x 10⁵개의 T 세포가 들어있는 웰 플레이트에 첨가함으로써 DC 대 T 세포 비율이 1:20, 1:80 또는 1:320이 되도록 하였다. 그리고 RPMI1640 배지를 사용하여 동일하게 각 배양의 최종 부피가 200 ㎕가 되도록 채워 주었다. 이어, 5일 동안 37℃, CO₂ 배양기에서 배양을 한 후, 0.5 μCi [³H]티미딘(NEN, Boston, MA)을 첨가하여 16시간 동안 배양을 계속하였다. 각 DC 대 T 세포 비율 당 세 개의 배양을 반복 실시하였다. 최종일에 세포 수확기(SKATRON Inc, Norway)로 세포를 자동 수거한 후 방사선 동위원소 측정기(Liquid Scintillation Counter, LS6000, Beckman)로 세포에 잔류한 [3H]티미딘의 cpm(counter per minute) 값을 측정하였다.

도 6은 상기 조건에서 배양한 각 세포들의 항원 제공능력을 MLR(mixed leukocyte reaction)로 항원제공세포들의 능력을 분석한 결과이다. 원형(흑색,회색,흰색)은 각각 P0/C6, P0/C12 및 P0/C24 수지상세포에 의한 반응군의 증식을, 사각형(흑색,회색,흰색)은 각각 C0/P6, C0/P12 및 C0/P24 수지상세포에 의한 반응군의 증식을, 마름모꼴(◇)은 대조군(C0/P0) 수지상세포에 의한 반응군의 증식을 나타낸다.

도 6에서 볼 수 있듯이 표현형질의 결과와 동일하게 사이토카인 칵테일과 폴리(I:C) 동시 처리군(C0/P0) 또는 폴리(I:C)를 선처리하고 사이토카인 칵테일을 후 처리한 모든 군(P0/C6, P0/C12 및 P0/C24)에 비해 사이토카인 칵테일을 선 처리하고 폴리(I:C)를 후 처리한 군(C0/P6, C0/P12 및 C0/P24)들에서 성숙 수지상세포에 의한 T 세포의 증식이 월등함을 알 수 있다. 따라서 C0/P6, C0/P12 및 C0/P24 의 방식으로 제조한 수지상세포들의 항원제공 능력이 탁월함을 의미한다. 반면 P0/C6, P0/C12 및 P0/C24의 시험군은 대조군(C0/P0)과 큰 차이가 없었다.

3-3. 수지상세포가 분비하는 사이토카인 IL-10과 IL-12의 분석

수지상세포를 상기한 방식으로 순차적으로 자극하여 총 48시간 배양한 다음 배양액에 분비된 IL-10과 IL-12의 양을 측정하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 모든 시험군에서 IL-12는 통계적으로 유의하지 않은 정도로 많이 분비가 되었다. 반면에 IL-10은 대조군(C0/P0)과 P0/C6, P0/C12 및 P0/C24의 수지상세포에서 모두 다량 검출되었으나, C0/P6, C0/P12 및 C0/P24의 시험군에서는 통계적으로 유의하게 적은 양이 검출됨을 알 수 있다. 또한, 보다 중요하게는 도 7에서 볼 수 있듯이, 높은 IL-12의 분비와 낮은 IL-10의 분비에 가장 효과적인 조건은 C0/P6에 의한 순차적 수지상세포의 자극임을 알 수 있다.

3-4. 수지상세포의 주화성 분석

수지상세포에 상기한 분화유도인자(사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C))를 동시 또는 순차적으로 처리 하고 총 48시간 동안 성숙한 수지상세포를 수거하여 FITC-접합-CCR7(BD-Pharmingen) 항체, PE-접합-CXCR4(BD-Pharmingen) 항체를 수지상세포에 처리하고 15분 동안 4℃에서 반응을 시켰다. 이어, PBS로 세척을 하고, FACS (CytomicsTM Flow Cytometer, Beckman Coulter, Fullerton, CA)를 사용하여 세포 표면 형질을 분석하고, 데이터는 WinMDI(Scripps Institute, La Jolla, CA)로 처리한 다음 평균 형광강도(MFI: mean fluorescence Intensity)를 측정하였으며 그 수치를 도 8에 나타내었다.

수지상세포의 이동능력은 5 ㎛ 직경의 홈을 갖는 24-웰 트랜스웰 (polycarbonate filter, Corning Costar, New York, NY)을 이용하였다. 트랜스웰의 하단에 CCL21(CCR7 ligand)과 CXCL12(CXCR4 ligand) 각 100 ng/㎖(Peprotech, Rochester, NY)를 함유하는 배지 600 ㎕를 주입한 다음 트랜스웰의 윗편에 상기한 방식으로 제조한 수지상세포(2 x 10⁵개)를 100 ㎕에 부유시킨 다음, 2시간을 37℃, 습도 95%, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기에서 배양하고, 500 ㎕의 배지를 트랜스웰의 하단에서 회수하여 FACS(CytomicsTM Flow Cytometer)로 60초간 분석된 입자(이동한 수지상세포)의 수를 측정하였다. 대조군으로는 트랜스웰 하단에 배지만 넣어 자연 이동한 수를 실험군에서 차감하였다. 동일 실험은 3회 반복하여 통계적 유의도를 분석하여 도 8b에 나타내었다.

도 8a에서 보는 바와 같이 미성숙 수지상세포 또는 폴리(I:C)로 자극한 수지상세포는 CCR7과 CXCR4를 거의 발현하지 않고, 사이토카인 칵테일 자체만으로는 매우 약하게 CCR7과 CXCR4의 발현이 유도함을 알 수 있다. C0/P0와 P0/C6로 대표되는 시험군에서는 사이토카인 칵테일 단독 처리군과 유사한 정도로 CCR7과 CXCR4의 발현이 유도 되었다. 반면, C0/P6는 앞서의 형질 분석 및 항원제공 능력의 결과와 동일하게 매우 유의 하게 높은 정도로 CCR7과 CXCR4의 발현을 유도함을 확인할 수 있다.

도 8b 및 8c에서는 동일한 조건으로 회수한 수지상세포의 주화성을 분석한 결과로, CCR7과 CXCR4 케모카인 수용체에 결합하는 각각의 주화성인자 CCL21(CCR7 ligand, 도 8b), CXCL12(CXCR4 ligand, 도 8c)에 반응하여 이동한 세포의 수를 측정한 것이다. 그림에서와 같이 케모카인 수용체의 발현양상과 동일하게 C0/P6에서 가장 월등한 세포의 이동성을 보였다. 또한, 보다 중요하게는 현재 가장 보편적으로 임상시험에 활용하고 있는 사이토카인 칵테일만으로 자극한 성숙 수지상세포는 매우 미약한 세포 이동능력을 보임을 알 수 있으며 본 발명의 순차적 자극을 받아 성숙한 수지상세포는 통계적으로 유의한 세포 이동 능력을 확인 할 수 있다.

3-5. 순차적 자극으로 성숙한 수지상세포에 의한 세포 면역의 방향성 분석

본 발명의 방법으로 제조한 수지상세포에 의해 유도되는 세포성 면역 반응의 크기와 반응 유형을 다양한 기준에서 분석하였다.

(a) IFN-γ 사이토카인 분비 T 세포 유도성

실시예 2의 방식으로 성숙시킨 수지상세포를 이용하여 동종(allogeneic) T 세포를 자극한 다음 세포면역의 방향성을 측정하기 위해 자극 받은 T 세포의 세포질에 발현된 IFN-와 IL-4를 형광 염색한 다음 FACS로 분석하였다. 이를 위해 동종의 CD4양성 T 세포를 MACS(miltenyi Biotech)를 이용하여 순수 분리한 다음 24 웰 플레이트(Corning Costar)에서 성숙 수지상세포와 T 세포의 비율이 1:10이 되도록 각각 1 x 10⁴개와 1 x 10⁵개로 분주한 다음 5일간 배양하였다. 대조군은 수지상 세포를 첨가하지 않은 웰과 PHA(1 ㎍/㎖)을 처리한 두 가지로 하였다. 5일간 배양한 T 세포에 IL-2(50 U/㎖, Peprotech)를 첨가한 다음 추가로 3-6일간 배양한 다음, 최종 8시간 동안 20 ng/㎖의 PMA(phorbol 12-myristate acetate)와 1 ㎍/㎖의 이오노마이신(Sigma)으로 추가 자극을 주었다. 세포내 사이토카인이 외부로 분비되는 것을 막기 위해 BrefeldinA(10 ㎍/㎖, Sigma)를 최종 6시간 동안 처리한 다음 세포질 사이토카인의 염색을 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 우선 Cytofix/Cytoperm 키트(BD Biosciences)로 세포를 고정시킨 다음, FITC-접합-IFN- 및 PE-접합-IL-4 항체 또는 이소타입 대조항체(BD Biosciences)로 15분간 염색한 다음 2차례 세척한 다음 CytomicsTM 유세포분석기로 분석하였다. 결과는 도 9a에 나타내었다. 각 시험군은 3회 반복하였다.

도 9a에서 보는 바와 같이 사이토카인 칵테일, C0/P0 및 C0/P6 세 시험군 모두에서 효과적으로 Th1 세포성 면역반응의 유도 능력을 측정하는 척도인 세포 내 IFN-γ을 발현하는 CD4 양성 T 세포 군이 수적인 증폭을 보였다. 세군 간의 통계적 유의성은 발견되지 않았다.

(b) IFN-γ 사이토카인 분비 T 세포의 정량 분석

상기한 실시예 3-5 (a)의 FACS 결과로부터 총 CD4양성 T 세포들 중에서 IFN-γ 발현세포의 양을 역산하여 결정하여 도 9b에 나타내었다. 도 9b에서 보는 바와 같이 C0/P0 및 C0/P6 시험군 모두 사이토카인 칵테일 단독 처리한 수지상세포로 자극한 T 세포의 대조군과 유사한 정도의 IFN-γ 발현세포의 분화를 유도하고 있다. 따라서 세 조건 모두 Th1 면역 방향성의 강도는 유사함을 알 수 있다.

(c) T 세포의 IFN-γ 사이토카인 분비량 분석

상기한 실시예 3-5 (a)과 동일한 방식으로 수지상세포와 동종 유래 CD4-양성 T 세포를 1:10의 비율로 24웰 플레이트에 각각 5 x 10⁴개와 5 x 10⁵개를 분주하여 5일간 공동 배양한 다음 50 U/㎖ IL-2를 추가하고 3일간 추가 배양하였다. 배양 후 회수된 배양액에 함유된 CD4-양성세포로부터 분비된 IFN-γ의 양은 ELISA로 측정하였고, 그 결과는 도 9c에 나타내었다.

도 9c에서 보듯이, 도 9a와 9b에서 나타난 IFN-γ 생산 세포의 비율과는 대조적으로 C0/P6 수지상세포에 의해 자극받은 CD4-양성 T세포가 가장 많은 양의 IFN-γ 생성을 유도하는 것으로 나타났다. 이것은 IFN-γ 생산 세포의 비율은 동일하더라도 3-2에서 보는 바와 같이 C0/P6 수지상세포가 T 세포의 증식을 가장 크게 유도하여 전체적으로 더 많은 T 세포들이 배양되기 때문이다.

(d) 수지상세포백신을 통해 유도된 암항원 특이적 자가 IFN-γ을 생성하는 CD8 + 세포 수 비교

우선, HLA-A2 유전형의 자발적 헌혈자로부터 말초혈액 1 유닛(450 ㎖)을 기증 받아, 단핵구를 CD14 MACS로 회수한 다음, CD3 MACS로 T 세포를 순수 분리하였다. 분리한 T세포는 사용되기 까지 DMSO 10%와 FBS(Gibco) 90%로 구성된 동결보존액에 1 ㎖ 바이얼 당 1 x 10⁷개씩 분주하여 -80℃ 냉동고에 하루 보관 한 뒤 액체질소 통에 이동시켜 장기보존 하였다. 단핵구는 실시예 2의 방법으로 순차적(대표적으로 C0/P6), 동시 자극(C0/P0) 및 사이토카인 칵테일 단독으로 수지상세포를 자극하여 성숙을 유도하였다. 총 48시간의 배양 후 회수한 수지상세포는 10⁶세포/㎖의 농도로 5% 인간 AB 혈청을 함유한 RPMI-1640 배지에 부유시킨 다음, 10 ㎍/㎖의 HLA-A2에 선택적으로 결합하는 MART-1₂₆₃₅ 펩타이드(ELAGIGILTV)를 첨가하고 2시간 동안 37℃, 습도 95%, 5% 이산화탄소 조건의 항온 배양기에서 배양하여 항원 적재를 진행한 다음 일부는 즉시 실험에 사용하고, 나머지는 1 x 10⁶ 세포/바이얼로 동결보존하였다.

항원을 적재한 2 x 10⁵개의 수지상세포를 3000 rad 방사선을 조사한 다음 동일인으로부터 추출한 자가 T 세포(2 x 10⁶)에 넣어 12 웰 플레이트에서 50 U/㎖의 IL-2 와 10 ng/㎖의 IL-7(BD Biosciences)을 첨가하여 총 1 ㎖이 되도록 하고 배양하였다. 7일간 배양 후, 비 부착성 세포를 회수하여 세척하고, 세포의 수를 헤모사이토미터로 측정하였다. 항원을 적재하고 동결했던 수지상세포를 해동하고 방사선 조사한 다음 위와 동일한 조건으로 배양하였으며 이 과정은 총 4회 반복되었다. 바람직하게는 2~5회 반복한다. 28일간의 배양 후, 회수한 비부착성 세포로 IFN-γ ELISPOT을 수행하였다. ELISPOT 분석은 제조사(eBioscience, San Diego,CA)의 권장 방식으로 3회 반복 수행하였다. 회수한 4 x 10⁴개의T 세포를 항원을 적재한 1 x 10⁴개의 본 특허의 방식으로 순차적 자극에 의해 제조한 성숙 수지상세포와 50 ㎕에서 IFN-γ에 대한 항체로 코팅된 ELISA용 플레이트(PVDF-기반 membrane 플레이트, Millipore Co. MAIPSWU10)에서 16-24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 자극 받지 않은 T 세포, 항원을 적재하지 않은 수지상세포와 공동 배양한 T 세포 등을 활용하였다. 배양 후 세포 등을 PBS로 3-4회 세척하여 제거한 다음 바이오틴이 결합된 IFN-γ에 대한 2차 항체를 투여하고 2시간 상온에서 배양한 다음, PBS로 4회 세척하였다. 여기에 스트렙타비딘이 결합된 호스래디쉬 페록시다제(HRP)를 첨가하여 상온에서 1시간 배양한 다음 PBS로 5회 세척하였다. 최종 발색은 3-아미노-9-에틸 카바졸(AEC)을 기질로 하여 진행하였고, IFN-γ 스팟은 Autoimmun Diagnostika system(AID; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)와 소프트웨어(Cell Technology Inc., Jessup, MD)로 분석하고 100,000개 세포 당 스팟의 수로 그래프화 하였다.

도 9d에서 나타난 바와 같이, 사이토카인 칵테일 또는 C0/P0에 의해 성숙시킨 다음 MART-1 항원을 적재한 수지상세포로 자극받은 T 세포들의 경우 비교적 적은 수의 세포가 IFN-γ를 분비하는 스팟으로 확인되었고, 이와 같은 결과는 이 조건하에서 성숙한 수지상세포들이 미약하게 CD8 T 세포에게 MART-1 항원을 전달해서 나온 것으로 판단된다. 그러나, 동일한 T 세포에 C0/P6로 성숙시킨 수지상세포가 더 많은 IFN-γ 스팟을 형성했다는 것은 본 발명의 순차적 자극에 의해 제조된 성숙 수지상세포가 세포독성 CD8+ T 세포를 가장 효과적으로 유도 할 수 있음을 시사하는 것이다.

또한, 보다 중요하게는 도 9d에서 볼 수 있듯이 이 IFN-γ 스팟은 자가 수지상세포의 표면에 있는 HLA-A2 분자에 적재된 MART-1을 인식한 자가 CD8+ T 세포에 의한 항원 특이적 반응으로 간주하며, 이것은 본 발명에 의한 수지상 세포 백신이 세포성 면역 (cellular immunity)을 유도하는 성질이 매우 뛰어남을 시사하는 것이다.

3-6. 활성화된 T 세포에 의한 수지상세포의 추가적인 반응 분석

실시예 2에 기재된 방법과 같이 성숙시킨 수지상세포를 회수한 다음 PBS로 2회 세척하고 세포의 수를 헤모사이토메터로 결정하였다. 5 x 10⁵개의 수지상세포에 각각 사이토카인이 없는 배지와 재조합 CD40리간드(1 ㎍/㎖, Peprotech)를 첨가한 다음 12 웰 플레이트에서 48시간 추가 배양 한 다음, 배지에 분비된 IL-12와 IL-10을 ELISA 기법으로 정량 분석하였다.

도 10에서 나타난 바와 같이, 사이토카인 칵테일 또는 P0/C6에 의해 성숙시킨 수지상세포에 비해 C0/P6로 성숙시킨 수지상세포가 매우 많은 양의 IL-12를 분비하였으며, IL-10의 분비는 거의 측정되지 않았다. 이것은 본 발명의 순차적 자극에 의해 제조된 성숙 수지상세포가 생체 내에서 림프절로 이동해서 T 세포에게 항원을 제공하여 T세포의 분화와 활성화를 유도한 다음, 역으로 활성화된 T 세포로부터 세포막의 CD40L로 수지상세포가 다시 한번 자극 받는데 있어 가장 효과적인 세포임을 시사하는 것이다.

3-7. 수지상세포의 형질적 안정성 분석

실시예 2에 기재된 방법과 같이 성숙시킨 수지상세포를 회수한 다음 PBS로 2회 세척하고 세포의 수를 헤모사이토메터로 결정하였다. 5 x 10⁵개의 수지상세포에 각각 GM-CSF와 IL-4가 첨가된 배지 또는 GM-CSF와 IL-4 및 IL-10(50 ng/㎖, Peprotech) 이 첨가된 배지에서 12 웰 플레이트에서 3일간 배양한 다음 수지상세포의 주요 형질 표지자를 FACS로 분석하였다. 결과는 각 표지자의 평균형광강도 (MFI)를 바탕으로 그래프로 나타냈다.

도 11에서 나타난 바와 같이, 사이토카인 칵테일 또는 P0/C6에 의해 성숙시킨 수지상세포에 비해 C0/P6로 성숙시킨 수지상세포의 표면에 표지자가 IL-10이 없는 경우와 있는 경우 모두에서 높게 유지됨을 확인하였다.

또한, 보다 중요하게는 도 7에서 볼 수 있듯이, 추가적인 분화 유도(성숙)인자의 부재 하에서 암 환자의 혈중에 높게 발현되며 수지상세포의 기능을 약화시키는 면역 억제사이토카인 IL-10의 존재 하에서도 다른 수지상세포에 비해 표지자들의 발현이 높게 유지된다는 것은 본 발명에 의한 수지상세포 백신이 세포성 면역(cellular immunity)을 유도하는 성질이 매우 뛰어나며, 안정성이 높아 임상 적용에 매우 효과적임을 시사하는 것이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 성숙 수지상 세포의 제조방법:
(a) 미성숙 수지상 세포를 취득하는 단계; 및
(b) 상기 취득한 미성숙 수지상 세포를 사이토카인 칵테일 및 폴리(I:C)의 조합으로 자극하여 성숙 수지상 세포로 분화 유도하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 사이토카인 칵테일은 IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2 및 poly(I:C)로 구성된 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 사이토카인 칵테일 및 상기 폴리(I:C)는 시간 간격을 두고 순차적으로 상기 미성숙 수지상 세포에 적용되는 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 사이토카인 칵테일은 상기 폴리(I:C)의 적용에 앞서 상기 미성숙 수지상 세포에 적용되는 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 시간 간격은 10분 내지 24시간인 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 시간 간격은 5시간 내지 7시간인 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 1 항에 있어서, 상기 미성숙 수지상 세포는 단핵구 또는 조혈모세포로부터 유래한 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단핵구 또는 조혈모세포는 말초혈액, 제대혈 또는 골수로부터 유래한 것을 특징으로 하는 성숙 수지상 세포의 제조방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 방법으로 제조한 성숙 수지상 세포 및 항원을 공동 배양하는 단계를 포함하는 항원이 적재된 수지상 세포 백신의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 항원은 펩타이드 항원인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 백신의 제조방법.
제 10 항에 있어서, 상기 항원은 암세포 표면의 암 항원인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 백신의 제조방법.
제 10 항의 방법으로 제조한 수지상 세포 백신.
제 13 항에 있어서, 상기 수지상 세포 백신은 암 백신인 것을 특징으로 하는 수지상 세포 백신.