WO2020116606A1 - Ｔ細胞又はｎｋ細胞の製造方法、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養用培地、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養方法、未分化ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びｔ細胞又はｎｋ細胞の増殖促進剤 - Google Patents

Ｔ細胞又はｎｋ細胞の製造方法、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養用培地、ｔ細胞又はｎｋ細胞の培養方法、未分化ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びｔ細胞又はｎｋ細胞の増殖促進剤 Download PDF

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晋一郎 高柳
篤志 國里
風香 中観寺
健 福本
一紀 中園
新 金子
洋平 河合
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キリンホールディングス株式会社
国立大学法人京都大学
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    • C07D471/12—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains three hetero rings
    • C07D471/18—Bridged systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D215/00—Heterocyclic compounds containing quinoline or hydrogenated quinoline ring systems
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    • C07D217/00—Heterocyclic compounds containing isoquinoline or hydrogenated isoquinoline ring systems
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/48—Regulators of apoptosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention provides a method for producing T cells or NK cells, a culture medium for T cells or NK cells, a method for culturing T cells or NK cells, a method for maintaining an undifferentiated state of undifferentiated T cells, and T cells or NK cells.
  • the present invention relates to a growth promoter.
  • T cells are one of the immune cells derived from hematopoietic stem cells. T cells express T cell receptor (TCR) on the cell surface and specifically recognize the HLA-peptide complex on target cells. In addition, T cells can proliferate with a proliferation signal via TCR. T cells are roughly classified into helper T cells (Th cells) and cytotoxic T cells (CTL), and they work in concert in the body.
  • TCR T cell receptor
  • Th cells helper T cells
  • CTL cytotoxic T cells
  • the immune response to tumors (anti-tumor immune response) consists mainly of CTLs that directly damage tumors and Th cells that enhance the function of CTLs.
  • dendritic cells (DC) have a role as a control tower that regulates the dynamics of other immune cells, and Th cells activate CTLs through activation of DCs and exert an antitumor effect. It is considered.
  • adoptive immunotherapy using CTLs specific for tumor-associated antigens that function as effector cells is also effective in suppressing regression, metastasis or recurrence of primary cancer.
  • it is a treatment method with less side effects on normal tissues.
  • T cells derived from pluripotent stem cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells are expected to lead to cellular immunotherapy that induces a strong antitumor immune response when administered in vivo. It is considered and is under development (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the methods described in Patent Document 1 and Non-Patent Document 1 are methods for producing iPS cells from antigen-specific CD8-positive CTL and inducing differentiation into CD8-positive CTL again.
  • T cells derived from pluripotent stem cells correlate with high persistence in vivo and response (Non-Patent Document 3), and the more undifferentiated T cells show the higher therapeutic effect (Non-patent document 3).
  • Patent Document 4 In the culture of T cells derived from pluripotent stem cells, cells derived from healthy donors are usually used as feeder cells, but there is a risk of contamination of unknown components at unknown concentrations, risk of infection, or cost. There is a problem and it is a problem in clinical application (Non-patent document 2).
  • NK cells account for about 10% of blood cells, and are one of the lymphoid cells that play an important role in the immune response. NK cells can perform various functions, but in particular, they have the ability to kill cancer cells or cells infected with pathogens or viruses that have invaded from the outside, and have become tumors or are becoming tumorous. It serves to remove abnormal cells.
  • NK cells also function as effector cells when antibody drugs recognize tumor cells and the like and exert antibody-dependent cellular cytotoxicity in the patient's body. Like T cells, NK cells can be given specificity by introducing a chimeric antigen receptor (CAR) or TCR, and can show specific cytotoxic activity to cancer cells and the like (Non-Patent Document 5). ..
  • NK cells as a therapeutic agent for cancer or infectious diseases as described above, the number of NK cells present in the patient's body is not large. Therefore, there is a demand for a technique capable of mass-producing NK cells while maintaining sufficient efficacy for use in therapeutic applications.
  • NK cells are incapable of large scale growth and culture in vitro as compared to T cells, and therefore much research has been done into techniques for expanding and culturing NK cells to therapeutically useful levels. ..
  • NK cells For example, regarding the culture of NK cells, OKT-3 antibody that stimulates IL-21, LPS (non-patent document 6) or CD3 as well as IL-2 that has been used for T cell proliferation/activity (non-patent document 7). ) Have been studied for proliferation or activation methods. However, these merely find new proliferative substances in the form of variations and developments of the conventionally used IL-2.
  • Non-patent Document 8 a method for culturing NK cells in which IL-12, IL-15 or IL-18 is combined has been developed.
  • a method of using autologous or allogeneic feeder cells for culturing NK cells has also been developed.
  • a breakthrough NK cell proliferation method using a low-molecular compound or the like which is excellent in terms of quality control, safety, cost, etc., has not yet been found.
  • Bisbenzylisoquinoline alkaloids are low-molecular compounds derived from naturally occurring medicinal materials.
  • the bisbenzylisoquinoline alkaloids for example berbamine and the like are used as clinical medicines.
  • Berbamine is one of the components of the cepharanthin preparation, and is known to have a cytostatic effect on cancer cells and exhibit an antitumor effect (Non-Patent Document 9). Berbamine also stimulates myeloid cell proliferation, improves levels of hematopoietic stem cell colony stimulating factor (GCSF), promotes proliferation of myeloid hematopoietic stem cells and myeloid progenitor cells and their differentiation into granulocytes and leukocyte proliferation. It is known to have an effect (Patent Document 2).
  • GCSF hematopoietic stem cell colony stimulating factor
  • the present invention provides a method for producing T cells or NK cells, a medium for culturing T cells or NK cells, capable of efficiently proliferating T cells or NK cells and maintaining the state of the cells (for example, undifferentiated).
  • a method for culturing T cells, a method for maintaining an undifferentiated state of undifferentiated T cells, and an agent for promoting the proliferation of T cells or NK cells are examples of T cells or NK cells.
  • a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or (X-2) or a compound in which one ether bond is cleaved, or a compound thereof It was found that a pharmaceutically acceptable salt has an excellent growth promoting effect on T cells or NK cells and an effect of maintaining the state (for example, undifferentiated state) of the cells, and completed the present invention.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3 , R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 and R′ 7 are each independently H, acyl, or a linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, N Or it may be interrupted by an S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • n 1 and n 3 are each independently an integer of 0 to 3
  • n 2 and n 4 are each independently an integer of 0 to 4, and these may be bonded to each other to form a ring.
  • T cells are undifferentiated T cells. 5.
  • the T cell is 1 selected from the group consisting of helper T cells, regulatory T cells, cytotoxic T cells, naive T cells, memory T cells and terminal effector T cells The manufacturing method described. 7.
  • the regulatory T cell expresses FoxP3.
  • the memory T cell is a stem cell memory T cell, a central memory T cell or an effector memory T cell. 9. 4.
  • the bisbenzylisoquinoline alkaloid, the compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is selected from berbamine, (+)-berbamine, E6-berbamine, cepharanthin and a pharmaceutically acceptable salt thereof. 10.
  • 11. 11 The production method according to any one of 1 to 10 above, wherein the concentration of the bisbenzylisoquinoline alkaloid, the compound in which one ether bond is cleaved, or the pharmaceutically acceptable salt thereof is 0.1 nM to 10 ⁇ M in the medium.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3, R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 , and R′ 7 are each independently H, acyl, or a straight-chain or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, Optionally interrupted with an N or S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3, R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 , and R′ 7 are each independently H, acyl, or a straight-chain or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, Optionally interrupted with an N or S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • n 1 and n 3 are each independently an integer of 0 to 3
  • n 2 and n 4 are each independently an integer of 0 to 4, and these may be bonded to each other to form a ring.
  • the bisbenzylisoquinoline alkaloid, the compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is selected from berbamine, (+)-berbamine, E6-berbamine and cepharanthin and pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3, R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 , and R′ 7 are each independently H, acyl, or a straight-chain or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, Optionally interrupted with an N or S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • n 1 and n 3 are each independently an integer of 0 to 3
  • n 2 and n 4 are each independently an integer of 0 to 4, and these may be bonded to each other to form a ring.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3, R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 , or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 and R′ 7 are each independently H, acyl, or a linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, Optionally interrupted with an N or S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • n 1 and n 3 are each independently an integer of 0 to 3
  • n 2 and n 4 are each independently an integer of 0 to 4, and these may be bonded to each other to form a ring.
  • a method for producing T cells or NK cells which comprises culturing T cells or NK cells in a medium containing a CaMKII inhibitor. 29. 28.
  • the CaMKII inhibitor is a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the following formula (X-1) or (X-2), a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Manufacturing method.
  • R 1 and R′ 1 are each independently H or linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms
  • R 2 , R′ 2 , R 3, R′ 3 , R 4, R′ 4 , R 5 and R′ 5 are each independently H, acyl, a straight chain containing 1 to 10 carbon atoms, or Branched alkyl, which may be interrupted by O, N or S heteroatoms, or R 2 and R 3 , R 4 and R 5 , R′ 2 and R′ 3 or R′.
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 , and R′ 7 are each independently H, acyl, or a straight-chain or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, Optionally interrupted with an N or S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • n 1 and n 3 are each independently an integer of 0 to 3
  • n 2 and n 4 are each independently an integer of 0 to 4, and these may be bonded to each other to form a ring.
  • T in the presence of a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or formula (X-2) or a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or formula (X-2) or a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • FIG. 1 shows a schematic diagram of the procedure for inducing differentiation of iPS cells.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the procedure for expanding iPS-T cells.
  • FIG. 3A shows a schematic diagram of the procedure of immunophenotyping using T-iPS-T cells.
  • FIG. 3B shows the results of immunophenotyping using T-iPS-T cells.
  • FIG. 4(A) shows a schematic diagram of the procedure of the immunophenotyping test using T-iPS-T cells, and FIG. 4(B) shows the result.
  • FIGS. 5(A) to (C) show a scheme of screening for low molecular weight compounds that improve the proliferation efficiency of T-iPS-T cells under feeder-free culture conditions.
  • FIG. 5(A) to (C) show a scheme of screening for low molecular weight compounds that improve the proliferation efficiency of T-iPS-T cells under feeder-free culture conditions.
  • FIG. 5(A) to (C) show a scheme of screening for low mole
  • FIG. 6 shows the results of screening a low-molecular compound that promotes the proliferation of T-iPS-T cells under feeder-free culture conditions, using the number of viable cells as an index.
  • FIG. 7 shows the results of screening low molecular weight compounds that promote cell proliferation while maintaining the undifferentiated state of undifferentiated T cells under feeder-free culture conditions.
  • FIG. 8 shows the results of evaluation of the concentration dependence of berbamine and its derivatives on the number of viable cells under feeder-free culture conditions.
  • FIG. 9 shows the results of concentration-dependent evaluation of berbamine and its derivatives on the number of undifferentiated cells under feeder-free culture conditions.
  • FIGS. 12(A) and 12(B) show the results of evaluating the effect of T-iPS-T cell in culture by comparing known compounds that contribute to the proliferation of memory T cells with berbamine.
  • FIG. 12(A) and 12(B) show the results of evaluating the effect of T-iPS-T cell in culture by comparing known compounds that contribute to the proliferation of memory T cells with berbamine.
  • FIG. 13 shows the results of examining the effect of berbamine in combination with a MAPK cascade inhibitor on the proliferation of memory T cells.
  • FIG. 14(A) shows an experimental scheme for evaluating feeder-free long-term culture of T-iPS-T cells by using berbamine, and FIG. 14(B) shows the result.
  • FIG. 15(A) shows an experimental scheme for evaluating feeder long-term culture of T-iPS-T cells by using berbamine, and FIG. 15(B) shows the result.
  • FIG. 16(A) shows an experimental scheme for evaluating the effect of berbamine on the proliferation of primary T cells (CD4T, CD8 T cells), and FIGS. 16(B) and 16(C) show the results.
  • the method for producing T cells or NK cells according to the present invention provides a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or (X-2), a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable compound thereof. Culturing T cells or NK cells in a medium containing a salt (hereinafter, also referred to as T cell or NK cell culture medium according to the present invention).
  • R 4 and R′ 5 together represent O or S
  • R 6 , R′ 6 , R 7 and R′ 7 are each independently H, acyl, or a linear or branched alkyl containing 1 to 10 carbon atoms, and said alkyl is O, N Or it may be interrupted by an S heteroatom, or R 6 and R 7 or R′ 6 and R′ 7 together represent O or S
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 may be the same or different, each of which is independently H, hydroxy, linear or branched containing 1 to 10 carbon atoms.
  • acyl refers to RC( ⁇ O)—, and R may be any of linear or branched alkyl, aryl or heterocycle containing 1 to 10 carbon atoms, which are Further, it may have a substituent.
  • acyl, acyloxy or sulfonyloxy or when X 1 , X 2 , X 3 or X 4 further has a substituent, the additional substituent is, for example, a direct substituent containing 1 to 10 carbon atoms. Examples thereof include linear or branched alkyl, aryl, heterocycle, halogen, amino, amine, nitro, hydroxy, or a substituent represented by the structural formula shown below.
  • Boc indicates tert-butoxycarbonyl.
  • the aryl or hetero ring may further have a linear or branched alkyl, halogen, amino, amine, nitro or hydroxy substituent containing 1 to 10 carbon atoms. ..
  • One of the two ether bonds in the above formula (X-1) or (X-2) may be cleaved.
  • quaternary N ion compounds are also included in the bisbenzylisoquinoline alkaloids of the present invention.
  • the quaternary N ion compound include compounds represented by the following formula (X-3) or (X-4).
  • R 1 to R 7 , R′ 1 to R′ 7 , X 1 to X 4 and n 1 to 4 in formula (X-3) or formula (X-4) are respectively represented by formula (X-1) and formula It is synonymous with (X-2).
  • R 8 and R′ 8 are each independently H or a linear or branched alkyl group containing 1 to 10 carbon atoms, or Aryl.
  • Examples of the bisbenzylisoquinoline alkaloids represented by the formulas (X-1) to (X-4) include compounds represented by the following formulas (I) to (V), respectively.
  • R 1 to R 8 , R′ 1 to R′ 7 , X 1 to X 4 and n 1 to 4 in formulas (I) to (V) are respectively represented by formulas (X-1) to (X- It is synonymous with 4).
  • the bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the above formula (X-1) or (X-2) or the compound in which one ether bond is cleaved in the present invention may be a hydrate.
  • bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (I) and a pharmaceutically acceptable salt thereof include berbamine, (+)-berbamine, berbamine dihydrochloride and E6-norbamine (E6-norberbamine). , Fanguquinoline, tetrandrine, isotetrandrin, cocsoline and the like.
  • bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (I) also include berbamine derivatives BBMD1 to BBMD13 represented by the following structural formulas.
  • BBMD1 The structural formula of BBMD1 is shown below.
  • BBMD2 The structural formula of BBMD2 is shown below.
  • BBMD3 The structural formula of BBMD3 is shown below.
  • BBMD4 The structural formula of BBMD4 is shown below.
  • BBMD5 The structural formula of BBMD5 is shown below.
  • BBMD6 The structural formula of BBMD6 is shown below.
  • BBMD7 The structural formula of BBMD7 is shown below.
  • BBMD8 The structural formula of BBMD8 is shown below.
  • BBMD10 The structural formula of BBMD10 is shown below.
  • BBMD11 The structural formula of BBMD11 is shown below.
  • BBMD12 The structural formula of BBMD12 is shown below.
  • BBMD13 The structural formula of BBMD13 is shown below.
  • cepharanthin The structural formula of cepharanthin is shown below.
  • bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (III) include 2-norberbamine.
  • bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (IV) include cicleuanine.
  • bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (V) include tubocurarine and tuboclarin chloride pentahydrate (curare pentahydrate).
  • the structural formula of tuboclavine chloride pentahydrate is shown below.
  • Specific examples of the compound represented by the formula (VI) include dauricin, magnoline and daurisolin.
  • daurisolin The structural formula of daurisolin is shown below.
  • the present invention also provides a method for producing T cells or NK cells, which comprises culturing T cells or NK cells in a medium containing a Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) inhibitor, and a CaMKII inhibitor.
  • a medium for culturing T cells or NK cells a method for maintaining an undifferentiated state of undifferentiated T cells, which comprises culturing T cells or NK cells in a medium containing a CaMKII inhibitor, and a CaMKII inhibitor as an active ingredient
  • a T cell or NK cell proliferation promoter containing the same is also provided.
  • CaMKII is a protein kinase that is activated by the Ca 2+ and Ca 2+ binding protein calmodulin.
  • the CaMKII inhibitor include bisbenzylisoquinoline alkaloids represented by the above formula (X-1) or (X-2), a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and Peptides derived from the sequence of the autophosphorylation site present in the regulatory domain, AIP (Autocamtide 2 Related Inhibitory Peptide), Staurosporine, Fasudil, Monohydrochlolide, Salt, 1-Naphthyl L52, Nylthyl 52K, PP1, K2, PP2 (S)-HPETE, K-252b, HA-1077 dihydrochloride, Arcyriaflavin A and the like can be mentioned.
  • the CaMKII inhibitor may be a compound alone or a composition or mixture such as a plant extract. Further, the CaMKII inhibitor may be
  • a method of inhibiting the CaMKII gene family such as siRNA targeting the CaMKII gene family is also included in the CaMKII inhibitor of the present invention.
  • the genomic DNA of stem cells, T cells or NK cells may be altered by gene targeting, genome editing, etc. May be.
  • Examples of gene targeting include a method of introducing a targeting vector into a known pluripotent stem cell to cause homologous recombination.
  • the gene editing is not particularly limited, and examples thereof include known Zinc Finger Nuclease, Transcription Activator-like Effector Nuclease (TALEN), and CRISPR/Cas9.
  • Cytotoxic T cells are CD8-positive cells and, like helper T cells, are classified into Tc1 cells, Tc2 cells, etc. by the cytokines that are further expressed.
  • Tc1 cells include cells expressing IFN- ⁇ , IL-2, TNF- ⁇ and the like.
  • Tc2 cells include cells expressing IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13 and the like.
  • central memory T cells examples include CD4(+)CD45RA( ⁇ )CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) cells, CD8(+)CD45RA( ⁇ )CD62L(+)CCR7(+)CD95(+) ) Cells, CD4(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells or CD8(+)CCR7(+)CD45RA(-)CD45RO(+) cells.
  • the method of inducing T cells from pluripotent stem cells can be carried out using known methods. Specifically, for example, the method described in WO 2016/076415 as a method for producing CD8-positive cells and the method described in WO 2017/221975 as a method for producing CD4 CD8 both-positive T cells can be mentioned.
  • the pluripotent stem cells are preferably of mammalian origin, more preferably of human origin.
  • lymphocytes preferably T cells that have undergone TCR gene rearrangement are preferable.
  • lymphocytes are used as somatic cells, it is preferable that the lymphocytes are stimulated and activated by anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody in the presence of cytokine such as IL-2 prior to the step of reprogramming.
  • the T cells in the present invention are not particularly limited, but may be peripheral blood-derived T cells. Further, the T cells into which CAR or TCR is introduced may be T cells in peripheral blood. Peripheral blood is derived from healthy individuals such as the patient himself/herself, related donors and unrelated donors.
  • NK cells Any NK cell can be used as the NK cell in the present invention.
  • the NK cell donor (donor) and the NK cell donor (recipient) are preferably of the same species.
  • the donor is human
  • the recipient is human. It is more preferable that the NK cell donor and the NK cell recipient be the same individual.
  • the donor is Donor X
  • the recipient is Donor X.
  • Examples include 1 nM to 10 nM, 1 nM to 3 ⁇ M, 1 nM to 10 nM, 10 nM to 100 nM, 100 nM to 1 ⁇ M, 1 nM to 1 ⁇ M, and the like.
  • the bisbenzylisoquinoline alkaloids represented by the formula (X-1) or the formula (X-2) and pharmaceutically acceptable salts thereof are derived from berbamine, (+)-berbamine, berbamine dihydrochloride, E6-berbamine and cepharanthin. When it is at least 1 selected, it is preferably 0.1 nM to 10 ⁇ M.
  • the culture medium for culturing T cells or NK cells according to the present invention is a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or formula (X-2), a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable compound thereof.
  • a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by formula (X-1) or formula (X-2) a compound in which one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable compound thereof.
  • an acceptable salt it is possible to promote cell growth while maintaining the state (eg, undifferentiated state) of the cells, and thus feeder cells may not be included.
  • feeder cells By not including feeder cells in the medium, the risk of infection derived from feeder cells can be reduced, and the stability of production can be improved, resulting in cost reduction.
  • the cell-supporting substrate examples include collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin or a partial structure of laminin, fibronectin or a mixture thereof, and specifically, Matrigel Alternatively, lysed cell membrane preparations and the like can be mentioned (for example, Lancet, 365, 9471, 1636-1641, 2005).
  • the culture density of T cells or NK cells is not particularly limited as long as it is a density that can achieve the effect of promoting survival and proliferation of cells.
  • the cell composition containing T cells or NK cells obtained by the method for producing T cells or NK cells according to the present invention can be used as a cell source for regenerative medicine or the like.
  • the cell composition may be a composition containing dispersed T cells or NK cells such as small cell clusters.
  • the T cell or NK cell proliferation-promoting agent according to the present invention (hereinafter, also referred to as the proliferation-promoting agent according to the present invention) is a bisbenzylisoquinoline alkaloid represented by the formula (X-1) or the formula (X-2), or The compound is characterized in that one ether bond is cleaved, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the content is such that, for example, when the growth promoting agent according to the present invention is added to the medium, the concentration of the compound in the medium is contained in a concentration sufficient to promote the proliferation of T cells or NK cells. It is preferably configured.
  • Example 1 Induction of iPS cell differentiation Induction of T cells from iPS cells was performed by modifying the method described in Non-Patent Document 1. A schematic diagram of the procedure for inducing differentiation of iPS cells in Example 1 is shown in FIG.
  • the iPS cells were treated with a dissociation agent [CaCl 2 (Nacalai tesque), KSR (Life Technologies) and trypsin (Life Technologies)-added D-PBS] to recover iPS cell colonies.
  • the colonies were seeded on 10T1/2 cells, and Sac medium [IMDM (Sigma), 15% FBS, 1% PSG, Insulin, Transferrin, Selenium Solution (ITS-G, 1 ⁇ , GIbco), monothioglycerol (MTG, Nacalai tesque), L(+)-ascorbic acid (PAA, 50 ⁇ g/mL, Nacalai tesque, 03420-52), VEGF (R&D Systems, 20 ng/ml)] at 37° C., 5% O 2 , 5% CO 2.
  • the cells were cultured under 2 (Day 0).
  • the Sac medium was replaced with Day4.
  • the medium was replaced with Sac medium to which SCF (R&D Systems, 30 ng/ml) and Flt3 (Peprotech, 10 ng/ml) were added at Day 7, 10 and 12, respectively, and 20% O 2 , 5% CO 2 at 37° C. Cultured under.
  • T cells were induced by co-culturing HPC with OP9-DL1 cells.
  • OP9-DL1 cells were maintained in alpha-MEM medium (Life technologies) supplemented with 15% FBS and 1% PSG. Sac 14 days after the initiation of differentiation induction was collected with the tip of a pipette, and after pipetting, passed through a cell strainer to collect the flow-through.
  • CD8beta-PE Bacillus subtilis
  • CD5-PECy7 ThermoFisher
  • CD1a-FITC ThermoFisher
  • CD336-APC Biolegend
  • FIG. 3A shows a schematic diagram of the procedure in which immunophenotyping was performed using T-iPS-T cells that were once expanded, and FIG. 3 shows the result.
  • CD95 and CD45RA were 100% positive.
  • partial expression of CD5, CD27, CCR7 and CD45RO was observed.
  • Example 7 Comparison with PBMC feeder Using T-iPS-T cells, the same stimulation method as in Example 2 using the PBMC feeder, the same stimulation method as in Example 4 using CD3/CD28 Dynabeads, or CD3/ The cells were cultured using the same stimulation method as in Example 4 in which 1 ⁇ M of berbamine (SIGMA, 547190) was added to CD28 Dynabeads, and the growth promoting effects were compared.
  • the PBMC feeder cells were labeled with CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit-For Flow Cytometry (CFSE, Invitrogen, 100 nM) in order to discriminate them from T-iPS-T cells, followed by irradiation treatment.
  • CFSE Cell Proliferation Kit-For Flow Cytometry
  • FIGS. 10(A) and 10(B) The results of staining and measurement performed in the same manner as in Example 5 are shown in FIGS. 10(A) and 10(B).
  • FIGS. 10(A) and (B) by culturing in the presence of berbamine, a significant increase in the number of viable cells was observed as compared with the presence of feeder cells, and the number of undifferentiated cells was the same. The result was. From the above, it can be said that the present invention can replace PBMC which has been conventionally used for the proliferation of T cells.
  • Non-Patent Document 1 the method using human normal human-derived PBMC shown in Examples 2 and 7 as a feeder has been used.
  • Non-Patent Document 1 the addition of berbamine made it possible to proliferate T cells for a long period of time without using PBMC, and it was confirmed that cell proliferation was further enhanced.
  • FIG. 18B shows the gating at the time of sorting
  • FIG. 18C shows the result of the cell count.

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Abstract

本発明は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を効率的に増殖させ、且つ該細胞の状態（例えば未分化性）を維持し得る、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤を提供することを目的とする。 本発明は、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含むＴ細胞又はＮＫ細胞の製造方法等に関する。

Description

Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤
　本発明は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤に関する。
　Ｔ細胞は造血幹細胞に由来する免疫細胞の一つである。Ｔ細胞は、細胞表面にＴ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＣＲ）を発現し、標的細胞上のＨＬＡ－ペプチド複合体を特異的に認識する。また、Ｔ細胞はＴＣＲを介した増殖シグナルにより、増殖することが出来る。Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞（Ｔｈ細胞）と細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）に大別され、体内において協調して働いている。
　腫瘍に対する免疫応答（抗腫瘍免疫応答）は、主に直接的に腫瘍を傷害するＣＴＬと、ＣＴＬの機能を増強するＴｈ細胞によって成り立っている。一方、樹状細胞（ＤＣ）は、他の免疫細胞の動態を調整する司令塔としての役割を持ち、Ｔｈ細胞はＤＣの活性化を介してＣＴＬを活性化し、抗腫瘍効果を発揮していると考えられている。
　抗腫瘍免疫応答を用いた癌の治療方法において、エフェクター細胞として機能する腫瘍関連抗原に特異的なＣＴＬ等を用いた養子免疫療法は、原発癌の退縮、転移又は再発の抑制にも効果を発揮し、且つ正常組織への副作用の少ない治療方法である。
　養子免疫療法の中でも、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞等の多能性幹細胞から誘導したＴ細胞は、これを生体内に投与して強い抗腫瘍免疫応答を惹起する細胞免疫療法につながると考えられ、開発が進められている（特許文献１、非特許文献１）。例えば、特許文献１及び非特許文献１に記載の方法は、抗原特異的なＣＤ８陽性ＣＴＬからｉＰＳ細胞を作り、再びＣＤ８陽性ＣＴＬに分化誘導する方法である。
　多能性幹細胞から誘導したＴ細胞は、生体内における持続性の高さとレスポンスとが相関しており（非特許文献３）、Ｔ細胞がより未分化状態であるほど高い治療効果を示す（非特許文献４）。
　しかし、多能性幹細胞から誘導したＴ細胞の培養において、通常、健常人ドナー等の由来の細胞がフィーダー細胞として用いられるが、未知成分の未知濃度における混入のおそれ、感染の危険性又はコストの問題があり、臨床応用における課題となっている（非特許文献２）。
　ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、血球細胞の約１０％程度を占めており、免疫反応において重要な役割をするリンパ球系細胞の一つである。ＮＫ細胞は、様々な機能を果たすことが出来るが、特に、癌細胞又は外部から侵入した病原菌若しくはウイルスに感染された細胞等を殺す能力を有し、腫瘍化している又は腫瘍化が進んでいる異常細胞を除去する役割をする。
　また、ＮＫ細胞は、抗体医薬品が腫瘍細胞等を認識し、患者体内で抗体依存的細胞傷害活性を発揮する際のエフェクター細胞としても機能する。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞同様に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又はＴＣＲを導入することで特異性を付与し、癌細胞等に特異的な細胞傷害活性を示すことが出来る（非特許文献５）。
　上記のような癌又は感染性疾患の治療剤としてのＮＫ細胞の可能性にも関わらず、患者体内に存在するＮＫ細胞の数は多くはない。そのため、ＮＫ細胞を治療用途に使用出来る程度の十分な効能を保持しながらも、大量に生産することが出来る技術が求められている。
　しかし、Ｔ細胞と比較してＮＫ細胞は、インビトロでの大量増殖及び培養ができず、したがって、ＮＫ細胞を治療に有用な水準に増幅及び培養するための技術に対する多くの研究が行われている。
　例えば、ＮＫ細胞の培養に関して、Ｔ細胞増殖／活性に用いられていたＩＬ－２だけでなく、ＩＬ－２１、ＬＰＳ（非特許文献６）又はＣＤ３を刺激するＯＫＴ－３抗体（非特許文献７）を用いる増殖又は活性化方法の研究が行われてきた。しかし、これらは、従来から用いられてきたＩＬ－２の使用の変形及び発展の形態で新たな増殖物質を見出したものにすぎない。
　更に、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５又はＩＬ－１８を組み合わせたＮＫ細胞の培養方法も開発されている（非特許文献８）。また、ＮＫ細胞の培養に自家又は同種のフィーダー細胞を用いる方法も開発されている。
　しかし、依然として品質管理、安全性又はコスト等の面で優れた低分子化合物等を用いた画期的なＮＫ細胞の増殖方法は見いだされていない。
　ビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、天然に存在する薬効材料に由来する低分子化合物である。ビスベンジルイソキノリンアルカロイドのうち、例えばベルバミン等が臨床用医薬として用いられている。
　ベルバミンはセファランチン製剤の成分の一つであり、癌細胞に対する細胞増殖抑制作用を有し、抗腫瘍効果を示すことが知られている（非特許文献９）。また、ベルバミンは、骨髄性細胞増殖の刺激、造血幹細胞コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）のレベルの改善、骨髄造血幹細胞及び骨髄性前駆細胞の増殖並びにその顆粒球への分化の促進及び白血球の増殖の促進効果を有することが知られている（特許文献２）。
国際公開第２０１１／０９６４８２号 日本国特表２０１３－５３７１７１号公報
Nishimura T, et al., Cell Stem Cell. 12(1): 114-126, 2013 Takayama N, et al., Journal of Experimental Medicine, 207(13): 2817-2830, 2010 Porter et al., Science Translational Medicine. 7(303): 303ra139, 2015 Nicholas P. Restifo, Blood. 124(4): 476-477, 2014 Li Y, et al., Cell Stem Cell, 23(2): 181-192,2018 J.Immunol., 165(1): 139-147,2000 Experimental Hematol.,29(1): 104-113,2001 Front. Immunol., 8(458): 1-18, 2017 Ying Gu et al., Blood, 120(24): 4829-4839, 2012
　上述の通り、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を治療用途に使用出来る程度の十分な効能を保持しながらも、大量に生産することが出来る技術が求められている。しかし、上記の公知の方法は、従来から用いられてきたＩＬ－２等の使用の変形及び発展の形態にすぎず、未だに治療に適用可能な水準となる画期的な増殖又は活性化方法は見いだされていない。一方、ベルバミン等のビスベンジルイソキノリンアルカロイドによるＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進効果及び該細胞の状態（例えば未分化性）の維持効果については、これまで何ら知られていない。
　本発明は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を効率的に増殖させ、且つ該細胞の状態（例えば未分化性）を維持し得る、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地、Ｔ細胞培養方法、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に対する優れた増殖促進効果及び該細胞の状態（例えば、未分化性）の維持効果を有することを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の発明を提供するものである。
１．下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含む、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
２．前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が免疫細胞療法用のＴ細胞又はＮＫ細胞である、前記１に記載の製造方法。
３．前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記１又は２に記載の製造方法。
４．前記Ｔ細胞が未分化Ｔ細胞である、前記１～３のいずれか１に記載の製造方法。
５．前記Ｔ細胞がＣＤ４及びＣＤ８の少なくとも一方を発現している、前記１～４のいずれか１に記載の製造方法。
６．前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞及びターミナルエフェクターＴ細胞からなる群から選ばれる１である前記１～５のいずれか１に記載の製造方法。
７．前記制御性Ｔ細胞がＦｏｘＰ３を発現している、前記６に記載の製造方法。
８．前記メモリーＴ細胞がステムセルメモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞又はエフェクターメモリーＴ細胞である、前記６に記載の製造方法。
９．前記ＮＫ細胞が未成熟ＮＫ細胞又は成熟ＮＫ細胞である、前記１～３のいずれか１に記載の製造方法。
１０．前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン、セファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である前記１～９のいずれか１に記載の製造方法。
１１．前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである前記１～１０のいずれか１に記載の製造方法。
１２．前記培地が更にＭＡＰＫカスケード阻害剤を含有する、前記１～１１のいずれか１に記載の製造方法。
１３．前記培地中にフィーダー細胞を含有しない、前記１～１２のいずれか１に記載の製造方法。
１４．前記培養する期間が５０日間以上である、前記１～１３のいずれか１に記載の製造方法。
１５．前記１～１４のいずれか１に記載の製造方法により製造されるＴ細胞又はＮＫ細胞。
１６．前記１５に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞を含有する免疫細胞療法剤。
１７．下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞培養用の培地。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
１８．前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記１７に記載の培地。
１９．前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である前記１７又は１８に記載の培地。
２０．前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである前記１７～１９のいずれか１に記載の培地。
２１．更にＭＡＰＫカスケード阻害剤を含有する前記１７～２０のいずれか１に記載の培地。
２２．下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
２３．前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、前記２２に記載の培養方法。
２４．前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である、前記２２又は２３に記載の培養方法。
２５．前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである前記２２～２４のいずれか１に記載の培養方法。
２６．下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中で未分化Ｔ細胞を培養することを含む、前記未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
２７．下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
２８．ＣａＭＫＩＩ阻害剤を含有する培地でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含む、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法。
２９．ＣａＭＫＩＩ阻害剤が下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩である前記２８に記載の製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
　本発明によれば、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の存在下でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することにより、該細胞の状態（例えば未分化性）を維持しながら、効率的に増殖させることが出来る。従って、本発明によれば、より安全且つ低コストで、優れた生体持続性を示すＴ細胞又はＮＫ細胞を生産することが出来る、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法及びＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤が提供される。
図１は、ｉＰＳ細胞の分化誘導の手順の模式図を示す。 図２は、ｉＰＳ－Ｔ細胞を増殖させる手順の模式図を示す。 図３ＡはＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用いた免疫表現型検査の手順の模式図を示す。 図３ＢはＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用いた免疫表現型検査の結果を示す。 図４（Ａ）はＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用いた免疫表現型検査の手順の模式図を示し、図４（Ｂ）はその結果を示す。 図５（Ａ）～（Ｃ）は、フィーダーフリー培養条件下において、Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の増殖効率を改善させる低分子化合物のスクリーニングのスキームを示す。 図６は、フィーダーフリー培養条件下においてＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の増殖を促進する低分子化合物を、生細胞数を指標としてスクリーニングした結果を示す。 図７は、フィーダーフリー培養条件下において未分化なＴ細胞の未分化性を維持しながら細胞増殖を促進する低分子化合物をスクリーニングした結果を示す。 図８は、フィーダーフリー培養条件下における、ベルバミン及びその誘導体の生細胞数に対する濃度依存性評価の結果を示す。 図９は、フィーダーフリー培養条件下における、ベルバミン及びその誘導体の未分化細胞数に対する濃度依存性評価の結果を示す。 図１０（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用い、ＰＢＭＣフィーダーを用いた刺激方法、ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いた刺激方法、及びＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓにベルバミン１μＭを加えた刺激方法の３方法を比較した結果を示す。 図１１は、フィーダーフリー培養条件において、低分子化合物によるＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の増殖への影響を、生細胞数を指標として解析した結果を示す。 図１２（Ａ）及び（Ｂ）は、Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の培養における影響を、メモリーＴ細胞の増殖に寄与する既知化合物とベルバミンとを比較して評価した結果を示す。 図１３は、ベルバミンとＭＡＰＫカスケード阻害剤との併用によるメモリーＴ細胞の増殖への効果を検討した結果を示す。 図１４（Ａ）は、ベルバミンを用いることによるＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞のフィーダーフリー長期培養を評価した実験スキームを示し、図１４（Ｂ）はその結果を示す。 図１５（Ａ）は、ベルバミンを用いることによるＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞のフィーダー長期培養を評価した実験スキームを示し、図１５（Ｂ）はその結果を示す。 図１６（Ａ）はベルバミンが初代Ｔ細胞（ＣＤ４Ｔ、ＣＤ８Ｔ細胞）の増殖に与える影響を評価した実験スキームを示し、図１６（Ｂ）及び（Ｃ）はその結果を示す。 図１７（Ａ）及び（Ｂ）は、ベルバミンの制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖における有用性を検証した結果を示す。 図１８ＡはＴ細胞の階層性を示す模式図である。 図１８Ｂは、ベルバミンがＴ細胞内で作用する分画を検証した結果であり、ソート時のゲーティングを示す。 図１８Ｃは、ベルバミンがＴ細胞内で作用する分画を検証した結果であり、セルカウントを示す。 図１９（Ａ）はベルバミンと培養した細胞がマウスへの生着に及ぼす影響を検討した実験スキームを示し、図１９（Ｂ）はその結果を示す。 図２０（Ａ）はＮＫ細胞に対するベルバミンの作用を検討した実験スキームを示し、図２０（Ｂ）及び（Ｃ）はその結果を示す。図２０（Ｂ）はＮＫ細胞精製前後のＦＡＣＳプロットを示す。図２０（Ｃ）は培養後の細胞数を示す。
［Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法］
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の製造方法は、式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地（以下、本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地ともいう）中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養する工程を含む。
［式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド］
　本発明における下記式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物について説明する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
　式（Ｘ－１）及び（Ｘ－２）中、
　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。
　本発明において、アシルとはＲＣ（＝Ｏ）－を指し、Ｒは１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アリール又はヘテロ環のいずれであってもよく、これらは更に置換基を有していてもよい。
　本発明において、アシルオキシとはＲＣ（＝Ｏ）Ｏ－を指し、Ｒは上述と同様である。
　本発明において、スルホニルオキシとはＲＳ（＝Ｏ）２Ｏ－を指し、Ｒは上述と同様である。
　本発明において、アシル、アシルオキシ若しくはスルホニルオキシ、又はＸ１、Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ４が更に置換基を有する場合の更なる置換基としては、例えば、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アリール、ヘテロ環、ハロゲン、アミノ、アミン、ニトロ、ヒドロキシ又は下記に示す構造式で表される置換基等が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　Ｂｏｃとはｔｅｒｔ－ｂｕｔｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌを示す。また、これらのうち、アリール又はヘテロ環は、更に１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、ハロゲン、アミノ、アミン、ニトロ又はヒドロキシ等の置換基を有してもよい。
　上記式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）における２ヶ所のエーテル結合のうち一方は、切断されていてもよい。
　また、上記式（Ｘ－１）又は（Ｘ－２）において、イソキノリン骨格に含まれる１又は２の３級のＮに更に１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル又はアリールが修飾された４級のＮイオンの化合物も本発明のビスベンジルイソキノリンアルカロイドに含まれる。４級のＮイオンの化合物として、例えば下記式（Ｘ－３）又は（Ｘ－４）等で示される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　式（Ｘ－３）又は式（Ｘ－４）におけるＲ１～Ｒ７、Ｒ’１～Ｒ’７、Ｘ１～Ｘ４及びｎ１～４は、それぞれ、式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）と同義である。また、式（Ｘ－３）及び式（Ｘ－４）中、Ｒ８及びＲ’８は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル又はアリールである。
　式（Ｘ－１）～式（Ｘ－４）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、例えば、以下の式（Ｉ）～式（Ｖ）で表される化合物がそれぞれ挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　式（Ｉ）～式（Ｖ）におけるＲ１～Ｒ８、Ｒ’１～Ｒ’７、Ｘ１～Ｘ４及びｎ１～４は、それぞれ、は式（Ｘ－１）～式（Ｘ－４）と同義である。
　式（Ｘ－１）～式（Ｘ－４）における１つのエーテル結合が切断した化合物としては、例えば、式（ＩＩＩ）における１つのエーテル結合が切断した化合物である下記式（ＶＩ）で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
　式（ＶＩ）中、Ｒ１～Ｒ７、Ｒ’１～Ｒ’７、Ｘ１～Ｘ４及びｎ１～４は、それぞれ、は式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）と同義でありＲ９及びＲ１０は、それぞれ独立に、Ｈ、ヒドロキシ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルコキシである。
　本発明における上記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物には、いかなる立体異性体、光学異性体又はこれらの混合物が含まれる。例えば、イソキノリン環上の４級炭素であるＣ（１）及びＣ（１’）が、それぞれ、ＲＲ、ＳＳ、１Ｓ１’Ｒ又は１Ｒ１’Ｓから選択される立体異性配置を有する化合物が挙げられる。
　本発明における上記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物は水和物であってもよい。
　また、本発明における上記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物の薬学的に許容される塩としては、無機塩又は有機酸塩等が挙げられる。無機塩としては、限定されないが、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩又はヨウ化水素酸塩等が挙げられる。有機酸塩としては、限定されないが、例えば、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α－ケトグルタル酸塩又はα－グリセロリン酸塩等が挙げられる。
　式（Ｉ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びその薬学的に許容される塩としては、具体的には、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、ベルバミン二塩酸塩、Ｅ６－ベルバミン（Ｅ６－ｎｏｒｂｅｒｂａｍｉｎｅ）、ファングキノリン、テトランドリン、イソテトランドリン又はｃｏｃｓｏｌｉｎｅ等が挙げられる。
　ベルバミンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　（＋）－ベルバミンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
　Ｅ６－ベルバミンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　ファングキノリンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
　テトランドリンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　イソテトランドリンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
　Ｃｏｃｓｏｌｉｎｅの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　また、式（Ｉ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、具体的には、以下の構造式で表されるベルバミン誘導体であるＢＢＭＤ１～ＢＢＭＤ１３等も挙げられる。
　ＢＢＭＤ１の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
　ＢＢＭＤ２の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　ＢＢＭＤ３の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
　ＢＢＭＤ４の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　ＢＢＭＤ５の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
　ＢＢＭＤ６の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　ＢＢＭＤ７の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
　ＢＢＭＤ８の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　ＢＢＭＤ９の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
　ＢＢＭＤ１０の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　ＢＢＭＤ１１の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
　ＢＢＭＤ１２の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　ＢＢＭＤ１３の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
　式（ＩＩ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、具体的には、セファランチン、オキシアカンチン、タルルゴサミニン又はＣｏｃｓｏｌｉｎｅ等が挙げられる。
　セファランチンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　オキシアカンチンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
　タルルゴサミニンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　Ｃｏｃｓｏｌｉｎｅの構造式を下記に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
　式（ＩＩＩ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、具体的には、２－ノルベルバミン（２－ｎｏｒｂｅｒｂａｍｉｎｅ）等が挙げられる。
　２－ノルベルバミンの構造式を下記に記す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　式（ＩＶ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、具体的には、シクレアニン等が挙げられる。
　シクレアニンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
　式（Ｖ）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドとしては、具体的には、ツボクラリン、ツボクラリンクロリド五水和物（クラーレ五水和物）等が挙げられる。ツボクラリンクロリド五水和物の構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　式（ＶＩ）で表される化合物としては、具体的には、ダウリシン、マグノリン又はダウリソリン等が挙げられる。
　ダウリシンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
　マグノリンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　ダウリソリンの構造式を下記に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
　また、本発明は、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）阻害剤を含有する培地でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含むＴ細胞又はＮＫ細胞の製造方法、ＣａＭＫＩＩ阻害剤を含有するＴ細胞又はＮＫ細胞培養用の培地、ＣａＭＫＩＩ阻害剤を含有する培地でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含む未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法、ＣａＭＫＩＩ阻害剤を有効成分として含有するＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤も提供する。
　ＣａＭＫＩＩは、Ｃａ２＋及びＣａ２＋結合タンパク質であるカルモジュリンによって活性化されるタンパク質リン酸化酵素である。
　ＣａＭＫＩＩ阻害剤としては、上記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩のほか、その制御ドメインに存在している自己リン酸化部位の配列に由来するペプチドＡＩＰ（Ａｕｔｏｃａｍｔｉｄｅ　２　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　Ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ、Ｆａｓｕｄｉｌ，　Ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ　Ｓａｌｔ、１－Ｎａｐｈｔｈｙｌ　ＰＰ１、Ｋ－２５２ａ、ＫＮ－６２、Ｌａｖｅｎｄｕｓｔｉｎ　Ｃ、１２（Ｓ）－ＨＰＥＴＥ、Ｋ－２５２ｂ、ＨＡ－１０７７　ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ａｒｃｙｒｉａｆｌａｖｉｎ　Ａ等が挙げられる。ＣａＭＫＩＩ阻害剤は、化合物単体でもよく、植物抽出物のような組成物又は混合物でもよい。また、ＣａＭＫＩＩ阻害剤は、人工的に合成されたものであってもよく、天然物由来であってもよい。
　また、ＣａＭＫＩＩ遺伝子ファミリーを標的としたｓｉＲＮＡ等のＣａＭＫＩＩ遺伝子ファミリーを阻害する方法も本発明のＣａＭＫＩＩ阻害剤に含まれる。ＣａＭＫＩＩ遺伝子ファミリーを阻害する方法は、幹細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞のゲノムＤＮＡを遺伝子ターゲティング又はゲノム編集等により変化させてもよく、例えば、ｓｈＲＮＡ等を導入して恒久的に遺伝子発現のレベルを下げてもよい。遺伝子ターゲティングは、例えば、公知の多能性幹細胞にターゲティングベクターを導入して相同性組換えを起こす方法等が挙げられる。遺伝子編集としては、特に制限はなく、例えば、公知のＺｉｎｃ　Ｆｉｎｇｅｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　Ｅｆｆｅｃｔｏｒ　Ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ）又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等が挙げられる。
［Ｔ細胞］
　本発明におけるＴ細胞とは、表面にＴ細胞受容体（Ｔ　ｃｅｌｌ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＴＣＲ）と称される抗原受容体を発現している細胞を意味する。
　本発明におけるＴ細胞としては、特に制限されないが、ＣＤ３を発現しており、且つＣＤ４及びＣＤ８の少なくとも一方の分子を発現しているＴ細胞が好ましい。
　このようなＴ細胞としては、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ細胞又はターミナルエフェクターＴ細胞等が挙げられる。
　ヘルパーＴ細胞はＣＤ４陽性細胞であり、更に発現するサイトカインによりＴｈ１細胞、Ｔｈ２細胞及びＴｈ１７細胞等に分類される（例えば、J Allergy Clin. Immunol., 135(3): 626-635,2012）。
　Ｔｈ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０又はＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｈ１７細胞としては、例えば、ＩＬ－１７又はＩＬ－６等を発現する細胞等が挙げられる。
　細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ８陽性細胞であり、ヘルパーＴ細胞同様に、更に発現するサイトカインによりＴｃ１細胞及びＴｃ２細胞等に分類される。
　Ｔｃ１細胞としては、例えば、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２又はＴＮＦ－α等を発現する細胞等が挙げられる。Ｔｃ２細胞としては、例えば、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３等を発現する細胞等が挙げられる。
　制御性Ｔ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ＦｏｘＰ３（＋）細胞が好ましく挙げられる。
ナイーブＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
ステムセルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　セントラルメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ６２Ｌ（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ９５（＋）細胞、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　エフェクターメモリーＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）細胞等が好ましく挙げられる。
　ターミナルエフェクターＴ細胞としては、例えば、ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞又はＣＤ８（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ６２Ｌ（－）細胞等が好ましく挙げられる。
　本発明におけるＴ細胞は、未分化Ｔ細胞であることが好ましい。未分化Ｔ細胞としては、例えば、未分化度の高い順に、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリーＴ細胞及びセントラルメモリーＴ細胞が挙げられる。これらの中でも、細胞の未分化状態を維持して増殖性や生体持続性を向上する点から、ナイーブＴ細胞及びステムセルメモリーＴ細胞が特に好ましい。
　未分化性の高いＴ細胞は高い治療効果を示すことから、本発明におけるＴ細胞は、免疫細胞療法用Ｔ細胞であることが好ましい。
　Ｔ細胞が未分化状態を維持しているか否かを判定する方法としては、未分化マーカーの発現の検出及び／又は分化マーカーの発現の不検出により判定する方法、その他の各種マーカー（遺伝子やタンパク質）の発現の検出により判定する方法又は細胞の形態学的特徴を観察する方法等が挙げられる。例えば、ＣＣＲ７は末梢血の未分化マーカーとして用いられている（例えば、Nature Reviews Immunology, 18: 363-373, 2018）。
　本発明におけるＴ細胞は、多能性幹細胞由来のＴ細胞であることが好ましい。
　多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する方法は、公知の方法を用いて行うことが出来る。具体的には例えば、ＣＤ８陽性細胞の製造方法として国際公開第２０１６／０７６４１５号に記載の方法、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞の製造方法として国際公開第２０１７／２２１９７５号に記載の方法が挙げられる。
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、少なくとも本発明で使用される造血前駆細胞に誘導される任意の細胞が包含される。
　多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。
　多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（ＧＳ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞若しくは臍帯血由来の多能性幹細胞又は骨髄幹細胞由来の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）等が含まれる。本発明において、好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、ｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３若しくはＧｌｉｓ１等の遺伝子又は遺伝子産物が挙げられる。これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
　初期化因子の組み合わせとしては、国際公開第２００７／０６９６６６号、国際公開第２００８／１１８８２０号、国際公開第２００９／００７８５２号、国際公開第２００９／０３２１９４号、国際公開第２００９／０５８４１３号、国際公開第２００９／０５７８３１号、国際公開第２００９／０７５１１９号、国際公開第２００９／０７９００７号、国際公開第２００９／０９１６５９号、国際公開第２００９／１０１０８４号、国際公開第２００９／１０１４０７号、国際公開第２００９／１０２９８３号、国際公開第２００９／１１４９４９号、国際公開第２００９／１１７４３９号、国際公開第２００９／１２６２５０号、国際公開第２００９／１２６２５１号、国際公開第２００９／１２６６５５号、国際公開第２００９／１５７５９３号、国際公開第２０１０／００９０１５号、国際公開第２０１０／０３３９０６号、国際公開第２０１０／０３３９２０号、国際公開第２０１０／０４２８００号、国際公開第２０１０／０５０６２６号、国際公開第２０１０／０５６８３１号、国際公開第２０１０／０６８９５５号、国際公開第２０１０／０９８４１９号、国際公開第２０１０／１０２２６７号、国際公開第２０１０／１１１４０９号、国際公開第２０１０／１１１４２２号、国際公開第２０１０／１１５０５０号、国際公開第２０１０／１２４２９０号、国際公開第２０１０／１４７３９５号、国際公開第２０１０／１４７６１２号、Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol., 26: 795-797, 2008、Shi Y, et al., Cell Stem Cell, 2: 525-528, 2008、Eminli S, et al., Stem Cells. 26: 2467-2474, 2008、Huangfu D, et al., Nat. Biotechnol. 26: 1269-1275, 2008、Shi Y, et al., Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008、Zhao Y, et al., Cell Stem Cell, 3: 475-479, 2008、Marson A, , Cell Stem Cell, 3, 132-135, 2008、Feng B, et al., Nat. Cell Biol. 11: 197-203, 2009、R.L. Judson et al., Nat. Biotechnol., 27: 459-461, 2009、Lyssiotis CA, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 8912-8917, 2009、Kim JB, et al., Nature. 461:649-643, 2009、Ichida JK, et al., Cell Stem Cell. 5: 491-503, 2009、Heng JC, et al., Cell Stem Cell. 6: 167-74, 2010、Han J, et al., Nature. 463: 1096-100, 2010、Mali P, et al., Stem Cells. 28: 713-720, 2010又はMaekawa M, et al., Nature. 474: 225-9, 2011等に記載の組み合わせ等が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞を製造するのに用いられる体細胞としては、特に制限されないが、例えば、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、成熟した健全な若しくは疾患性の体細胞、初代培養細胞、継代細胞又は株化細胞等が挙げられる。
　前記体細胞としては、例えば、（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞若しくは歯髄幹細胞等の組織幹細胞（例えば、体性幹細胞）、（２）造血前駆細胞等の組織前駆細胞、又は（３）血液細胞（例えば、末梢血細胞若しくは臍帯血細胞等）、骨髄球、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（例えば、皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（例えば、膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞若しくは脂肪細胞等の分化した細胞等が挙げられる。前記体細胞としては、Ｔ細胞が好ましいが、Ｔ細胞以外の体細胞（非Ｔ細胞）を用いてもよい。
　体細胞としては、例えば、ＴＣＲの遺伝子再編成が行われたリンパ球（好ましくは、Ｔ細胞）が好ましい。体細胞としてリンパ球を用いる場合、初期化の工程に先立ち当該リンパ球をＩＬ－２等のサイトカイン存在下にて抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体によって刺激して活性化することが好ましい。
　前記刺激は、例えば、培地中に、ＩＬ－２等のサイトカイン、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ２８抗体を添加して前記リンパ球を一定期間培養することによって行うことが出来る。また、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体は磁性ビーズ等が結合されているものであってもよく、更にこれらの抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を表面に結合させた培養ディッシュ上で前記Ｔ細胞を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。更に、ヒトＴ細胞が認識する抗原ペプチドを培地中に添加することによって刺激を与えてもよい。
　本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。生産されるＴ細胞を輸血に使用する場合、輸血される患者とヒト白血球型抗原（ＨＬＡ）の型を適合させ易いという観点から、ｉＰＳ細胞の元となる体細胞は、輸血される対象から単離されることが好ましい。
　ｉＰＳ細胞として既存の細胞株を用いてもよい。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株として、２５３Ｇ１株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００２）、２０１Ｂ７株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００６３）、４０９Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７６）、４５４Ｅ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００７７）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００３）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０００９）、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ００２９）又はＮｉｐｓ－Ｂ２株（理研セルバンクＮｏ．ＨＰＳ０２２３）等が挙げられる。
　ｉＰＳ細胞は、更に予めＣＡＲ又は特異的なＴＣＲが導入されたｉＰＳ細胞であってもよい。
　ここで、ＣＡＲとは、抗原に結合する細胞外ドメインと、前記細胞外ドメインとは異なるポリペプチドに由来する細胞内ドメインを含む融合タンパク質を意味する。ＣＡＲとしては、例えば、特定の抗原に対する抗体の抗原認識部位（可変領域のＬ鎖とＨ鎖）を、例えば、ＣＤ３等のＴ細胞受容体の細胞内ドメイン及びＣＤ２８又は４－１ＢＢ等の共刺激分子の細胞内ドメインと結合させた融合タンパク質等が挙げられる（例えば、日本国特表２０１５－５０９７１６号公報）。
　ＣＡＲの抗原認識部位は目的とする抗原に応じて選択でき、それにより目的の抗原に対して特異的なＴ細胞を作製することが可能である。例えば、ＣＤ１９を抗原とする場合、抗ＣＤ１９抗体の抗原認識部位をクローニングし、ＣＤ３分子の細胞内ドメインと結合させることにより、ＣＡＲとすることが出来る（例えば、Cancer Res., 66: 10995-11004, 2006）。また、結合させる共刺激分子の種類や数を選択することにより、活性化の強さ又は持続時間をコントロールすることが出来る（例えば、Mol Ther., 17: 1453-1464, 2009）。
　ＣＡＲを導入することにより、Ｔ細胞を由来とするｉＰＳ細胞又はＴ細胞を由来としないｉＰＳ細胞から分化誘導したＴ細胞のいずれにおいても、目的の抗原に対する特異性を付与することが可能となる。また、ＣＡＲを導入することにより、抗原分子を直接認識することができ、ＨＬＡクラスＩ遺伝子の発現が低下した腫瘍に対しても高い免疫反応を起こすことが可能である。
　また、特異的なＴＣＲを導入することにより、Ｔ細胞を由来とするｉＰＳ細胞又はＴ細胞を由来としないｉＰＳ細胞から分化誘導したＴ細胞のいずれにおいても、目的の細胞に対する特異性を付与することが可能となる。また、がん特異的にペプチド－ＨＬＡ複合体を発現する腫瘍に対しても高い免疫反応を起こすことが可能である。
　本発明におけるＴ細胞は、特に制限されないが、末梢血由来のＴ細胞であってもよい。また、上記のＣＡＲやＴＣＲを導入するＴ細胞は、末梢血中のＴ細胞であってもよい。末梢血の由来は患者自身、血縁ドナーや非血縁ドナー等の健常人由来である。
　また、本発明におけるＴ細胞は、初代造血幹・前駆細胞由来のＴ細胞であってもよい。初代造血幹・前駆細胞は臍帯血又は骨髄若しくは動員末梢血等から採取可能であり、これらの由来は患者自身又は血縁ドナー若しくは非血縁ドナー等の健常人由来である。初代造血幹・前駆細胞からT細胞を誘導する方法は、上述の多能性幹細胞からＴ細胞を誘導する方法と同一又は類似の方法で行うことが出来る（例えば、Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro; Blood, 105(4): 1431-1439, 2005）。
　本発明におけるＴ細胞は、所望の抗原特異性を有することが好ましい。従って、上述のｉＰＳ細胞の元となるリンパ球は、所望の抗原特異性を有することが好ましい。
　当該リンパ球は、所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製により特異的に単離されてもよい。この精製では、所望の抗原を結合させた主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を４量体化させたもの（いわゆるＭＨＣテトラマー）を用いて、ヒトの組織より所望の抗原特異性を有するリンパ球を精製する方法も採用することが出来る。
　また、Ｔ細胞は、特に精製せずとも、ＣＤ３抗体やＣＤ３ビーズによる刺激で選択的に増殖させることで濃縮して得ることも出来る。
［ＮＫ細胞］
　本発明におけるＮＫ細胞は、いかなるＮＫ細胞も利用することが出来る。なお、ＮＫ細胞の提供者（ドナー）とＮＫ細胞の被提供者（レシーピエント）は、同種であることが好ましい。例えば、提供者がヒトの場合には、被提供者はヒトである。また、ＮＫ細胞の提供者とＮＫ細胞の被提供者は、同一個体であることがより好ましい。例えば、ドナーが提供者Ｘの場合には、レシーピエントは提供者Ｘである。
　本発明におけるＮＫ細胞は、公知の方法（例えば、特許第５０１６７３２号公報に記載の方法）で取得することが出来る。ＮＫ細胞は、末梢血、リンパ節、胸腺、骨髄、腫瘍、胸水、腹水又は臍帯血から採取された単核球、より好ましくは末梢血単核球から誘導して取得することが出来る。例えば、末梢血から比重遠心法により、ＮＫ細胞を含む単核球を回収することが出来る。
　本発明におけるＮＫ細胞は、多能性幹細胞由来のＮＫ細胞であることが好ましい。多能性幹細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト由来であることがより好ましい。多能性幹細胞からＮＫ細胞を誘導する方法は、公知の方法（例えば、Cell Stem Cell. 23(2): 181-192, 2018に記載の方法）を用いて行うことが出来る。多能性幹細胞については、上述したものと同様である。
　本発明におけるＮＫ細胞は、初代造血幹・前駆細胞由来のＮＫ細胞であってもよい。初代造血幹・前駆細胞については、上述したものと同様である。
　本発明におけるＮＫ細胞は、末梢血由来のＮＫ細胞であってもよい。末梢血の由来は患者自身、血縁ドナーや非血縁ドナー等の健常人由来である。また、ＮＫ細胞は高い治療効果を示すことから、本発明におけるＮＫ細胞は、免疫細胞療法用ＮＫ細胞であることが好ましい。
　ＮＫ細胞としては、例えば、ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）細胞が挙げられる。更にＮＫ細胞としては、ＣＤ３（－）ＣＤ５６（＋）に加えてＣＤ２（＋／－）、ＣＤ５（－）、ＣＤ７（＋）、ＣＤ８（＋）、ＣＤ１ｄ（－）、ＣＤ１６ａ（＋）、ＣＤ２７（＋）、ＣＤ４９ａ～ｆ（＋）ＣＤ５６（＋）、ＣＤ５７（＋）、ＣＤ９４（＋）、ＣＤ１６１（＋）又はＣＤ１６５（＋）等の表面マーカーが発現する細胞が挙げられる。
　本発明におけるＮＫ細胞は、未成熟ＮＫ細胞又は成熟ＮＫ細胞のいずれでもよく、例えば、ＣＤ５６　ｂｒｉｇｈｔ　ＣＤ１６（－）　未成熟ＮＫ細胞又はＣＤ５６　ｄｉｍ　ＣＤ１６（＋）成熟ＮＫ細胞等が挙げられる。
［Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地］
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地は、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を添加して調製することが出来る。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地における式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の含有量は、Ｔ細胞又はＮＫ細胞に対する増殖促進活性を示す限りにおいて特に限定されないが、例えば、通常０．１ｎＭ～１０μＭであり、好ましい範囲としては、０．１ｎＭ～３μＭ、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、１ｎＭ～３μＭ、１ｎＭ～１０ｎＭ、１０ｎＭ～１００ｎＭ、１００ｎＭ～１μＭ又は１ｎＭ～１μＭ等が挙げられる。式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びその薬学的に許容される塩がベルバミン、（＋）－ベルバミン、ベルバミン二塩酸塩、Ｅ６－ベルバミン及びセファランチンから選ばれる少なくとも１である場合は、０．１ｎＭ～１０μＭであることが好ましい。
　基礎培地としては、例えば、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ）培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ライフテクノロジーズ）及びこれらの混合培地等が挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清を使用してもよい。
　必要に応じて、基礎培地は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、２－メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類又はサイトカイン等の１つ以上の物質も含有し得る。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地は、ビタミンＣ類又はサイトカインを更に含有することが好ましい。
　ビタミンＣ類とは、Ｌ－アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、Ｌ－アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンＣとなるものを意味する。Ｌ－アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、リン酸ビタミンＣ、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンＣエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビル又はアスコルビン酸－２リン酸－６パルミチン酸等が挙げられる。好ましくは、リン酸ビタミンＣであり、例えば、リン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｎａ又はリン酸－Ｌ－アスコルビン酸Ｍｇ等のリン酸－Ｌ－アスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンＣ類のＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地における濃度は、例えば、５μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌである。
　サイトカインとしては、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２１又はＦｌｔ３Ｌ等が挙げられる。これらのＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地における濃度は、例えば、ＩＬ－７は１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌであり、ＩＬ－１２は１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１５は１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－１８は１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ－２１は１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌ、Ｆｌｔ３Ｌは１ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌである。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地は、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有することにより、該細胞の状態（例えば未分化性）を維持させつつ細胞増殖を促進可能であるため、フィーダー細胞を含有させなくてもよい。フィーダー細胞を培地に含有させないことにより、フィーダー細胞に由来する感染の危険性を低下させることが出来、また製造の安定性が向上し、その結果コストを抑えることが出来る。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の培養用培地は、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩に加えて、ＭＡＰＫカスケード阻害剤を含有してもよい。ＭＡＰＫカスケード阻害剤を併用することにより、免疫細胞療法における活性に優れた細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の増殖を亢進出来る。
　ＭＡＰＫカスケードはＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫ、及びＭＡＰＫという３種類のキナーゼ（蛋白質リン酸化酵素）分子等から構成されており、ヒト細胞内には機能の異なるＭＡＰＫカスケードが少なくとも３種類（ＥＲＫカスケード、ｐ３８カスケード、ＪＮＫカスケード）存在する（例えば、電気泳動、６０：７～１０ページ、２０１５年）。このうち、ＥＲＫ経路が増殖因子等によって活性化され、主に細胞増殖に作用するのに対し、ストレス応答ＭＡＰＫカスケードであるｐ３８カスケード及びＪＮＫカスケードは、様々な環境ストレス刺激や炎症性サイトカインによって活性化され、アポトーシス誘導や免疫応答の制御に重要な役割を果たしている。
　本発明におけるＭＡＰＫカスケード阻害剤としては、ＥＲＫカスケード阻害剤又はｐ３８カスケード阻害剤が好ましく挙げられる。ＥＲＫカスケード阻害剤としては、例えば、ＥＲＫカスケードを構成するＢＲＡＦ、ＲＡＦ等をターゲットとする阻害剤（例えば、ＣＥＰ－３２４９６又はＺＭ－３３６３７２等）等が挙げられる。ｐ３８カスケード阻害剤としては、例えば、ｐ３８をターゲットとする阻害剤（例えば、ＳＢ－２０３５８０又はＬｏｓｍａｐｉｍｏｄ等）等が挙げられる。
［Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養］
　Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養に用いる培養器としては、特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、シャーレ、マイクロウエルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ又は培養バッグ等が挙げられる。これらの培養器の基材としては、特に限定されず、例えば、ガラス又はポリプロピレイン若しくはポリスチレン等の各種プラスチック等が挙げられる。
　培養器は、細胞接着性であっても細胞非接着性であってもよく、目的に応じて適宜選ばれる。細胞接着性の培養器は、培養器の表面と細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）等の任意の細胞支持用基質でコーティングされたものであってもよい。
　細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン若しくはラミニンの一部構造体、フィブロネクチン又はそれらの混合物等が挙げられ、具体的には、マトリゲル又は溶解細胞膜調製物等が挙げられる（例えば、Lancet, 365, 9471, 1636-1641, 2005）。
　培養に用いられるＴ細胞又はＮＫ細胞は、分散細胞又は非分散細胞であってもよい。分散細胞とは、細胞分散を促進するために処理された細胞をいう。分散細胞としては、例えば、２～５０個、２～２０個、又は２～１０個の細胞からなる小さな細胞塊を形成している細胞が挙げられる。分散細胞は、浮遊（懸濁）細胞又は接着細胞であってもよい。
　Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養密度は、細胞の生存及び増殖を促進する効果を達成し得るような密度である限り特に限定されない。好ましくは１．０×１０１～１．０×１０７細胞／ｍｌ、より好ましくは１．０×１０２～１．０×１０７細胞／ｍｌ、更により好ましくは１．０×１０３～１．０×１０７細胞／ｍｌ、最も好ましくは３．０×１０４～１．０×１０７細胞／ｍｌである。
　温度、ＣＯ２濃度、溶存酸素濃度及びｐＨ等の培養条件は、従来公知の技術に基づいて適宜設定出来る。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、通常３０～４０℃、好ましくは３７℃である。ＣＯ２濃度は、通常１～１０％、好ましくは２～５％である。酸素分圧は、通常１～１０％である。ｐＨは、通常３～１０である。
　Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養において、フィーダー細胞の存在下で培養してもよいが、好ましくはフィーダー細胞を用いずに培養を行う。Ｔ細胞又はＮＫ細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、通常３７～４２℃、好ましくは３７～３９℃である。また、培養期間については、当業者であればＴ細胞又はＮＫ細胞の数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、１０日間以上、３０日間以上、４０日間以上、５０日間以上、６０日間以上、７０日間以上であり、好ましくは３日間以上、より好ましくは１０日間以上、更に好ましくは３０日間以上、特に好ましくは４０日間以上、最も好ましくは５０日間以上である。本発明の培養方法により、５０日間以上の長期間の培養が可能となる。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の製造方法は、必要に応じてＴ細胞又はＮＫ細胞を継代する工程を含む。Ｔ細胞の継代及び分化誘導は、従来公知の手法により行うことが出来る。
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の製造方法により得られるＴ細胞又はＮＫ細胞を含む細胞組成物は、再生医療用の細胞ソース等に利用され得る。前記細胞組成物は、小さな細胞塊のような分散したＴ細胞又はＮＫ細胞を含む組成物であってもよい。
　前記細胞組成物は、例えば、凍結保存によるＴ細胞又はＮＫ細胞の保存、輸送及び継代に用いることが出来る。前記細胞組成物は、血清あるいはその代替物、又はＤＭＳＯ等の有機溶剤を更に含んでいてもよい。この場合、血清又はその代替物の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば１～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）である。有機溶剤の濃度は、特に限定されるものではないが、例えば０～５０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５～２０％（ｖ／ｖ）である。前記細胞組成物は、フィーダー細胞を含むものであってもよいが、含まないものであることが好ましい。
［免疫細胞療法剤］
　本発明の製造方法により得られるＴ細胞、ＮＫ細胞又はその細胞組成物は、免疫細胞療法剤に好適に用いることが出来る。Ｔ細胞、ＮＫ細胞又はその細胞組成物は、公知の手段にしたがって医薬上許容される担体と混合する等して、経口／非経口製剤、好ましくは、注射剤、懸濁剤又は点滴剤等の非経口製剤として製造される。当該非経口製剤に含まれ得る医薬上許容される担体としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖又はその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール又は塩化ナトリウム等）等の注射用の水性液を挙げることが出来る。
　免疫細胞療法剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液等）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム又は塩酸プロカイン等）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン又はポリエチレングリコール等）、保存剤又は酸化防止剤等と配合してもよい。
　免疫細胞療法剤を水性懸濁液剤として製剤化する場合、上記緩衝液に例えば、約１．０×１０６～約１．０×１０７細胞／ｍＬとなるように、Ｔ細胞又はＮＫ細胞を懸濁させればよい。
　このようにして得られる製剤は、安定で低毒性であるので、ヒト等の哺乳動物に対して安全に投与することが出来る。投与方法は特に限定されず、経口又は非経口的に投与することが出来るが、好ましくは注射若しくは点滴投与であり、投与ルートとしては、例えば、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与又は患部直接投与等が挙げられる。当該免疫細胞療法剤の投与量は、投与対象、対象臓器、症状又は投与方法等により差異はあるが、通常、成人の患者（体重６０ｋｇとして）においては、例えば、非経口投与の場合、１回につき細胞数として約１．０×１０７～約１．０×１０９細胞を、約１～２週間隔で、約４～約８回投与することが挙げられる。
　投与するＴ細胞又はＮＫ細胞の生体内における活性化を促進するため、本発明の免疫細胞療法剤においては、その有効成分であるＴ細胞又はＮＫ細胞と、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の受容体リガンドとを組み合わせてもよい。
［未分化状態を維持する方法］
　本発明に係る未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法は、上記したＴ細胞培養用培地中で、Ｔ細胞を培養することを特徴とする。Ｔ細胞の培養方法については上記と同様とする。当該培地中で未分化Ｔ細胞を培養することにより、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の作用により、未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持することが出来る。
　Ｔ細胞の未分化状態の維持は、例えば、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の非存在下で培養したＴ細胞と比較して、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の存在下で培養したＴ細胞において、Ｔ細胞の未分化マーカー遺伝子の発現レベルがｍＲＮＡレベル又はタンパク質レベルで培養開始時の発現レベルと同程度のレベルに有意に維持されているか否かで評価出来る。Ｔ細胞の未分化マーカー遺伝子としては、例えばＣＣＲ７遺伝子等が挙げられる。
　未分化マーカー遺伝子の発現レベルを測定する方法としては、ｍＲＮＡレベルでは、例えば、マーカー遺伝子に特異的なプライマー若しくはプローブを用いたＲＴ－ＰＣＲ、定量ＰＣＲ又はノーザンブロッティング等の方法が挙げられる。また、タンパク質レベルでは、例えば、マーカー遺伝子によりコードされるタンパク質に特異的な抗体を用いたＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー又はウエスタンブロッティング等の免疫学的方法が挙げられる。
　未分化マーカー遺伝子の発現レベルを測定した結果、培養開始時のＴ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現レベルと式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の存在下で所定時間培養後のＴ細胞における未分化マーカー遺伝子の発現レベルとの相対比が、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合にＴ細胞の未分化状態を維持できたと判定することが出来る。
［Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤］
　本発明に係るＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤（以下、本発明に係る増殖促進剤とも略す）は、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含むことを特徴とする。本発明に係る増殖促進剤を含む培地を用いてＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することにより、フィーダー細胞を用いない場合であっても、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖効率が顕著に向上し、且つ該細胞の状態（例えば未分化性）を維持することが出来る。
　本発明に係る増殖促進剤は、更に生理学的に許容される担体〔例えば、生理的な等張液［生理食塩水、上述の基礎培地、ブドウ糖又はその他の補助薬（例えば、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンニトール又は塩化ナトリウム等）を含む等張液等］、賦形剤、防腐剤、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン又はポリエチレングリコール等）、結合剤、溶解補助剤、非イオン性界面活性剤、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液又は酢酸ナトリウム緩衝液等）、保存剤、酸化防止剤又は上述の添加物等〕、シグナル伝達阻害剤等を含む組成物として提供することも出来る。
　本発明に係る増殖促進剤に含まれる式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の含有量は、例えば、本発明に係る増殖促進剤を培地に添加する場合において、該培地中の該化合物の濃度が、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖を促進するのに十分な濃度含まれるように構成されていることが好ましい。
　本発明に係る増殖促進剤は、等張な水溶液又は粉末等の状態で、培地に添加されること等の方法で用いられることが好ましい。
　Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進は、例えば、本発明に係る増殖促進剤の非存在下で培養したＴ細胞又はＮＫ細胞と比較して、本発明に係る増殖促進剤の存在下で培養した該Ｔ細胞又はＮＫ細胞の細胞数が有意に増加されているか否かで評価することが出来る。細胞数の測定は、例えば、公知のＭＴＴ法又はＷＳＴ法等により、市販の細胞数測定キットを用いて行うことが出来る。測定の結果、培養開始時のＴ細胞又はＮＫ細胞の細胞数と本発明に係る増殖促進剤の存在下とで所定時間培養後のＴ細胞又はＮＫ細胞の細胞数との相対比が、本発明に係る増殖促進剤の非存在下で培養した場合の同相対比（コントロール）よりも大きい場合にＴ細胞又はＮＫ細胞の増殖を促進できたと判定することが出来る。
　以下、実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１］ｉＰＳ細胞の分化誘導
　ｉＰＳ細胞からのＴ細胞の誘導は、非特許文献１に記載の方法を改変して行った。実施例１においてｉＰＳ細胞を分化誘導した手順の模式図を図１に示す。
　ｉＰＳ細胞はマウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）をフィーダー細胞として維持した。培地はｉＰＳ細胞用培地［Ｄｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ／Ｎｕｔｒｉｅｎｔ　Ｍｉｘｔｕｒｅ　Ｆ－１２　Ｈａｍ　（Ｓｉｇｍａ）、Ｋｎｏｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、２０％、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ、１００×、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１％　ＭＥＭ　Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＮＥＡＡ、Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ　２－Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ（５５ｍＭ、Ｇｉｂｃｏ）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　ｂａｓｉｃ（Ｓｉｇｍａ）］を用いた。
　造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）はｉＰＳ細胞を１０Ｔ１／２細胞上で培養し、Ｓａｃを形成させて誘導した(非特許文献２）。１０Ｔ１／２細胞は１％　ＦＢＳ、１％　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ－Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＳＧ、Ｓｉｇｍａ）を加えたＢａｓａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ　Ｅａｇｌｅ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、０．１％　ゼラチンコートディッシュで維持しフィーダー細胞として用いた。
　ｉＰＳ細胞を剥離剤［ＣａＣｌ２（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）、ＫＳＲ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びトリプシン（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＤ－ＰＢＳ］を用いて処理し、ｉＰＳ細胞コロニーを回収した。コロニーを１０Ｔ１／２細胞上に播種し、Ｓａｃ培地［ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ）、１５％　ＦＢＳ、１％　ＰＳＧ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＩＴＳ－Ｇ、１×、ＧＩｂｃｏ）、モノチオグリセロール（ＭＴＧ、Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）、Ｌ（＋）－アスコルビン酸（ＰＡＡ、５０μｇ／ｍＬ、Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ、０３４２０－５２）、ＶＥＧＦ（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、２０ｎｇ／ｍｌ）］を用いて３７℃にて５％　Ｏ２、５％　ＣＯ２下で培養した（Ｄａｙ０）。Ｄａｙ４でＳａｃ培地を交換した。培地は、Ｄａｙ７、１０及び１２でそれぞれＳＣＦ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、３０ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ３（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、１０ｎｇ／ｍｌ）を添加したＳａｃ培地で交換し、３７℃にて２０％　Ｏ２、５％　ＣＯ２下で培養した。
　Ｔ細胞はＨＰＣをＯＰ９－ＤＬ１細胞と共培養して誘導した。ＯＰ９－ＤＬ１細胞は１５％　ＦＢＳ及び１％　ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。分化誘導開始後１４日のＳａｃをピペットの先端で回収し、ピペッティング後、セルストレーナーに通し、フロースルーを回収した。
　得られた血液細胞をＯＰ９－ＤＬ１細胞に播種し、ＩＬ－７（１ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ－Ｇ、１５％　ＦＢＳ及び１％　ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて培養した。
　３日後、フレッシュなＯＰ９－ＤＬ１細胞に血液細胞をトランスファーした。以後３日毎に培地交換と６日毎にフレッシュなＯＰ９－ＤＬ１細胞へトランスファーした。ＯＰ９－ＤＬ１細胞との共培養開始から２４日後、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ－Ｇ、１５％　ＦＢＳ、ＰＳＧ及びＡｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（１μｇ／ｍＬ）を添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地に交換した。
　３日後、トリプシン処理及びａｄｈｅｓｉｏｎ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎによるＯＰ９－ＤＬ１細胞の除去後、レトロネクチン（登録商標）（ＴａＫａＲａ、２μｇ／ｍＬにＰＢＳで希釈）でコートされた２４ウェルプレートにトランスファーし、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）、Ｆｌｔ３Ｌ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ－Ｇ、１５％　ＦＢＳ及びＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地で培養した。
　ＯＫＴ３刺激から６日後、細胞をＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＣＤ５－ＰＥＣｙ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）、ＣＤ１ａ－ＦＩＴＣ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）及びＣＤ３３６－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ５（＋）ＣＤ１ａ（－）ＣＤ３３６（－）細胞をソーティングし、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞（Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞）を得た。
［実施例２］ｉＰＳ－Ｔ細胞の拡大培養
　実施例１の方法に従い得られるＣＤ８（＋）Ｔ細胞（Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞）は数千から数万細胞しかない。この細胞をＰｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ－Ｐ（ＰＨＡ）及び健常人ドナー由来ＰＢＭＣと共培養し、数万倍に増やした。実施例２においてｉＰＳ－Ｔ細胞をＥｘｐａｎｓｉｏｎした手順の模式図を図２に示す。
　ＰＢＭＣを解凍し、１５％　ＦＢＳ及びＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地で一晩培養した。翌日、このＰＢＭＣを放射線照射後（４０Ｇｙ）、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）、Ｐａｎ　Ｃａｓｐａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０μＭ）、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ－Ｇ、１５％　ＦＢＳ及びＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地でｉＰＳ－Ｔ細胞と混合し、ＰＨＡ（Ｗａｋｏ、２μｇ／ｍＬ）を添加した（Ｄａｙ０）。培地交換を３日毎に行い、増殖に合わせて適宜継代し、Ｄａｙ１４まで培養した。本実施例では、この工程を必要に応じて１度又は２度実施した。
［実施例３］免疫表現型検査
　ｉＰＳ－Ｔ細胞におけるＴ細胞関連分子の発現をフローサイトメトリーにより解析した。解析にはＣＤ８ａｂ（＋）ｉＰＳ－Ｔ細胞をＰＨＡ及びＰＢＭＣにより０～２回ｅｘｐａｎｄした細胞を用いた。染色にはＣＤ８β－ＰＥ（ＢＥＣＫＭＡＮ）、ＣＤ５－ＰＥＣｙ７（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、ＣＤ２７－ＡＰＣ、ＣＤ２８－ＢＶ４２１、ＣＣＲ７－ＡＰＣ、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０、ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣＣｙ７及びＣＤ６２Ｌ－ＦＩＴＣ、ＣＤ９５－ＰＥＣｙ７（以上ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いた。解析はＢＤ　ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用い、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて死細胞を除外した。
　一度ｅｘｐａｎｄしたＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用いて免疫表現型検査を行った手順の模式図を図３Ａに、その結果を図３に示す。図３Ｂに示すように、ＣＤ９５及びＣＤ４５ＲＡは１００％陽性であった。また、ＣＤ５、ＣＤ２７、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯの部分的な発現が認められた。ＣＤ２８及びＣＤ６２Ｌは陽性対照である健常人由来ＰＢＭＣ中のＴ細胞での発現は認められたが、Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞での発現は認められなかった。
　続いて、Ｔ細胞の増殖にともなう分化過程でのマーカー分子の発現の変化を評価するため、実施例２のＥｘｐａｎｓｉｏｎ回数の異なるＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を比較検討した。検討の手順についての模式図を図４（Ａ）に、その結果を図４（Ｂ）に示す。図４（Ｂ）に示すように、Ｅｘｐａｎｓｉｏｎに伴うＣＣＲ７の発現レベル及びＣＣＲ７陽性細胞率の低下が認められた。
　ＰＢＭＣ中のＴ細胞において、ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）Ｎａｉｖｅ　Ｔ細胞を未分化性の頂点とする階層性が知られている（例えば、Nicholas P. Restifo, Blood, 124: 476-477, 2014）。したがって、ｉＰＳ－Ｔ細胞においてＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）が未分化細胞マーカーである可能性が示された。
［実施例４］生細胞数を指標とした低分子化合物のスクリーニング
　ＰＢＭＣフィーダーを用いずにＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を培養し、増殖効率を改善させる低分子化合物をスクリーニングした。スクリーニングのスキームを図５（Ａ）～（Ｃ）に示す。
　１ｓｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ後のＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞（１５００細胞／ウェル）を播種し、１５％　ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ、３５－０７６－ＣＶ、３５０７６１０４Ｒ）、１％　ＰＳＧ（ＳＩＧＭＡ、Ｇ１１４６）、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ、Ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ、０３４２０－５２）、ＩＴＳ－Ｇ、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍＬ）及びｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ（１０μＭ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（ＳＩＧＭＡ、Ｒ８７５８）で培養した。ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｇｉｂｃｏ、１１１３１Ｄ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓは登録商標）（４５００ビーズ／ウェル）を加えて刺激し、１０８０の化合物［ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ００３）、Ｃｅｌｌ　Ｃｙｃｌｅ／ＤＮＡ　Ｄａｍａｇｅ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ００４）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ００８）、ＭＡＰＫ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ０１０）、ＮＦ－ｋａｐｐａＢ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ０１４）、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ０１５）、Ｗｎｔ／Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／Ｎｏｔｃｈ　Ｃｏｍｐｏｕｎｄ　Ｌｉｂｒａｒｙ（ＨＹ－Ｌ０２０）］を終濃度１μＭとなるように各ウェル１種ずつ添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で培養した。
　化合物の溶媒であるＤＭＳＯ（０．１％）を対照とした。６日後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ、０７５５３）とマイクロプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ　５．Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を用いて生細胞数を測定した。その結果、ＤＭＳＯと同等以上の吸光度を示す２６６化合物が選抜された。
　細胞数の検量線については、次の通り設定した。生細胞数測定時には、スクリーニングと同様の細胞を１２点段階希釈し、１５％ＦＢＳ、１％ＰＳＧ、ＰＡＡ、ＩＴＳ－Ｇ、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＲＰＭＩ－１６４０培地で播種（０～１５３６０００細胞／ウェル）した。スクリーニングサンプルと共に生細胞数を測定し、ＷＳＴ－８ａｓｓａｙの検量線とした。
　生細胞数において、コントロール（ＤＭＳＯ）及び上位２０化合物の結果を図６に示す。図６に示すように、本実施例で用いた１０８０化合物の中でベルバミン（ＨＹ－Ｎ０７１４Ａ、Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｅｘｐｒｅｓｓ）の存在下で培養した場合に、最も高い生細胞数を示した。この結果から、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドがフィーダーフリー培養条件において、細胞増殖を著しく促進する作用を有することが示された。
［実施例５］
ＣＣＲ７陽性細胞数を指標とした低分子化合物のスクリーニング
　Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞及び、実施例４で用いた１０８０化合物から抽出した２６６化合物を用い、実施例４の培養方法に従い６日間培養し、ＣＣＲ７及びＣＤ４５ＲＡの発現をＦＡＣＳで解析した。化合物と培養した細胞を９６ウェルプレートに移し、染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＣＲ７－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５３２１４）及びＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４１４２）で染色した。
　洗浄後、ＰＩを含む染色液で再懸濁した。ＨＴＳを搭載したＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて半量を解析し、すべての細胞を記録した。ＦｌｏｗＪｏ１０で解析したＰＩ陰性細胞集団中のＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞のイベント数（＃Ｃｅｌｌｓ）について、コントロール（ＤＭＳＯ）及び上位２０化合物をプロットしたグラフを図７に示す。
　図７に示すように、本実施例で用いた２６６化合物の中で、ベルバミンがもっとも高いＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞数を示した。以上の結果から、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドがフィーダーフリー培養条件において未分化Ｔ細胞の未分化性を維持しながら細胞増殖を促進する化合物として抽出された。
［実施例６］ビスベンジルイソキノリンアルカロイドの濃度依存性評価
　Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞のフィーダーフリー増殖における式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドの濃度依存性を検討した。Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を１５％　ＦＢＳ、１％　ＰＳＧ、ＰＡＡ（５０μｇ／ｍＬ）、ＩＴＳ－Ｇ、ＩＬ－７（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－１８（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ－２１（２０ｎｇ／ｍＬ）及びｚ－ＶＡＤ－ｆｍｋ（１０μＭ）を添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地を用いて培養した。また、培地に、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）で示される各種ビスベンジルイソキノリンアルカロイド［ベルバミン（ＳＩＧＭＡ、５４７１９０）、（＋）－ベルバミン（Ａｒｋ　Ｐｈａｒｍ、ＡＫ１６７９７５）、Ｅ６－ベルバミン（Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ＳＣ－２２１５７３）又はセファランチン（Ｃａｙｍａｎ、１９６４８）］を、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ、１００ｎＭ、３００ｎＭ、１μＭ、３μＭ又は１０μＭの濃度にて添加した。６日間培養後、実施例５の方法と同様に染色と測定を行った。結果を図８及び図９に示す。
　図８に示すように、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドの濃度依存的に生細胞数が増加し、１μＭで最も増殖作用を認めた。また、図９に示すように、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドの濃度依存的に未分化細胞数が増加し、１μＭで最も増殖作用を認めた。よって、以降の検討は全て、式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドの培地中の濃度を１μＭとして、実施することとした。
［実施例７］ＰＢＭＣフィーダーとの比較
　Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を用い、ＰＢＭＣフィーダーを用いる実施例２と同様の刺激方法、ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓを用いる実施例４と同様の刺激方法、又はＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓにベルバミン（ＳＩＧＭＡ、５４７１９０）　１μＭを加えた実施例４と同様の刺激方法の３方法を用いて培養し、増殖促進効果を比較した。ＰＢＭＣフィーダー細胞はＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞と識別するためにＣｅｌｌＴｒａｃｅ　ＣＦＳＥ　Ｃｅｌｌ　Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ－Ｆｏｒ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（ＣＦＳＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００ｎＭ）で標識し、放射線照射処理を行った。
　実施例５と同様に染色及び測定を行った結果を図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示す。図１０（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ベルバミンの存在下で培養することにより、フィーダー細胞存在下と比較して、生細胞数の顕著な増加が観察され、未分化細胞数は同等の結果となった。以上のことから、本発明は従来、Ｔ細胞の増殖に用いられてきたＰＢＭＣを代替出来るものといえる。
［実施例８］低分子化合物のスクリーニング
　実施例４により得られた結果を更に評価するため、再現性を評価した。方法は、実施例４と同様の方法で培養し、評価した。化合物はベルバミンを含む実施例４で用いた化合物のうち２０化合物を選択して用い、化合物の溶媒であるＤＭＳＯ（０．１％）を対照とした。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。結果を図１１に示す。
　図１１に示すように、ＤＭＳＯと比較してベルバミンを筆頭に複数の化合物で有意な細胞数の増加を認め、ベルバミンがＤＭＳＯと比較してｉＰＳ－Ｔ細胞の増殖を亢進することがわかった。
［実施例９］メモリーＴ細胞の増殖に寄与する既知化合物との比較
　Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の培養における影響について、メモリーＴ細胞の増殖に寄与する既知化合物とベルバミンとを比較して評価した。方法は、１ｓｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ後のＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を実施例４と同様の方法でＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、既知化合物として知られるＴＷＳ１１９（Ｃａｙｍａｎ、６０１５１４－１９－６）（例えば、Gattinoni et al., Nat. Med., 15(7): 808-813, 2009）、（＋）―ＪＱ１（ａｂｃａｍ、ａｂ１４６６１２）（例えば、Gattinoni et al., Nat. Med., 15(7): 808-813, 2009）又はベルバミン（ＢＢＭ、ＳＩＧＭＡ社、５４７１９０）のいずれかを１μＭ添加した。化合物の溶媒であるＤＭＳＯ（０．１％）を対照とした。
　実施例６と同様の培地で６日間培養後、実施例５の方法で細胞を染色し、測定した。ＦｌｏｗＪｏ９で解析したＰＩ陰性細胞のイベント数、及びＰＩ陰性細胞中のＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞のイベント数をデータとした。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。結果を図１２（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
　図１２（Ａ）及び（Ｂ）に示すようにＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞において上記既知化合物は増殖に寄与せず、ベルバミンのみ有意な増殖効果を示した。（＋）―ＪＱ１（ａｂｃａｍ、ａｂ１４６６１２）化合物については０．１５μＭも実施したが１μＭと同様の結果であった。
　以上の結果から、既知化合物と比較してベルバミンがＴ細胞の培養ならびに製造に有用であることが示された。
［実施例１０］ＭＡＰＫカスケード阻害剤との併用によるメモリーＴ細胞の増殖への効果
　ベルバミンとＭＡＰＫカスケード阻害剤との併用によるメモリーＴ細胞の増殖への効果を検討した。方法は、１ｓｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ後のＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を実施例４と同様の方法でＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、ベルバミン（ＢＢＭ）とＣＥＰ－３２４９６（ＥＲＫカスケード阻害剤、Ｃａｙｍａｎ、１８７７６）、ＳＢ－２０３５８０（ｐ３８カスケード阻害剤、Ｃａｙｍａｎ、１３３４４）、Ｌｏｓｍａｐｉｍｏｄ（ｐ３８カスケード阻害剤、Ｃａｙｍａｎ、１３６１４）又はＺＭ－３３６３７２（ＥＲＫカスケード阻害剤、Ｃａｙｍａｎ、１００１０３６７）とを併用して添加した。各化合物の終濃度は１μＭとした。化合物の溶媒であるＤＭＳＯ（０．１％）を対照とした。
　実施例６と同様の培地で６日間培養後、実施例５の方法で細胞を染色し、測定した。ＦｌｏｗＪｏ９で解析したＰＩ陰性細胞集団中のＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＣＲ７（＋）細胞のイベント数（＃Ｃｅｌｌｓ）をプロットし、グラフ化した。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１）。結果を図１３に示す。
　図１３に示すように、ベルバミン単剤に加え、全ての併用条件においてＤＭＳＯと比較して有意な細胞増殖を認め、全ての併用条件の方がベルバミン単剤に比べて細胞増殖の亢進が認められた。
　以上の結果から、ベルバミンはＥＲＫカスケード又はｐ３８カスケード等のＭＡＰＫカスケード阻害剤と併用することでベルバミン単独よりも更にメモリーＴ細胞の増殖を亢進出来ることが示された。
［実施例１１］ベルバミン誘導体のＴ細胞増殖への影響
　ベルバミン誘導体のＴ細胞増殖への影響を検証した。方法は、１ｓｔ　ｅｘｐａｎｓｉｏｎ後のＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞を実施例４と同様の方法で培養し、ベルバミン（ＢＢＭ）又は１３種類の誘導体［ＢＢＭ１～１３、Ｈｅｂｅｉ　Ｓｕｎｄｉａ　ＭｅｄｉＴｅｃｈ　Ｃｏｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ．］を終濃度０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ又は１μＭとなるよう各ウェル１種ずつ添加し、３７℃にて５％ＣＯ２下で培養した。化合物の溶媒であるＤＭＳＯ（０．１％）を対照とした。
　培養６日後、生細胞数測定試薬ＳＦ（ｎａｃａｌａｉｔｅｓｑｕｅ、０７５５３）とマイクロプレートリーダー（ＳｏｆｔＭａｘＰｒｏ　５．Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ、４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を用いて生細胞数を測定し、ＯＤ値をデータとした。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。結果を表１に示す。
　表１におけるＲｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｎｏ．は以下の通りである。
１．Xie et al., Eur J Med Chem, 44(8: 3293-8, 2009
２．Tan et al., International Jornal of Mass Spetrometry, 386: 37-41, 2015
３．Nam et al., Mol Oncol, 6(5): 484-93, 2012
　表１においては、ＤＭＳＯに対する値を算出し、小数第４位を四捨五入にて示している。表１において、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。また、実施例６についても同様に統計解析を行なった。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000066
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000067
　表１及び表２に示すように、１６種類全ての誘導体でＤＭＳＯと比較して有意な細胞増殖の亢進を認めた。このことから、ベルバミン及びその誘導体がＴ細胞の製造に有用であることがわかった。
［実施例１２］Ｔ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の長期培養
　ベルバミンを用いることによるＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の長期培養の可能性を評価した。実験スキームを図１４（Ａ）に示す。まず、Ｔ－ｉＰＳ細胞からフィーダーを用いずにＴ細胞を誘導した。ｉＰＳ細胞の維持は、フィーダーフリーｉＰＳ細胞はＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を用いた。ｉＭａｔｒｉｘ－５１１をコートした培養表面にｉＰＳ細胞を剥離剤［１×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をＰＢＳで１／２に希釈し、０．５ｍｏｌ／ｌ－ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８、Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）を添加し、終濃度０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡ］を用いて剥離し、ＳｔｅｍＦｉｔ　ＡＫ０２Ｎに１０μＭ　Ｙ?２７６３２を加えた培地に継代、培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。翌日、Ｓｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎで培地交換を行った。この操作を週に一度繰り返し、ｉＰＳ細胞を維持した。
　ｉＰＳ細胞をＥｍｂｒｙｏｉｄ　Ｂｏｄｙ形成法で分化誘導することにより、造血前駆細胞（ＨＰＣｓ）を作製した。フィーダーフリーｉＰＳ細胞を０．５×ＴｒｙｐＬＥ　Ｓｅｌｅｃｔ、０．７５ｍＭ　ＥＤＴＡで剥離した後、超低接着処理された６ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に２～３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。１０μＭ　Ｙ－２７６３２（Ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ）及び１０μＭ　ＣＨＩＲ９９０２１（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加したＳｔｅｍｆｉｔ　ＡＫ０２Ｎ培地を用い、低酸素条件下（５％　０２）にて培養した（Ｄａｙ０）。
　翌日、１×Ｉｎｓｕｌｉｎ、Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、Ｓｅｌｅｎｉｕｍ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．２×ＰＳＧ、４５ｍＭモノチオグリセ口一ル（Ｗａｋｏ）および５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ（Ｗａｋｏ）を添加したＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地（ＥＢ培地）に５０ｎｇ／ｍｌ　ＢＭＰ－４（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ（Ｗａｋｏ）及び５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（Ｗａｋｏ）を加えて培養した（Ｄａｙ１、５％　０２）。
　翌日、６μＭ　ＳＢ４３１５４２（Ｗａｋｏ）を添加して培養した（Ｄａｙ２、５％　０２）。２日後、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦを添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ４、５％　０２）。
　２日後、５０ｎｇ／ｍｌ　ＶＥＧＦ－１６５Ａ、５０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ、３０ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｗａｋｏ）及び１０ｎｇ／ｍｌ　ＦＬＴ３Ｌ（Ｗａｋｏ）を添加したＥＢ培地で培養した（Ｄａｙ６）。その後、Ｄａｙ８まで細胞を５％ＣＯ２下で培養した。
　得られたＨＰＣｓを用いてＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を分化誘導した。Ｆｃ－ＤＬＬ４（５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｎｏ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｃ．）及びＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（５μｇ／ｍｌ、タカラバイオ）によりコーティングした４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにＨＰＣｓを２０００～３０００細胞／ウェルで播種した。
　５０ｎｇ／ｍｌ　ＳＣＦ（Ｗａｋｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０ｎｇ／ｍｌ　Ｆｌｔ３Ｌ（Ｗａｋｏ）、１００ｎｇ／ｍｌ　ＴＰＯ（Ｗａｋｏ）、３０μＭ　ＳＤＦ－１α（Ｗａｋｏ）、１５μＭ　ＳＢ２０３５８０（Ｔｏｃｒｉｓ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、５５μＭ　２－メルカプトエタノール（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍｌ　ＰＡＡ、１５％　ＦＢＳ及び１％　ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地を用いて２１日間培養した。一週間ごとに新たなＦｃ－ＤＬＬ４とＲｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎをコートしたプレートを作製し、細胞を撒きなおした。２～３日毎に培地交換をおこなった。
　続いて、ＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞を誘導した。詳細には、上記ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）Ｔ細胞を含む細胞を４８ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種し、５００ｎｇ／ｍｌ　Ａｎｔｉ－ＣＤ３抗体ＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１０ｎＭ　Ｄｅｘａｍｔｈａｓｏｎｅ（デキサートＲ、Ｆｕｊｉ　Ｐｈａｒｍａ）、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍＬ　ＰＡＡ、１５％　ＦＢＳ及び１％　ＰＳＧを添加したａｌｐｈａ－ＭＥＭ培地で培養した。
　３日後、１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ－７（Ｗａｋｏ）、５０μｇ／ｍＬ　ＰＡＡ、１５％　ＦＢＳ及び１％　ＰＳＧに培地交換を行い培養した。７日後、細胞をＣＤ８ｂｅｔａ－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ）、ＣＤ８ａｌｐｈａ－ＦＩＴＣ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色し、ＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞をソーティングした。
　フィーダーフリー分化誘導したＣＤ８ｂｅｔａ（＋）ＣＤ８ａｌｐｈａ（＋）Ｔ細胞（１５００細胞／ウェル）を播種し、実施例４と同様の方法でＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、ベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、実施例６と同様の培地で培養した。１４日目、２８日目及び４２日目にそれぞれ細胞を回収し、トリパンブルー法で生細胞数をカウントし、再刺激し培養した。５６日目に細胞を回収し、生細胞数のカウントを行った。結果を図１４（Ｂ）に示す。
　図１４（Ｂ）に示すように、ＭｉｌｌｉＱを加えて培養した細胞は刺激毎にｖｉａｂｉｌｉｔｙの低下が認められ、４２日目以降の培養は不可能であった。一方で、ベルバミンを加えて培養した細胞は５６日間の培養が可能であり、更にＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の増殖亢進も認められた。
　また、フィーダーを用いて分化誘導したＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞の評価を行った。実験スキームを図１５（Ａ）に示す。実施例１で分化誘導したＴ－ｉＰＳ－Ｔ細胞（１５００細胞／ウェル）を播種し、実施例４と同様の方法でＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激し、ベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、実施例６と同様の培地で培養した。１４日目、２８日目及び４２日目にそれぞれ細胞を回収し、トリパンブルー法で生細胞数をカウントし、再刺激し培養した。５６日目に細胞を回収し、生細胞数のカウントを行った。結果を図１５（Ｂ）に示す。
　図１５（Ｂ）に示すように、ＭｉｌｌｉＱを加えて培養した細胞は刺激毎にｖｉａｂｉｌｉｔｙの低下が認められ、２８日目以降の培養は不可能であった。一方で、ベルバミンを加えて培養した細胞は５６日間の培養が可能であり、更に細胞の増殖亢進も認められた。
　従来、Ｔ細胞の増殖は実施例２及び実施例７で示したヒト健常人由来ＰＢＭＣをフィーダーとして用いた方法が用いられている（非特許文献１）。本実施例の結果、ベルバミンを添加することでＰＢＭＣを用いずにＴ細胞の増殖を長期にわたって可能にし、更に細胞増殖の亢進が認められた。
　以上の結果から、ベルバミンを用いた細胞増殖はＴ細胞の増殖に用いられてきたヒトＰＢＭＣを代替出来るだけでなく、長期に渡る細胞増殖の結果、より多くの細胞を製造出来ることが示された。
［実施例１３］初代Ｔ細胞の増殖に与える影響
　ベルバミンが初代Ｔ細胞（ＣＤ４Ｔ、ＣＤ８Ｔ細胞）の増殖に与える影響を検討した。実験スキームを図１６（Ａ）に示す。方法は、ＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）からＰａｎ　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９６－５３５）を用いてＣＤ３Ｔ細胞を精製した。精製したＣＤ３Ｔ細胞（２００００細胞／ウェル）を播種し、ベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（６００００ビーズ／ウェル）で刺激した。
　実施例６と同様の培地で６日間培養し、再度刺激を加えた。更に４日間培養後、トリパンブルー法で生細胞数をカウントするとともにＣＤ４陽性細胞及びＣＤ８陽性細胞の割合をＦＡＣＳで解析した。ＦＡＣＳは化合物と培養した細胞を９６ウェルプレートに移し、染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＤ４－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５６２２）及びＣＤ８β－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＩＭ２２１７Ｕ）で染色した。
　洗浄後、２００μＬ／ｗｅｌｌのＰＩを含む染色液で再懸濁した。ＨＴＳを搭載したＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて１００μＬ／ｗｅｌｌを解析し、すべての細胞を記録した。
　ＦｌｏｗＪｏ９で解析したＰＩ陰性細胞集団中のＣＤ８（＋）又はＣＤ４（＋）細胞の陽性率に生細胞数を乗じた値をＣＤ８陽性細胞数又はＣＤ４陽性細胞数とした。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。結果を図１６（Ｂ）及び（Ｃ）に示す。
　図１６（Ｂ）及び（Ｃ）に示すように、初代Ｔ細胞をベルバミンと培養することでＣＤ４Ｔ、ＣＤ８Ｔ細胞ともにＭｉｌｌｉＱと比較して有意な細胞増殖の亢進を認めた。ＣＤ４Ｔ細胞の中にはＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ９、Ｔｈ１７、Ｔｈ２２、Ｔｆｈ又はＴｒｅｇ等が含まれる。ＣＤ８Ｔ細胞の中にはＴｃ、Ｔｃ１、Ｔｃ２又はＴｃ１７等が含まれる。
　以上の結果から、ベルバミンがＭｉｌｌｉＱと比較してＣＤ４Ｔ及びＣＤ８Ｔ細胞の増殖を亢進することが示された。
［実施例１４］制御性Ｔ細胞の増殖における有用性
　ベルバミン（ＢＢＭ）の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖における有用性を検証した。方法は、３ドナーの健常人由来ＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）から追加実施例６と同様の方法でＣＤ３Ｔ細胞を精製し、６日間培養した。６日間培養後、トリパンブルー法で生細胞数をカウントするとともにＣＤ２５（＋）ＦｏｘＰ３（＋）細胞の割合をＦＡＣＳで解析した。
　ＦＡＣＳは培養細胞をｆａｃｓ　ｔｕｂｅに分取し、染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＤ３－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００４１２）、ＣＤ４－ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７４４４）、ＣＤ８－Ｐａｃｉｆｉｃ　Ｂｌｕｅ（ＢＤ、５５８２０７）及びＣＤ２５－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０２６０４）で染色した。
　更に洗浄後、ＦｏｘＰ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓｅｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００－５５２３）とＦｏｘＰ３－ＰＥ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２－４７７６－４１）を用いて細胞内染色を行ない、ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。
　ＦｌｏｗＪｏ９で解析したＣＤ４（＋）細胞中のＦｏｘＰ３（＋）細胞の陽性率に生細胞数を乗じた値をＦｏｘＰ３陽性細胞数とした。結果を図１７（Ａ）及び（Ｂ）に示す。
　図１７（Ａ）及び（Ｂ）に示すように、ベルバミンにより３ドナー全てでＭｉｌｌｉＱと比較してＦｏｘＰ３陽性細胞数の増加を認めた。
　以上の結果、ベルバミンがＭｉｌｌｉＱと比較してＴｒｅｇの増殖を亢進することが示された。
［実施例１５］ベルバミンが特に作用するＴ細胞の分析
　非特許文献４には、Ｔ細胞には階層性が存在することが報告されている（図１８Ａ）。本実施例ではベルバミンがＴ細胞内で作用する分画を検証した。方法は、健常人由来ＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）を染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＣＲ７－ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５３２１４）、ＣＤ４５ＲＡ－ＢＶ５１０（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４１４２）、ＣＤ４５ＲＯ－ＡＰＣ―Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０７２２８）、ＣＤ９５－ＰＣ―Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０５６２２）及びＣＤ８β－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＩＭ２２１７Ｕ）、ＣＤ４－ＢＶ４２１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１７４３４）で染色した。
　洗浄後、ＰＩを含む染色液で再懸濁し、ＢＤ　ＡｒｉａＩＩ　Ｃｅｌｌ　Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＣＤ８β（＋）細胞中のＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（－）ＣＤ４５ＲＯ（－）をナイーブＴ細胞、ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（＋）ＣＤ９５（＋）ＣＤ４５ＲＯ（＋）をステムセルメモリーＴ細胞、ＣＣＲ７（＋）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）をセントラルメモリーＴ細胞、ＣＣＲ７（－）ＣＤ４５ＲＡ（－）ＣＤ４５ＲＯ（＋）をエフェクターメモリーＴ細胞としてソートした。
　各細胞（およそ３０００細胞／ウェル）を播種し、ベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、ＣＤ３／ＣＤ２８　Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（およそ９０００ビーズ／ウェル）で刺激した。実施例６と同様の培地を用いて培養した。
　培養６、９、１２及び１４日後にそれぞれトリパンブルー法で生細胞数をカウントした。統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。ソート時のゲーティングを図１８Ｂに、またセルカウントの結果を図１８Ｃに示す。
　図１８Ｂ及びＣに示すように、ナイーブＴ細胞、ステムセルメモリーＴ細胞でベルバミンによる有意な細胞増殖の亢進を認めた。
　以上の結果、ベルバミンはナイーブＴ細胞やステムセルメモリーＴ細胞を含むＴ細胞に作用することが示された。
［実施例１６］細胞のマウスへの生着に及ぼす影響
　ベルバミンと培養した細胞がマウスへの生着に及ぼす影響を検討した。実験スキームを図１９（Ａ）に示す。方法は、健常人由来ＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）からＣＤ８　Ｔ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９６－４９５）を用いてＣＤ８Ｔ細胞を精製した。
　精製したＣＤ８Ｔ細胞（２００００細胞／ウェル）を播種し、ベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、追加実施例６と同様の培地と刺激方法で培養し、１０日間培養した細胞を移植細胞とした。
　実験動物には６～１１週齢オスのＮＳＧマウス（日本チャールス・リバー）を用い、尾静脈より移植した（およそ４ｘ１０６細胞）。移植から２週間後に脾臓、末梢血、骨髄を採取しＣＤ８β及びＣＤ４５の陽性率をＦＡＣＳで解析した。
　ＦＡＣＳは脾臓と骨髄はホモジナイズ処理後、末梢血は溶血処理後に９６ウェルプレートに移し、染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＤ８β－ＰＥーｃｙ７（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５－５２７３－４２）及びＣＤ４５－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４０１４）で染色した。
　洗浄後、ＰＩを含む染色液で再懸濁した。ＢＤ　ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ　ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて解析した。ＦｌｏｗＪｏ９で解析したＰＩ陰性細胞集団中のＣＤ８β（＋）ＣＤ４５（＋）細胞の陽性率を測定した。なお、統計解析にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ－ｔｅｓｔを用いた（＊：ｐ＜０．０５）。結果を図１９（Ｂ）に示す。
　図１９（Ｂ）に示すように、脾臓、末梢血、骨髄の全てにおいてベルバミンと培養した細胞はＭｉｌｌｉＱと培養した細胞と比較して有意な生着を認めた。
　以上の結果、ベルバミンと培養した細胞を移植すると、ＭｉｌｌｉＱと培養した細胞と比較して生体内での生着が亢進し、その後の増殖と治療効果を向上させる可能性が示唆された。
［実施例１７］ＮＫ細胞の増殖亢進への影響
　ＮＫ細胞に対するベルバミンの作用を検討した。実験スキームを図２０（Ａ）に示す。方法は、３ドナーの健常人由来ＰＢＭＣ（ＣＴＬ社）からＮＫ　Ｃｅｌｌ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ，　ｈｕｍａｎ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、１３０－０９２－６５７）を用いてＮＫ細胞を精製した。
　精製前後のＮＫ細胞を染色液（２％ＦＢＳを含むＰＢＳ）で洗浄後、ＣＤ５６－ＦＩＴＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３６２５４６）及びＣＤ３－ＡＰＣ－Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３００３１８）で染色した。
　洗浄後、ヨウ化プロピジウムを含む染色液で再懸濁し、ＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩ　Ｆｌｏｗ　Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて測定した。ＦｌｏｗＪｏ１０で解析したＰＩ陰性細胞集団中のＣＤ３（－）、ＣＤ５６（＋）細胞の割合を確認した。ＮＫ細胞精製前後のＦＡＣＳプロットを図２０（Ｂ）に示す。
　図２０（Ｂ）に示すように、ＮＫ細胞を示すＣＤ３（－）、ＣＤ５６（＋）細胞の割合は９割以上と十分であった。この精製したＮＫ細胞（３７０００細胞／ウェル）を播種し、１５％　ＦＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、０４－００１－１Ａ）、Ｌ－Ａｓｃｏｒｂｉｃ　Ａｃｉｄ　２－Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　Ｓｅｓｑｕｉｍａｇｎｅｓｉｕｍ　Ｓａｌｔ　Ｈｙｄｒａｔｅ（Ｌ―ａｓｃ―２Ｐ、５０μｇ／ｍＬ、ｎａｃａｌａｉ　ｔｅｓｑｕｅ、１３５７０－６６）、ＩＴＳ－Ｇ、ＩＬ－７（１０ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ－１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＭＥＭ　Ａｌｐｈａ培地（ｇｉｂｃｏ、１２５７１－０６３）を用いて培養した。
　培地にはベルバミン（ＢＢＭ）１μＭ又は化合物の溶媒であるＭｉｌｌｉＱを対照として添加し、１４日間培養後にトリパンブルー法で生細胞数をカウントした。培養後の細胞数の結果を図２０（Ｃ）に示す。
　図２０（Ｃ）に示すように、ベルバミンにより３ドナー全てでＭｉｌｌｉＱと比較してＮＫ細胞数の増加を認めた。
　以上の結果、ベルバミンがＭｉｌｌｉＱと比較してＮＫ細胞の増殖を亢進させることが示された。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更及び変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年１２月６日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８－２２９４７８）に基づいており、その全体が引用により援用される。

Claims (29)

  1. 　下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含む、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
  2. 　前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が免疫細胞療法用のＴ細胞又はＮＫ細胞である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記Ｔ細胞が未分化Ｔ細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記Ｔ細胞がＣＤ４及びＣＤ８の少なくとも一方を発現している、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞及びターミナルエフェクターＴ細胞からなる群から選ばれる１である請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記制御性Ｔ細胞がＦｏｘＰ３を発現している、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　前記メモリーＴ細胞がステムセルメモリーＴ細胞又は、セントラルメモリーＴ細胞又はエフェクターメモリーＴ細胞である、請求項６に記載の製造方法。
  9. 　前記ＮＫ細胞が未成熟ＮＫ細胞又は成熟ＮＫ細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  10. 　前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン、セファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである請求項１～１０のいずれか１項に記載の製造方法。
  12. 　前記培地が更にＭＡＰＫカスケード阻害剤を含有する、請求項１～１１のいずれか１項に記載の製造方法。
  13. 　前記培地中にフィーダー細胞を含有しない、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記培養する期間が５０日間以上である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
  15. 　請求項１～１４のいずれか１項に記載の製造方法により製造されるＴ細胞又はＮＫ細胞。
  16. 　請求項１５に記載のＴ細胞又はＮＫ細胞を含有する免疫細胞療法剤。
  17. 　下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞培養用の培地。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
  18. 　前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項１７に記載の培地。
  19. 　前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である請求項１７又は１８に記載の培地。
  20. 　前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである請求項１７～１９のいずれか１項に記載の培地。
  21. 　更にＭＡＰＫカスケード阻害剤を含有する請求項１７～２０のいずれか１項に記載の培地。
  22. 　下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の培養方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
  23. 　前記Ｔ細胞又はＮＫ細胞が末梢血由来、初代造血幹・前駆細胞由来又は多能性幹細胞由来の細胞である、請求項２２に記載の培養方法。
  24. 　前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩が、ベルバミン、（＋）－ベルバミン、Ｅ６－ベルバミン及びセファランチン及びその薬学的に許容される塩から選ばれる少なくとも１である、請求項２２又は２３に記載の培養方法。
  25. 　前記培地中の前記ビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩の濃度が０．１ｎＭ～１０μＭである請求項２２～２４のいずれか１項に記載の培養方法。
  26. 　下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を含有する培地中で未分化Ｔ細胞を培養することを含む、前記未分化Ｔ細胞の未分化状態を維持する方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
  27. 　下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の増殖促進剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
  28. 　ＣａＭＫＩＩ阻害剤を含有する培地でＴ細胞又はＮＫ細胞を培養することを含む、Ｔ細胞又はＮＫ細胞の製造方法。
  29. 　ＣａＭＫＩＩ阻害剤が下記式（Ｘ－１）又は式（Ｘ－２）で表されるビスベンジルイソキノリンアルカロイド若しくは１つのエーテル結合が切断した化合物又はその薬学的に許容される塩である請求項２８に記載の製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
     ［式（Ｘ－１）及び式（Ｘ－２）中、
    　Ｒ１及びＲ’１は、それぞれ独立して、Ｈ又は１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
    　Ｒ２、Ｒ’２、Ｒ３、Ｒ’３、Ｒ４、Ｒ’４、Ｒ５及びＲ’５は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３、Ｒ４及びＲ５、Ｒ’２及びＲ’３、若しくはＲ’４及びＲ’５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｒ６、Ｒ’６、Ｒ７、及びＲ’７は、それぞれ独立に、Ｈ、アシル、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ６及びＲ７若しくはＲ’６及びＲ’７は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
    　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、Ｈ、ヒドロキシ、１～１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、アルコキシ、又はアシルオキシ若しくはスルホニルオキシであり、これらは更に置換基を有していてもよく、ｎ１及びｎ３は、それぞれ独立して、０～３の整数であり、ｎ２及びｎ４は、それぞれ独立して、０～４の整数であり、これらは互いに結合して環を形成してもよい。］
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