CN101273989B - 一类小檗胺衍生物及其盐的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一类小檗胺衍生物及其盐在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，主要是在制备预防和治疗与核转录因子NF-κBp65活性相关疾病、与BCR/ABL转录活性相关疾病的药物中的应用。所述药物由本发明所述的化合物和一种或多种药学上可以接受的赋型剂组合制备。制剂形式包括固体制剂、半固体制剂或液体制剂。本发明提供的一类小檗胺衍生物及其盐具有更广和更强的抗白血病与实体肿瘤活性，已证实敏感的肿瘤有白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌；毒副作用更轻。体外细胞培养体系和动物实验证实，小檗胺衍生物和其盐在抗肿瘤剂量下对正常人造血细胞生长和实验动物没有明显毒副作用，优于常用的化疗药物。

Description

一类小檗胺衍生物及其盐的应用

技术领域

本发明涉及化合物及其衍生物的应用，主要涉及小檗胺衍生物及其盐的应用。

背景技术

BCR/ABL融合基因是由造血细胞9号染色体上ABL基因和22号染色体上BCR基因发生融合形成的一种致癌基因，见于95％以上慢性粒细胞白血病和20-30％急性淋巴细胞白血病[Lancet 2007；370：342-50]。已有大量研究资料证实：BCR/ABL融合基因表达的酪氨酸蛋白激酶是导致白血病细胞恶性增殖的主要因素之一。根据这一发病机制，1996年Druker等人发现：酪氨酸蛋白激酶抑制剂伊马替尼(imatinib)可有效治疗BCR/ABL融合基因阳性白血病包括慢性粒细胞白血病和急性淋巴细胞白血病[N Engl J Med.2001，344：1038-1042]。但随着伊马替尼在临床的广泛应用，发现有许多白血病患者应用伊马替尼后出现耐药或无效而导致白血病复发。目前已知的原因主要有2个方面：(1)白血病细胞BCR/ABL融合基因表达的蛋白发生突变，对伊马替尼产生抵抗；(2)伊马替尼对白血病肿瘤干细胞无效[Blood.2007；110：4427-35]。

已知肿瘤干细胞在白血病和其它实体肿瘤的起始、生长、复发和耐药过程中起着十分重要的作用，而目前常用的化疗、放疗等手段对这些肿瘤性干细胞均无明显清除能力[Leukemia.2007；21：926-35]。近年来已有研究资料证实核转录因子NF-κB是肿瘤干细胞存活必需的因子，而相应正常细胞在生理状态下并非必需NF-κB，因此，NF-κB是白血病干细胞和肿瘤干细胞的药物靶分子。同步抑制BCR/ABL融合基因转录和核转录因子NF-κB活性有可能获得比目前常用的伊马替尼和化疗药物更好的抗BCR/ABL阳性白血病效果。特别需要指出的是，已有研究显示：抑制核转录因子NF-κB活性可以获得比其它化疗药物更好的抗白血病及其它实体肿瘤的效果。因此，研制以BCR/ABL融合基因转录产物和肿瘤干细胞NF-κB为靶分子的新型高效低毒靶向性药物显得十分迫切。

本发明人前期的研究已证实，小分子化合物小檗胺具有明显抗人白血病作用[Leukemia Research.2006，30：17-23]，但达到抗白血病和抗肿瘤效果所需药量很大。我国学者上世纪已有少量文献报道小檗胺衍生物4乙氧丁基小檗胺(0-4-ethoxy-butyl-berbamine，简称EBB)具有抑制小鼠肝癌生长[World JGastroenterol 2004，10：950-953]，诱导体外培养的人肺癌细胞凋亡[山西师范大学学报(自然科学版)2001年04期55-58页]，其抗肿瘤活性高于小檗胺，但它只能短暂抑制肿瘤细胞生长，不能完全清除肿瘤。也未见4乙氧丁基小檗胺抑制人Bcr/Abl基因阳性的白血病、多发性骨髓瘤等血液系统肿瘤的研究报导和专利，也未见4乙氧丁基小檗胺抑制核转录因子NF-κB活性和肿瘤干细胞活性的研究报导和专利。迄今为止，未见除4乙氧丁基小檗胺外的其它小檗胺衍生物和其盐具有拮抗BCR/ABL融合基因转录和核转录因子NF-κB活性的报道和专利，也未见除4乙氧丁基小檗胺外的其它小檗胺衍生物和其盐在制备治疗血液系统恶性肿瘤如白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤，和实体肿瘤如肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、骨肉瘤等药物中的应用的研究和专利报导。

小檗胺，                                  4-乙氧丁基小檗胺

berbamin                                  O-(4-ethoxybutyl)berbamine

发明内容

本发明的目的是提供4乙氧丁基小檗胺以外的小檗胺衍生物和其盐在制备治疗抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括但不限于白血病、多发性骨髓瘤和实体肿瘤如肝癌、骨肉瘤、乳腺癌等，所述的小檗胺衍生物是指除4乙氧丁基小檗胺外的具有通式(I)和通式(II)的小檗胺衍生物和其盐：

本发明也包括4乙氧丁基小檗胺以外具有通式(I)和(II)小檗胺衍生物的互变异构体或立体异构体在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

通式(I)                                    通式(II)

式中：

R为除4-乙氧基-丁基外的C₁-C₁₈的直链或支链烷烃、烯烃或炔烃；C₃-C₇的环烷烃、环烯烃；或者连有其他取代基团的烷基；

式中：

R也可以为

其中R₁为氢或者单取代、多取代的：烷氧基、烷巯基、氢、烷基、C₃-C₇的环烷基或者C₁-C₁₀的连有其他取代基团的烷基、氟、氯、溴、碘、硝基、氨基、氰基；

式中：

R也可以为

其中X为O、S或者NH，R₂为氢或者单取代、多取代的：烷基、C₃-C₇的环烷基或者C₁-C₁₀的连有其他取代基团的烷基、氟、氯、溴、碘、硝基；

式中：

R也可以为

其中R₃为氢或单取代、多取代的：烷基、C₃-C₇的环烷基或者C₁-C₁₀的连有其他取代基团的烷基、氟、氯、溴、碘、硝基；

式中：

R也可以为单个或多个杂原子取代的七元环。

本发明的优选化合物是但不限于4-氯苯甲酰小檗胺[4-chlorobenzoylberbamine]、3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺[O-(3，4，5-trimethoxybenzoyl)berbamine]、4-甲氧基苯甲酰小檗胺[4-methoxybenzoyl berbamine]、2-甲基苯甲酰小檗胺[2-methylbenzoylberbamine]、苄基小檗胺[O-(benzyl)berbamine]、4-硝基苄基小檗胺[O-(4-nitrobenzyl)berbamine]、乙基小檗胺[O-(ethyl)berbamine]、3-溴丙基小檗胺[O-(3-bromopropyl)berbamine]、苯甲酰小檗胺[Benzoyl berbamine]、4-硝基苯甲酰小檗胺[4-nitrobenzoyl berbamine]；和上述化合物互变异构体或立体异构体，或其盐。

通式(I)和通式(II)小檗胺衍生物和其盐显示了极好的BCR/ABL转录和核转录因子NF-κBp65的拮抗活性，因而，它们特别适合预防和治疗与BCR/ABL转录活性相关疾病如慢性粒细胞白血病、部分急性淋巴细胞白血病等，以及核转录因子NF-κBp65活性相关的疾病如白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等。

更特别地，通式(I)和通式(II)小檗胺衍生物和其盐对治疗BCR/ABL基因阳性白血病如慢性粒细胞白血病和核转录因子NF-κBp65过度活化有关的血液肿瘤性疾病例如但不限于慢性粒细胞白血病、急性白血病、多发性骨髓瘤有效。

式(I)和式(II)小檗胺衍生物及其盐类对治疗核转录因子NF-κBp65过度活化的实体肿瘤例如但不限于肝癌、骨肉瘤、乳腺癌等也有效。

而且，本发明提供了药物，该药物包括一种如上所述的化合物，和任选的药学上可以接受的赋型剂。

通式(I)和式(II)的化合物的典型盐包括通过将本发明的化合物与无机或有机酸反应而制备的盐。这种盐被分别称作酸式加成盐。形成酸式加成盐的酸包括无机酸，例如但不限于盐酸、硫酸、磷酸、氢溴酸、氢碘酸等；和有机酸，例如但不限于对甲苯磺酸、甲基磺酸、草酸、对溴苯磺酸、碳酸、丁二酸、柠檬酸、苯甲酸、乙酸等。

本发明的化合物或其盐可以经修饰形成低级烷基酯或已知的其它酯；和/或水合物或其它溶剂化物。这些酯、水合物和溶剂化物也包括在本发明的范围之内。

本发明的化合物可以以口服的形式给药，例如但不限于普通片剂和肠溶片、胶囊、药丸、粉剂、粒剂、酊剂、溶液、悬浮液和糖浆剂。它们也可以以肠胃外的形式给药，例如但不限于药学领域的普通人熟知的静脉内、腹膜腔内、皮下和肌肉等形式。

使用本发明的化合物的剂量方案由本领域的普通技术人员根据各种因素来选择所述因素包括但不限于：年龄、体重、性别和接受者的体格状况、需要治疗的疾病的严重程度、给药的途径、接受者的代谢水平和排泄功能、采用的剂量形式、采用的具体化合物和其盐。

本发明的化合物优选在给药之前与一种或多种药学上可以接受的赋型剂一起配制。赋型剂是惰性物质，例如但不限于载体、稀释液、调味剂、甜味剂、润滑剂、增溶剂、悬浮剂、粘合剂、药品崩解剂和胶囊材料。

本发明的另一个具体实施方案是药物制剂，该制剂包括本发明的化合物和一种或多种药学上可以接受的赋型剂，该赋型剂可以与该制剂中的其它成分相容且对其接受者无害。本发明的药物制剂通过将治疗有效量的本发明的化合物与一种或多种药学上可以接受的赋型剂组合来制备。在制备本发明的组合物过程中，所述活性成分可以与稀释剂混合、或被封闭在载体内，该载体可以是胶囊、小袋、包装纸或其它容器。该载体可以用作稀释剂，可以是用作运载体的固体、半固体或液体材料；或是药片、药丸、粉剂、锭剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、软和硬的凝胶胶囊、栓剂、无菌的注射溶液和无菌的包装粉剂。

对于口服给药，所述活性成分可以与口服的、非毒性的药学上可以接受的载体组合，该载体例如但不限于：乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、碳酸钠、甘露醇、山里糖醇、碳酸钙、磷酸钙、硫酸钙、甲基纤维素等；任选地还可以与崩解剂、结合剂、润滑剂组合，该崩解剂例如但不限于：玉米、淀粉、甲基纤维素、琼脂润土、黄原胶、褐藻酸等；结合剂例如但不限于凝胶、天然食糖、β-乳糖、玉米甜料、天然和合成橡胶、阿拉伯树胶、羧甲基纤维素、聚乙二醇、石蜡等；润滑剂例如但不限于：硬脂酸镁、硬脂酸钠、硬脂酸、油酸钠、苯甲酸钠、乙酸钠等。

在粉剂形式中，所述载体可以是与细碎的活性成分混合的细碎的固体。该活性成分可以以合适的比例与具有结合属性的载体混合，并压成希望的形状和大小，从而形成片剂。所述粉剂和片剂优选含有1％到99％重量的活性成分，该活性成分是本发明的新组合物。合适的固体载体是羧甲基纤维素镁、低熔点的蜂腊和可可油。

无菌的液体制剂包括悬浮液、乳状液和糖浆。所述活性成分能够溶解或悬浮在药学上可接受的载体中，例如无菌水、无菌有机溶剂、或无菌水和无菌有机溶剂的混合物。

所述活性成分也可以溶解在合适的有机溶剂中，例如，丙二醇水溶液，其它的组合物可以通过将细碎的活性成分分散在淀粉水溶液或羧甲基纤维素溶液或合适的油中来制备。

上述制剂可以以单位剂型存在，该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元，适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂，或是很多胶囊或片剂。“单位剂量”是本发明的活性化合物的预定量，经过计算使其与一种或多种赋型剂组合能产生理想的治疗效果。根据所涉及的具体治疗，活性成分的单位剂量的量可以在约0.1到约1000毫克或更多之间进行变化或调整。

本发明在进行抗白血病和肿瘤药物筛选时发现：小檗胺结构中的游离酚羟基可以进行修饰或改造，由通式(I)和通式(II)产生的一些小檗胺衍生物和其盐具有比小檗胺母体和已往文献报道的小檗胺衍生物4乙氧丁基小檗胺具有更强的抗白血病和实体肿瘤作用，尤其是对BCR/ABL融合基因阳性白血病如慢性髓系白血病、部分急性淋巴细胞白血病等，以及核转录因子NF-κB过度活化的肿瘤如多发性骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤等在内的肿瘤细胞清除活性是4乙氧丁基小檗胺和小檗胺的8～24倍。对其作用分子机制研究发现，通式(I)和通式(II)产生的一些小檗胺衍生物和其盐通过抑制BCR/ABL融合基因转录和阻止肿瘤细胞NF-κB p65亚单位从细胞浆进入细胞核全新分子机制靶向性诱导白血病、骨髓瘤及实体肿瘤干细胞死亡。

本发明小檗胺衍生物与小檗胺和以往文献报道的4乙氧丁基小檗胺相比，具有的有益效果是：(1)具有更广和更强的抗白血病与实体肿瘤活性，已证实敏感的肿瘤有白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、骨肉瘤、乳腺癌；(2)毒付作用更轻。体外细胞培养体系和动物实验证实，小檗胺衍生物和其盐在抗肿瘤剂量下对正常人造血细胞生长和实验动物没有明显毒副作用，优于常用的化疗药物。

附图说明

图1为小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺对人白血病K562细胞BCR/ABL融合基因转录影响(药物浓度2μg/ml)。

图2为小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺对人白血病K562细胞核内核转录因子NF-κB影响(药物浓度2μg/ml)。

图3为白血病荷瘤小鼠口服小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺(用药组)和生理盐水(对照组)后肿瘤重量和体重变化。

具体实施方式：

在下列实施例中，将更加具体地解释本发明。但应理解，下列实施例旨在说明本发明而不对本发明的范围构成任何限制。

实施例1：新合成小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺与已知小檗胺衍生物4乙氧丁基小檗胺和小檗胺抗人白血病活性比较

(1)实验材料

细胞株：人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。

试剂：小檗胺标准品购自中国药品生物制品鉴定所，小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺和4乙氧丁基小檗胺为我们自己合成。

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50值)。

(3)实验结果

实验结果证明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺、4乙氧丁基小檗胺和小檗胺都能诱导人白血病细胞系K562细胞死亡和抑制白血病细胞生长。但4-氯苯甲酰小檗胺4乙氧丁基小檗胺和小檗胺48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50)分别为0.5μg/ml、4μg/ml和12μg/ml。4-氯苯甲酰小檗胺抗白血病活性是4乙氧丁基小檗胺的8倍，小檗胺的24倍，表明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗白血病作用明显强于4乙氧丁基小檗胺和小檗胺。

实施例2：新合成小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺和其盐酸盐-盐酸4-氯苯甲酰小檗胺抗人白血病活性比较

(1)实验材料

细胞株：人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺和其盐酸盐-盐酸4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成。

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50值)。

(3)实验结果

实验结果证明4-氯苯甲酰小檗胺和盐酸4-氯苯甲酰小檗胺都能明显诱导人白血病细胞系K562细胞死亡和抑制白血病细胞生长。4-氯苯甲酰小檗胺和盐酸4-氯苯甲酰小檗胺的48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50)分别为0.5μg/ml和0.35μg/ml，表明4-氯苯甲酰小檗胺盐-盐酸4-氯苯甲酰小檗胺同样具有很强的抗白血病活性。

实施例3：新合成小檗胺衍生物3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺、4-甲氧基苯甲酰小檗胺和2-甲基苯甲酰小檗胺抗人白血病活性测定

(1)实验材料

细胞株：人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。

试剂：3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺、4-甲氧基苯甲酰小檗胺和2-甲基苯甲酰小檗胺为我们自己合成。

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的白血病细胞8000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50值)。

(3)实验结果

实验结果证明3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺、4-甲氧基苯甲酰小檗胺和2-甲基苯甲酰小檗胺都能诱导人白血病细胞系K562细胞死亡和抑制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50)依次为0.75μg/ml、0.3μg/ml和0.25μg/ml。这三种小檗胺衍生物抗白血病活性均明显强于已知小檗胺衍生物4乙氧基丁基小檗胺和小檗胺本身。

实施例4：新合成小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗人原代白血病细胞活性测定

(1)实验材料

人原代白血病细胞：人原代白血病细胞取自经知情同意后的用于其它检验用的患者外周血，用密度梯度法无菌分离和纯化白血病细胞，待用。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成。

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取上述原代人白血病细胞200000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50值)。

(3)实验结果

实验结果证明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺能明显诱导人原代白血病细胞死亡和抑制白血病细胞生长，其48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50)为1.0μg/ml。

实施例5：新合成小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗人多发性骨髓瘤细胞活性测定

(1)实验材料

细胞株：人多发性骨髓瘤细胞系U266由浙江大学医学院附属第二医院血液科提供。

试剂：4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成。

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的人多发性骨髓瘤细胞系U266细胞10000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入不同浓度的药物，混匀后，置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％，并计算出药物作用后细胞活力(％)和48小时白血病细胞半数生长抑制浓度(48小时IC50值)。

(3)实验结果

实验结果证明4-氯苯甲酰小檗胺能诱导人多发性骨髓瘤细胞系U266细胞死亡，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为0.45μg/ml，表明4-氯苯甲酰小檗胺具有抗人多发性骨髓瘤活性。

实施例6：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗人肝癌细胞作用测定

(1)实验材料

细胞株：人肝癌细胞系HepG2购自中国科学院上海细胞库。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的人肝癌细胞系HepG2细胞4000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％。

(3)实验结果

实验结果证明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺能明显诱导肝癌细胞系HepG2细胞死亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为0.85μg/ml，表明4-氯苯甲酰小檗胺具有抗人肝癌细胞活性。

实施例7：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗人骨肉瘤细胞作用测定

(1)实验材料

细胞株：人骨肉瘤细胞系MG63由浙江大学医学院附属第二医院骨科研究所提供。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的人骨肉瘤细胞系MG63细胞3000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％。

(3)实验结果

实验结果证明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺能明显诱导人骨肉瘤细胞系MG63细胞死亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为1.25μg/ml，表明4-氯苯甲酰小檗胺具有抗人骨肉瘤细胞系MG63活性。

实施例8：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺抗人乳腺癌细胞作用测定

(1)实验材料

细胞株：人乳腺癌细胞系MCF-7由浙江大学医学院附属第二医院肿瘤研究所提供。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成

仪器：细胞培养箱，酶标仪

(2)实验方法

取生长良好的人乳腺癌细胞系MCF-7细胞4000个，接种到96孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时后，加入不同浓度的药物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后用MTT法测定活细胞浓度，并计算出药物作用后细胞活力(％)。在本实验中对照组(不加药物处理)细胞活力设为100％。

(3)实验结果

实验结果证明小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺能明显诱导人乳腺癌细胞系MCF-7细胞死亡，并抑制其生长，其48小时半数生长抑制浓度(48小时IC50)为0.65μg/ml，表明4-氯苯甲酰小檗胺具有抗人乳腺癌细胞系MCF-7活性。

实施例9：小檗胺衍生物对人白血病细胞K562BCR/ABL融合基因转录影响

(1)实验材料

细胞株：人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。

试剂：4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成

仪器：细胞培养箱，PCR仪

(2)实验方法

取生长良好的白血病细胞，接种到6孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养24小时后，加入小檗胺衍生物，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后按常规法提取细胞RNA。用RT-PCR测定BCR/ABLRNA含量。

(3)实验结果

参见图1，实验结果证明小檗胺衍生物对K562白血病细胞BCR/ABL转录具有明显抑制作用，从图中可以看出白血病细胞经药物作用3小时后其Bcr/Abl融合基因转录产物RNA含量开始下降，至12小时时基本测不到。

实施例10：小檗胺衍生物对人白血病细胞K562核转录因子NF-κB进核影响

(1)实验材料

细胞株：人K562白血病细胞系购自中国科学院上海细胞库。

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺为我们自己合成

仪器：细胞培养箱，电泳仪、蛋白转印仪

(2)实验方法

取生长良好的白血病细胞，接种到6孔细胞培养板孔内。培养液为含10％胎牛血清的1640细胞培养液。加入4-氯苯甲酰小檗胺，混匀后，继续置二氧化碳(5％CO2)细胞培养箱37℃培养48小时。然后按常规法提取细胞核蛋白，用免疫印迹技术测定细胞核内NF-κBp65含量。

(3)实验结果

参见图2，可以看出白血病细胞经药物作用1小时后其核内核转录因子NF-KBp65含量明显减少，至6小时时基本测不到。证明4-氯苯甲酰小檗胺阻止K562白血病细胞NF-κBp65进核。

实施例11：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺对人白血病K562裸鼠体内异种移植瘤生长和动物毒性影响

(1)实验材料

实验动物：裸鼠购于中国科学院上海动物中心

试剂：小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺自己合成

仪器：细胞培养箱

(2)实验方法

取7周龄裸鼠，在其背部皮下接种人白血病细胞K5625×10⁷/每只鼠。24小时后，随机分2组。用药组：口服小檗胺衍生物4-氯苯甲酰小檗胺30mg每公斤体重，每天3次(灌渭)。对照组：用生理盐水代替，连用10天。共观察30天，期间测量裸鼠瘤重、体重以及活动与饮食等情况。实验结束时，处死小鼠，取肿瘤组织，测实际重量。

(3)实验结果

参见图3，实验结果证明4-氯苯甲酰小檗胺对人白血病裸鼠体内异种移植瘤生长具有明显抑制作用。从图中可以看出用药组肿瘤平均瘤重明显低于未用药组。实验期间两组实验动物体重没有明显差异，未见其它明显毒副反应。

实施例12：表1列出了本发明专利通式(I)和通式(II)化合物中七个代表化合物在不同药物浓度下抗人白血病细胞活性，并与文献报道的4乙氧丁基小檗胺和小檗胺进行比较。由表1可见，本发明专利通式(I)和通式(II)一些化合物如4-氯苯甲酰小檗胺、4-甲氧基苯甲酰小檗胺、2-甲基苯甲酰小檗胺、3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺等抗白血病活性是文献报道的4乙氧丁基小檗胺和小檗胺的8～24倍。

表1本发明专利小檗胺衍生物和4乙氧丁基小檗胺及小檗胺抗白血病活性比较

说明：(1)所用细胞为BCR/ABL融合基因阳性K562白血病细胞；(2)未加药组白血病细胞活性设为100％。

Claims (5)

1.一种小檗胺衍生物及其盐在制备治疗与预防白血病药物中的应用，所述的小檗胺衍生物及其盐的通式为：

式中：

R为

其中R₁为氢或者单取代、多取代的：烷氧基、烷巯基、氢、烷基；其特征是，所述化合物是2-甲基苯甲酰小檗胺、3，4，5-三甲氧基苯甲酰小檗胺、4-甲氧基苯甲酰小檗胺。

2.一种小檗胺衍生物及其盐在制备治疗白血病药物中的应用，其特征是，所述化合物是4-氯苯甲酰小檗胺、苄基小檗胺、4-硝基苄基小檗胺、4-溴苄基小檗胺。

3.一种小檗胺衍生物及其盐在制备治疗白血病、多发性骨髓瘤、肝癌、乳腺癌、骨肉瘤相关疾病的药物中的应用，其特征是，所述化合物是4-氯苯甲酰小檗胺。

4.根据权利要求1-3任一所述的一类小檗胺衍生物及其盐的应用，其特征是：所述药物由本发明所述的化合物和一种或多种药学上可以接受的赋型剂组合制备。

5.根据权利要求4所述的制剂，其特征是：制剂形式包括固体制剂、半固体制剂或液体制剂。

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