CN100493609C - 抗恶性肿瘤的药物组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可以抗肿瘤活性并且毒性低的抗恶性肿瘤药物组合物以及以此药物组合物作为活性成分的抗恶性肿瘤药物制剂，该药物组合物由能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑或其衍生物或其中间体组成。实验验证，能够增加胞内cAMP水平的腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、磷酸二酯酶抑制剂茶碱、IBMX能够协同增加羧胺三唑对SH-SY5Y、Bel-7402和HeLa细胞系增殖的抑制效应，可作为对多种肿瘤治疗中的广谱药物应用。

Description

抗恶性肿瘤的药物组合物及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种抗恶性肿瘤药物，特别涉及羧胺三唑和能升高细胞内cAMP浓度水平的药物协同作用而得到的一系列抗恶性肿瘤药物组合物。
背景技术
人类发现恶性肿瘤已有3000年以上历史。恶性肿瘤是一种细胞的不受控制的无序的异常增生现象。恶性肿瘤细胞与正常细胞相比，有结构、功能和代谢的异常，它们具有超过正常的增生能力，这种增生和机体不相协调。恶性肿瘤的发生过程称为癌变。癌变是一个复杂的、多阶段的过程。多数恶性肿瘤可能从单个细胞演变而来。恶性肿瘤细胞的特性包括细胞的无休止和无序的分裂，并有侵袭性(向周围组织浸润)和转移性。
恶性肿瘤一般亦根据其组织来源来命名。来源于上皮组织的统称为癌(carcinoma)，命名时在其来源组织名称之后加“癌”字，如来源于鳞状上皮的恶性肿瘤称为鳞状细胞癌。从间叶组织(包括纤维结缔组织、脂肪、肌肉、脉管、骨、软骨组织等)发生的恶性肿瘤统称为肉瘤(sarcoma)，其命名方式是在来源组织名称之后加“肉瘤”，例如纤维肉瘤等。如一个肿瘤中既有癌的结构又有肉瘤的结构，则称为癌肉瘤(carcinosarcoma)。在病理学上，癌是指上皮组织来源的恶性肿瘤，但习惯上“癌症”(cancer)常泛指所有恶性肿瘤。
在各种疾病中，癌症是致人死亡的主要疾病之一。据世界卫生组织报告，每年世界上有超过1000万起新的癌症病例发生。在2000年，有530万例男性和470万例女性发生恶性肿瘤，总计有620万例死于此病，全球因恶性肿瘤死亡的占了总死亡人数的12％。尽管有先进的医疗技术，由于平均寿命的延长，生活方式的改变以及抽烟等原因，如果没有进一步抑制癌症的措施，预计到到2020年全球癌症发病率将上升50％，发病人数将达到1500万。报告中还指出，在发展中国家同发达国家一样，癌症已成了一个主要卫生问题。肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肝癌和子宫颈癌是最发病率最高的几种癌症。癌症前三位死因与前三位常见癌症有所不同，癌症前三位死因是：肺癌，占所有癌症死亡的17.8％，胃癌10.4％，肝癌8.8％。
目前治疗恶性肿瘤的主要方法包括：手术治疗、抗癌药物的化学治疗、放射治疗和生物反应调节剂及其它治疗。其中化疗在白血病，中晚期恶性肿瘤治疗中占有不可替代的地位。但是，由于抗恶性肿瘤药物的选择性差，毒副作用大，造成恶性肿瘤患者免疫功能低下，生活质量降低，这使得化疗药物的使用受到一定的限制。另外，多药耐药性的产生也限制了化疗药物的使用。因此，研究新一代的低毒高选择性、耐药性低的药物以及改进治疗方法成为恶性肿瘤治疗的当务之极。其中，通过联合用药来增强药物的抗恶性肿瘤活性并降低药物毒性是一种发展趋势。
发明创造内容
本发明的目的是提供一种可以抗恶性肿瘤活性并且毒性低的抑制恶性肿瘤药物组合物。
本发明的另一目的是提供以这种药物组合物作为活性成分的抑制恶性肿瘤药物制剂。
本发明的再一目的是提供这种药物组合物作为恶性肿瘤治疗中的药物的应用。
本发明所提出的抗恶性肿瘤药物组合物，是由能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑或其衍生物或其中间体组成。
上述抗恶性肿瘤药物组合物，所述能升高细胞内cAMP浓度水平的药物为腺苷酸环化酶激活剂Forskolin及其衍生物、磷酸二脂酶抑制剂茶碱及其衍生物、Gs蛋白偶联受体的激动剂IBMX及其衍生物中的一种或多种，所述能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑或其衍生物或其中间体的质量比为10～10000：100。
具体的，所述Forskolin与羧胺三唑或其衍生物或其中间体组合的质量比为20～100：100；所述茶碱与羧胺三唑或其衍生物或其中间体组合的质量比为500～2000：100；所述IBMX与羧胺三唑或其衍生物或其中间体组合的质量比为500～2000：100。
上述抗恶性肿瘤药物组合物，既可以为一种或几种所述升高胞内cAMP水平的药物和羧胺三唑及其中间体或衍生物的组合，也可以是一种或几种升高胞内cAMP水平的药物衍生物和羧胺三唑及其中间体或衍生物的组合。
本发明提供的抗恶性肿瘤药物制剂，是以上述抗恶性肿瘤药物组合物作为活性成分，并辅以可接受的药用载体。所述制剂为片剂、胶囊、或口服液。
上述抗恶性肿瘤药物组合物和制剂直接可以作为肿瘤治疗中的药物。
总的说来，本发明涉及对病人施予治疗有效量的一种药物组合物，该组合物的本身，由治疗有效比例和量的能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑，或其衍生物或中间体组成。该组分能够协同羧胺三唑抑制恶性肿瘤的生长，降低羧胺三唑的有效剂量，进而增加羧胺三唑的疗效并且降低羧胺三唑的毒副作用。本发明的药用组合物和制剂，可作为多种恶性肿瘤治疗(如非小细胞性肺癌和前列腺癌等)的药物。
附图说明
图1描述的是SH-SY5Y细胞给药48小时后，细胞计数观察所得的Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制SH-SY5Y细胞增殖协同效应的试验结果。
图2描述的是HeLa细胞给药48小时后，细胞计数观察所得的Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制HeLa细胞增殖协同效应的试验结果。
图3描述的是Bel-7402细胞给药48小时后，细胞计数观察所得的Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制Bel-7402细胞增殖协同效应的试验结果。
图4描述的是移植性Lewis’LC肿瘤的小鼠给药8天后，称量肿瘤组织重量所得的Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制小鼠移植性Lewis’LC肿瘤生长协同效应的试验结果。
具体实施方式
本发明的药物组合物是由能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑或其衍生物或中间体组成。
已知的能够升高胞内cAMP水平的药物有①直接激活腺苷酸环化酶的物质，例如Forskolin等；②抑制cAMP磷酸二酯酶的物质，例如茶碱(theophylline)、3—异丁基—1—甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)及它们的衍生物等。这些药物能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖(Lingzhi Zhang，2004；SN Kim，2001)，其可能的作用机理是通过升高细胞内cAMP的水平，进而激活蛋白激酶A(proteinkinase A，PKA)，再通过调控蛋白磷酸化或基因的转录或表达来影响细胞的增殖和凋亡。
其中，Forskolin(结构式如下)是国外20世纪70年代首先从印度唇形科锦紫苏属植物毛喉鞘蕊花(coleus forskohlii)根中提取的二萜类化合物，具有强心、降血压、平喘、消炎、抗血小板聚集、降低眼压等作用。研究认为Forskolin通过直接激动腺苷酸环化酶，提高多种组织细胞内的环腺苷酸(cAMP)浓度，从而参与多种细胞功能调节，在体内起着广泛的调节作用。国外把forskolin的粗提取物作为一种保健品，用于减肥。在印度Shri C.B.Patel研究中心所做的一项人体试验中，有60名肥胖患者参与了该项研究。这些患者每天分两次饭前服用500mg的
Figure C200510002387D00051
(内含10％forskolin)，连续服用12周。在研究结束时，这些患者的体重获得明显的下降，平均下降了2.3％。在研究中，没有出现任何毒副作用，这表明forskolin对人体的毒性是非常小的。美国Sabinsa公司在印度的研究机构Sami实验室现在已经开发出一种稳定的forskolin滴眼液，用于治疗青光眼和降低眼压，在临床前动物试验中取得了令人满意的结果，现正计划进行一项多中心的临床试验。
Figure C200510002387D00061
茶碱是一种磷酸二脂酶抑制剂，通过抑制cAMP磷酸二酯酶，减少cAMP的降解，升高细胞内的cAMP的水平。茶碱及其衍生物(如氨茶碱、二羟丙茶碱)现在已经广泛应用于临床治疗，主要用于治疗支气管哮喘、喘息性支气管炎、阻塞性肺气肿以及心源性水肿，心绞痛等。茶碱能松弛平滑肌，兴奋心肌，兴奋中枢，并有利尿作用。其松弛平滑肌的作用对处于痉挛状态的支气管更为突出。对急、慢性哮喘，不论口服、注射或直肠给药，均有疗效。对喘息性慢性支气管炎，由于它能兴奋骨骼肌，可增强呼吸肌收缩力和减轻患者呼吸肌疲劳的感觉。
IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，结构式如下)是黄嘌呤的衍生物之一。由于它能比较特异地抑制cAMP磷酸二酯酶，减少cAMP的降解，所以广泛应用于各种有关cAMP的试验研究中，以防止由于磷酸二酯酶降解造成的cAMP水平改变。目前尚未见到其作为药物用于临床医学的报道。
Figure C200510002387D00062
羧胺三唑(Carboxyamidotriazole，CAI)的化学名是5-胺基-1-[3，5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苄基]-1H-1，2，3-三唑-4-苯甲酰胺；(1H-1，2，3-Triazole-4-carboxamide，5-amino-1-[[3，5-dichloro-4-(4-chlorobenzoyl)phenyl]methyl]-)(US Patent 4590201)。其中间体是4-(4-氯苯甲酰基)-3，5-二氯苄基叠氮。根据其取代和修饰部位其衍生物可以分为4个家族：(I)在三唑环上的取代物；(II)去掉苯甲酮基团后的衍生物；(III)去掉苯甲酮基团上的卤素原子或部分去掉苯甲酮基团的产物；(IV)去掉三唑或改变苯甲酮基团上的取代基之产物。
有研究发现CAI具有抗恶性肿瘤细胞增生和抗转移作用。并且与一般细胞毒药物比较，其毒副作用非常低，可能是一种有希望的新型抗恶性肿瘤药物。另有文献报道(Kohn EC，et al，Cancer Res.54：935~942)，CAI的上述衍生物也具有抗肿瘤作用，但强度低于CAI。
临床前研究发现CAI能抑制血管内皮增生，从而抑制肿瘤新生血管生成。其作用机理仍然不清楚。有研究表明，CAI可能通过抑制细胞膜上的非激活型钙离子通道，影响血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)激活其受体(VEGFR-2)后的信息传递通路，从而抑制了由此导致的血管内皮增生，抑制了肿瘤新生血管的生成。(Faehling M.，Kroll J.et al.Essential role of calciumin vascular endothelial growth factor A-induced signalling：mechanicsm of theantiangiogenic effect of carboxyamidotriazole.FESEB J.16：1805(2002))。
实验证明CAI对多种恶性肿瘤细胞系具有抑制作用，其中包括成胶质细胞瘤细胞(Jacobs，W；Mikkelsen T，Kohn EC et al.Inhibitory effects of CAI in glioblastoma growthand invasion.J Neurooncol.32(2)：93-101，1997)、头颈鳞状细胞癌细胞(Wu Y，PaladAJ，Kohn EC et al.Inhibition o f head and neck squamous cell carcinoma growth andinvasion by the calcium influx inhibitor carboxyamido-triazole.Clin Cancer Res.3(11)：1915-21，1997)、乳腺癌细胞(Lambert PA，Somers KD，Kohn EC et al.Antiproliferativeand antiinvasive effects of carboxyamido-triazole on breast cancer celllines.Surgery.122(2)：372-8；discussion 378-9，1997；Yeh YA，Weber G，Quercetin：synergistic actionwith carboxyamidotriazole in human breast carcinoma cells.Life Sci.57(13)：1285-92，1995；Kohn EC，Liotta LA L651582：a novel antiproliferative and antimetastasis agent.JNatl Cancer Inst.82(1)：54-60，1990)、膀胱癌细胞(Kohn EC，Liotta LA L651582：anovel antiproliferative and antimetastasis agent.J Natl Cancer Inst.82(1)：54-60，1990)、神经胶质细胞瘤(Kohn EC，Liotta LA L651582：a novel antiproliferative andantimetastasis agent.J Natl Cancer Inst.82(1)：54-60，1990)、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞(Wasilenko WJ，Palad AJ，Kohn EC et al.Effects ofthe calcium influx inhibitorcarboxyamido-triazole on the proliferation and invasiveness of human prostate tumor celllines.Int J Cancer.68(2)：259-64，1996)、黑色素瘤细胞(Fink-Puches R，Helige C，Kerl H et al.Inhibition of melanoma cell directional migration in vitro via different cellulartargets.Exp Dermatol.2(1)：17-24，1993)及卵巢癌细胞(Kohn EC；Liotta，LA L651582：a novel antiproliferative and antimetastasis agent.J Natl Cancer Inst.82(1)：54-60，1990)等数十种肿瘤细胞的增生。同时也抑制裸鼠中形成的原发及转移瘤的生长及转移。
国内外已经和正在进行的若干临床实验也证实了CAI能广谱地抑制肿瘤的生长、侵袭及转移，并且毒性作用较小。
国外已经完成的临床I期和II期试验研究有如下7项：
1.CAI治疗难以控制的肿瘤之I期临床试验研究(NCI-92-C-0054P，NCI-MB-281)
2.CAI与酮康唑联合治疗晚期恶性肿瘤的I期临床试验研究(UCCRC-9019，CI-T97-0086)
3.每日口服CAI治疗难治性实体瘤和淋巴瘤的I/II期临床试验研究(WCCC-C0-9397，NCI-T93-0193C)
4.CAI治疗转移性肾细胞癌的II期随机临床试验研究(CLB-69901)
5.CAI治疗免疫疗法无效的晚期肾细胞癌患者的II期临床试验研究(E-4896)
6.CAI与放射疗法共同用于幕上成胶质细胞瘤的II期临床试验(JHOC-NABTT-9904，NABTT-9904)
7.口服CAI治疗雄性激素非依赖性前列腺癌的II期临床试验研究(NCI-97-C-0059C，NCI-T96-0053)
正在进行中的临床试验研究有如下3项：
1.CAI治疗晚期实质性肿瘤或难治性淋巴瘤的I期临床试验研究(NCI-95-C-0015F，NCI-CPB-334，NCI-T94-0006N)
2.CAI治疗难治性或复发性卵巢上皮癌、输卵管癌或原发性腹膜癌的II期临床试验研究(NCI-98-C-0012，NCI-T97-0112)
3.口服CAI治疗III期非小细胞性肺癌的III期临床试验研究(NCCTG-972451，CTSU)
从上述材料可以发现，若干I、II期临床试验结果已经证明了CAI的安全性和初步的有效性，并取得一系列有关临床剂量和药物代谢数据的基础上，已经针对具体的肿瘤开始进行III期临床试验。
经中国国家食品药品监督管理局批准，由中国医学科学院基础医学研究所主持进行的CAI抗恶性肿瘤作用的I期临床试验也正在进行中。
发明人对羧胺三唑在体外、体内抑制肿瘤细胞生长的作用进行的实验研究显示：羧胺三唑对培养中的11种人癌细胞株都显示出不同程度的抑瘤活性，尤以对U251，A549，MCF-7最为敏感，IC50<1μg/ml，对Bel-7402、PAA也有较强的抑制作用，IC50值为1.056和3.753μg/ml。对HCT-8，EJ，BGC-803，431和A2780的IC50值在4.079-6.851μg/ml，CaEs-17细胞的IC50<10μg/ml。
体内实验已完成羧胺三唑对7株动物移植性肿瘤和2株人癌细胞裸鼠移植的药效观察。羧胺三唑口服用药剂量为40mg/kg，20mg/kg和10mg/kg，给药8次后，对S180，ESC，Lewis LC，EMT6和B16五个动物瘤株的抑制率，高剂量为45～66％，中剂量为30～40％，低剂量多数低于30％，但对H22和L1210未显示抑瘤作用。对人癌BTEP-Sml和OS732，给药14次后高剂量抑瘤率分别为59.42和66.31％，上述结果统计学t测验P值均小于0.001。表明羧胺三唑对多数瘤株的作用显示出明确的量效关系。
羧胺三唑抑制小鼠移植性肿瘤肺转移的实验中，对Ma891和U14的肺转移无明显抑制作用，但可减轻转移所致的病变程度。对LA795在40mg/kg剂量下，肺转移灶明显减少，抑制率达到58.8％(P<0.01)。
羧胺三唑对L1210的存活时间无延长效果，但对ESC，三个剂量的生命延长率分别达到99.11％，78.13％和58.04％。表明羧胺三唑可以显著延长ESC小鼠的生存时间。
上述实验结果表明，与传统的细胞毒抗恶性肿瘤药物比较，CAI最明显的优点是其不良反应轻微，并且发生率较低。从对恶性肿瘤的抑制效果上，对恶性肿瘤细胞的直接抑制作用较差。虽然CAI除了直接抑制恶性肿瘤细胞的增生作用之外，还具有抑制恶性肿瘤新生血管的作用，但其总体的临床抑瘤作用仍然低于细胞毒药物。因此，如何保持CAI低毒的优点并增加其抗癌作用，就成为一个非常重要的问题。
本发明的特点在于找到了一种既能保持CAI的优点又能增强其抗恶性肿瘤作用的药物组合。
本发明在研究和实验的基础上，发现羧胺三唑在组合上述任一能够升高胞内cAMP水平的药物后，组合物对肿瘤的抑制效果更为明显，组合药具有协同增效作用。
本发明的药物组合物是以100质量的羧胺三唑或其衍生物或中间体和10～10000质量的增加胞内cAMP水平的药物制剂组合。本发明实施例中例举了一些具体组合物，为100质量的羧胺三唑或其衍生物或中间体和500至2000质量的茶碱组合物，或者为100质量的羧胺三唑或其衍生物或中间体和20至100质量的Forskolin的组合物，或者为100质量的羧胺三唑或其衍生物或中间体和500至2000质量的IBMX的组合物。
本发明中，上述组合物对SH-SY5Y、Bel-7402和HeLa细胞系增殖均具有明显的抑制。
以下通过具体实施例和实验验证上述组合物的效果。
实施例1
本例验证Forskolin、茶碱、IBMX和羧胺三唑的组合物抑制SH-SY5Y细胞增殖的协同效应。
实验材料：
人成神经细胞瘤SH-SY5Y细胞系
Forskolin、茶碱和IBMX购自Sigma。
DMSO购自北京化学试剂公司
实验方法：收集体外生长良好的SH-SY5Y肿瘤细胞，用含10％小牛血清的RPMI1640培养基配制成5×104/ml细胞悬液，于12孔培养板内接种，每孔1ml(含5×104个瘤细胞)，置37℃，5％CO2孵箱内培养24小时后弃去原培养基，加入含有相应浓度药物的RPMI1640完全培养基1ml，每组三孔，同时计数三孔细胞数量作为开始给药时细胞数量。继续培养48小时后弃去培养基，0.05胰酶-0.02EDTA消化液消化收集细胞，于倒置显微镜下用血细胞计数板计数细胞数量。抑制率计算公式如下：
100％×(溶剂对照组细胞数量—给药组细胞数量)/(溶剂对照组细胞数量—开始给药时细胞数量)
实验结果：结果见表1和图1。
表1：不同药物对SH-SY5Y细胞增殖的抑制结果
 
分组 细胞计数(×10<sup>4</sup>细胞)(Mean±SD) 抑制率(％)
溶剂对照 71.3±11.7 -
5μmol/L羧胺三唑 46.5±7.9 46.5
1μmol/L Forskolin 61.8±8.6 17.8
5μmol/L羧胺三唑+1μmol/L Forskolin 31.5±7.0 74.6
100μmol/L茶碱 63.9±11.5 13.8
5μmol/L羧胺三唑+100μmol/L茶碱 36.4±6.2 65.5
100μmol/L IBMX 58.1±9.0 24.6
5μmol/L羧胺三唑+100μmol/L IBMX 33.9±7.8 70.2
结果显示，单独应用5μmol/L的羧胺三唑对SH-SY5Y细胞系增殖的抑制率为46.5％；单独应用1μmol/L Forskolin对SH-SY5Y细胞系增殖的抑制率仅为17.8％，单独应用100μmol/L茶碱对SH-SY5Y细胞系增殖的抑制率仅为13.8％，单独应用100μmol/L IBMX对SH-SY5Y细胞系增殖的抑制率仅为24.6％；当相同剂量羧胺三唑和Forskolin联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为74.6％，较单独使用羧胺三唑上升了28.1％，较单独使用Forskolin上升56.8％；当相同剂量羧胺三唑和100μmol/L茶碱联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为65.5％，较单独使用羧胺三唑上升了上升了19％，较单独使用茶碱上升51.7％；当相同剂量羧胺三唑和100umol/L IBMX联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为70.2％，较单独使用羧胺三唑上升了上升了23.7％，较单独使用IBMX上升45.6％；由此可证明Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制SH-SY5Y细胞增殖的协同效应。
实施例2
本例验证Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制HeLa细胞增殖的协同效应。
实验材料为人子宫颈癌细胞系HeLa，其它试剂与实验方法同实施例1。
实验结果见表2和图2。
表2：不同药物对HeLa细胞增殖的抑制结果
 
分组 细胞计数(×10<sup>4</sup>细胞)(Mean±SD) 抑制率(％)
溶剂对照 38.9±7.1 -
10μmol/L羧胺三唑 26.7±7.9 42.2
10μmol/L Forskolin 34.5±3.9 15.2
10μmol/L羧胺三唑+10μmol/L Forskolin 14.4±4.0 84.8
100μmol/L茶碱 33.9±8.3 17.1
100μmol/L茶碱+10μmol/L羧胺三唑 20.0±7.6 65.2
100μmol/L IBMX 30.3±7.4 29.9
100μmol/L IBMX+10μmol/L羧胺三唑 20.4±4.5 63.9
结果显示，单独应用10μmol/L的羧胺三唑对HeLa细胞系增殖的抑制率为42.2％；单独应用10μmol/L Forskolin对HeLa细胞系增殖的抑制率仅为15.2％，单独应用100μmol/L茶碱对HeLa细胞系增殖的抑制率仅为17.1％，单独应用100μmol/LIBMX对HeLa细胞系增殖的抑制率仅为29.9％；当相同剂量羧胺三唑和Forskolin联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为84.8％，较单独使用羧胺三唑上升了42.6％，较单独使用Forskolin上升69.6％；当相同剂量羧胺三唑和100umol/L茶碱联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为65.2％，较单独使用羧胺三唑上升了上升了23％，较单独使用茶碱上升48.1％；当相同剂量羧胺三唑和100umol/LIBMX联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为63.9％，较单独使用羧胺三唑上升了上升了21.7％，较单独使用茶碱上升34.0％；由此可证明到Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制HeLa细胞增殖的协同效应。
实施例3
本例验证Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制Bel-7402细胞增殖的协同效应。
实验材料为人肝癌细胞系Bel-7402，其它试剂与实验方法同实施例1。
实验结果见表3和图3。
表3：不同药物对Bel-7402细胞增殖的抑制结果
 
分组 细胞计数(×10<sup>4</sup>细胞)(Mean±SD)          抑制率(％)  
溶剂对照 77.5±11.0 -
10μmol/L羧胺三唑 48.3±7.7 50.9
10μmol/L Forskolin 59.5±7.8 31.3
10μmol/L Forskolin+10μmol/L羧胺三唑 34.2±5.0 75.3
100μmol/L茶碱 75.2±10.1 4.1
100μmol/L茶碱+10μmol/L羧胺三唑 46.1±7.7 54.6
100μmol/L IBMX 73.0±11.7 5.8
100μmol/L IBMX+10μmol/L羧胺三唑 39.6±10.3 65.9
结果显示，单独应用10μmol/L的羧胺三唑对Bel-7402细胞系增殖的抑制率为50.9％；单独应用10μmol/L Forskolin对Bel-7402细胞系增殖的抑制率为31.3％，单独应用100μmol/L茶碱对Bel-7402细胞系增殖的抑制率仅为4.1％，单独应用100μmol/LIBMX对Bel-7402细胞系增殖的抑制率仅为5.8％；当相同剂量羧胺三唑和Forskolin联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为75.3％，较单独使用羧胺三唑上升了24.4％，较单独使用Forskolin上升44％；当相同剂量羧胺三唑和100umol/L茶碱联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为54.6％，较单独使用羧胺三唑上升了3.7％，较单独使用茶碱上升50.5％；当相同剂量羧胺三唑和100umol/LIBMX联合应用时，对细胞系增殖的抑制率为65.9％，较单独使用羧胺三唑上升了上升了15.0％，较单独使用IBMX上升60.1％；由此可证明到Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制Bel-7402细胞增殖的协同效应。
实施例4
该例验证Forskolin、茶碱和IBMX对羧胺三唑抑制小鼠移植性Lewis’LC肿瘤生长的协同效应。
实验材料：BALB/C品系小鼠，为II级实验动物，合格证号为中华人民共和国科学技术部2000年5月25日颁发的SCXK11-00-0006号。体重18-22g，雌雄各20只，购自中国医学科学院实验动物中心。
实验方法：在无菌操作下，取生长良好无破溃的Lewis’LC肿瘤瘤结，选出健康无坏死的肿瘤组织，剪碎后放入研磨器中，加入适量生理盐水(NS)，研磨成肿瘤单细胞匀浆液，在镜下计数后，用NS调至1×107/ml细胞的浓度，于小鼠右腋皮下接种，每只注入瘤细胞液2×106/0.2ml。给药8天后称量肿瘤组织重量观察各种药物及组合物对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤生长的抑制作用。肿瘤生长抑制率计算公式如下：
(1—治疗组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％
实验结果：结果见表4和图4。
表4：
 
分组 瘤重(Mean±SD，g) 抑瘤率(％)  
阴性对照 1.36±0.39 0.0
20mg/kg羧胺三唑 0.96±0.40 29.4
10mg/kgForskolin 1.22±0.29 10.6
10mg/kgForskolin+20mg/kg羧胺三唑 0.39±0.17 71.6
100mg/kg茶碱 1.26±0.32 7.5
100mg/kg茶碱+20mg/kg羧胺三唑 0.62±0.21 54.4
100mg/kg IBMX 1.24±0.37 8.8
100mg/kg IBMX+20mg/kg羧胺三唑 0.72±0.26 47.1
动物体内试验结果表明，灌胃给予剂量为20mg/kg羧胺三唑对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤的抑瘤率为29.4％。当与10mg/kgforskolin一同灌胃给药时，对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤的抑瘤率上升到71.6％，上升了41.2％，表现出了明显的协同作用。当与100mg/kg茶碱一同灌胃给药时，对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤的抑瘤率上升到54.4％，上升了25％，表现出了明显的协同作用。当与100mg/kg IBMX一同灌胃给药时，对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤的抑瘤率上升到47.1％，上升了17.7％，表现出了明显的协同作用。
以上实施例和实验结果表明，能够增加胞内cAMP水平的腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、磷酸二脂酶抑制剂茶碱、IBMX能够协同增加羧胺三唑对SH-SY5Y、Bel-7402和HeLa细胞系增殖的抑制效应；能够协同增加羧胺三唑对对小鼠移植性Lewis’LC肿瘤生长的抑瘤效应。事实上，本发明的组合物可以作为恶性肿瘤治疗的广谱性药物。
以上具体列举本发明的组合物，其中升高胞内cAMP水平的药物和羧胺三唑两种组分为可以发挥协同增效作用的药用成分，本领域技术人员均了解，事实上的组合物，还应该包括一种或几种升高胞内cAMP水平的药物和羧胺三唑及其中间体或衍生物的组合，一种或几种升高胞内cAMP水平的药物衍生物和羧胺三唑及其中间体或衍生物的组合，这些化合物的衍生物包括药学上可接受的盐类如盐酸盐、氯化物、螯合物和代谢产物；本发明的药物组合物也可以包括那些药用载体，特别是用于口服给药的可药用系统载体。本发明也包括两类药用成分的代谢产物的组合。本发明组合物还可包括将一种或多种药用活性成分缓慢释放的形式。
本发明的药用组合物可制成固体或液体制剂形式，如颗粒混悬液或以PEG为基础的溶液。可优选口服的形式，但也可以非肠道的方式给药。
向肿瘤患者施以足够剂量的与本发明的组合物和制剂，可以减轻和治疗多种相应的肿瘤。
本发明中，涉及用于系统性的给药(口服、局部给药、经皮的药物控释)的药学剂量单位形式，其有效用于治疗哺乳动物，包括人类。“剂量单位形式”指物理上分散的单位，适于给不如动物单个的服用，每一个单位含有预定量的足够活性成分，通过为达到系统性给药而调整所述成分的药学方法，可计算得到所需的效果。
本发明相应的剂量单位形式的实施是片剂、胶囊、存在于液体载体中的口服液体制剂。固体口服药物单位形式的固体稀释剂或载体选自脂类、碳水化合物、蛋白质、固体矿物质：如淀粉、蔗糖、高岭土、磷酸二钙、明胶、阿拉伯胶、玉米浆、玉米淀粉、滑石粉等等。胶囊，无论硬的还是软的，可使用常用的稀释剂和赋形剂制成，如食用油、碳酸钙、硬脂酸钙、硬脂酸镁等等。用于口服的液体药物制剂可制成水溶液或者水性溶液，最好含有助悬剂。如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇等等。
上述制剂在制造和储存时必须保持稳定，通常在基本的溶剂或者混悬液之外还含有具有杀菌剂和杀真菌剂性质的防腐剂如羟苯烷基酯类、三氯叔丁醇、苄基醇、苯酚、乙基汞硫代水杨酸钠等等。在很多情况下，优选的含有等渗剂，如糖类或氯化钠。载体和赋形剂包括植物油、水、乙醇、和多元醇如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等等。
药学上的剂量单位形式的制备是根据前面的一般描述，伴随着适应系统形成给药的方法，提供每一剂量单位形式中必要的活性成分的有效剂量。通常，单位剂量形式将含有3-73％(重量)的必要活性成分。
用于与本发明方法相应的哺乳动物的治疗，由必要活性物质的精确剂量构成的一种有效的剂量，其如能根据实施临床治疗的特性、病况的严重程度、哺乳动物的种类、年龄、体重和状况施以与之相适应的给药形式和确定的制剂，将会有很好效果。当需要给予精确剂量的情况下，可事先给予一试验剂量，然后观察临床反应以确定所需的精确剂量。总的来说，给药的有效剂量在对受药者体重大约每天约1mg每千克到50mg每千克之间。优选每日0.5mg/kg到大约25mg/kg。
显然，临床上使用的药物的含量和成分应根据疾病的程度和病人对单个药物成分的容纳能力而进行调整。更进一步的，升高胞内cAMP水平的药物或羧胺三唑的代谢产物应以适当的形式使用。

Claims (10)

1、一种抗恶性肿瘤药物组合物，由能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与5-胺基-1-[3，5-二氯-4-(4-氯苯甲酰基)苄基]-1H-1，2，3-三唑-4-苯甲酰胺即羧胺三唑组成。
2、根据权利要求1所述的抗恶性肿瘤药物组合物，其特征在于，所述能升高细胞内cAMP浓度水平的药物为腺苷酸环化酶激活剂Forskolin、磷酸二脂酶抑制剂茶碱、Gs蛋白偶联受体的激动剂IBMX中的一种或多种，所述能升高细胞内cAMP浓度水平的药物与羧胺三唑的质量比为10～10000：100。
3、根据权利要求1或2所述的抗恶性肿瘤药物组合物，其特征在于，所述Forskolin与羧胺三唑组合的质量比为20～100：100。
4、根据权利要求1或2所述的抗恶性肿瘤药物组合物，其特征在于，所述茶碱与羧胺三唑组合的质量比为500～2000：100。
5、根据权利要求1或2所述的抗恶性肿瘤药物组合物，其特征在于，所述IBMX与羧胺三唑组合的质量比为500～2000：100。
6、根据权利要求1或2所述的抗恶性肿瘤药物组合物，其特征在于，为一种或几种所述升高胞内cAMP水平的药物和羧胺三唑的组合。
7、抗恶性肿瘤的药物制剂，以权利要求1至6任一所述抗恶性肿瘤药物组合物作为活性成分，并辅以可接受的药用载体。
8、根据权利要求7所述抗恶性肿瘤的药物制剂，其特征在于，所述制剂为片剂、胶囊、或口服液。
9、权利要求1—6任一所述抗恶性肿瘤的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
10、权利要求7或8任一所述抗恶性肿瘤的药物制剂在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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