CN108721279A

CN108721279A - 包含5`-羟基-5-硝基-靛玉红-3`-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂

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Publication number: CN108721279A
Application number: CN201710256930.7A
Authority: CN
Inventors: 金载�; 金载一; 金善明; 金山淏; 朴文英
Original assignee: Anygen Co Ltd
Current assignee: Anygen Co Ltd
Priority date: 2017-04-19
Filing date: 2017-04-19
Publication date: 2018-11-02
Anticipated expiration: 2037-04-19
Also published as: CN108721279B

Abstract

公开了包含5'‑羟基‑5‑硝基‑靛玉红‑3'‑肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂。进一步而言，公开了包含5'‑羟基‑5‑硝基‑靛玉红‑3'‑肟作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的乳腺癌治疗剂，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)。

Description

包含5′-羟基-5-硝基-靛玉红-3′-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂

技术领域

本发明涉及包含5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂。更具体而言，本发明涉及包含5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的乳腺癌治疗剂，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)。

背景技术

细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)属于一组丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节细胞周期进程、神经元功能、分化和凋亡。它们的活性(包括结合至相应的细胞周期蛋白)通过多种机制严格调节，其表达水平在细胞周期的不同时期中波动。

在贯穿G1期、S期、G2期、M期的各细胞周期阶段期间，不同的CDK/细胞周期蛋白复合物被激活。通过在G1早期的CDK4/细胞周期蛋白D、CDK6/细胞周期蛋白D以及在G1晚期的CDK2/细胞周期蛋白E使视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)连续磷酸化，引起转录因子蛋白E2F的释放。反过来，E2F蛋白引起用于进入细胞周期的S期所需的一套基因的转录激活。

随后，在DNA复制(S期)的晚期期间，CDK2被细胞周期蛋白A激活，并促进适时的E2F失活，以防止通过持续的E2F活性引发的凋亡。最后，与细胞周期蛋白A或细胞周期蛋白B复合的CDK1被认为具有调节G2/M检查点和驱动细胞通过有丝分裂的作用。

除了细胞周期调控外，确定了CDK2、CDK7、CDK8和CDK9的其它作用。例如，CDK2/细胞周期蛋白E对p53介导的DNA损伤应答途径而言很重要，而CDK7、CDK8和CDK9通过RNA聚合酶的磷酸化参与转录起始和延伸的调节。因此，CDK通过数种不同的机制影响细胞生长和存活，并且对于多种细胞过程而言，对CDK活性的适当调节很重要。

已经认识到在许多人类肿瘤中出现了由细胞周期蛋白(如细胞周期蛋白D和细胞周期蛋白E)的异常高表达或突变引起的CDK失调。例如，在结肠直肠癌、卵巢癌、乳腺癌和/或前列腺癌中，CDK2/细胞周期蛋白E复合物的表达和催化活性增加，原发性肿瘤中的细胞周期蛋白E表达的升高与乳腺癌患者的不良存活率相关。在一些病例(前列腺腺癌和肺癌)中还观察到CDK1/细胞周期蛋白B复合物的异常表达。

尽管以前的报道显示细胞周期进程和增殖可能不需要CDK2，但最近的报道表明黑素细胞和肝细胞可能依赖CDK2进行增殖和存活。同时，已报道了与靶向单独的CDK1或CDK2相比，同时消除CDK1和CDK2的研究在肿瘤细胞系的抗增殖方面提供了增强的功效。此外，出现的证据表明某些肿瘤细胞的增殖可能需要特定的分裂间期(interphase)CDK。

目前，许多小分子CDK抑制剂正在临床试验中。这些抑制剂是在激酶的ATP结合位点参与同ATP竞争的平面的小杂环化合物。其中，flavopyridol是进入临床评价的第一个CDK抑制剂。R-Roscovitine(三取代的嘌呤类似物)和BMS-387032(氨基噻唑)对CDK2/细胞周期蛋白E是选择性的，dinaciclib(MK-7965，SCH-727965)对CDK1、CDK2、CDK5和CDK9是选择性的。

迄今为止开发出的所有CDK抑制剂可分为两大类：广范围抑制剂(broad-rangeinhibitors)，例如xavopiridol、奥罗莫星(olomoucine)、roscovitine、kenpaullone、SNS-032、AT7519、AG-024322、(S)-Roscovitine和R547；以及特异性抑制剂，例如fascaplysin、ryuvidine、purvalanol A、NU2058、BML-259、SU 9516、帕博西尼(palbociclib)(PD0332991)和P-276-00。

乳腺癌是全球范围的健康问题。我们对这种恶性肿瘤的了解取得了重大进展，并表征了乳腺癌的数种分子亚型。这种分子上的了解为开发靶向驱动肿瘤细胞生长的致病性分子改变的新药剂铺平了道路。普遍存在的所有癌症类型都是具有正常细胞周期控制的调节功能障碍(dys-regulation)的异常增殖。出于这个原因，关键细胞周期调控因子(cellcycle regulators)的抑制剂是新型癌症治疗剂的有吸引力的靶标。

在正常对照下，细胞周期作为严格调节且可预测的过程由以下多个不同的时期组成：G0(静止)、然后是G1(DNA合成前)、S(DNA合成)、G2(分裂前)和M(细胞分裂)。对这一系统的精细调节至关重要，并且调节功能障碍可导致包括癌症在内的多种疾病进程。从G1到S的进展是保护细胞免于异常复制的关键检查点。

数项研究鉴定出人类乳腺癌中的细胞周期调控因子的改变，并为该肿瘤类型中的CDK4/6抑制的潜在治疗作用提供了理论基础。已经在15％-20％的人乳腺癌中鉴定出细胞周期蛋白D1基因的扩增，而且还证实了该蛋白以较高的百分比过表达。

细胞周期蛋白D1过表达的预知意义尚不清楚；一些研究表明它是与不良临床结果相关的主要癌基因，而其它研究表明它与较顽固(indolent)的雌激素受体(ER)阳性表型相关。

另外，研究将细胞周期蛋白D的扩增与他莫昔芬耐药相关联。虽然CDK4/6与细胞周期蛋白D1之间的相互作用表明了它们的相互依赖性(interdependence)，发现细胞周期蛋白D1通过直接激活ER在协助增殖方面不依赖于CDK4/6而起作用。

此外，在20％-35％的乳腺癌中描述了pRb的功能缺失。来自帕博西尼与来曲唑联用的临床试验的最新数据显示出，CDK4/6抑制剂帕博西尼对改善ER阳性转移性或晚期乳腺癌的无进展生存期(progression free survival)起到关键作用。

另一方面，已在各种癌症适应症(尤其是晚期乳腺癌)的临床试验中对CDK抑制剂之一dinaciclib(SCH-727965)进行了评价。作用机制被视为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂以与溴结构域的乙酰基赖氨酸识别位点相互作用以及用于通过CDK1和CDK5依赖性机制抑制未折叠蛋白应答(unfolded protein response)。

已研究了具有双吲哚支架的靛玉红及其衍生物，作为靶向重要的蛋白激酶(如CDK、GSK-3β和极光激酶(aurora kinases))的强效抑制剂受到了相当大的关注。

在美国专利号8,859,783 B2“Indirubin-3'-oxime derivatives as potentcyclin dependent kinase inhibitors”中，本发明的发明人已公开了作为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的靛玉红-3'-肟衍生物。此外，还公开了此类细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂针对人肺癌细胞、人纤维肉瘤细胞、人结肠癌细胞、人白血病细胞、人胃癌细胞、人鼻咽癌细胞和/或人乳腺癌细胞具有出色的抗癌活性。

在该美国专利公开中，公开了由式1表示的下述靛玉红-3'-肟衍生物。

其中，

i)R₁是OH且R₂是NO₂；

ii)R₁是F且R₂是NO₂；

iii)R₁是OH且R₂是Cl；或

iv)R₁是OH且R₂是F。

在所述靛玉红-3'-肟衍生物中，本发明的发明人选择了具有最小毒性且具有出色的抗癌活性的最佳化合物，即5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物。该化合物对应于其中的R₁是OH且R₂是NO₂的式1化合物。在本申请文件中，以下将该化合物称为AGM-130。

AGM-130的IUPAC化学名称是(2'Z,3'E)-5'-羟基-5-硝基靛玉红肟。它几乎不溶于水，可溶于DMF和DMSO，并且非常难溶于乙醇和丙酮。关于可注射水溶液的实际配方，用处于盐溶液中的0.1N Na₂CO₃将处于PEG300溶液中的AGM-130稀释至终浓度为3.75mg/mL的70％水溶液。

临床前研究表明，AGM-130是高度选择性的CDK抑制剂，有效地抑制肿瘤中的CDK信号传导。AGM-130对体外人肿瘤细胞系和肿瘤异种移植物的生长表现出明显的抑制活性。此外，AGM-130经常引起已确立的肿瘤的完全消退。

此前，本发明的发明人尝试测量5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物(AGM-130)对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病(CML)细胞的抗癌活性。此外，我们发现这种化合物有效地降低体外和体内系统中的伊马替尼耐药的K562细胞的生存力。这些结果已公开在Leukemia Research vol.37pp.427-433(2013)中。然而，我们最近发现，AGM-130化合物不能作为用于治疗CML的药物使用，因为如果将其施用至CML，不能完全保证AGM-130化合物的安全性。

随后，本发明的发明人尝试测量5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物(AGM-130)对非小细胞肺癌的抗癌活性。于是，我们发现AGM-130化合物显著抑制A549人非小细胞肺癌细胞的增殖并且阻滞G2/M期的细胞周期。还发现，释放的细胞色素C、Bax、切割后的半胱天冬酶和PARP的蛋白质水平可能增加。此外，在体内肿瘤异种移植物模型中，AGM-130剂量依赖性地阻抑移植的A549细胞肿瘤的生长。

此外，这些结果已公开于European Journal of Pharmaceutical Sciencesvol.79 pp.122-131(2015)中。然而，我们最近发现，AGM-130化合物不能作为用于治疗非小细胞肺癌的药物使用，因为如果将其施用至非小细胞肺癌，不能完全保证AGM-130化合物的毒性。

因此，本发明的发明人重复进行体外和体内试验，以找出AGM-130化合物对各种癌细胞系的最佳施用的抗癌活性。最后，本发明的发明人发现作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物(AGM-130)可用作用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)的药物，因为如果将其施用至这些特定的乳腺癌，AGM-130化合物显示出具有最低毒性的最佳抗癌活性。

发明内容

技术问题

待解决的问题是通过针对各种癌细胞系进行重复的体外和体内试验，找出AGM-130化合物的最佳施用的抗癌活性。此外，作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物(AGM-130)被尝试是否可用作治疗三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)的药物。

技术手段

本发明的目的是提供包含作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌。

此外，所述三阴性乳腺癌(TNBC)的特征在于雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和/或Her2/neu受体的基因表达是沉默的。

此外，所述雌激素受体(ER)阳性乳腺癌包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌。

此外，所述5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟通过阻滞细胞周期中的G2/M期以及使参与乳腺癌中的G2/M期的细胞周期蛋白B1的表达明显减少，从而抑制癌细胞的生长。

此外，所述5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟通过线粒体依赖性凋亡抑制癌细胞的生长。

有益效果

本发明的有益效果是提供AGM-130化合物的最佳施用的抗癌活性。此外，作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟化合物(AGM-130)作为用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)的最佳药物提供。

附图说明

图1示出了用于测量本发明的AGM-130化合物的抗癌活性的三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型设计的示意图，其中，将AGM-130化合物腹腔内注射至小鼠。

图2示出了说明在三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图3示出了说明在三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型中剂量依赖性的抗癌活性的照片和图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图4示出了用于测量本发明的AGM-130化合物的抗癌活性的三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型设计的示意图，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

图5示出了说明在三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

图6示出了说明在三阴性乳腺癌(MDA-MB-231)异种移植模型中肿瘤的重量呈剂量依赖性减少的照片和图表，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

图7示出了说明在他莫昔芬耐药的乳腺癌(TAMR-MCF-7)异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图8a示出了说明在他莫昔芬耐药的乳腺癌(TAMR-MCF-7)异种移植模型中的剂量依赖性的抗癌活性的照片，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图8b示出了说明在他莫昔芬耐药的乳腺癌(TAMR-MCF-7)异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图9示出了说明在MCF-7ER阳性乳腺癌异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的照片和图表，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

图10示出了作为关于AGM-130化合物的抗癌活性的比较实施例的KB口腔癌异种移植模型设计的示意图，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图11示出了说明在作为比较实施例的KB口腔癌异种移植模型中肿瘤的体积如何变化的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图12示出了说明在作为比较实施例的HCT-116结肠直肠癌异种移植模型中肿瘤的体积如何变化的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图13示出了说明在作为比较实施例的HCT-116结肠直肠癌异种移植模型中肿瘤的体积和重量如何变化的照片和图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图14示出了说明在作为比较实施例的A549肺癌异种移植模型中肿瘤的体积如何变化的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图15a示出了说明在作为比较实施例的A549肺癌异种移植模型中肿瘤的重量如何变化的照片和图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图15b示出了通过TUNEL分析而测量的照片，所述照片说明了在作为比较实施例的A549肺癌异种移植模型中肿瘤的形状如何变化，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

具体实施方式

本发明涉及包含作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)。

可对本发明进行如下更具体的阐明。

我们尝试了针对由NCI提供的60种癌细胞系的AGM-130化合物的体外抗癌活性试验。采用10μM的AGM-130化合物测量对癌细胞生长的抑制。

针对60种癌细胞系的细胞生长抑制的体外结果以生长百分比表示。如果癌细胞的生长百分比为100％，这意味着对癌细胞的生长没有抑制。如果生长百分比为0％，这意味着癌细胞未进一步生长，这是理想的情况。另一方面，如果生长百分比小于0％，这意味着由于其高毒性，该抗癌剂显示出比抑制细胞生长所需的杀伤力更高的杀伤力。

结果示于表1中。

表1

在白血病细胞系中，AGM-130化合物由于其高毒性而不能被施用至RPMI-8226细胞系，但是它对其它细胞系的细胞生长显示出中度抑制。在非小细胞肺癌的情况中，由于其高毒性，AGM-130化合物也不能被施用至几乎所有的细胞系。此外，在中枢神经系统(CNS)癌的情况中，由于其高毒性，AGM-130化合物不能被施用至SF-539细胞系、SNB-75细胞系。

在恶性黑色素瘤的情况中，由于其高毒性，AGM-130化合物对于几乎所有细胞系而言是不可用的。此外，在卵巢癌和肾细胞恶性肿瘤的情况中，AGM-130化合物由于其高毒性而对于某些种类的细胞系是不可用的。

另一方面，除了KM12结肠直肠癌细胞系外，AGM-130化合物对结肠直肠癌细胞系显示出出色的抗癌活性。在HCT-116癌细胞系的情况中，使异种移植模型中的肿瘤体积减少。然而，这并不能被解释为使肿瘤体积显著减少。

然而，在乳腺癌的情况中，AGM-130化合物对所有细胞系均显示出具有最低毒性的出色的抗癌活性，所述细胞系为MCF-7细胞系、MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞系、HS 578T、BT-549和T-47D癌细胞系。

为了证实AGM-130对乳腺癌细胞系的抗增殖活性，我们对18种不同种类的乳腺癌细胞系进行了评价。结果，4种Her2阳性乳腺癌细胞系显示出相对不敏感(IC₅₀值高于3μM)，而3种ER阳性细胞系和10种三阴性细胞系中的7种细胞系的生长均被强效地抑制(IC₅₀值低于1μM)。

此外，通过流式细胞术分析，我们对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的细胞周期进行了研究。结果，在AGM-130治疗时，观察到减少的G1期和增加的G2/M期。此外，蛋白质印迹(Western blot)示出了参与G2/M期的细胞周期蛋白B1的表达显著减少，表明AGM-130诱导G2/M期的阻滞。

此外，我们使用荧光显微镜对用DAPI染色的凋亡小体进行检查，以研究AGM-130对凋亡的诱导。结果，AGM-130在线粒体依赖性凋亡机制下抑制癌细胞的增殖。

此外，我们对作为代表性的坏死生物标志物的LDH酶(乳酸脱氢酶)向介质的分泌进行了分析。因此，AGM-130同时诱导凋亡和坏死。

然后，根据小鼠的乳腺癌异种移植模型(尤其是三阴性乳腺癌和他莫昔芬耐药的乳腺癌异种移植模型)，我们尝试了对乳腺癌细胞生长的体内抑制。

从乳腺癌异种移植模型，我们证实了AGM-130化合物剂量依赖性地抑制MDA-MB-231三阴性乳腺癌和/或TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌的癌细胞的生长。

三阴性乳腺癌的特征在于癌细胞中缺乏雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和HER-2受体。因此，受体靶向疗法不能用于治疗这种三阴性乳腺癌。

迄今为止，尚未开发出用于特异性地治疗三阴性乳腺癌或他莫昔芬耐药的雌激素受体阳性乳腺癌的抗癌剂。因此，以高剂量给予传统的抗癌剂来治疗这些乳腺癌。然而，AGM-130化合物的引入可成为用于这些乳腺癌的选择性的最佳治疗剂。CDK抑制剂AGM-130化合物的机制被认为是通过抑制细胞周期蛋白依赖性激酶信号而阻滞癌细胞周期中的G2/M期。

可将本发明的AGM-130化合物与至少一种药学上可接受的载体或稀释剂一起配制。适当的药学上可接受的载体或稀释剂可为选自如下的至少一种：磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、羟丙基-β-环糊精和/或聚乙烯吡咯烷酮。

对于受试者，AGM-130化合物的治疗剂量可为一天0.1-100mg/kg·体重。AGM-130化合物的优选剂量可为一天0.5-30mg/kg·体重。

还可将AGM-130化合物口服给予、肠胃外给予、舌下给予、直肠给予或局部给予至受试者。剂型可包含无毒的药学上可接受的载体、佐剂和/或赋形剂。

还可优选将AGM-130化合物配制成具有水溶液或非水溶液或混悬液的可注射制剂。在该可注射制剂中，可包含合适的分散剂、湿润剂和/或悬浮剂。

可注射的制剂能够以脂质体的形式给予。脂质体通常来源于磷脂或脂质材料，所述脂质体包含混悬和分散于水性介质中的单层或多层的水合类脂质。

此外，可单独给予AGM-130化合物或将AGM-130化合物与其它抗癌药物联合给予。可给予的抗癌药物的实例为选自如下的至少一种：伊立替康、拓扑替康、吉西他滨、格列卫、赫赛汀、5-氟尿嘧啶、亚叶酸、卡铂、顺铂、紫杉烷、替扎他滨、环磷酰胺、长春花-生物碱、伊马替尼、蒽环类药物、利妥昔单抗、曲妥珠单抗和/或拓扑异构酶I抑制剂。

可通过以下实施例对本发明进行更具体的说明。然而，本发明的范围不应被解释为受到以下实施例限定。

实施例

实施例1MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中的抗癌活性试验(腹腔内注射)

将MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞移植至裸鼠后，肿瘤生长至体积为200mm³。然后，向小鼠腹腔内给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周两次。观察肿瘤生长27天。

图1示出了用于测量本发明的AGM-130化合物的抗癌活性的MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型设计的示意图，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

如图1所示，将MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞接种至小鼠。10天后，向小鼠腹腔内给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周两次。观察裸鼠中的肿瘤体积和形状27天。

图2示出了说明在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。如图2所示，在给予AGM-130化合物后，通过MDA-MB-231乳腺癌细胞接种和生长的肿瘤的体积剂量依赖性地减少。

在本实验中，作为对照组，向小鼠给予紫杉醇(5mg/kg)。与对照组的肿瘤体积相比，给予AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约14％。这意味着对于乳腺癌，AGM-130化合物而非紫杉醇显示出更好的抗癌活性。

表2示出了在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中AGM-130化合物的抗癌活性结果。向裸鼠腹腔内给予一定剂量(10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg)的AGM-130化合物后，测量肿瘤的体积。作为对照组，采用不给予AGM-130化合物的裸鼠中的肿瘤体积。

表2

图3示出了说明在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中的剂量依赖性的抗癌活性的照片和图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

如表2所示，与对照组的肿瘤体积相比，给予10mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约40％。此外，与对照组的肿瘤体积相比，给予20mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约64％。尤其是，与对照组的肿瘤体积相比，给予40mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约70％。

实施例2MDA-MB-231三阴性乳腺异种移植模型中的抗癌活性试验(静脉内注射)

将MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞移植至裸鼠后，肿瘤生长至体积为200mm³。然后，向小鼠静脉内给予3mg/kg、7mg/kg、14mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周一次。观察肿瘤生长24天。

图4示出了用于测量本发明的AGM-130化合物的抗癌活性的MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型设计的示意图，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

如图4所示，将MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞接种至小鼠。10天后，向小鼠静脉内给予3mg/kg、7mg/kg、14mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周一次。观察裸鼠中的肿瘤的体积和形状24天。

图5示出了说明在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

如图5所示，在给予AGM-130化合物后，通过MDA-MB-231乳腺癌细胞接种并生长的肿瘤的体积剂量依赖性地减少。

表3示出了在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中AGM-130化合物的抗癌活性的结果。向裸鼠静脉内给予一定剂量(3mg/kg、7mg/kg、14mg/kg)的AGM-130化合物后，测量肿瘤的体积。作为对照组，采用不给予AGM-130化合物的裸鼠中的肿瘤体积。

表3

图6示出了说明在MDA-MB-231三阴性乳腺癌异种移植模型中肿瘤的重量呈剂量依赖性减少的照片和图表，其中，将AGM-130化合物静脉内给予至小鼠。

如表3所示，与对照组的肿瘤体积相比，给予3mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约31％。此外，与对照组的肿瘤体积相比，给予7mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约47％。尤其是，与对照组的肿瘤体积相比，给予14mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约61％。

实施例3TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌异种移植模型中的抗癌活性试验(腹腔内注射)

将TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌细胞移植至裸鼠并生长后，向小鼠腹腔内给予10mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周两次。观察肿瘤生长24天。

图7示出了说明在TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

如图7所示，与对照组的肿瘤体积相比，给予10mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约54％。此外，与对照组的肿瘤体积相比，给予40mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约45％。

此外，与对照组的小鼠的重量相比，给予10mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物的小鼠的重量显著变化。

图8a示出了说明在TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌异种移植模型中的剂量依赖性的抗癌活性的照片，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

图8b示出了说明在TAMR-MCF-7他莫昔芬耐药的乳腺癌异种移植模型中肿瘤的体积呈剂量依赖性减少的图表，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

如图8所示，在给予10mg/kg剂量的AGM-130的小鼠和给予40mg/kg剂量的AGM-130的小鼠中均显著地观察到肿瘤体积的减少。

如图9所示，将MCF-7ER阳性乳腺癌细胞接种至小鼠。10天后，向小鼠静脉内给予3mg/kg、7mg/kg、14mg/kg剂量的AGM-130化合物，每周一次。观察裸鼠中肿瘤的体积和形状24天。

表4示出了在MCF-7乳腺癌异种移植模型中AGM-130化合物的抗癌活性的结果。向裸鼠静脉内给予3mg/kg、7mg/kg、14mg/kg剂量的AGM-130化合物后，测量肿瘤的体积。作为对照组，采用不给予AGM-130化合物的裸鼠中的肿瘤体积。

表4

如表4所示，与对照组的肿瘤体积相比，给予3mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约49％。此外，与对照组的肿瘤体积相比，给予7mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约64％。尤其是，与对照组的肿瘤体积相比，给予14mg/kg剂量的AGM-130化合物引起肿瘤体积减少约69％。

这意味着在给予AGM-130化合物后，由MCF-7乳腺癌细胞长成的肿瘤的体积呈剂量依赖性的减少。因此，证明了AGM-130化合物是用于治疗ER阳性乳腺癌的有效治疗物。

因此，可预料到本发明的AGM-130化合物可为用于治疗三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌(包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌)的有效抗癌治疗物。

比较实施例1KB口腔癌异种移植模型中的抗癌活性试验(腹腔内注射)

将KB口腔癌细胞(10×10⁶个细胞/0.1ml无血清基质胶培养基)注射到裸鼠后，使肿瘤生长。然后，每隔一天向小鼠腹腔内给予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察肿瘤生长28天。

如图10所示，将KB口腔癌细胞接种至小鼠。10天后，每隔一天向小鼠腹腔内给予5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察裸鼠中的肿瘤体积和形状28天。

如图11所示，给予AGM-130化合物后，由KB口腔癌细胞接种并生长的肿瘤的体积不以剂量依赖的方式显著减少。

在本实验中，作为阳性对照组，向小鼠给予紫杉醇(10mg/kg)。与给予紫杉醇的肿瘤体积相比，给予AGM-130化合物不能引起肿瘤体积显著减少。

比较实施例2HCT-116结肠直肠癌异种移植模型中的抗癌活性试验(腹腔内注射)

将HCT-116结肠直肠癌细胞(10×10⁶个细胞/0.1ml无血清基质胶培养基)注射至裸鼠后，使肿瘤生长。然后，每隔一天向小鼠腹腔内给予10mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察肿瘤生长24天。

如图12所示，将HCT-116结肠直肠癌细胞接种至小鼠。10天后，每隔一天向小鼠腹腔内给予10mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察裸鼠中的肿瘤体积和形状24天。

如图12所示，在给予AGM-130化合物后，不能使由HCT-116结肠直肠癌细胞接种并生长的肿瘤的体积以剂量依赖的方式显著减少。

如图13所示，在给予AGM-130化合物后，不能使由HCT-116结肠直肠癌细胞接种并生长的肿瘤的体积以剂量依赖的方式显著减少。

比较实施例3A549肺癌异种移植模型中的抗癌活性试验(腹腔内注射)

将A549肺癌细胞注射入裸鼠后，使肿瘤生长。然后，每隔一天向小鼠腹腔内给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察肿瘤生长27天。

如图14所示，将A549肺癌细胞接种至小鼠。10天后，每隔一天向小鼠腹腔内给予10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg剂量的AGM-130化合物。观察裸鼠中的肿瘤体积和形状27天。作为阳性对照，给予多西紫杉醇(5mg/kg)。

如图14所示，给予AGM-130化合物后，不能使由A549肺癌细胞生长的肿瘤的体积以剂量依赖的方式显著减少。此外，AGM-130化合物的抗癌活性看起来与多西紫杉醇的抗癌活性类似。

如图15a所示，在给予AGM-130化合物后，不能使由A549肺癌细胞接种并生长的肿瘤的重量以剂量依赖的方式显著减少。

图15b示出了由TUNEL分析而测量的照片，所述照片说明了在作为比较实施例的A549肺癌异种移植模型中肿瘤的形状如何变化，其中，将AGM-130化合物腹腔内给予至小鼠。

如图15b所示，在石蜡包埋的肿瘤区域中观测到凋亡。这表明与溶媒对照相比，AGM-130化合物诱导A549肺癌细胞凋亡。

Claims

1.一种包含作为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂的5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟作为活性成分的乳腺癌治疗剂，其中，所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)和/或雌激素受体(ER)阳性乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的乳腺癌治疗剂，其中，所述三阴性乳腺癌(TNBC)的特征在于雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和/或Her2/neu受体的基因表达是沉默的。

3.根据权利要求1所述的乳腺癌治疗剂，其中，所述雌激素受体(ER)阳性乳腺癌包括他莫昔芬耐药的雌激素受体(ER)阳性乳腺癌。

4.根据权利要求1所述的乳腺癌治疗剂，其中，所述5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟通过阻滞细胞周期中的G2/M期以及使参与乳腺癌G2/M期的细胞周期蛋白B1的表达明显减少，从而抑制癌细胞的生长。

5.根据权利要求1所述的乳腺癌治疗剂，其中，所述5'-羟基-5-硝基-靛玉红-3'-肟通过线粒体依赖性凋亡抑制癌细胞的生长。