JP6445082B2

JP6445082B2 - ５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムを有効成分として含有する乳がん治療剤

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Inventors: 載一金; 善明金; 山 ▲ホ▼ 金; 文英朴
Original assignee: エニジェンカンパニー．，リミテッド．
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Description

本発明は、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム（5’-hydroxy-5-nitro-indirubin-3’-oxime）を有効成分として含有する乳がん治療剤に関する。より詳細には、本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ, cyclin-dependent kinase）阻害剤として５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムを含有する三重陰性(triple negative）乳がん及び／またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がん治療剤に関する。

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の進行、神経機能、分化及びアポトーシスの調節に関与するセリン／トレオニンキナーゼのグループに属する。それらの活性は、対応するサイクリンへの結合を含む複数のメカニズムによって厳密に制御され、そのレベルの発現は細胞周期の異なる段階を通じて進展される。

様々なＣＤＫ／サイクリン複合体は、Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及びＭ期を介して各細胞周期段階の間に活性化される。初期のＧ１期のＣＤＫ４／サイクリンＤ、ＣＤＫ６／サイクリンＤ及びＧ１期の後期のＣＤＫ２／サイクリンＥによる網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）の連続的なリン酸化は、転写因子のＥ２Ｆタンパク質の放出を引き起こす。次に、Ｅ２Ｆタンパク質は、細胞周期のＳ期に入るために必要とされる一連の遺伝子の転写活性化をもたらす。

ＣＤＫ２はＤＮＡ複製の後期段階でサイクリンＡによって活性化され、Ｓ期で永続的なＥ２Ｆ活性によって誘発されるアポトーシスを防ぐためにＥ２Ｆの適切な時限失活化を促進する。最後に、サイクリンＡまたはＢと複合体化したＣＤＫ１は、Ｇ２／Ｍチェックポイントを調節し、有糸分裂によって細胞を駆動する役割を有すると考えられている。

例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥは、ｐ５３媒介性ＤＮＡ損傷応答経路にとって重要であり、ＣＤＫ７、８、９はＲＮＡポリメラーゼのリン酸化による転写開始の調節に関連している。ＣＤＫは、いくつかの異なるメカニズムを介して細胞増殖及び生存に影響を与えるため、ＣＤＫ活性の適切な調節は、様々な細胞プロセスにとって重要である。

サイクリンＤ及びサイクリンＥなどのサイクリンの異常高発現によるＣＤＫの調節緩和(deregulation)は、多くのヒト腫瘍において起こることが認識されている。
例えば、ＣＤＫ２／サイクリンＥ複合体の発現及び活性は、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん及び／または前立腺がんにおいて増加し、原発腫瘍におけるサイクリンＥの発現の上昇は、乳がん患者の生存率の低下と相互に関連している。ＣＤＫ１／サイクリンＢ複合体の異常発現が前立腺がん及び肺がんにおいても観察されている。

従来の報告では、ＣＤＫ２は細胞周期の進行及び増殖には必要なものではないとされてきたが、最近、メラノサイト及び肝細胞の増殖及び生存がＣＤＫ２に依存している可能性があることが報告されている。
また、ＣＤＫ１とＣＤＫ２の同時枯渇の研究は、ＣＤＫ１単独、またはＣＤＫ２のいずれかを標的化することと比較して、腫瘍細胞系の抗増殖において有効性を提供することが報告されている。さらに、新たな証拠は、特定の腫瘍細胞が増殖のために特定の間期ＣＤＫを必要とすることを示す。

現在、多数の小分子ＣＤＫ阻害剤が臨床試験中である。これらの阻害剤は、キナーゼＡＴＰ結合部位におけるＡＴＰとの競合に関連する小さなヘテロ環である。その中で、フラボピリドール(flavopyridol)は、臨床評価に入る最初のＣＤＫ阻害剤であった。Ｒ−ロスコビチン（R-Roscovitine）（三置換プリンアナログ）及びBMS-387032（アミノチアゾール(aminothiazole)）はＣＤＫ２／サイクリンＥに対して選択的であり、ジナシクリブ(dinaciclib)（MK-7965、SCH-727965）はＣＤＫ１，２，５及び９に対して選択的である。

現在までに開発されたＣＤＫ阻害剤は、２つの主要な群に分類することができる。
１つの群は、ザボピリドール(xavopiridol)、オロムシン(olomoucine)、ロスコビチン(roscovitine)、ケンパウロン(kenpaullone)、SNS-032、AT7519、AG-024322、（Ｓ）−ロスコビチン(（S）-Roscovitine)またはR547のような広範囲阻害剤である。
他の群は、ファスカプリシン(fascaplysin)、リュビジン(ryuvidine)、パーバラノールＡ(purvalanol A)、NU2058、BML-259、SU9516、パルボシクリブ(palbociclib)（PD0332991）またはP-276-00のような特異的阻害剤である。

乳がんは世界的な健康問題である。この悪性腫瘍の理解には大きな進展があった。乳がんはいくつかの分子サブタイプに特徴付けられている。この分子的な理解は、腫瘍細胞の成長を促進する病原性の分子変化を標的とする新しい薬剤の開発の道を切り開いてきた。
すべてのがん型に偏在するのは、正常な細胞周期制御のdys-調整（調整不全）のような異常な増殖である。この理由から、重要な細胞周期調節因子の阻害剤は、新規ながん治療の魅力的な標的である。

正常な制御下では、細胞周期は厳密に調節されたものとして機能する。細胞周期にはＧ０（静止）、Ｇ１（ＤＮＡ合成前）、Ｓ（ＤＮＡ合成）、Ｇ２（前分裂）及びＭ（細胞分裂）からなる予測可能ないくつかの相が存在する。このシステムの慎重な規制は基本的に重要であり、調節はがんを含む病気に関連している。Ｇ１からＳへの進行過程は異常な複製から細胞を保護するための重要なチェックポイントである。

いくつかの研究により、ヒト乳がんにおける細胞周期調節物質の変化が確認され、この腫瘍型におけるＣＤＫ４／６阻害の潜在的な治療的役割の根拠が提供されている。
サイクリンＤ１遺伝子の増幅はヒト乳がんの１５〜２０％で確認されたが、タンパク質の過剰発現はより高い割合で発生している。

サイクリンＤ１の過剰発現の予後の意義は明らかではない。いくつかの研究は、それが主要ながん遺伝子であることを示唆しているが、他の研究の大部分は、それがよりエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性表現型と関連していることを示唆している。

さらに、乳がんの２０〜３５％においてｐＲｂの機能喪失が報告されている。ＣＤＫ４／６阻害剤（パルボシクリブ；palbociclib）は、ＥＲ陽性の転移性または進行性の乳がんにおける無増悪生存期間を改善するために重要な役割を示し、レトロゾール(letrozole)と組み合わせたパルボシクリブを用いた臨床試験に関するデータが報告されている。

一方、ＣＤＫ阻害剤の１つであるジナシクリブ(dinaciclib)（SCH-727965）は、様々ながんの適応症、特に進行性乳がんの臨床試験において評価されている。その作用機序は、ブロモドメイン(bromo-domain)のアセチル−リシン(acetyl-lysine)認識部位と相互作用し、ＣＤＫ１及びＣＤＫ５依存性機構を介して非折り畳み（unfolded）タンパク質応答を阻害するためのサイクリン依存性キナーゼ阻害剤と考えられている。

インジルビン及びビス−インドール(bis-indole)骨格を有するその誘導体は、ＣＤＫ、ＧＳＫ−３β及びオーロラキナーゼ(aurora kinase)などの重要なタンパク質キナーゼを標的とする強力な阻害剤として研究が進められている。

米国特許第８，８５９，７８３号公報(特許文献１)で本発明者らは、強力なサイクリン依存性キナーゼ阻害剤としてのインジルビン−３’−オキシム誘導体を既に開示している。さらに、このようなサイクリン依存性キナーゼ阻害剤は、ヒト肺がん細胞、ヒト線維肉腫細胞、ヒト結腸がん細胞、ヒト白血病細胞、ヒト胃がん細胞、ヒト鼻咽頭がん細胞及び／またはヒト乳がん細胞に対して優れた抗がん活性を有することも開示している。

この米国特許公報では、下記式（１）で示されるインジルビン-3’-オキシム（indirubin-3’-oxime）誘導体が開示されている。

式中、
i）Ｒ₁がＯＨ、Ｒ₂がＮＯ₂を表わし；ｉｉ）Ｒ₁がＦ、Ｒ₂がＮＯ₂を表わし；ｉｉｉ）Ｒ₁がＯＨ、Ｒ₂がＣｌを表わし；またはｉｖ）Ｒ₁がＯＨ、Ｒ₂がＦを表わす。

本発明者らは、前記インジルビン−３’−オキシム誘導体の中で、５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム（5’-hydroxy-5-nitro-indirubin-3’-oxime）化合物を最小限の毒性を持った最も優れた抗がん活性化合物として選別した。この化合物は、式（１）において、Ｒ₁がＯＨでＲ₂がＮＯ₂である化合物である。本明細書では、以下、この化合物をＡＧＭ−１３０と称する。

ＡＧＭ−１３０化合物の化学名（ＩＵＰＡＣ名）は、（２’Ｚ３’Ｅ）５’−ヒドロキシ−５−ニトロインダニルオキシム｛（２’Ｚ３’Ｅ）５’−ヒドロキシ−５−ニトロインジルビンオキシム｝である。これは水にほとんど溶けず、ＤＭＦとＤＭＳＯに可溶であり、エタノールとアセトンに溶解するのが非常に困難である。注入可能な水溶液の実際の処方物については、ＰＥＧ３００溶液中のＡＧＭ−１３０化合物を生理食塩水中の０．１ＮＮａ₂ＣＯ₃で最終濃度３．７５ｍｇ／ｍＬの７０％水溶液に希釈する。

前臨床試験は、ＡＧＭ−１３０化合物が腫瘍におけるＣＤＫ信号伝達を効果的に阻害する高度に選択的なＣＤＫ阻害剤であることを示している。ＡＧＭ−１３０化合物は、インビトロ及び腫瘍異種移植片のヒト腫瘍細胞株の増殖に対して顕著な阻害活性を示した。さらに、ＡＧＭ−１３０化合物は確立された腫瘍の完全な退行を引き起こした。

以前に、本発明者らは、イマチニブ（Imatinib）耐性慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞に対する５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム化合物（ＡＧＭ−１３０）の抗がん活性を測定しようと試みた。さらに、本発明者らは、この化合物が試験管内及び生体内でイマチニブ耐性Ｋ５６２細胞の生存率を効率的に低下させることを見出した。

これらの結果は、Leukemia Research vol.37 pp.427-433 (2013)（非特許文献１）に開示されている。しかしながらＡＧＭ−１３０化合物は、ＣＭＬに適用すると安全性が十分に保証されないため、ＣＭＬ治療薬としてＡＧＭ−１３０化合物を適用しても完全な治療効果を示さなかった。

次に、本発明者らは、非小細胞肺がんに対する５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム化合物（ＡＧＭ−１３０）の抗がん活性を測定しようと試みた結果、ＡＧＭ−１３０化合物が、Ａ５４９ヒト非小細胞肺がん細胞に対してＧ２／Ｍ期の細胞周期を著しく阻害し、細胞周期を停止させることを見出し、放出されたシトクロムＣ(Cytochrome C)放出、Ｂａｘ、切断されたカスパーゼ（caspase）及びＰＡＲＰなどのタンパク質レベルが増加することもまた見出した。さらに、インビボ腫瘍異種移植モデルでは、ＡＧＭ−１３０化合物は、移植されたＡ５４９細胞腫瘍増殖を容量依存的に抑制した。
これらの結果は、European Journal of Pharmaceutical Sciences vol.79 pp.122-131（2015）（非特許文献２）に開示されている。しかし、ＡＧＭ−１３０化合物は、非小細胞肺がんに適用すると毒性が十分に保証されないため、非小細胞肺がんの治療薬として使用するのには適していなかった。

従って、本発明者らは、種々のがん細胞株に対するＡＧＭ−１３０化合物が最適に適用される抗がん活性を見出すために、試験管内及び生体内試験を繰り返した。
最後に、本発明者らは、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤としての５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム化合物（ＡＧＭ−１３０）が、タモキシフェン（tamoxifen）耐性エストロゲン（estrogen）受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がん及び／または三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）治療に適用する際に、優れた抗がん活性と十分な安全性を確保することができることを発見し、本発明を完成するに至った。

米国特許第８，８５９，７８３号公報

Leukemia Research vol.37 pp.427-433 (2013) European Journal of Pharmaceutical Sciences vol.79 pp.122-131（2015）

本発明が解決しようとする課題は、様々な種類のがん細胞株に対するインビトロ及びインビボ試験を繰り返して、ＡＧＭ−１３０化合物が最適に適用される抗がん治療剤を見つけることである。
さらに、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤としての５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム化合物（ＡＧＭ−１３０）が、タモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がん及び／または三重陰性乳がんの治療剤として使用可能かどうかを確認するためのものである。

本発明は、（１）サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤である５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムを有効成分として含有することを特徴とする三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）及び／またはエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療剤を提供する。
さらに、本発明は（２）前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及び／またはＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の遺伝子発現がサイレント(silent)である前項（１）に記載の乳がんの治療剤を提供する。

さらに、本発明は（３）前記エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんが、タモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含む前項（1）に記載の乳がんの治療剤を提供する。
さらに、本発明は（４）前記５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムが、Ｇ２／Ｍ期に関与するサイクリンＢ１発現を顕著に減少させ、かつ細胞周期でＧ２／Ｍ期を停止させることによってがん細胞の増殖を阻害する前項（１）に記載の乳がんの治療剤を提供する。
さらに、本発明は（５）前記５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムが、ミトコンドリア依存性アポトーシスによるがん細胞の増殖を阻害する前項（１）に記載の乳がんの治療剤を提供する。

本発明によれば、ＡＧＭ−１３０化合物が最適に適用される抗がん治療剤を提供することが可能となり、さらに、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤として５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシム化合物（ＡＧＭ−１３０）を含有する三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）及び／またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療剤を提供することが可能となる。

本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、腹腔内（i.p.）に注入されたＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定する実験デザイン概要図である。本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示すグラフである。本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の容量に依存的な抗がん活性を示す写真及びグラフである。本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、静脈内（i.v.）に注入されたＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定する実験デザイン概要図である。本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス静脈内（i.v.）注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示すグラフである。本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス静脈内（i.v.）注入時の容量依存的な腫瘍重量の減少を示す写真及びグラフである。本発明のＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７タモキシフェン耐性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の容量依存的な腫瘍サイズの変化を示すグラフである。図８ａは、本発明のＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７タモキシフェン耐性乳がんの細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の容量に依存的な抗がん活性を示す写真である。図８ｂは、本発明のＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７タモキシフェン耐性乳がんの細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の容量に依存的な抗がん活性による体重変化を示すグラフである。本発明のＭＣＦ−７ＥＲ陽性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス静脈内（i.v.）注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示す写真及びグラフである。比較例としてＫＢ口腔がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、腹腔内（i.p.）注入されたＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定する実験デザイン概要図である。比較例としてＫＢ口腔がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。比較例としてＨＣＴ−１１６大腸がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。比較例としてＨＣＴ−１１６大腸がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍サイズと体重の変化を示す写真及びグラフである。比較例としてＡ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。比較例としてＡ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍重量の変化を示す写真及びグラフである。比較例としてＡ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内（i.p.）注入時の腫瘍の形状変化をＴＵＮＥＬエッセイで測定した写真である。

本発明は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤としての三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療に効果的であることを特徴とする５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムを有効成分として含有する乳がん治療剤に関する。

以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明者らは、上記ＡＧＭ−１３０化合物を用いて、ＮＣＩ(National Cancer Institute)から提供される６０種のがん細胞株に対するインビトロがん細胞株の増殖阻害試験を実施した。ＡＧＭ−１３０化合物は、１０μＭの濃度のＡＧＭ−１３０を使用してがん細胞株の増殖阻害を試験した。

６０種のがん細胞株に対するインビトロがん細胞株の増殖阻害の結果を増殖パーセント（growth percent）にて示した。増殖パーセントが１００％であれば、全くがん細胞の増殖が阻害されていないことを意味する。また、増殖パーセントが０％であれば、これ以上の増殖が起こらない理想的な場合を意味する。一方、増殖パーセントが０％よりも小さいマイナスの場合、がん細胞の増殖阻害よりも高い致死率（lethality）を持ち、高い毒性を有することを意味する。
表１にその結果を示した。

上記表１に示すように、白血病細胞株の場合、ＲＰＭＩ−８２２６細胞株は高い毒性を示し使用することができなかったが、残りの細胞株の場合、良好な増殖阻害効果を示した。
非小細胞肺がんの場合、ほぼすべての細胞株で高い毒性を示し使用することができなかった。一方、中枢神経系がんの場合にも、ＳＦ−５３９、ＳＮＢ−７５細胞株の場合、高い毒性を示し、使用することができなかった。

また、黒色腫の場合、ほとんどの細胞株で高い毒性を示し、使用することができなかった。卵巣がん、腎臓がんの場合にも、いくつかの細胞株で高い毒性を示し、使用することができなかった。
また、大腸がんの場合には、ＫＭ１２細胞株を除いては、優れた抗がん活性と低い毒性を示した。一方、大腸がんＨＣＴ−１１６細胞株の場合、腫瘍異種移植モデルで腫瘍の大きさを減少させたが大きな意味を持つわけではない。
乳がんの場合、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨＳ−５７８Ｔ、ＢＴ−５４９とＴ−４７Ｄ細胞株など、すべての細胞株で毒性を示さず、優れた増殖阻害率を示した。

これにより、本発明者らは、乳がん細胞を移植したマウスの腫瘍異種移植（tumor xenograft）モデルを用いて、生体内のがん細胞の増殖を阻害するか否かを試験した。
具体的には、タモキシフェン耐性乳がん細胞を移植したマウスの腫瘍異種移植モデルを用いて、タモキシフェン耐性乳がん細胞の増殖を阻害するか否かを試験した。その結果、本発明のＡＧＭ−１３０化合物はＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞とタモキシフェン耐性乳がん細胞であるＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７乳がん細胞の腫瘍の増殖を容量依存的に阻害することを確認した。
これにより、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療に効果的であることが確認された。

ここで、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）はエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、及びＨＥＲ−２受容体が存在しない受容体ターゲット治療に反応しない乳がんであることを意味する。
また、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの場合、現在まで特異的感受性を示す抗がん剤が開発されず、通常の細胞毒性抗がん剤を過量投与してきたが、本発明のＡＧＭ−１３０化合物の発明により、低毒性でより効果的な抗がん治療剤の導入が可能になった。
また、本発明者らは、本発明のＡＧＭ−１３０化合物のＣＤＫ阻害効果に起因するがん細胞増殖抑制効果は、ＡＧＭ−１３０化合物が腫瘍内でサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）の信号化を阻害してがん細胞周期内でＧ２／Ｍ期を停止させることでがん細胞の増殖を抑制させるものと考えている。

本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、単独で、または薬学的に許容可能な担体または賦形剤と一緒に組成物に製剤化することができる。適切な薬学的に許容可能な担体または賦形剤は、リン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、単糖類、二糖類、澱粉、ゼラチン、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストロース、ヒドロキシプロピル−ｐ−シクロデキストリン、ポリビニルピロリドンまたはそれらの２つ以上の組み合わせを含む。

本発明のＡＧＭ−１３０化合物の治療的に有効な投与量は、１日の体重あたりの投与量で０．１〜１００ｍｇ／ｋｇであり、好ましくは０．５〜３０ｍｇ／ｋｇの量で被験者に投与することができる。
また、本発明のＡＧＭ−１３０組成物は、非毒性の薬学的に許容可能な担体、エジュバント、ビークルを含有する投与製剤で経口投与、非経口投与、舌下投与、エアロゾル投与、直腸投与または局所的投与することもできる。

また、本発明のＡＧＭ−１３０製剤は、注射製剤として製造することが好ましく、滅菌注射可能水性または油性懸濁液を適切な分散剤、湿潤剤または懸濁剤を使用して、当業界公知の方法により製剤化することができる。
この時、注射製剤は、リポソームの形態で投与することができる。リポソームは、一般的に、リン脂質または脂質物質から由来したもので水性培地に懸濁分散されている単一または多層の水和液体結晶を含むものである。

一方、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、単独で投与することができ、また他の抗がん剤と併用して使用することができる。この時、併用できる抗がん剤としては、代表的にイリノテカン（irinotecan）、トポテカン（topotecan）、ゲムシタビン（gemcitabine）、グリベック（glivec）、ハーセプチン（herceptin）、５−フルオロウラシル（5-fluorouracil）、ロイコボリン（leucovorin）、カルボプラチン（carboplatin）、シスプラチン（cisplatin）、タキサン（taxane）、テザシタビン（tezacitabine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、ビンカ−アルカロイド（vinca-alkaloid）、イマチニブ（imatinib）、アントラサイクリン（anthracycline）、リツキシマブ（rituximab）、トラスツズマブ（trastuzumab）及び／またはトポイソメラーゼＩ（topoisomerase I）阻害剤が含まれる。

以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験（腹腔内投与）
ヌードマウスを用い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞をマウスに移植して腫瘍を２００ｍｍ³の体積に増殖させた後、本発明のＡＧＭ−１３０化合物を１０、２０、及び４０ｍｇ／ｋｇの各用量で週２回マウスに腹腔内投与して、２７日間マウス内の腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図１は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、腹腔内（i.p.）に注入したＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定する実験デザイン概要図である。
図１に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞をマウスに接種し、その１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を１０／２０／４０ｍｇ／ｋｇの各用量で注入した後、さらにＡＧＭ−１３０化合物を２週間に１回腹腔に浸透させ、２７日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。

図２は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示すグラフである。
図２に示すように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞で増殖された腫瘍の大きさを容量依存的に減少させた。
この時、５ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを投与した対照抗がん剤に比べて約１４％腫瘍体積の減少が観察された。これは、本発明のＡＧＭ−１３０化合物が通常の乳がんに使用される抗がん剤であるパクリタキセルよりも抗がん活性が優れていることを示すものである。

一方、表２は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルでのＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験の結果を示し、ヌードマウス内の腫瘍サイズをＡＧＭ−１３０化合物の腹腔内投与容量（１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ及び４０ｍｇ／ｋｇ）に基づいて測定したものである。この時の対照群はＡＧＭ−１３０化合物を投与していないヌードマウスがん細胞の腫瘍サイズを示す。

図３は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内注入時の容量依存抗がん活性を示す写真及びグラフである。
図３に示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合、対照群に比べて約４４％の腫瘍サイズの減少を示し、２０ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合、対照群に比べて約７０％の腫瘍サイズの減少を示し、４０ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合、対照群に比べて約７８％の腫瘍サイズの減少を示した。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験（静脈内投与）
ヌードマウスを用い、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞をマウスに移植して腫瘍を２００ｍｍ³の体積に増殖させた後、本発明のＡＧＭ−１３０化合物を３、７、及び１４ｍｇ／ｋｇの各用量で週１回、マウスに静脈内（iv）投与し、２４日間マウスの腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図４は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞の腫瘍三重陰性乳がん異種移植モデルによる、静脈内（i.v.）に注入したＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定する実験デザイン概要図である。
図４に示すように、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞をマウスに接種し、その１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を３／７／１４ｍｇ／ｋｇの各用量で注入させた後、さらにＡＧＭ−１３０化合物を週１回静脈内浸透させ、２４日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。

図５は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによる、ＡＧＭ−１３０化合物のマウス静脈内注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示すグラフである。
図５に示すように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳がん細胞で増殖された腫瘍の大きさを容量依存的に減少させた。

一方、表３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験の結果を示し、ヌードマウス内の腫瘍サイズをＡＧＭ−１３０化合物の静脈内投与量（３ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、及び１４ｍｇ／ｋｇ）に基づいて測定したものである。この時の対照群は、ＡＧＭ−１３０化合物を投与していないヌードマウスがん細胞の腫瘍サイズを示す。

図６は、本発明のＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の容量依存的な腫瘍重量の減少を示すグラフである。
図６に示すように、３ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合、対照群に比べて約３６％の腫瘍サイズの減少を示し、７ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合は、対照群に比べて約５５％の腫瘍サイズの減少を示し、１４ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合は、対照群に比べて約７０％の腫瘍サイズの減少を示した。

タモキシフェン耐性乳がん細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験（腹腔内投与）
ヌードマウスを用いて、タモキシフェン耐性乳がん細胞（ＴＡＭＲ−ＭＣＦ−７）をマウスに移植して、腫瘍を増殖させた後、本発明のＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇ、及び４０ｍｇ／ｋｇの各用量で週２回、マウスに腹腔内投与して２４日間のマウスの腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図７は、本発明のタモキシフェン耐性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の容量依存的な腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
図７に示すように、ＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスの場合、腫瘍の大きさが対照群であるビークルに比べて約５４％程度減少し、ＡＧＭ−１３０化合物を４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスの場合、腫瘍の大きさが対照群であるビークルに比べて約４５％程度減少した。
ＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスと４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスの体重は、対照群のマウスに比べて有意な変化を示した。

図８は、本発明のタモキシフェン耐性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルでＡＧＭ−１３０化合物のマウス腹腔内注入時の容量依存的な抗がん活性を示す写真である。
図８に示すように、ＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスとＡＧＭ−１３０化合物を４０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスの両方で、腫瘍サイズの減少が有意に観察された。

図９は、本発明のＭＣＦ−７ＥＲ陽性乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス静脈内（i.v.）注入時の容量依存的な腫瘍サイズの減少を示す写真及びグラフである。
図９に示すように、ＭＣＦ−７乳がん細胞をマウスに接種し、その１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を３／７／１４ｍｇ／ｋｇの各用量で注入させた後、さらに週１回静脈内注入し、２４日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。

一方、下記表４は、ＭＣＦ−７乳がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験の結果を示し、ヌードマウス内の腫瘍サイズをＡＧＭ−１３０化合物を静脈内投与量（３ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、及び１４ｍｇ／ｋｇ）に基づいて測定したものである。
この時の対照群はＡＧＭ−１３０化合物を投与していないヌードマウスがん細胞の腫瘍サイズを示す。

表４に示すように、３ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合、対照群に比べて約５９％の腫瘍サイズの減少を示し、７ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合は、対照群に比べて約７５％の腫瘍サイズの減少を示し、１４ｍｇ／ｋｇのＡＧＭ−１３０化合物を投与したマウスの場合は、対照群に比べて約８１％の腫瘍サイズの減少を示した。

以上の実施例により、本発明のＡＧＭ−１３０化合物が、ＭＣＦ−７乳がん細胞の容量に依存的に腫瘍の大きさを減少させることが示され、本化合物がＥＲ陽性乳がんの治療に非常に効果的な治療薬として使用できることが実証された。
したがって、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを含むエストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんのより効果的な抗がん治療剤として導入可能である。

比較例

［比較例１］
ＫＢ口腔がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験（腹腔内投与）
ヌードマウスを用いて、ＫＢ口腔がん細胞（１０×１０⁶細胞／０．１ｍｌ無血清５０％matrigel培地）をマウスに注入させて、腫瘍を増殖させた後、本発明のＡＧＭ−１３０化合物を５、１０、及び２０ｍｇ／ｋｇの各用量で隔日に腹腔内投与して２８日間、マウス内の腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図１０は、ＫＢ口腔がん細胞の腫瘍異種移植モデルにより腹腔内注入されたＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性を測定するための実験デザイン概要図である。
図１０に示すように、ＫＢ口腔がん細胞をマウスに接種した後、１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を５／１０／２０ｍｇ／ｋｇの各用量で注入させた後、さらに隔日に腹腔内注入し、２８日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。

図１１は、ＫＢ口腔がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
図１１でグループ１は対照群を表し、グループ２はＡＧＭ−１３０化合物を５ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群、グループ３はＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群、グループ４はＡＧＭ−１３０化合物を２０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群を意味し、グループ５は陽性対照群でパクリタキセル（paclitaxel）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した群を意味する。
この時、１０ｍｇ／ｋｇのパクリタキセルを投与した対照抗がん剤に比べて、本発明のＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性の優位性は観察されなかった。このように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、ＫＢ口腔がん細胞に増殖された腫瘍の大きさを容量依存的に有意には減少させなかった。

［比較例２］
ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の化合物の抗がん活性試験（腹腔内投与）
ヌードマウスを用いて、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞（１０×１０⁶細胞／０．１ｍｌ無血清５０％matrigel培地）をマウスに注入させて、腫瘍を増殖させた後、本発明のＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇ用量で隔日に腹腔内投与し、２４日間マウスの腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図１２は、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
図１２に示すように、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞をマウスに接種し、その１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を１０ｍｇ／ｋｇの用量で注入した後、さらに隔日に腹腔内注入し、２４日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。
図１２に示したように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞で増殖された腫瘍の大きさを減少させたが、有意程度ではなかった。

図１３は、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の体重変化を示す写真及びグラフである。
図１３に示したように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、ＨＣＴ−１１６大腸がん細胞で増殖された腫瘍の重量を減少させたが、有意程度ではなかった。

［比較例３］
Ａ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物の抗がん活性試験（腹腔内投与）
ヌードマウスを用いて、Ａ５４９肺がん細胞をマウスに注入させ、腫瘍を増殖させた後、本発明の化合物ＡＧＭ−１３０化合物を１０／２０／４０ｍｇ／ｋｇの各用量で隔日に腹腔内投与して２７日間、マウス内の腫瘍の状態を測定する試験を行った。

図１４は、Ａ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
図１４に示すように、Ａ５４９肺がん細胞をマウスに接種し、１０日後にＡＧＭ−１３０化合物を１０／２０／４０ｍｇ／ｋｇの用量で注入した後、さらに隔日に腹腔内注入し、２７日までの腫瘍サイズとヌードマウスの腫瘍の状態を観察測定した。この時の対照抗がん剤としてはドセタキセル（docetaxel）（５ｍｇ／ｋｇ）を投与した。
図１４に示したように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、陽性対照群に使用したドセタキセルに比べて類似なレベルの腫瘍抑制効果を示した。

図１５は、Ａ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の腫瘍重量の変化を示す写真及びグラフである。
図１５に示すように、本発明のＡＧＭ−１３０化合物は、Ａ５４９肺がん細胞に増殖された腫瘍の大きさを減少させた。

図１６は、Ａ５４９肺がん細胞の腫瘍異種移植モデルによるＡＧＭ−１３０化合物のマウス内注入時の腫瘍の形状変化をＴＵＮＥＬエッセイで測定した写真である。
これはアポトーシス細胞死滅しているパラフィン含浸腫瘍部位をタネル法（ＴＵＮＥＬエッセイ）で測定したものであり、この写真からＡＧＭ−１３０化合物が対照群であるビークルに比べてＡ５４９の肺がん細胞を死滅させていることがわかる。

Claims

サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤である５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムを有効成分として含有することを特徴とする三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）及び／またはタモキシフェン耐性エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんの治療剤。
前記三重陰性乳がん（ＴＮＢＣ）が、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）及びＨｅｒ２／ｎｅｕ受容体の遺伝子の発現がサイレント(silent)である請求項１に記載の乳がんの治療剤。
前記５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムが、Ｇ２／Ｍ期に関与するサイクリンＢ１発現を顕著に減少させ、かつ細胞周期でＧ２／Ｍ期を停止させることによってがん細胞の増殖を阻害する請求項１に記載の乳がんの治療剤。
前記５’−ヒドロキシ−５−ニトロ−インジルビン−３’−オキシムが、ミトコンドリア依存性アポトーシスによるがん細胞の増殖を阻害する請求項１に記載の乳がんの治療剤。