CN112083109B - 羧胺三唑杂质及其制备方法和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种羧胺三唑杂质及其制备方法和检测方法。所述羧胺三唑杂质，其具有如下所示结构特征。该杂质为一种新的羧胺三唑杂质，属于含有警示结构的高风险化合物中的醛类化合物，其能够为羧胺三唑药物中遗传毒性杂质的毒理学提供研究基础，为羧胺三唑药物的安全性研究提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及药物杂质，特别是羧胺三唑杂质及其制备方法和检测方法。
背景技术
羧胺三唑属非细胞毒类抗肿瘤药物，目前被认为是最具发展潜力的抗肿瘤新药之一。临床结果显示，人体对其有良好的耐受性，不良反应主要为全身不良反应(如疲乏)和消化系统不良反应(如恶心、呕吐、厌食)。在羧胺三唑原料药和制剂的杂质研究过程中发现，其有机杂质较多，且存在多个遗传毒性杂质。
遗传毒性(Genotoxcity)是指遗传物质中任何有害变化引起的毒性，而不考虑诱发该变化的机制，又称为基因毒性。遗传毒性杂质(Genotoxic Impurities，GTIs)是指能引起遗传毒性的杂质，包括致突变杂质和其它类型的无致突变性杂质。其主要来源于原料药的生产和贮存过程，如起始原料、反应物、催化剂、试剂、溶剂、中间体、副产物、降解产物等。醛类化合物是分子中含有醛基(-CHO)的一类化合物，其化学性质较活泼，根据欧盟联合研究中心(Joint Research Center，JRC)公开的信息表明，醛类化合物是一类含有警示结构的高风险化合物。药物中遗传毒性杂质的毒理学关注阈值(Threshold of toxicologiclaconcern，TTC)取决于药物的日常服用剂量和暴露期。人用药物注册技术要求国际协调会议(International Conference on Harmonization，ICH)M7(评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质以限制潜在的致癌风险)提出单个杂质分阶段的TTC，具体如下所示：
按照TTC计算出的杂质限度要远低于一般杂质。羧胺三唑为晚期癌症治疗用药，可将遗传毒性杂质的限度适当放宽(不得过0.02％)，但也远低于一般杂质控制限度。
因此，对羧胺三唑中的遗传毒性杂质进行研究，以及建立针对其遗传毒性杂质的检测方法是十分有必要的。
发明内容
基于此，有必要提供一种羧胺三唑杂质。该杂质为一种新的羧胺三唑杂质，属于含有警示结构的高风险化合物中的醛类化合物，其能够为羧胺三唑药物中遗传毒性杂质的毒理学提供研究基础，为羧胺三唑药物的安全性研究提供依据。
具体技术方案如下：
一种羧胺三唑的杂质，其具有如下所示结构特征：
本发明还提供所述羧胺三唑的杂质的制备方法，采用液相色谱法制备，所述制备方法包括如下步骤：
以羧胺三唑原料药和/或羧胺三唑制剂为原料，制备待分离液；
采用高效液相色谱法对所述待分离液进行分离制备，收集所述羧胺三唑的杂质；
其中，所述高效液相色谱法采用的流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，先对所述原料进行氧化破坏处理，再制备所述待分离液。
在其中一个实施例中，所述流动相A的pH值为7～9。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
本发明还提供所述羧胺三唑的杂质的检测方法，采用高效液相色谱法，流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，进行梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述羧胺三唑的杂质的检测方法包括如下步骤：
取所述羧胺三唑杂质的对照品，以溶剂溶解，制备对照品；
取羧胺三唑待测物，以溶剂溶解或提取，制备供试品；
采用高效液相色谱法对所述对照品和供试品进行检测；
其中，所述高效液相色谱法采用的流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的填充剂为辛烷基硅烷键合颗粒杂化硅胶。
在其中一个实施例中，所述流动相A的pH值为7～9。
在其中一个实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
在其中一个实施例中，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由20％上升至50％；
50.1～60min，保持流动相A的体积百分比为50％。
与现有技术相比较，本发明具有如下有益效果：
本发明在抗肿瘤药物羧胺三唑原料药和制剂中发现了一种新的杂质，其是羧胺三唑原料药的氧化破坏杂质，为一种醛类化合物，属于含有警示结构的高风险化合物。该羧胺三唑杂质能够为羧胺三唑药物中遗传毒性杂质的毒理学提供研究基础，并为羧胺三唑药物的安全性研究提供依据。
本发明采用合适流动相设置的高效液相色谱法实现了上述新的羧胺三唑杂质的制备，能够为羧胺三唑杂质的研究提供对照品，便于对羧胺三唑进行质量控制，提高其用药安全性。
本发明采用合适流动相设置的高效液相色谱法，能够检测羧胺三唑原料药和制剂中上述新的羧胺三唑杂质的含量，其中合适的流动相A和流动相B能够协同抑制醛杂质峰的前延，改善其峰型并提高检测灵敏度。该检测方法操作简单、结果可靠，可实现羧胺三唑原料药和制剂中上述新的羧胺三唑杂质的快速、低成本检测。
附图说明
图1为实施例1制备的羧胺三唑杂质的LC/MS测试图；
图2为实施例1制备的羧胺三唑杂质的1H-NMR测试图；
图3为样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC比对色谱图；
图4为实施例3色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图5为实施例4色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图6为实施例5色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图7为实施例6色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图8为实施例7色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图9为实施例8色谱条件下的样品和实施例1制备的羧胺三唑杂质的HPLC分离色谱图；
图10为实施例9的羧胺三唑杂质的检测方法色谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的羧胺三唑杂质及其制备方法和检测方法作进一步详细的说明。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。若无特别说明，本文所使用的“％”均表示体积百分比。
可以理解地，本文所述“磷酸氢二铵缓冲液”可根据pH值需要，采用磷酸氢二铵和/或磷酸二氢铵进行配制。
本发明的实施例提供一种羧胺三唑的杂质，其具有如下所示结构特征：
进一步地，所述羧胺三唑的杂质属于醛类化合物，醛类化合物在酸性条件下易形成醛水合物(Aldehyde hydrate)，又称水合醛，具体为在酸性条件下，水作为亲核试剂，与醛发生相应的亲核加成反应所形成的加成产物，该加成产物最大的特点是一个碳原子上有两个羟基，因此把这种结构的产物称为偕二醇。而由于该种因素的存在，醛类化合物在反相色谱分离中易与色谱柱填料中残留的硅羟基通过氢键作用而致使峰型不对称，影响特征峰的专属性以及检测的灵敏度和准确度。同时，所述羧胺三唑的杂质在羧胺三唑原料药或制备中的限度较低。
基于此，本发明所述羧胺三唑杂质进行了鉴别和检测。所述羧胺三唑杂质为羧胺三唑原料药的氧化破坏杂质，根据其分子量推测杂质结构，通过高效液相色谱法根据保留时间进行定位，确定为上述结构特征的醛杂质。然后将羧胺三唑原料药和/或制剂用溶剂溶解或提取，并定容配制成待检测溶液，通过高效液相色谱法，采用合适的流动相，定量检测羧胺三唑原料药和制剂中所述羧胺三唑杂质的含量。
具体地，本发明的实施例提供所述羧胺三唑杂质的检测方法，采用高效液相色谱法，流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，进行梯度洗脱。其中，采用合适的流动相A和流动相B，能够协同抑制所述羧胺三唑杂质的特征峰的前延，改善其峰型，提高检测灵敏度和准确度。
更为具体地，所述羧胺三唑杂质的检测方法包括如下步骤：
取所述羧胺三唑杂质的对照品，以溶剂溶解，制备对照品；
取羧胺三唑待测物，以溶剂溶解或提取，制备供试品；
采用高效液相色谱法对所述对照品和供试品进行检测；
其中，所述高效液相色谱法采用的流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，洗脱方式为梯度洗脱。
可以理解地，所述羧胺三唑待测物可以为可能包含所述羧胺三唑杂质的任何羧胺三唑相关物质，具体如，羧胺三唑原料药、羧胺三唑制剂、羧胺三唑生产中间体等。
在其中一个具体的实施例中，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的填充剂为辛烷基硅烷键合颗粒杂化硅胶。
在其中一个具体的实施例中，所述流动相A的pH值为7～9。流动相A在该pH范围内，能够保证所述羧胺三唑杂质的特征峰峰型良好，并获得较佳的分离度，提高检测的准确度。具体地，所述流动相A的pH值包括但不限于如下pH值：7、7.5、8、8.5、9。
在其中一个具体的实施例中，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。具体地，所述柱温包括但不限于如下温度值：30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃。
在其中一个具体的实施例中，所述高效液相色谱法采用的流速为0.5～1.5ml/min。具体地，所述流速包括但不限于如下值：0.5ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min。
在其中一个具体的实施例中，所述溶剂为甲醇。
在其中一个具体的实施例中，所述对照品中，所述羧胺三唑杂质的浓度为0.2～0.6μg/mL。具体地，所述浓度包括但不限于如下浓度值：0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.35μg/mL、0.4μg/mL、0.45μg/mL、0.5μg/mL、0.6μg/mL。
在其中一个具体的实施例中，所述供试品中，所述羧胺三唑原料药和/或羧胺三唑制剂的浓度为1～3mg/mL。具体地，所述浓度包括但不限于如下浓度值：1mg/mL、1.2mg/mL、1.5mg/mL、1.8mg/mL、2mg/mL、2.2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL。
在其中一个具体的实施例中，采用外标法计算所述羧胺三唑杂质的含量。
在其中一个具体的实施例中，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
更为具体地，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由20％上升至50％；
50.1～60min，保持流动相A的体积百分比为50％。
本发明的实施例还提供所述羧胺三唑杂质的制备方法，采用液相色谱法制备，所述制备方法包括如下步骤：
以羧胺三唑原料药和/或羧胺三唑制剂为原料，制备待分离液；
采用高效液相色谱法对所述待分离液进行分离制备，收集所述羧胺三唑的杂质。
具体地，所述高效液相色谱法的洗脱方式可以有两种：
第一种，所述高效液相色谱法采用的流动相A为磷酸氢二铵缓冲液，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，洗脱方式为梯度洗脱。
在其中一个具体的实施例中，所述流动相A的pH值为7～9。流动相A在该pH范围内，能够保证所述羧胺三唑杂质的特征峰峰型良好，并获得较佳的分离度，提高检测的准确度。具体地，所述流动相A的pH值包括但不限于如下pH值：7、7.5、8、8.5、9。
在其中一个具体的实施例中，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
第二种，所述高效液相色谱法采用的流动相C为醋酸铵缓冲液，流动相D为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，洗脱方式为等梯度洗脱。
在其中一个具体的实施例中，所述流动相C和流动相D的体积比为43～47:53～57。
在其中一个具体的实施例中，所述流动相C的pH值为7～9。
进一步地，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶或辛烷基硅烷键合颗粒杂化硅胶。
进一步地，先对所述原料进行氧化破坏处理，再制备所述待分离液。具体地，所述氧化破坏处理采用的氧化剂为过氧化氢，处理条件为于65～75℃条件下处理4～6小时。
进一步地，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。具体地，所述柱温包括但不限于如下温度值：30℃、32℃、34℃、35℃、36℃、38℃、40℃。
进一步地，所述高效液相色谱法采用的流速为0.5～1.5ml/min。具体地，所述流速包括但不限于如下值：0.5ml/min、0.7ml/min、0.8ml/min、0.9ml/min、1ml/min、1.1ml/min、1.2ml/min、1.5ml/min。
如下为具体的实施例，如无特别说明，实施例中采用的原料均为市售获得。
实施例1
鉴于抗肿瘤药物羧胺三唑原料药和制剂中存在多个杂质，本实施例拟对其高效液相色谱图中保留时间30-40min之间的杂质进行制备和鉴定。具体为通过液质联用技术对实际样品中有机杂质进行分子量测定，用于获得杂质信息进行杂质结构推测。
样品：羧胺三唑原料药，由广东银珠医药科技有限公司提供，批号为201106001批。
液相色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-二极管阵列检测器-质谱检测器(TOF，安捷伦6200)；
色谱柱：Waters Symmetry C18，5μm，4.6×250mm；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：乙腈；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
紫外波长：262nm；
进样体积：20μl；
溶剂：乙腈-水(60:40)。
质谱检测条件：
电离模式：正离子电喷雾(ESI+)；
质谱扫描范围：200～800；
碎裂电压：100V；
干燥气温度：275℃；
干燥气流速：5L/min；
雾化器电压：50V；
毛细管电压：1000V；
喷雾电压：2000V；
鞘气温度：250℃；
鞘气流速：8L/min。
样品溶液：取样品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含样品1mg的溶液。
收集35.787min处特征峰的分离相，制备得到目标杂质(即所述羧胺三唑杂质)。HPLC和质谱结果如图1所示，目标杂质峰分析结果见下表：
Formula Calculator Results
| Formula | Best | Mass | Tgt Mass | Diff(ppm) | Ion Species | Score |
| C14 H7 Cl3 O2 | TRUE | 311.9514 | 311.9512 | -0.87 | C14 H8 Cl3 O2 | 96.02 |
| C12 H5 Cl3 N3 O | FALSE | 311.9515 | 311.9498 | -5.51 | C12 H6 Cl3 N3 O | 85.67 |
| C11 H10 Cl4 N O | FALSE | 311.9515 | 311.9516 | 0.39 | C11 H11 Cl4 N O | 73.36 |
| C10 H3 Cl3 N6 | FALSE | 311.9517 | 311.9485 | -10.18 | C10 H4 Cl3 N6 | 68.16 |
| C9 H8 Cl4 N4 | FALSE | 311.9516 | 311.9503 | -4.27 | C9 H9 Cl4 N4 | 65.92 |
| C8 H12 Cl4 O4 | FALSE | 311.9515 | 311.949 | -8.07 | C8 H13 Cl4 O4 | 56.05 |
| C8 H26 N9 O4 | TRUE | 312.2109 | 312.2108 | -0.27 | C8 H27 N9 O4 | 47.59 |
| C9 H22 N13 | FALSE | 312.2109 | 312.2121 | 4.01 | C9 H23 N13 | 42.6 |
| C10 H28 N6 O5 | FALSE | 312.2109 | 312.2121 | 4.03 | C10 H29 N6 O5 | 42.56 |
| C18 H31 Cl N O | FALSE | 312.2109 | 312.2094 | -4.62 | C18 H32 Cl N O | 41.08 |
| C21 H28 O2 | FALSE | 312.2109 | 312.2089 | -6.18 | C21 H29 O2 | 36.56 |
图1中，在35.787min处为目标杂质峰，其分子量为311.9514，结合氢谱(1H-NMR)测试结果(如图2所示)在制备分离得到的目标杂质的1H-NMR谱中，低场区显示有三组共6个苯环上的氢信号，分别为δH7.50(2H，d，J＝8.6Hz，H-3”和H-5”)，δH7.78(2H，d，J＝8.5Hz，H-2’和H-6’)，δH7.92(2H，s，H-2”和H-6”)；此外在更低场区显示有一组活泼氢信号，δH10.03(H，s，-CHO)，为醛基上的氢信号。
据此，可以推测制备得到的羧胺三唑杂质的结构为：
实施例2
以实施例1制备得到的所述羧胺三唑杂质作为对照品进行下述研究。色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters Symmetry C18，5μm，4.6×250mm；
流动相A：水；
流动相B：乙腈；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：30℃；
流速：1.0ml/min；
紫外波长：262nm；
进样体积：20μl；
溶剂：乙腈-水(60:40)。
制备对照品溶液：取实施例1制备得到的所述羧胺三唑杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含对照品1mg的溶液。
制备样品(同实施例1)溶液：取样品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释制成每1ml约含样品1mg的溶液。
结果如图3所示，其中，样品中与对照品相对应峰的保留时间和峰型对比如下表：
对比表明，实施例1制备和鉴定的所述羧胺三唑杂质即为样品中的杂质，将其称为醛杂质。
实施例3色谱条件的优化
鉴于实施例1和2的色谱条件下，杂质峰均存在前延，因此对色谱条件进行优化。
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸二氢钾缓冲液(20mmol/L，pH 3.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱；
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图4所示：醛杂质峰型前延，且在分离度溶液中与其相邻杂质未达到基线分离。
实施例4色谱条件的优化
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 7.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图5所示：醛杂质峰型良好，且在分离度溶液中与其相邻杂质达到基线分离。
实施例5色谱条件的优化
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图6所示：醛杂质峰型良好，且在分离度溶液中与其相邻杂质达到基线分离，定量限溶液浓度为0.08μg/ml(约相当于限度浓度的20％)，S/N为14.7，表明本方法灵敏度良好。
实施例6色谱条件的优化
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 9.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图7所示：醛杂质峰型良好，且在分离度溶液中与其相邻杂质达到基线分离。
实施例7色谱条件的优化
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)；
流动相B：乙腈；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：40℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取羧胺三唑样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约羧胺三唑样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图8所示：醛杂质峰型前延，且在分离度溶液中与其相邻杂质未达到基线分离。
实施例8色谱条件的优化
本实施例采用的色谱条件如下：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：30℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
分离度溶液：分别取羧胺三唑样品(同实施例1)和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约羧胺三唑样品2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
结果如图9所示：醛杂质峰型良好，且在分离度溶液中与其相邻杂质达到基线分离。
实施例9
本实施例一种羧胺三唑杂质的检测方法。
色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，5μm，4.6×150mm；
流动相A：磷酸氢二铵缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)；
流动相B：甲醇；
按照下表进行梯度洗脱：
柱温：30℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：20μl；
溶剂：甲醇。
对照品溶液：取醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约含醛杂质0.4μg的溶液。
供试品溶液：取待测羧胺三唑适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约羧胺三唑2mg的溶液。
供试品加标溶液：分别取羧胺三唑和醛杂质适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml约羧胺三唑2mg、醛杂质0.4μg的溶液。
计算公式：
(1)校正因子
式中：F—校正因子；
C对照品—对照品溶液的浓度(mg/ml)；
A对照品—对照品溶液的峰面积。
(2)醛杂质含量
式中：F平均—校正因子的平均值；
A供试品—供试品溶液中醛杂质的峰面积；
D—供试品的稀释倍数；
W供试品—供试品的称样量(mg)。
(3)供试品加标溶液中醛杂质的回收率
结果如图10所示：
实际样品(供试品溶液)中未检测出醛杂质；按外标法，供试品加标溶液(100％)中醛杂质的量为0.021％，回收率为104.5％，回收率符合可接受标准(80.0％～120.0％)，表明本方法可用于醛杂质的准确定量。
实施例10
本实施例一种羧胺三唑杂质的制备方法。
色谱条件：
仪器：高效液相色谱仪-紫外检测器；
色谱柱：Waters XTerra RP8，10μm，10×300mm；
流动相：醋酸铵缓冲液(20mmol/L，pH 8.0)-甲醇(45:55)
柱温：30℃；
流速：1.2ml/min；
紫外波长：267nm；
进样体积：500μl；
收集时间：30min。
待分离溶液：取羧胺三唑原料药200mg，置20ml量瓶中，加乙腈10ml和3％过氧化氢溶液5ml，摇匀，于70℃水浴加热5小时，冷却后用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为待分离溶液。
采用上述分离制备色谱条件，进样10次，得到本杂质6mg，按照质量平衡法标定其含量，为98.91％。
质量平衡法公式：对照品含量＝(100％-TGA失重率％)×色谱纯度％
| 色谱纯度(％) | TGA失重率(％) | 杂质标定含量(％) |
| 98.906 | 0.000 | 98.91 |
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (9)
1.一种羧胺三唑杂质的制备方法，其特征在于，所述羧胺三唑杂质具有如下所示结构特征：
采用液相色谱法制备，所述制备方法包括如下步骤：
以羧胺三唑原料药和/或羧胺三唑制剂为原料，制备待分离液；
采用高效液相色谱法对所述待分离液进行分离制备，收集所述羧胺三唑杂质；
其中，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的填充剂为辛烷基硅烷键合颗粒杂化硅胶，流动相A磷酸氢二铵缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7～9，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，梯度洗脱方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
2.权利要求1所述羧胺三唑杂质的制备方法，其特征在于，先对所述原料进行氧化破坏处理，再制备所述待分离液。
3.权利要求2所述羧胺三唑杂质的制备方法，其特征在于，所述氧化破坏处理采用的氧化剂为过氧化氢，处理条件为于65～75℃条件下处理4～6小时。
4.权利要求1～3任一项所述羧胺三唑杂质的制备方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
5.一种羧胺三唑杂质的检测方法，其特征在于，所述羧胺三唑杂质具有如下所示结构特征：
采用高效液相色谱法检测，所述高效液相色谱法采用的色谱柱的填充剂为辛烷基硅烷键合颗粒杂化硅胶，流动相A磷酸氢二铵缓冲液的浓度为20mmol/L，pH值为7～9，流动相B为甲醇，紫外检测波长为260nm～280nm，梯度洗脱方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％。
6.根据权利要求5所述羧胺三唑杂质的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
取所述羧胺三唑杂质的对照品，以溶剂溶解，制备对照品；
取羧胺三唑待测物，以溶剂溶解或提取，制备供试品；
采用所述高效液相色谱法对所述对照品和供试品进行检测。
7.根据权利要求5所述羧胺三唑杂质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为30～40℃。
8.根据权利要求5所述羧胺三唑杂质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的方法如下：
0～20min，保持流动相A的体积百分比为50％；
20～30min，流动相A的体积百分比由50％下降至40％；
30～35min，流动相A的体积百分比由40％下降至20％；
35～50min，保持流动相A的体积百分比为20％；
50～50.1min，流动相A的体积百分比由20％上升至50％；
50.1～60min，保持流动相A的体积百分比为50％。
9.根据权利要求5～8任一项所述羧胺三唑杂质的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法采用的流速为0.5～1.5mL/min。
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