CN101443021A - 癌和其他疾病的预防和治疗 - Google Patents

Abstract

公开了核苷化学化合物，其与脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的特定结构相互作用。所述化合物干扰端粒末端转移酶和反转录酶的活性，并可以用作抗病毒、抗菌和抗癌剂。还公开了治疗或预防患者中癌的方法，包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物具有患者的细胞内表达的反转录酶(RT)的抑制剂或拮抗剂。还公开了使用核苷类似物和其他RT抑制剂连同DNA损害剂例，如遗传毒性试剂或放射或光动力学治疗或这些的组合用于各种癌症的治疗的方法。

Description

癌和其他疾病的预防和治疗

本申请要求提交于2006年3月14日的美国临时申请60/782,559、提交于2006年5月18日的美国临时申请60/801,693和提交于2006年11月21日的美国临时申请60/860,518的权益，并且是提交于2006年5月18日的PCT/US2006/019488的部分延续申请，和申请60/782,559、60/801,693、60/860,518和PCT/US2006/019488的内容通过参考全部引入本文。

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域和特别是使用反转录酶(RT)抑制剂的组合用于抑制癌细胞生长以及治疗和预防癌症的方法。本发明还包括使用核苷类似物和其他RT抑制剂连同DNA损害剂例如遗传毒性试剂或放射或光动力学治疗或这些的组合，用于各种癌症的治疗的方法。本发明还涉及新的核苷化合物，其与脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的特定结构相互作用。更具体地说，本发明的化合物干扰端粒末端转移酶和反转录酶的活性，并可以用作抗病毒剂、抗寄生虫剂、抗菌剂和抗癌剂。

背景技术

细胞分裂(增殖)是在几乎所有组织中和在许多环境下都发生的生理过程。细胞周期的进程都被激酶、磷酸酶和抑制蛋白质的组合作用所控制，所述抑制蛋白质是被蛋白质伴侣及正-及负-磷酸化作用所调节的。细胞周期进程的特征在于检查点(checkpoint)，在此细胞在前进之前确定之前的步骤是否已经成功完成。大多数细胞在它们死亡之前有固定的分裂次数(大约50次)。PCT申请公开WO2005/069880描述了细胞怎样进入死亡期(M1和M2)和某些细胞逃避开死亡期的条件，并通过端粒维持以保持不受控制的方式快速分裂的能力。

细胞不受控制的和经常快速的增殖能导致肿瘤的形成(良性的或恶性的)。良性肿瘤不扩散到身体的其他部分或侵入其他组织，并且它们很少威胁到生命，除非它们压迫重要的结构或是生理活性的(例如，产生激素例如雌激素)。恶性肿瘤能侵入其他器官，扩散到远处的位置(转移)和变得危及生命。能够形成恶性肿瘤的细胞显示出不受控制的分裂能力(或，它们是永生的)，并且它们通常以与健康组织或甚至良性肿瘤的细胞相比更高的速率分裂。因此，癌症的治疗通常集中于清除恶性细胞。

传统上，据信许多癌症治疗的效力是由细胞毒性产生，所述细胞毒性来源于化学治疗诱导的和/或放射诱导的DNA损害。认为这样的DNA损害触发了细胞调亡反应。例如，据信卡培他滨(capecitabine)(也被称为Xeloda

)和蒽环类抗生素柔红霉素(也被称为DNR)治疗诱导细胞毒性，所述细胞毒性是药物诱导的对DNA损害的结果。

近年来，已经建立了更靶向目标的方法，所述方法干扰癌症细胞中的端粒维持并导致细胞周期停滞和细胞调亡。通过端粒末端转移酶延长缩短的端粒是已知的人癌症细胞中的端粒维持机制。端粒末端转移酶维持端粒DNA并在肿瘤细胞永生中扮演了关键性的角色。人端粒末端转移酶在正常体细胞中被抑制或仅有瞬时活性并且端粒在几十年间逐渐缩短。已经报道说在大多数癌症中，端粒(尽管短)被端粒末端转移酶所维持。已经证明了在端粒末端转移酶活化和肿瘤进展之间的相关性。这导致本领域技术人员相信端粒末端转移酶的抑制是用于癌症治疗的有希望的方法。然而，高达30％的不同类型人肿瘤没有表达端粒末端转移酶。据报道非端粒末端转移酶调节的端粒维持或其它端粒延长存在于高达30％的不同类型人肿瘤、肿瘤衍生细胞系和体外永生化人细胞系中(Bryan et al.，Nat.Med.3：1271-1274，1997；Reddel et al.，Radiat.Res.155：194-200，2001；Bryan et al.，Eur.J.Cancer 33：767-773，1997；Bryan et al.，EMBO J.14：4240-4248，1995)和在肿瘤和永生细胞系的某些子集中高达50％(Gupta et al.，J.Natl.Cancer Inst.88：1152-1157(1996))。

PCT申请公开WO 2005/069880报道说，某些核苷类似物能在端粒末端转移酶阴性癌细胞中诱导细胞调亡。例如，当用治疗浓度的AZT或更昔洛韦(GCV)处理U-2 OS和Saos-2骨肉瘤细胞时，在治疗14天后这些核苷类似物在这些癌症细胞中诱导了端粒缩短、G2期停滞和大量的细胞凋亡。同样地，美国专利6,723,712报告了用于治疗癌症的某些核苷类似物。特别地，它报道了抗病毒核苷磷酸类似物、西多福韦和放射的组合作为用于治疗人癌症的方法。特别地，它报道说当用放射和西多福韦单独处理Ramos(淋巴瘤)HTB31和SCC97(癌瘤)细胞时，单独放射和单独西多福韦两者都诱导弱的生长延迟，然而两种试剂的相伴联合对于研究的肿瘤细胞剧烈的减少生长延迟。另外，Sciamanna et al.，2005，Oncogene 24：3923，报道说内源性的反转录酶(RT)或非端粒末端转移酶反转录酶是一种细胞增殖的后生调节剂，并且在动物试验中体内RT活性的抑制拮抗肿瘤生长。

这些报道说明用于抑制癌症细胞生长的治疗在稳步进展。然而，仍存在这样的事实，即使目前最好的治疗也并不总是足够有效和/或经常在治疗之后变得无效，并且经常伴随有显著的副作用，因此一直在寻找改良的抗癌治疗。已知合成核苷类似物是治疗有益的，尤其是，作为抗病毒、抗生素和抗癌剂。这些核苷类似物中的许多都在市场上出售。然而，尽管有广泛的药物化学研究，病原体抗性的增加和在化学治疗中核苷通常严重的副作用加强了对核苷类似物较高数量和多样性的需要。特别地，对于方法和药剂的需要持续存在，所述方法和药剂用于实现对异常细胞增殖的足够控制和对癌症的治疗，所述异常细胞增殖包括癌细胞异常生长潜能。

发明概要

本发明通过提供方法和某种组合的相关化合物来实现了这种用于治疗病况的需求，所述病况的特征在于细胞增殖，包括但不限于，癌和转移。

发明还公开了在酶促核酸合成/延长反应中用作链终止剂的新无环核苷类似物。

本发明是部分地基于如下发现，多种端粒维持机制(TMM)的同时抑制导致在癌症细胞中渐进的端粒缩短和细胞周期的G2/M期停滞，从而限制了细胞的增殖潜能。它还表明了在缺少这种同时抑制的情况下，细胞通过从一种端粒维持机制切换为另一种来继续异常增殖。为了同时抑制多种端粒维持机制，使用化合物(几种反转录酶的抑制剂)的组合。此外，本发明人还发现TMM的同时抑制使癌细胞对任意种类的DNA损害治疗(例如，遗传毒性化学治疗、放射治疗、光动力学治疗)更敏感。更具体地说，已经发现了端粒维持的抑制，导致在癌细胞中端粒缩短和G2/M期停滞，不仅能限制细胞的异常增殖而且能增加DNA损害剂的效力，因为也许是由于G2/M期停滞，细胞对这种试剂最敏感。

一方面，本发明提供了一种用于治疗具有以异常哺乳动物细胞增殖为特征的病况的患者的方法。该方法包括向需要这种治疗的患者施用抑制增殖有效量的化合物的端粒维持影响(或端粒缩短)组合，其中所述组合是双鸡尾酒组合或三鸡尾酒组合。

根据一个具体实施方式，患者以某种方式和以某种数量使用给定的化合物鸡尾酒治疗，以抑制原发肿瘤的增殖，或抑制转移扩散或生长，同时最小化全身性毒性的可能，特别是由于使用其他DNA损害剂。在某些具体实施方式中，异常的哺乳动物细胞增殖显现为肿瘤。意欲通过本发明方法治疗的一些病况包括良性的(即，非癌的)、恶性前的和恶性的(即，癌)肿瘤。在某些具体实施方式中，以异常哺乳动物细胞增殖为特征的病况的特征还在于存在具有与它们在连续细胞分裂后的正常对应物相比的长端粒的细胞。

在其他具体实施方式中，异常哺乳动物细胞增殖可以是一种病况，其被诊断为癌瘤、肉瘤和黑素瘤。在其他具体实施方式中，所述病况是结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、黑素瘤和纤维肉瘤的任一种。在其他具体实施方式种，所述病况可以是与骨和结缔组织肉瘤相关的一种，其实例包括，但不限于，骨肉瘤和纤维肉瘤。

在某些其他具体实施方式中，所述异常哺乳动物细胞增殖是在上皮细胞中。某些以异常哺乳动物上皮细胞增殖为特征的病况包括上皮组织例如乳腺、结肠和前列腺的腺瘤，以及恶性肿瘤。根据本发明的其他具体实施方式，提供了一种用于治疗具有上皮来源的转移的患者的方法。

如上所述，待治疗的患者是具有以异常哺乳动物细胞增殖或癌为特征的病况的患者。然而，在某些具体实施方式中，所述患者没有异常哺乳动物细胞增殖或癌，但很可能产生这种病况(根据某些生物标记物或遗传缺陷)，从而要求用化合物的组合来治疗，用于端粒缩短和G2/M期停滞。

在本发明的另一个方面，提供了一种方法，其中将能够影响端粒维持的化合物的组合与一个或多个DNA损害剂例如遗传毒性化学治疗剂组合施用。在另一个具体实施方式中，将有或没有DNA损害剂的化合物的组合与手术组合施用，以移除异常增殖细胞团块。在相关的具体实施方式中，将有或没有DNA损害剂的化合物的组合施用到已经进行了手术的患者，以移除异常增殖细胞团块。

在一些具体实施方式中，所述异常的哺乳动物细胞增殖表现为肿瘤。在另一个具体实施方式中，所述异常哺乳动物细胞增殖选自癌瘤、肉瘤和黑素瘤。在另一个具体实施方式中，以异常哺乳动物细胞增殖为特征的病况是转移。在其他具体实施方式中，所述病况选自乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、黑素瘤和纤维肉瘤。在另一个具体实施方式中，所述异常哺乳动物细胞增殖在上皮细胞中，意指上皮细胞是异常增殖的。

化合物的组合或其组合物可以全部以全身性的方式施用，通过以下施用途径例如，但不限于，口服、静脉内、肌肉内和腹膜内施用。然而，在有些情况下，包含三个不同化合物的组合，两个可以被全身性施用，而第三个通过其他途径施用。全身性施用途径是优选的，例如，如果患者具有转移性的病灶时。

也可以局部施用给定组合的部分或全部化合物。在某些具体实施方式中，将化合物或包含所述化合物的组合物靶向至肿瘤。这能通过特定的施用方式来实现。例如，容易接近的肿瘤例如乳腺或前列腺肿瘤可以通过直接的针刺注射到病灶位点来靶向。肺肿瘤可以通过使用作为施用途径的吸入来靶向。

虽然不是必须的，但在某些具体实施方式中，给定组合的一个或多个化合物可以通过使用对特定组织或肿瘤类型特异的靶向化合物来靶向到细胞团块(例如，肿瘤)。在某些具体实施方式中，所述化合物通过使用靶向化合物靶向到原发病灶或在某些情况下继发(即，转移)病灶，所述靶向化合物优选的识别细胞表面标记物。在其他具体实施方式中，给定组合的一个或多个化合物也可以在持续释放制剂中施用。

因此，在本发明的一个方面，公开了分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的胸腺嘧啶和腺嘌呤衍生物。公开了分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的的生理上可接受的盐、光学异构体和前体药物。在一个具体实施方式中，胸腺嘧啶衍生物是1-(2-羟基乙氧基甲基)和腺嘌呤衍生物是9-(2-羟基乙氧基甲基)腺嘌呤。

还公开了具有作为活性成分的分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物与药学上可接受的载体结合的药物制剂。

在本发明的另一个方面，公开了用于在动物或人类患者中治疗癌症的方法。其包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物具有作为活性成分的分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其生理上可接受的盐或其光学异构体与叠氮基-2′，3′-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)和2′，3′-双去氧肌苷(去羟肌苷(didanosine)或ddI)结合。所述组合物进一步包含治疗有效量的具有抗癌剂例如，环磷酰胺、卡培他滨、紫杉醇、顺铂、卡铂、喜树碱和/或多柔比星的组合物。

除了基于使用无环、抗端粒末端转移酶、抗L1RT和抗肿瘤药的核苷类似物的治疗方面之外，本发明还提供了用于检测表达端粒末端转移酶或L1RT的病理增殖细胞的诊断方法和试剂盒。下文将更详细地描述本发明的这些或其他方面。在整个公开中，所有的技术和科学术语具有本发明所属领域的技术人员所通常理解的相同的意思，除非另外定义。

发明内容

本发明涉及用于在增殖细胞中缩短端粒的方法和组合物。本发明还涉及用于抑制增殖细胞生长的方法和组合物。端粒的缩短或细胞生长的抑制在这些细胞中对端粒维持机制的干扰，更特别地伴随有对这些细胞中反转录酶(RT)活性的干扰来完成。化合物的组合被用于这些目的。这些化合物缩短端粒或影响端粒维持，并从而影响病理性增殖细胞(例如，癌细胞)的生长性质和/或导致死亡。

端粒在允许线形染色体DNA末端被完全复制而在每个链的5′端处无末端碱基损失中发挥作用。永生细胞和快速增殖细胞利用RT来把端粒的DNA重复TTAGGG添加至染色体末端。抑制RT能导致增殖细胞不能够增加端粒，因此它们将最终停止进一步分裂。用于本发明的化合物组合将在癌细胞中影响端粒维持或诱导端粒缩短、G2/M停滞和/或大量的细胞调亡。对本领域技术人员来说很明显，这种用于影响端粒维持和抑制细胞增殖能力的方法可用于治疗与细胞增殖相关的病况例如癌症，或治疗生殖谱系细胞，其可用于避孕的目的。

如上所述，对于癌细胞，已知端粒末端转移酶的活性涉及端粒维持和细胞永生，并且癌细胞可以是端粒末端转移酶阳性的或端粒末端转移酶阴性的。在本领域中还已知端粒末端转移酶阴性癌细胞通过端粒延长的替代机制(ALT)来维持它们的端粒和永生。最近，已经报道说L1(LINE-1)逆转录转座子反转录酶(L1RT)与延长相关，因此与端粒末端转移酶阴性癌细胞中的端粒维持有关(见WO2005/069880)。因此，L1RT是端粒末端转移酶阴性癌细胞中的端粒延长替代机制之一。这些报告说明，细胞的永生化包括端粒末端转移酶阳性细胞中的端粒末端转移酶(例如，hTERT)和端粒末端转移酶阴性细胞中的L1RT的活化。集中于端粒末端转移酶或L1RT的靶向治疗可以显著地减少癌细胞的生长或肿瘤生长，并因此在某种程度上可以是有效的。然而，迄今为止，还没有被明确确认为是端粒末端转移酶抑制剂或L1RT抑制剂的药物在人类患者中作为抗癌剂进行测试。

目前在癌症治疗中的一个主要挑战是有效地治疗给定癌症。大量的努力旨在寻找对癌症越来越有效的治疗。据此精神，本发明人目前发现，由于癌细胞切换端粒维持机制或激活给定端粒维持机制的能力，针对端粒末端转移酶或L1RT的靶向治疗不足以有效地治疗给定癌症。切换或激活可以是自发的、由进行中的靶向到特定端粒维持机制的癌症治疗所诱导和/或是由于另外的基因组不稳定性。例如，使用L1RT抑制剂的癌症治疗可以抑制该酶的活性，并且这种抑制可以初始停滞癌细胞的生长。然而，如同能从本发明公开中发现的，癌细胞能依靠或激活其他端粒维持机制并开始以不受控制的方式增殖。这有些类似于在传统癌症治疗中遇到的抗药性。

在本发明中，癌细胞生长的抑制是通过使用能够影响这些细胞的生长性质和/或导致死亡化合物的组合来实现的。尽管不希望被理论所限制，但相信对由癌细胞激活的超过一种端粒维持机制(TMM)的同时抑制经常能有效的用于治疗任意癌症。所述化合物特定干扰几个在癌细胞中可见的反转录酶(RT)分子的活性或表达，并且从而对许多种恶性肿瘤的预防或治疗有用。这些RT包括端粒末端转移酶和L1(LINE-1)逆转录转座子编码的反转录酶(L1RT)。另外，据信癌细胞可以激活用于延长端粒的非L1RT反转录酶(ALT的一种)。非L1RT包括长末端重复(LTR)逆转录转座子编码的反转录酶(或LTRRT)和逆转录病毒来源的RT，其对癌细胞可以是内源性的或外源性的。

用于本发明的化合物的组合，其通过干扰一种或多种RT，在癌细胞中影响端粒维持或诱导端粒缩短、G2/M停滞(在本文中也指G2停滞)和/或大量的细胞调亡。特别是，本发明的化合物能提供一种预防或治疗恶性肿瘤的高度普遍的方法，如同通过它们抑制端粒末端转移酶阳性和端粒末端转移酶阴性人肿瘤细胞系两者和表达几种RT的肿瘤的能力所证明的。更重要地，在本发明中描述的抑制剂在肿瘤细胞系中而不是在正常细胞中，于细胞分裂期间诱导端粒减少。还可以预料所述抑制剂在它们建议使用的RT抑制浓度时，在正常细胞中不显示明显的细胞毒性作用。因此，所述抑制剂能有效的提供选择性靶向恶性肿瘤细胞的治疗，因此有效地避免通常与细胞毒性化学治疗试剂相关的许多不希望的副作用。

因此，使用本发明化合物组合的癌症治疗能被称为是一种基于组合的分子靶向癌症治疗。利用所述组合来影响端粒维持或诱导端粒缩短的治疗在本文中指端粒缩短治疗或基础治疗(backgroundtherapy)。这种分子靶向癌症治疗能与一种或多种已知的其他抗癌治疗结合，其中包括细胞毒化学治疗、生物治疗、光动力学治疗和放射治疗，并被用作有效的癌症治疗。

影响端粒维持(或端粒缩短)的化合物组合意指TERT(也指端粒末端转移酶)抑制剂和L1RT抑制剂的组合(指双鸡尾酒的组合)或者端粒末端转移酶RT抑制剂、L1RT抑制剂和非L1RT抑制剂的组合(指三鸡尾酒组合)。通过施用双鸡尾酒或三鸡尾酒的治疗在本文中指基础治疗。

用作本发明化合物组合的一部分的抑制剂或拮抗剂是如下抑制剂或拮抗剂，其能(1)特异地与给定的RT相互作用或结合(在该酶的mRNA或蛋白质或模板RNA)以抑制RT的表达或活性和/或(2)并入端粒的DNA重复中，从而在细胞中影响端粒维持或端粒长度。例如，对应于在端粒重复序列TTAGGG中的一个或多个核苷酸的核苷类似物，能合并入延长的端粒并影响端粒维持或当细胞经过几轮细胞增殖过程时侵蚀端粒长度。

抑制剂可以是本领域技术人员已知的小分子、肽、显性阴性突变体蛋白质、抗体、或抗体片段、和核酸结构、反义结构、对应于在选定RT中确定的目标区的dsRNA、寡核苷酸中的任意一种。所使用的抑制剂将产生对RT或给定RT的抑制。在本文中使用时，术语＂RT的抑制＂是指反转录酶类的端粒末端转移酶、L1RT和/或非L1RT的直接可测量的抑制，如所显示的例如，通过使用SpeddingG.1996，J MolRecognit.，9(5-6)：499-502描述的非放射性分析系统所表明的，或根据在所有细胞中平均端粒长度的减少，其如同通过使用Wege et al.，2003，SYBR Green real-time telomeric repeat amplificationprotocol for the rapid quantification of telomerase activity，Nucleic Acids Res.31(2)：E3-3所描述的TRAP分析所表明的，或单个端粒的侵蚀(见Lansdorp PM，Heterogeneity in telomere lengthof human chromosomes，Hum Mol Genet.，1996，5(5)：685-91)或在单个细胞中的使用在公开文献中描述的FISH分析(见HultdinMet al.，1998，Telomere analysis by fluorescence in situhybridization and flow cytometry，Nucleic Acids Res.，26(16)：3651-3656)。

同样地，本领域技术人员知道怎样确定特定的鸡尾酒是否已经在细胞中诱导了端粒缩短。例如，可以进行末端限制性片段(TRF)分析，其中通过使用对某些序列特异的限制酶消化来分析来自肿瘤细胞的DNA。这种分析的一个实例描述在VaziriH，1993，Loss of telomericDNA during aging of normal and trisomy 21 human lymphocytes，Am J Hum Genet.，52(4)：661-7中。例如，在DNA消化之后，进行凝胶电泳以根据大小来分离限制性片段。然后，用对端粒序列特异的核酸探针来探测分离的片段，以确定在样品中包含细胞端粒DNA的末端片段的长度。通过测量端粒DNA的长度，能估计给定的鸡尾酒是否诱导了端粒缩短并应当施用多长的鸡尾酒。另外，在治疗期间，可以测试细胞以确定在进行的细胞分裂中是否发生了端粒长度的降低，来证明治疗的效力。

最近，已经报道了新开发的纳米传感器用于快速筛选反转录酶(端粒末端转移酶)的用途(Grimm et al.，2004，Cancer Research64：639-643)。所述技术利用磁性纳米微粒，一旦与端粒末端转移酶合成的TTAGGG重复相退火，使切换它们的磁状态，通过磁性读出器能容易地检测到该现象。通过磁共振成象对这种技术进行高通量改造据报道允许在数十分钟内以超高敏感性处理数百样品，并定量反转录酶的活性。总之，这些研究建立了用于快速检测在生物样品内(包括肿瘤细胞和组织)的反转录酶活性和定量治疗性抑制的分析法和工具。

本质上，在本发明中，所述抑制剂被用于抑制细胞的生长。例如，当患者被施用给定的抑制剂组合时，它们通过影响端粒维持或通过引起进行性端粒缩短、在细胞中的细胞周期停滞和/或细胞的大量细胞调亡来抑制癌细胞的生长。据信与双鸡尾酒组合相比三鸡尾酒组合在抑制癌细胞生长中更有效，因为，如在本文中证明的，通过添加形成三鸡尾酒组合的抑制剂，能抑制在双鸡尾酒组合的情况下持续增殖的细胞。

优选的端粒末端转移酶抑制剂是核苷类似物。实际上，核苷类似物是被证明对抗病毒感染有效的第一等化合物之一。阿昔洛韦被广泛的用在疱疹感染的治疗中。第一批被批准的四种抗艾滋病病毒药，AZT、ddI、ddC和D4T，也是核苷类似物。这些核苷类似物被渐进地磷酸化为5′-三磷酸，然后其在反转录酶(RT)反应中充当链终止剂。

在本发明中已经发现，某些新的胸腺嘧啶和腺嘌呤衍生物能与脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的特定结构相互作用。例如，这些衍生物能合并到增殖细胞内的端粒重复中，从而干扰端粒维持。对于癌细胞的治疗，端粒末端转移酶是高度吸引人的靶位。因此，从治疗的观点来看，本发明化合物的一个优点，是在病理性的增殖细胞中阻断端粒末端转移酶的活性。

因此，在一个方面，本发明提供了组合物和方法，其包括使用能够在端粒末端转移酶阳性细胞中干扰端粒延长的无环核苷类似物。本发明的一些具体实施方案中设计的无环核苷类似物具有嘌呤(或嘧啶)骨架和尾部(例如，9-(1，3-二羟基-2-丙氧基甲基基团))，但缺少羟基环状环(戊糖)。在一些具体实施方式中，本发明嘧啶骨架和尾部(例如，9-(1，3-二羟基-2-丙氧基甲基基团))，但缺少羟基环状环(戊糖)。在一些具体实施方式中，本发明的嘌呤基核苷类似物在鸟嘌呤骨架的第二位缺少NH₂基团。许多无环核苷类似物在本领域中是已知的。例如，它们是阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和相应的前体药物，即，分别为伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦。阿昔洛韦¹²通过模仿细胞DNA成分，鸟嘌呤，来起作用。即是DNA的AT-CG中的“G”。阿昔洛韦(9-[2(氢甲氧基)-甲基]鸟嘌呤)，尽管结构类似于＂G＂，失去了它的尾部-羟基＂环状＂环(戊糖)，因此它是＂无环的＂。更昔洛韦和喷昔洛韦也是“无环的”，因为它们也缺少羟基环状环。

在本发明的具体实施方式中，本发明无环核苷类似物的尾部有至少一个羟基，其模仿核苷的2′-脱氧核糖部分的3′-和5′-羟基基团。已经发现本发明的无环核苷类似物并在临床可接受的剂量显示出抗端粒末端转移酶和抗肿瘤药性质并只显示出临床可接受毒性程度。

本发明的化合物符合预期的目的，就是说，其在癌细胞内通过合并入延长的端粒中与DNA相互作用，并从而显示出端粒末端转移酶抑制活性，其是无环核苷类似物，所述无环核苷类似物是端粒末端转移酶抑制剂并具有对上述端粒末端转移酶的专一性。优选的本发明无环核苷类似物对应以下分子式，及它们药学上可接受的盐或其酯：

例如，分子式(I)或(II)的无环核苷类似物，具有在胸腺嘧啶1-位或在腺嘌呤的9-位取代的尾部(即，2-羟基乙氧基甲基)，有在端粒延长上非常特异的作用机理。它们是特异的抑制剂，因为这些化合物至少在特定的临床可接受的浓度抑制端粒末端转移酶调节的端粒延长而不抑制L1(LINE-1)逆转录转座子反转录酶(L1RT)调节的端粒延长。本质上，本发明的化合物是链终止剂。术语“链终止剂”是指核苷类似物，其作为用于核酸聚合酶的底物，但一旦合并到生长中的聚核酸链的末端上，类似物本身不能作为用于后续核苷酸残基附着的底物。

因此，由于它们合并入细胞和病毒的DNA和RNA的特定结构从而干扰细胞的酶(例如，端粒末端转移酶)和病毒的酶的能力，本发明的化合物(链终止剂)能被治疗性地用作抗癌剂、抗病毒剂、抗生素、抗精神病剂、止痛剂、抗炎剂、抗高血压剂。

本发明的化合物能以旋光体的形式存在，即，它们有旋转平面偏振光的平面的能力。它们包括d和1或(+)和(-)型(包括立体异构体、对映体或对映体混合物)。对于使用(R)或(S)的情况，是根据整个化合物的情况而不是在取代基自身的情况命名取代基的绝对构型。

本发明也包括前体药物。根据本发明，前体药物是一种其中作为活性药物的母体药物(例如SNI)被化学转化为本身无活性的衍生物，其在抵达作用位点之前或之后在生理环境内(在身体内)借助于化学的或酶促的作用被转变为母体药物。换句话说，本发明化合物的衍生物是前体药物，其具有化学上或代谢上可分裂的基团并在生理条件下变成在体内有药学活性的本发明化合物。

因此，前体药物的制备包括把活性药物转变成非活性形式的方法。这些方法对本领域人员来说是熟知的。根据本发明的前体药物是载体连接的前体药物而不是生物前体。所述载体连接前体药物能由活性分子与转运部分的暂时性键合产生。这些前体药物与根源活性药物相比是较少活性的或无活性的。所述运载部分，其不被限制到任意特定的化合物或基团，将针对它的无毒性和它的确保活性成分以有效的动力学释放的能力来选择。例如，如本领域技术人员所知，能通过形成活性药物的酯、半酯、硝酸酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、亚胺或用偶氮、糖苷、肽和醚官能团功能化处理药物或使用聚合物等等来制备前体药物。

制备前体药物以通过增加吸收和分布以及减少毒性和增加药物药理作用的持续时间，来改变药物的药代动力学、改善药物的生物利用率。在前体药物的设计中，能考虑多种因素，例如在载体和药物之间的键通常是共价键，与活性母体相比前体药物是无活性或较少活性的，前体药物是药物的可逆的或生物可逆的衍生物和当释放时载体部分是无毒的和无活性的。

在一个具体实施方式中，通过形成活性药物的酯(例如，缬氨酸酯)或分子式I至VI的化合物来制备前体药物。载体部分(例如，缬氨酸)能被添加到目的化合物的尾部。这些缬氨酸酯化合物，当被体外或体内施用到细胞时，转变为活性化合物，其是分子式(I)和(VI)中的任一个。

在本发明中，已经显示(参看下文的实施例)无环核苷类似物能在哺乳动物细胞中靶向端粒末端转移酶并影响端粒延长(或损害端粒)。为了在哺乳动物细胞中靶向L1RT或其他非端粒末端转移酶并影响端粒延长(或损害端粒)，使用包括阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和/或分子式I至VI的化合物或相应前体药物(例如，缬氨酸酯，即，活性药物的伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦酯)和/或其他核苷类似物例如AZT和ddI中任意的无环核苷类似物。

核苷类似物例如阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和相应前体药物，即，伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦，都被批准在临床上用作抗病毒药。例如，阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和相应前体药物是众所周知的用于治疗或减轻疱疹病毒或/和CMV感染的药物，它们在肿瘤疾病治疗中的用途是未知的。喷昔洛韦被用在人的口唇和面部上来治疗由单纯疱疹病毒引起的唇疱疹(cold sore)。在本领域还已知对于这些核苷类似物的靶酶是DNA聚合酶。它们的化学结构和用于对抗病毒感染的剂量方案是本领域技术人员所熟知的。

据信核苷类似物一旦进入增殖细胞，将被磷酸化(例如，二和三磷酸类型)并与端粒末端转移酶反应的天然底物(例如，dGTP)竞争。所述磷酸化类似物能抑制天然底物合并入生长中的端粒DNA链中，或自己能被合并入DNA中，从而干扰端粒末端转移酶或L1RT调节的聚合活性，其最终导致链延长的终止。本质上，这些核苷类似物，通过终止链的延长，损害端粒DNA，缩短端粒和导致细胞调亡。与正常细胞相比对快速生长细胞(例如肿瘤)的端粒的损害更加有害。

与现有技术已知的核苷类似物例如AZT相比，本发明的核苷类似物是端粒延长更有效并是端粒延长的选择性抑制剂；与核苷类似物例如AZT相比，临床可接受的剂量足以实现端粒长度的减少和端粒末端转移酶阳性细胞的细胞凋亡或死亡。

其他端粒末端转移酶抑制剂可以是化学试剂例如2，6-二氨基-蒽醌和羰花青染料、3，3′-二乙基恶二羰花青(DODC)(和其他端粒DNA相互作用试剂)、端粒末端转移酶模板拮抗剂(例如，覆盖端粒末端转移酶中RNA模板区域的反义寡核苷酸；特别地，例如，脂质缀合的硫代氨基磷酸酯，N3′-P5′，与包含在RT的RNA组件中的模板序列互补的寡核苷酸序列)、针对端粒末端转移酶RNA的反义结构、直接针对端粒末端转移酶RNA的序列特异性的肽-核酸。对于本发明来说，尽管在先公开涉及到AZT作为端粒末端转移酶抑制剂，但AZT不是端粒末端转移酶抑制剂。在优选具体实施方式中，待抑制的端粒末端转移酶是哺乳动物端粒末端转移酶，例如人端粒末端转移酶。

优选的L1RT抑制剂是核苷类似物AZT、阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和它们的前体药物。优选的前体药物是伐昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦。其他的L1RT抑制剂可以是反义结构和寡核苷酸(见WO2005/069880，其公开在此通过参考引入本文)。例如，能使用相应于人L1逆转录转座子(GenBank GI：5070620)的核苷酸1987-2800的反义序列。核酸残基的序列或所述核酸残基更长序列的一部分的核苷酸能被用作寡核苷酸。它们包括，例如，5’-CCA GAG ATT CTG GTATGT GGT GTC TTT GTT-3’，5’-CTT TCT CTT GTA GGC ATT TAG TGCTAT AAA-3’，5’-CTC TTG CTT TTC TAG TTC TTT TAA TTG TGA-3’，5’-CTT CAG TTC TGC TCT GAT TTT AGT TAT TTC-3’，和5’-TCCTGC TTT CTC TTG TAG GCA-3’。

优选的非TERT和非L1RT抑制剂是核苷类似物AZT和ddI。其他的非TERT和非L1RT抑制剂可以是反义结构和寡核苷酸。在优选具体实施方式中，待抑制的非L1RT是人非L1RT和/或逆转录病毒来源的非L1RT。

已经在先公开了本发明的许多抑制剂和制造它们的方法。例如，通过在美国专利5,011,774公开的方法合成化合物ddI和在美国专利5,075,445中公开的喷昔洛韦。

优选的双鸡尾酒是AZT和ACV或喷昔洛韦(PCV)的组合。优选的三鸡尾酒是AZT和无环核苷类似物和ddI的组合，然而更优选的三鸡尾酒是AZT和ACV或其前体药物和ddI。优选的用于治疗NSCLC(例如，SK-LU-1细胞，这种细胞被认为是同时端粒末端转移酶阴性和L1RT阴性的)的三鸡尾酒是AZT和PCV和ddI。

本发明描述的化合物组合在细胞抽提物中、在培养细胞中和在体内抑制反转录酶。使用本发明的双鸡尾酒抑制癌细胞生长的方法不包括与病毒相关癌症(例如，卡波西肉瘤)的治疗，其中所述癌症的发生与病毒的感染有关，所述病毒选自疱疹病毒、腺病毒(21)、多形瘤病毒、乳头瘤病毒(HPV)、埃-巴二氏病毒、肝炎DNA病毒(HBV或HCV)。

在本发明中，术语“处理”或“治疗”意指包括增殖细胞，特别是不适当地或病理地增殖细胞或永生细胞的，病况或疾病的体外、离体或在患者中的任意治疗，或者其意指癌症的治疗。骨髓净化是一种离体的治疗的实例。该术语包括抑制病况或疾病(例如，停滞其发展)或减轻病况或疾病(例如，引起退化)或延迟增殖细胞的生长或诱导细胞凋亡或程序化细胞死亡。意欲通过本发明的方法治疗的一些病况包括良性的(即，非癌的)、恶性前的和恶性的(即，癌)肿瘤。

在本文中使用术语“异常哺乳动物细胞增殖”意指一种病况或病症，其中与它们的正常组织对应物相比细胞的局部区域(例如，肿瘤)显示出异常(例如，增加)的分裂速率。在本文中使用的以异常哺乳动物细胞增殖为特征的病况包括但不限于包含有由良性、恶性前或恶性特性的实体瘤团块的病况。实际上，正常细胞有时变成不适当地或病理性地增殖细胞或永生细胞(例如，由于p53缺失或突变)，并独立于细胞的正常调节机制来繁殖。这些细胞被认为是不适当地或病理地增殖细胞或永生细胞，因为由于细胞成分的活动，如上述的反转录酶，它们脱离了正常细胞的表现型。当然，在本文中使用的术语“不适当地增殖细胞”可以是良性的高增殖细胞，但除非另有说明这些细胞意指恶性的高增殖细胞，其是多种肿瘤和癌的特征，其中包括胃癌、骨肉瘤、肺癌、胰腺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤、脂肪癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、结缔组织癌、子宫癌、肛门与生殖器癌、中枢神经系统癌、视网膜癌、血液和淋巴癌、肾癌、膀胱癌、结肠癌和前列腺癌。

术语“处理”或“治疗”在患者或哺乳动物或人中的癌包括以下一个或多个：诱导细胞凋亡或抑制癌的生长，即，停滞它的生长、预防癌的扩散，即，防止转移、减轻癌症，即，引起癌的退化、预防癌的复发和缓和癌的症状(例如，通过在没有显著癌进展的情况下暂停细胞毒治疗来改善这种治疗的副作用)。术语“抑制癌细胞生长”或“细胞生长的抑制”也可以指减少或防止细胞分裂。

因此，在一个方面，本发明是发现，双鸡尾酒或三鸡尾酒当以有效影响端粒维持的数量施用患者时，能缩短在肿瘤中的端粒长度。本发明的这个方面包括干扰患有端粒维持调节的病况或疾病的患者(或患者)，优选为人，的端粒维持。

因此，根据本发明的这个方面，提供了一种治疗方法和用于治疗端粒维持调节的病况或疾病的药物组合物。治疗包括向需要这种治疗的患者施用药学组合物，所述药学组合物包括药学载体和治疗有效量的在本发明组合中的各种化合物，即治疗有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒。

对于双和三鸡尾酒，应注意到本发明的化合物组合能以任一以下合适的形态存在：(i)作为单独的化合物或组成部分(例如，在三鸡尾酒的情况下是至少三个不同的片剂)，包括至少一个单独组分是药学上可接受盐的形态，或(ii)单独的化合物组合成一个组成部分(例如，一个片剂包含三鸡尾酒的至少三个不同的抑制剂)，包含该组合化合物的药学上可接受的盐(即，该组合的盐)或(iii)在三鸡尾酒的情况下是两个不同的组成部分，包括它们药学上的盐。此外，当实施本发明的方法时，组合的单独组成部分能在治疗过程中的不同时间分别施用或以分开或单一组合的形式同时施用。例如，在二个组成部分的组合中(即，双鸡尾酒)，其是TERT的抑制剂和L1RT的抑制剂，用L1RT抑制剂的治疗可以与用TERT抑制剂的治疗之前，随后或同时开始。同样地，用三鸡尾酒组合的治疗可以是同时的、交替的或既同时又交替的。因此，认为本发明包含所有这些同时或交替的治疗方案，并且也如此解释术语“施用”或“施用”。

影响端粒维持(或端粒缩短)的化合物组合意指TERT(也指端粒末端转移酶)抑制剂和L1RT抑制剂的组合(指双鸡尾酒的组合)或者端粒末端转移酶RT抑制剂、L1RT抑制剂和非L1RT抑制剂的组合(指三鸡尾酒组合)。通过施用双鸡尾酒或三鸡尾酒的治疗在本文中指基础治疗。

在本文中使用时，患者意指哺乳动物，包括人、非人灵长类动物、狗、猫、绵羊、山羊、马、奶牛、猪和其他兽医学关注的非人哺乳动物。“治疗有效量”意指化合物、化合物组合或组合物、双鸡尾酒或三鸡尾酒的数量，当施用到哺乳动物，尤其是人用于诱导细胞凋亡或者治疗或预防癌时，其足够影响对癌的治疗。“有效量”是化合物、化合物组合、双鸡尾酒或三鸡尾酒的数量，其在测定中与未处理细胞内的水平相比，在癌细胞内有效的可再现地诱导端粒缩短、G2停滞和/或大量的细胞凋亡。“有效量”还意指化合物、化合物组合、双鸡尾酒或三鸡尾酒的数量，其将降低、减少、抑制或换句话说中止癌细胞的生长。

在另一方面，本发明涉及通过把双或三鸡尾酒与细胞接触，来抑制病理性增殖细胞例如肿瘤细胞的方法。通常，该方法包括把一定数量的能有效减少或抑制细胞增殖、或诱导程序细胞死亡的双或三鸡尾酒与病理性增殖细胞(例如，癌细胞)接触的步骤。本方法能在培养细胞上进行，例如，体外或离体，或能在存在于患者体内的细胞上进行，例如作为体内治疗方案的一部分。治疗方案可以在需要这种治疗的人或其他动物患者上进行。在本发明中公开的基础治疗的治疗专一性显示出了对细胞毒抗癌剂的传统高毒性方案，例如传统细胞毒化学治疗或者甚至DNA损害治疗，的有前途的替代。

从上可知，本领域技术人员可以容易的理解，本发明的抑制剂的组合和方法在某些情况下可以用于替代现存的外科步骤或药物治疗，尽管大多数情况下本发明是用于改进效力和/或改善用于治疗这种病况的现有治疗的毒性影响。特别地，应用本发明的方法中的抑制剂组合能通过选择性的敏化或增加异常增殖细胞(例如，肿瘤细胞)对各种DNA损害剂的敏感性，来改进效力和/或改善现有治疗的有毒影响。

因此，本文描述的基础治疗可以与其他抗癌治疗结合并用于治疗患者。例如，选择的基础治疗可以与另一种抗增殖(例如，抗癌)治疗结合来施用至患者。在本文中使用时，“与另一种或多种抗增殖治疗结合”意指所述基础治疗可以在另一种或多种抗增殖治疗之前、期间或之后施用。合适的抗癌治疗包括移除肿瘤团块的外科手术步骤或DNA损害治疗(在下文更详细的描述)，所述DNA损害治疗包括局部放射。因此，另一种抗增殖治疗可以在用本发明的抑制剂组合治疗之前、同时或之后施用。在施用不同治疗之间也可以有几个小时、几天和某些情况下几星期的延迟，因此所述基础治疗可以在另一种治疗之前或之后施用。

举例来说，所述基础治疗可以与用于移除异常增殖细胞团块的外科手术结合来施用。用于治疗胃-肠肿瘤病况的外科方法包括腹内的手术例如结肠全部切除术和胃切除术。在这些具体实施方式中，基础治疗的化合物可以通过连续输注或单一推注来施用。在手术期间或之后马上的治疗可以包括用在药学上可接受载体中的抑制剂的药物制剂在肿瘤切除位点的灌洗、浸泡或灌流。在某些具体实施方式中，在手术的时候和在手术之后施用抑制剂的组合，以抑制转移性病灶的形成和发展。药剂的施用可以在移除肿瘤团块的外科步骤之后持续几小时、几天、几星期、或在有些情况下几个月。

如同已经描述的，虽然所述基础治疗可以独立使用，但这种治疗也可以与DNA损害处理或治疗结合，用于产生与单独DNA损害处理或治疗相比更大的治疗效果。这是因为停滞在细胞周期G2/M期的细胞通常对DNA损害处理或治疗是非常敏感的。DNA损害处理或治疗包括遗传毒性化学治疗(用遗传毒性药物)、放射治疗(用伽马放射、X射线、放射性同位素等等)和/或光动力学治疗(例如，用5-氨基乙酰丙酸)。损害DNA的药剂已经被本领域技术人员所熟知，并且被广泛用于治疗赘生物的临床配置中。例如，遗传毒性药物是影响核酸并改变它们功能的化学治疗药物。这些药物可以直接与DNA结合或者它们可以通过影响涉及DNA复制中的酶来间接导致DNA损害。快速分裂细胞对遗传毒性药物特别敏感，因为它们是活跃地合成新的DNA。如果对细胞的DNA产生了足够的损害，通常将遭受细胞凋亡，相当于细胞自杀。所述遗传毒性化学治疗包括：(1)烷化剂：使用的第一类化学治疗药物。这些药物修饰DNA的碱基，干扰DNA复制和转录并导致突变；(2)插入剂：这些药物把它们自己嵌入到在DNA双螺旋内的核苷酸之间的空隙内。它们干扰转录、复制并诱导突变；和(3)酶抑制剂：这些药物抑制包含在DNA复制中的关键酶，例如拓扑异构酶，诱导DNA损害。

已经开发了许多这种试剂，特别有益的是已经经受了广泛临床试验和易于获得的试剂。试剂5-氟尿嘧啶(5-FU)(或相关试剂卡培他滨)是一种这样的试剂，其优先被赘生组织利用，使其特别可用于靶向赘生性细胞。因此，尽管相当有毒，5-氟尿嘧啶，可用许多载体来应用，包括局部和甚至静脉内施用。铂化合物顺铂也被广泛用于治疗癌症，临床应用中使用的有效剂量是20mg/m²，每三星期5天，共三个疗程。顺铂不被口服吸收，并因此必须通过静脉内、皮下、瘤内或腹膜内注射来递送。其他设想在本发明中使用的DNA损害剂包括卡培他滨

环磷酰胺、奥沙利铂、白消安、卡铂、亚硝脲氮芥、苯丁酸氮芥、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、替莫唑胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、达卡巴嗪、氮芥、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、米托蒽醌、依立替康和托泊替康等等。

这些药物被用于治疗各种实体癌和血细胞癌。使用任一这些药物的治疗目的是在癌细胞中诱导DNA损害。如果DNA损害足够严重，将诱导细胞经历细胞凋亡，相当于细胞自杀。然而，所述DNA损害剂既影响正常细胞也影响癌细胞。药物作用的选择性是基于快速分裂细胞，例如癌细胞对损害DNA来治疗的敏感性。作用方式也解释了用这些药物治疗的许多副作用。但是，分裂中的非癌细胞，例如沿肠排列的细胞或在骨髓中的干细胞，也由于所述药物与非癌细胞DNA的非特异相互作用(其可以是直接的或间接的相互作用)经常随癌细胞一起被杀死。除细胞毒性(细胞毒素)之外，这些药物也是诱变的(引起突变)和致癌的(引起癌)。用这些药物的治疗伴随有继发癌的风险，例如白血病，或许是由于对进行DNA损害治疗的抗性的产生。此外，暴露于微亚致死浓度的化学治疗剂的癌细胞将经常产生对这种试剂的抗性，并经常是对几个其他遗传毒性试剂的交叉抗性。对给定遗传毒性治疗有抗性的患者由于抗性细胞是非控制的生长，经常只有非常短的存活时间。

如上所述，经由TERT和/或其他RT的端粒维持的不受控制生长或增殖是癌细胞的标志。由于用于基础治疗的化合物或化合物的组合影响端粒维持，双或三鸡尾酒仅在不受控制增殖的细胞或癌细胞中选择性地损害端粒DNA和诱导进行性的端粒缩短。由于双或三鸡尾酒的这种选择性，可以实现相对于它们针对非恶性细胞的毒性的宽的治疗指数，。相反，由用于DNA损害治疗的药物所诱导的DNA损害在开始时不局限于端粒DNA和因此是非特异的。在那一点上，来自用于DNA损害治疗的试剂的DNA损害是更宽的并且，如上所述，与许多副作用和产生白血病的风险相关。

本领域中已知白血病是骨髓(其是不同类型血细胞：红细胞、白细胞和血小板，的制造厂)和血液的癌。特别地，白血病是恶性的癌并且其特征在于不受控制的血细胞(例如，白血球)增殖。不管癌症是产生自原发癌或继发癌，据信双和三鸡尾酒将在对白血病的斗争中将是非常宝贵的角色和/或伙伴。通过损害端粒DNA和诱导G2停滞，甚至在长时间曝露于鸡尾酒之后，鸡尾酒也将保持它们对抗所有恶性细胞(白血病的和非白血病的细胞)的效力。换句话说，由于对进行DNA损害剂产生抗性能够另外逃脱的恶性细胞，保留了对端粒DNA损害和G2停滞的易损性，和最终在双或三鸡尾酒中死亡。

因此，在本发明的另一个方面，提供了一个使肿瘤细胞对DNA损害治疗敏感的方法。这种方法包括施用敏化有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒组合，并在DNA损害治疗之前或期间敏化肿瘤细胞。致敏有效量是有效诱导G2/M期停滞的数量。优选，首先施用基础治疗，把肿瘤细胞暴露至双鸡尾酒或三鸡尾酒至少几个增殖循环周期，并且更优选至少14天的增殖。然后，施用除基础治疗之外DNA损害治疗一段持续时间(例如，直至DNA损害治疗显现了临床不利的毒性作用或刚好在这种阶段之前)，并且根据治疗医师的评价中止或撤消DNA损害治疗。基础治疗的施用可以先于DNA损害治疗的至少一个(例如遗传毒性化学治疗剂、生物治疗剂或放射治疗的一个剂量的施用)仅仅几分钟(例如，在同一天或在同一治疗访视期间)至多至几个星期，例如从一至五个星期，例如一至三个星期。

备选的优选方法是在施用DNA损害方式期间施用基础治疗。这当然是如下状况，患者为已经进行了DNA损害治疗，但需要基础治疗以诱导G2/M期停滞并从而敏化病理性增殖细胞(例如，肿瘤细胞)。

不论哪一种情况，优选在DNA损害方案终止后继续进行选择的基础治疗，并且其继续至少几个星期、月、年或更长。在临床配置中，如果癌复发或被证明对其他治疗是难治的，基础治疗将基本上允许治疗医师有效地与患者的癌斗争。尤其是本发明的鸡尾酒组合对患者有最小或没有毒性，因此它提供了良好的风险收益率。例如，低量的抑制RT的双和三鸡尾酒核苷类似物(AZT和ACV或AZT、ACV/PCV和ddI)，对患者是最低限度的或没有毒性的，并且提供了很好的风险收益率。

在患者(例如，人)上把连续基础治疗引入DNA损害治疗的上述策略不仅允许更短的DNA损害治疗持续时间而且允许施用更低剂量的临床认可的细胞毒性试剂，因此减少了在患者中诱导的不良事件，例如人癌患者。例如，卡培他滨(Xeloda

)单一疗法的临床相关不良事件在本领域中是已知的。它们包括手-足综合症(hand-and-footsyndrome)、心脏毒性、口腔炎、腹泻、恶心、呕吐、中性白细胞减少、电解质不平衡神经毒性和高胆红素血症。然而，在存在基础治疗(其能有效诱导程序细胞死亡通过G2/M期停滞)的情况下，能够减少这种细胞毒性试剂的原始规定治疗剂量并增强它们对致敏细胞的效力，从而实质上提供改善的治疗。作为最终结果，随着施用基础治疗，在人癌患者中可以预期有，DNA损害治疗的毒性的改善(简单地通过能够暂停或减少细胞毒性试剂的有毒剂量)，增强的肿瘤缩小，延迟的肿瘤生长和/或癌的清除和延长的存活时间。当然，如同上所述，也可以在非外科治疗之外或替代非外科治疗来进行肿瘤的外科切除。

药物鸡尾酒也能用于预防疾病在动物内的发生，或者能被用于减少癌的发病率，所述动物是对疾病易感的，但还没有经历或显示疾病的症状。因此，在另一个方面，本发明公开一种在患者中预防癌的方法，其通过识别倾向于患癌症和/或藏匿有能够变成恶性肿瘤的细胞的患者，这两者通过传统方法(身体检查)是难以检测的。所述方法包括向患者施用基础治疗，以便获得对癌生成的预防。作为实例，某些传统的检测肿瘤的方法是物理方法(例如，触诊)、病理方法(例如，血尿或血便)、或成像方法(例如，X射线、CAT扫描、PET扫描、超声波扫描图)。通过监测生物标记物或遗传缺陷也可以实现对可能具有癌症或隐藏不可检测癌细胞的患者的识别。

例如，本领域已知，野生型p53(wt-p53)功能的缺失通常导致不可控制的细胞循环和复制、无效DNA修复、选择性的生长优势和，因此，肿瘤形成。事实上，已经报道了，在超过50％的肿瘤中p53基因是突变的。作为另一个实例，目前没有可检测的肿瘤的女性患者，在BRCA1或BRCA2基因中可能具有突变，显示了强的产生乳腺或卵巢癌的倾向。类似地，对于乳腺癌，已经在唾液分泌中发现了生物标记物，肿瘤抑制因子癌基因蛋白53、癌基因c-erbB-2和它们的组合。另一个实例，其中报道了分子标记物位于肺癌。包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(腺癌、扁平细胞肺癌和大细胞癌)的肺癌是世界上癌症死亡的主要原因之一。NSCLC占肺恶性肿瘤的几乎80％，并且它与不良预后相关。在本领域中已知肺癌是由于细胞中分子的改变，导致控制正常细胞生长、分化和细胞凋亡的通路反常。在这些疾病中，发现各种基因例如原癌基因和肿瘤抑制基因突变或具有异常的表达模式。实际上，已经报道了在肺癌细胞中由Rb2/p130调节的一组分子特征。所述分子特征包括一个或多个以下基因的表达产物：B-MYB、PCSK7、STK15、ELK1、NOL1、MAGEA3/6、PIM1、CCND1、CDR2和RAF1，它们都被RB2/p130所介导。因此，在各种组织样品中识别分子特征或标记物的技术可以提供用于评定患者中肿瘤发生的可能性。用如上所述给定基础治疗伴有或不伴有细胞毒性试剂对这种患者的治疗有效地预防癌症。

本发明包括基于端粒末端转移酶抑制剂的癌症治疗用于多种肿瘤和癌的用途，所述肿瘤和癌侵袭皮肤、结缔组织、脂肪、乳腺、肺小细胞肺癌和非小细胞肺癌(NSCLC)、胃(胃癌)、胰腺、卵巢、子宫颈、子宫、肾、膀胱、结肠、前列腺、肛门与生殖器、中枢神经系统(CNS)、视网膜以及血液和淋巴(由在前体T细胞、前体B细胞、发生中心细胞(germinal centercell)、激活的T细胞或里德-斯特恩伯格细胞中CDK9/CYCLIN T1表达引起的淋巴瘤)和在本公开中其它位置记载的许多癌。

虽然用于上述指明的用途和适应症的化合物可以单独施用，但优选以药学制剂形式存在。特别是在某些预期按照管理原则进行临床应用的情况下，就有必要制备适合于目标应用的形式的药物组合物或药物的制剂。通常，这将伴有制备组合物，所述组合物是基本上没有热原和其他可能对人或动物有害的杂质。供本发明使用的抑制剂可以溶于水(优选无菌饮用水)中或者药学或药理学可接受的载体。术语“药学或药理学可接受的”是指当施用至动物或人时，不产生有害、过敏或其他不良反应的载体和组合物。其包括任意和所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂等等。这些介质和试剂对药学活性物质的用途是本领域所熟知的。

在双鸡尾酒组合中，如上所述，至少有一个端粒末端转移酶抑制剂和不同于端粒末端转移酶抑制剂的L1RT抑制剂。所述抑制剂可以共同在单一的组合物或药理学制剂中，或者分别在两个不同的组合物或制剂中。在三鸡尾酒组合中，至少有一个端粒末端转移酶抑制剂、不同于端粒末端转移酶抑制剂的L1RT抑制剂和不同于端粒末端转移酶和L1RT抑制剂的非L1RT抑制剂。这些抑制剂也可以共同在单一的组合物或制剂中，或者在三个不同的组合物或制剂中。

这些药学组合物可以是任意合适的形式，包括口服施用混悬液或片剂；鼻喷雾；无菌可注射制剂的形式，例如，作为无菌可注射水溶液或油质混悬液或栓剂。

根据本发明化合物和组合物将被通过任意常规和合适的途径施用，只要通过这个途径可以达到靶组织。这包括经口、经鼻、口腔或局部。任选的，施用可以是通过常位的、皮内的、皮下的、肌肉的、腹膜内的或静脉内的注射。在某些具体实施方式中，所述化合物或组合物可以以全身性的方式施用，通过施用途径例如，但不限于，经口、静脉内、肌肉内和腹膜内施用。全身性施用途径可以是优选的，例如，如果已知或怀疑受试者具有转移性的病灶时。以这种方法，全部肿瘤位点，不管是原发或继发，都可以接受该试剂。

在其他具体实施方式中，以持续释放制剂的形式施用所述化合物或组合物，以便避免对患者的重复施用和不便。各种形式的持续释放微球或微胶囊也是可用的，或者被开发为用于快速扩展类的肽和非肽类治疗或药理试剂的递送系统。例如，在抗肿瘤药物、肽和简单碱性化合物例如甲硫哒嗪和甲哌噻庚酮的施用中，持续释放微球或微胶囊是已知的，其利用生物可降解的聚合物材料。此外，例如，近年来，已经报道了各种可注射长效制剂(depot formulation)，其中治疗药物包裹在由生物可降解的聚合物制成的微球中并从微球缓慢释放(美国专利5,478,564、5,540,973、5,609,886、5,876,761、5688530、5631020、5631021和5716640)。实际上，GnRH类似物(激动剂和拮抗剂)的长效可注射的长效制剂正在被使用和/或试验用于各种病理和生理病况的治疗，所述病况在哺乳动物中，特别是在人中(Kostanskiet al.，2001，BMC Cancer，1：18-24)。所述治疗尤其是用于处理性激素依赖疾病例如前列腺癌和子宫内膜异位症并用于雄性可育性的控制。因此，通过使用包含生物可降解的生物相容聚合物的组合物，能实现本发明中描述的化合物或鸡尾酒在动物中的稳定释放。在所有这些聚合物组合物之后的一个明显的目标是，与配制为其中没有使用聚合物的溶液时相比，目的生物活性药物(例如，肽或蛋白质)能以较少的频率施用，有时以更低的整体剂量。长期持续释放制剂或植入物的使用可能特别适合于慢性病况的治疗，例如怀疑存在休眠的转移。在本文中使用时，长期的释放意指制造和安排制剂或植入物，以释放治疗水平的如上所述的双或三鸡尾酒至少30天、至少60天和更优选几个月。

在向受试者施用本发明化合物中，可以选择服药数量、服药方案、施用途径等等以便影响这些化合物的其他已知活性。例如，可以如本文描述地选择数量、服药方案和施用途径从而提供用于抑制细胞增殖的治疗有效水平。

然而，根据发明的某些具体实施方式，局部使用所述化合物或组合物。在某些具体实施方式中，将所述化合物或组合物靶向至肿瘤。这能通过特定的施用方式来实现。例如，容易接近的肿瘤例如乳腺或前列腺肿瘤可以通过直接的针刺注射来靶向到病灶位点。可以通过使用作为施用途径的吸入来靶向肺肿瘤。可以在全身性的或局部的递送中使用吸入。优选的途径是直接肿瘤内注射，注射入肿瘤维管结构或相对于肿瘤位点局部的或区域的施用。

用于本发明方法中的化合物能在每个化合物的特定剂量范围内施用至哺乳动物(例如，人)。当使用反义寡核苷酸作为RT的抑制剂时，它们可以以5-50μM的剂量施用，优选30μM的2′氧-甲基RNA或10μM的反义寡核苷酸(Pitts et al.，Inhibition of humantelomerase by 2′-O-methy1-RNA，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：11549-11554，1998)，10μM的硫代磷酸寡核苷酸或10μM的六聚体硫代磷酸寡核苷酸，其中三个碱基的对被九-碳亚磷酰胺隔离物分离(Mata et al.，A hexameric phosphorothioate oligonucleotidetelomerase inhibitor arrests growth of Burkitt’s lymphoma cellsin vitro and in vivo.Toxicol.Appl.Pharmacol.，144：189-197，1997；Page et al.，The cytotoxic effects of single-strandedtelomere mimics on OMA-BL1 cells.Exp.Cell Res.，252：41-49，1999)。可以使用小分子抑制剂RT例如二氨基蒽醌衍生物，例如，以10μM(Perry et al.，1998，1，4-and 2，6-Disubstitutedamidoanthracene-9，10-dione derivatives as inhibitors of humantelomerase.J.Med.Chem.，41：3253-3260)。

例如，当使用核苷类似物作为RT抑制剂时，核苷类似物或其药学上可接受的盐可以通过任意合适的途径施用(例如，经口或肠道外)，剂量范围在大约10mg和大约4000mg每日之间，每日分一至四次施用。一个优选的剂量范围是在每8小时大约200mg和大约1200mg之间。

然而，通常，合适的有效剂量是在0.1至250mg每千克受试者体重每日范围内，优选在1至100mg每千克体重每日范围内和最优选在5至20mg每千克受试者体重每日范围内；最优剂量是大约10mg每千克体重每日。期望的剂量优选在一天中合适的间隔以二、三、四或更多亚剂量施用。这些亚剂量可以在单位剂量形式施用，例如，包含10至1000mg。

例如，阿昔洛韦或其前体药物，

的一个优选剂量范围是100至400mg活性成分每单位剂量形式。本领域技术人员易于理解前体药物的不同剂量形式可以使用不同的剂量范围，所述剂量范围通常通过测定代谢产物的血药水平浓度来确定(例如，阿昔洛韦，如果前体药物是

类似地，对于更昔洛韦或其前体药物的口服剂型，例如，治疗有效量可以从大约1至250mg每Kg体重每日的范围内变化，优选大约7至100mg/Kg体重每日。因此，对于70Kg的人，治疗有效量是从大约70mg/天至大约7g/天，优选大约500mg/天至大约5g/天。喷昔洛韦和其前体药物，泛昔洛韦，的有效剂量通常在从1.0至20mg/kg体重每日的范围内，或更经常2.0至10mg/kg每日。AZT(叠氮胸苷)的一个优选剂量范围是在每8小时大约50mg和大约600mg之间。ddI的一个优选剂量范围是在每日两次大约10mg和大约500mg之间。遗传毒性化学治疗剂的剂量是厂家为给定疾病治疗推荐的那些。

如上所述各种RT抑制剂(包括阿昔洛韦，更昔洛韦，

泛昔洛韦，

-AZT或叠氮胸苷-和去羟肌苷，

顺铂，等等)的剂量和用药的更多细节，能在Physician’s Desk Reference，PDR，58th Edition，2004中找到，其内容通过参考引入本文。

本发明还包括各种动物模型的用途。通过生长或分离表达端粒末端转移酶的细胞系，可以在各种实验动物中形成疾病模型。这些模型可以采用皮下的、常位的或全身性的施用细胞来模仿各种疾病状态。例如，将HeLa细胞系皮下注射到裸鼠中，以获得端粒末端转移酶阳性肿瘤。所得肿瘤在端粒重复扩增方案(TRAP)分析中显示端粒末端转移酶活性。这种模型提供了一种用于检验核苷类似物单独和组合的载体。

通常，可以以描述的方式测量细胞中端粒末端转移酶活性或L1RT活性的水平，例如，在申请人于2005年3月25日提交的名称为＂Modulation Of Telomere Length In Telomerase Positive Cells ForCancer Therapy＂的美国专利申请60/655,105和于2005年1月18日提交的名称为＂Modulation Of Line-1 Reverse Transcriptase＂的国际专利申请PCT/US05/001319中描述的，其专利申请通过参考引入本文。也可以通过任意其他现存的方法或等价的方法来测量细胞中端粒末端转移酶活性(或L1RT活性)的水平。端粒末端转移酶活性或L1RT活性的“提高的水平”意指，与患者或个体中的正常细胞相比，或与没有患有所述病况的其他患者或个体中的正常细胞相比，在特定细胞中的端粒末端转移酶活性或L1RT活性的绝对水平被提高。所述病况的实例包括癌症病况，或与不是正常存在与个体中的细胞的存在相关的状况。

化合物在体内有效性的测定包括各种不同的标准，包括但不限于，存活、肿瘤退化、停滞或延缓肿瘤的进展、消除肿瘤和抑制或预防转移。

用测试化合物对动物的治疗将包括将所述化合物或组合物以合适的形式施用动物。本发明的药物组合物、抑制或对抗药物能以各种途径施用，包括但不限于，经口、肠胃外、经鼻、口腔、直肠、阴道或局部。备选的，施用可以是通过气管内滴注法、支气管滴注法、皮内的、皮下的、肌肉内的、腹膜内的或静脉内的注射。特别预期的是全身性静脉内注射、经过血液或淋巴供给的区域施用和肿瘤内注射。

本发明的无环核苷类似物和/或本发明的组合物(所述组合物包括现有技术已知的无环和非无环的核苷类似物)在许多方面中都是重要的。它们被用作选择性的抑制剂并用于对细胞施加选择性压力，以转换端粒延长机制。它们在用于治疗端粒末端转移酶/L1RT相关癌症的方案中是重要的，不管是独自或与对癌症治疗领域技术人员来说已知的化学和/或放射治疗方案结合来施用。备选的，通过简单地降低端粒末端转移酶或L1RT的活性，这些组合物将有助于选择性地诱导癌细胞大量细胞凋亡。

所述核苷类似物可以在生理学或药学可接受载体中施用至宿主，用于治疗增殖性疾病等等。药学上可接受的载体部分地由被施用的特定组合物和用于施用所述组合物的特定方法来确定。

在本发明的一个方面，提供了用于在哺乳动物中预防或治疗由不适当或病理性增殖细胞或永生细胞存在而引起的病症的方法。不适当或病理增殖细胞或永生细胞独立于细胞的正常调节机制而的存在和再生。这些细胞是病理性的，因为它们由于细胞元素，即端粒末端转移酶，的活性而脱离了正常细胞。当然，本文使用的不适当增殖细胞可以是良性高增殖细胞，但除非另有说明，这些细胞是指恶性高增殖细胞例如所有类型的癌细胞包括，例如，骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。在本发明的一个具体实施方式中，转移后淋巴组织增生疾病(PTLD)，作为一种血液癌，从本文预期的范围中排除。

特别地，提供了用于预防或治疗人肿瘤的方法，所述肿瘤的特征在于表达端粒末端转移酶。根据本发明，所述病症的预防或治疗是通过利用本发明的无环核苷类似物(端粒末端转移酶的抑制剂或拮抗剂)来实现的。在发明的具体实施方式中，用于本发明的抑制剂或拮抗剂是直接与负责端粒延长的端粒末端转移酶相互作用以抑制其活性的那些无环核苷类似物，和/或被合并入端粒，并因此抑制端粒进一步延长，尽管有功能性端粒末端转移酶的那些无环核苷类似物，从而抑制表达端粒末端转移酶的细胞的生长。因此，所述端粒末端转移酶的抑制剂或拮抗剂被用于抑制细胞的生长。例如，当向患者施用所述端粒末端转移酶的抑制剂或拮抗剂时，它们导致进行性的端粒缩短、细胞中的细胞周期停滞和/或表达端粒末端转移酶细胞的大量细胞凋亡。在本发明中，术语“抑制生长”或“生长的抑制”也指减少或防止细胞分裂。根据本发明，表达端粒末端转移酶细胞的生长抑制可以是大约100％或更低，但不是0％。例如，与对照细胞(对照细胞表达端粒末端转移酶，但不用抑制剂或拮抗剂处理)相比，所述抑制可以是从大约10％至大约100％，优选至少大约25％，和更优选至少大约50％，更优选至少大约90％、95％或准确地100％。能通过本领域任何已知的方法来测量所述生长的抑制。例如，将被处理药品中活细胞的数目与对照样品中活细胞的数目相比，在与活体染料孵化后测定。另外，当被注入动物宿主时，生长抑制可以通过体内或体外检测细胞增殖减少的分析方法，例如氚化氢掺入分析(tritiated hydrogen incorporation assays)、BdU掺入分析、MTT分析、形成病灶能力、锚定依赖性或永生的缺失、肿瘤特定标记物的缺失、和/或不能形成或抑制肿瘤能力的改变来测量(Dorafshar et al.，2003，J Surg Res.，114：179-186；Yang et al.，2004，Acta Pharmacol Sin.，25：68-75)。

在人体中，从单一的永生细胞或少数这种细胞至癌瘤的发育过程花费几个月至几年的时间。然而，通过实行本发明可以预防癌症，因为用包含一个或多个无环核苷类似物处理的肿瘤发生细胞，在它们有机会生长为肿瘤之前丧失了它们的增殖潜能。此外，向高危群体周期性预防性施用所述抑制剂或拮抗剂以在临床表现出癌症之前阻遏肿瘤产生，将显著地有效减少新的癌症病例的比率。

将所述核苷化合物单独或与不同的类似物组合施用，并且通过任意施用途径，包括口服施用。无环核苷类似物SN1、SN2是优选的核苷类似物并且SN1是最优选的一个。在现有技术已知的无环核苷类似物中，ACV、GCV或它们的L-缬氨酸酯缬更昔洛韦(V-GCV)和伐昔洛韦(V-ACV)是优选的核苷类似物。它们都是市场上可买到的，并且已经在许多专利和出版物中描述了所述制剂。

应当选择性靶向有端粒末端转移酶和/或L1RT活性的细胞，因为这些细胞依赖于端粒末端转移酶和/或L1RT来延长或维持端粒，并且端粒的延长或维持需要所述核苷和/或它们的类似物与端粒末端转移酶或L1RT的相互作用。至于希望任意特定靶向药物用于递送所述类似物以发挥抗癌作用的程度，在在本文中设想了分子式(I)至(VI)、PCV或ACV或GCV和/或其他类似物的靶向化合物的使用。因此，在某些具体实施方式中，药学组合物可以具有活性化合物，在这种情况下，为分子式(I)至(VI)、PCV、ACV和GCV的任一化合物，其已经缀合到靶向试剂(例如，肽)上用于特异递送至特定的靶细胞或至细胞内的核部分。

通过本领域技术人员进行的常规试验来确定端粒末端转移酶和L1RT的给定抑制剂或拮抗剂的剂量。在向患者施用之前，在标准实验动物模型中展示所述效力。在这方面，能使用本领域已知的任意端粒末端转移酶诱导的癌的动物模型。(Hahn et al.，1999，NatureMedicine，5(10)：1164-1170；Yeager et al.，1999，Cancer Research，59(17)：4175-4179)。用本发明方法治疗的受试者或患者优选是人，并且是胎儿、孩子或成人。其他被治疗的哺乳动物是小鼠、大鼠、兔、猴子和猪。

所述无环核苷类似物，即本发明的抑制剂或拮抗剂能单独使用或与其他化学治疗结合使用。例如，端粒末端转移酶诱导的癌的治疗可以与化学和/或放射治疗结合，以治疗由端粒末端转移酶或其它因素诱导的癌。本领域技术人员已知的化学治疗剂的实例包括，但不限于，抗癌药例如博莱霉素、丝裂霉素、氮芥、苯丁酸氮芥、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脲嘧啶脱氧核苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙碱和己烯雌酚(DES)。为了进行组合治疗，可以简单地以有效在动物或患者内产生它们的组合的抗癌作用的方式向动物施用与另一个抗癌药物(化学或放射)组合的本发明抑制剂组分。因此，以在靶细胞区域中引起它们的组合存在的有效数量和有效的时间段来提供所述试剂。为了实现这个目标，同时施用所述试剂，和在化学治疗剂的情况下，或者在单一组合物中或者作为两个不同的组合物使用不同的施用途径施用所述试剂。备选的，所述两种治疗可以彼此在先、或在后，通过彼此，例如，间隔几分钟至几小时或几天。举例来说，但不是限制，用于全身应用的GCV的平均每日剂量可以是对于成人100

mg/kg每日，对于小鼠和婴儿是50mg/kg每日。

依赖于被治疗的受试者的病况可以对剂量进行某些改变。负责施用的医师能确定对于个体患者的合适剂量，并取决于多种因素，例如，就诊患者的年龄、病况、病史等等。

因此，本发明的方法可用于与端粒末端转移酶诱导的细胞病理增殖有关的病况和疾病的治疗应用中。从本发明的治疗应用中获益的疾病包括以细胞高增殖为特征的所有疾病包括，例如，实体瘤和白血病、以及非癌病况。进一步设想本发明的方法不但在体内环境而且在离体环境中用于抑制癌细胞生长的。本发明方法特别可用于抑制离体病理性增殖人细胞的生长，包括但不限于，人癌细胞-骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。

本发明提供用于识别由于细胞中端粒末端转移酶表达的不适当的、病理性的或异常的增殖细胞的方法和试剂盒。所述方法能用作一种筛选方法，所述筛选方法通过测定在来自患者的组织中端粒末端转移酶表达的存在(和/或水平)来帮助诊断在患者中癌细胞或肿瘤的存在，升高水平的端粒末端转移酶表达的存在是在患者中癌细胞或病理性细胞增殖的指示。

例如，通过癌瘤样品在本发明无环核苷类似物存在的情况下不能增殖来诊断癌瘤样品。所述诊断可以进一步包括端粒末端转移酶特异mRNA表达的检测，其通过各种方法来测量，包括但不限于，使用核酸的杂交、Northern印迹法、原位杂交、RNA微阵列、RNA保护分析(RNAprotection assay)、RT-PCR、实时RT-PCR，或者端粒末端转移酶催化亚单位编码蛋白质的存在，其通过各种方法来测量，包括但不限于，Western印迹法、免测沉淀法或免疫组织化学或端粒末端转移酶的酶活性(TRAP分析和其改良^4，26，27)。

在优选的具体实施方式中，直接端粒末端转移酶催化亚单位RNA的核酸探针能用于检测在进行快速增殖的组织中端粒末端转移酶催化亚单位RNA mRNA水平的存在和/或增加，所述组织例如原发癌细胞，包括人骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤。因此，本发明提供了使用核酸探针以检测和鉴定病理性增殖细胞，包括癌细胞，的方法，所述核酸探针是与端粒末端转移酶的子序列互补的。例如，用于鉴定病理性增殖细胞的方法包括直接针对hTERT mRNA或L1RT mRNA的核酸探针，以比较在试验细胞中hTERT mRNA或L1RT mRNA的表达水平和在对照细胞中的hTERT mRNA或L1RT mRNA的表达水平。当观察到如同对照细胞中的hTERT或L1RT表达水平时，试验细胞被鉴定为病理性增殖细胞。然而，用于本发明方法的核酸探针也可以与人、小鼠或其他哺乳动物的hTERT mRNA或L1RT mRNA序列基本上互补。

在所述核酸探针中产生不会影响该探针在病理增殖细胞(例如，癌细胞)中有效检测hTERT mRNA或L1RT mRNA能力的替换，对本领域技术人员是显而易见的，并且因此，这种替换也在本发明的范围内。用于本发明方法的核酸探针可以是DNA探针，或改良探针例如肽核酸探针、硫代磷酸探针或2′-O甲基探针。所述核酸探针的长度从大约8或10至50个核苷酸，优选从大约15至25个核苷长的。本发明的方法可以容易的在来自人、哺乳动物或其他脊椎动物的细胞抽提物、培养细胞或组织样品中进行。

本发明的方法用于在体外细胞、细胞培养物和人细胞和组织中，检测由于端粒末端转移酶表达引起的不适当地、病理地或异常增殖的细胞，例如实体瘤和癌(例如，人骨肉瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、肾上腺皮质癌或黑素瘤)。

本发明还提供了用于检测和/或抑制高增殖细胞或癌细胞的试剂盒。所述试剂盒能具有分子式(I)至(VI)的化合物，和任选地PCV、ACV、GCV、缬更昔洛韦、伐昔洛韦或其他无环核苷类似物，和/或具有与hTERT mRNA或L1RT mRNA的子序列完全或基本上互补的核酸探针。

本发明的药物组合物、抑制或拮抗药物能以各种途径施用，包括经口、局部、肠胃外例如皮下地、腹膜内、通过病毒感染、血管内等等。依赖于引入的方式，所述化合物能以多种方法配制。适合于口服施用的制剂可以是液体溶液。适合于肠胃外施用(例如，通过关节内的、心室内的、鼻内的、静脉内的、肌肉内的、皮内的、腹膜内的和皮下的途径)的制剂包括含水的和无水的、等渗无菌注射溶液。在本发明的实施中，例如通过静脉内输注、经口、局部、肠道外或腹膜内施用组合物。口服和肠胃外施用是优选的施用方法。用于制剂和施用的技术是本领域常规的和更多的细节可以见于，例如，Remington′sPharmaceutical Sciences(2000)，Gennaro AR(ed)，20th edition，Maack Publishing Company，Easton，PA中。

治疗有效量或药理学有效量是本领域中熟知的短语并且是指有效产生期望药理结果的试剂数量。例如，治疗有效量是足以在患者中随着时间产生有益治疗性反应的数量(即，治疗疾病或病况或者改善患者中被治疗疾病的症状)。实际施用的数量依赖于治疗所应用的个体，并且优选是优化数量，以便获得期望的效果而没有显著的副作用。如同在下文详细描述的，也通过特定抑制剂或拮抗剂的效力和患者的病况、以及待治疗患者的体重或体表面积确定所述剂量。也通过伴随着施用的任意有害副作用的存在、性质和程度来确定剂量的大小，例如，施用至特定患者的特定试剂、载体或转导细胞类型。

使用数据容易地确定能够预防、抑制或减少端粒末端转移酶/L1RT调节癌的发病率的试剂的治疗有效剂量，所述数据是来源于本文公开的细胞培养物分析和/或利用动物模型的体内分析。所述动物模型还能被用于评价人中适当的剂量范围和施用途径。在被转移到临床环境之前，具有人来源实体肿瘤的实验动物(或本领域接受的动物模型)经常被用于优化合适的治疗剂量。已知这种模型在预测有效抗癌策略中是非常可靠的。例如，具有实体瘤的小鼠或本领域接受的小鼠模型广泛用于临床前试验中，以确定治疗试剂的工作范围，所述工作范围产生有益的抗肿瘤作用而只有最小的毒性。由于在本领域接受的模型中已经证明了安全性，至少对于本文举例说明的核苷类似物，本发明的临床前试验更是常规实验。利用测量肿瘤形成(进展)抑制、肿瘤退化或转移等等的分析来预测体内效力。

下文描述了利用裸鼠皮下的由人HeLa癌细胞系长成的肿瘤(即，承载异种移植的小鼠)作为癌模型对分子式(I)至(VI)的化合物、ACV、PCV和/或GCV的抗肿瘤效力的示例性体内分析。

体内分析中需要的人癌细胞的制备，例如，以如下方式：通过公共来源获得端粒末端转移酶阳性HeLa人细胞系和端粒末端转移酶阴性U-2OS人细胞系。细胞被维持在补充有10％胎牛血清的D-MEM介质中，在37℃的5％CO₂的湿润空气中。

为了体内分析，合适的宿主，例如，获得大约5-7星期大的裸鼠(nu/nu)并养殖在无病原体的条件下。大致的，将包含在200ul无血清介质中的1 x 10⁶HeLa细胞(和/或U-2OS细胞)递送给所有的动物，所有动物通过胁腹的皮下注射(s.c:)用甲氧氟烷短暂地麻醉。然后将小鼠分为实验组和对照组。适当浓度的分子式(I)至(VI)的化合物、ACV、PCV和/或GCV用于肿瘤生长进展或退化分析。

在一个具体实施方式中，评估皮下注射肿瘤生长的破坏或产生的时间而不是形成肿瘤的尺寸的下降。在这个具体实施方式中，从第零天开始，实验组中的小鼠接受在不限量饮用水中的更昔洛韦。更昔洛韦在水中的浓度是2mg/ml。每隔3天供给更昔洛韦的新鲜溶液。对照组中的小鼠仅接受饮用水。每2-3天测量肿瘤。当肿瘤超过1cm³时，处死小鼠。用公式4/3πr³计算肿瘤的体积，其中r是肿瘤的半径。对照组中所有的小鼠将产生肿瘤而实验组中所有的小鼠保持无肿瘤。

在另一个具体实施方式中，本发明的试剂和方法用于促进在具有免疫能力的携带有前-形成肿瘤的动物中的体内肿瘤退化；即本发明的试剂用于治疗有前-存在肿瘤的动物。在这种情况下，将10⁶个小鼠hapatoma MH-22细胞或类似物被在C3HA小鼠的肋腹侧皮下注射以产生肿瘤。一旦肿瘤细胞注入后形成肿瘤，实验组的小鼠被在不限量饮用水中施用包含泛昔洛韦口服溶液的组合物，而对照组的小鼠接受没有药物的相同组合物(例如，蒸馏水)。每2-3天监测肿瘤的生长。当向这些具有肿瘤动物施用大约30天的分子式(I)至(VI)的任一化合物时，可以观察到延迟的肿瘤生长。在对照组中没有观察到肿瘤细胞的这种抑制。在开始治疗后几星期，只有用包含至少一个分子式(I)至(VI)的化合物的组合物治疗的动物，在很多具有肿瘤动物中显示出完全的肿瘤退化。

在另一个具体实施方式中，也使用定性细胞凋亡的促进的体内分析。在这个具体实施方式中，对用所述治疗性组合物治疗的承受异种移植的动物可以检查细胞凋亡病灶的存在，并与未治疗的承受异种移植的动物比较。在治疗动物的肿瘤中发现的细胞调亡病灶的程度提供了一种对所述组合物治疗效力的指示。

在用于治疗人端粒末端转移酶调节的癌(早期肿瘤和血管化肿瘤两者)的药物的合适剂量的设计中，可以容易的从本文描述的动物研究中外推，以便得到用于临床施用的合适剂量。为了实现这种转换，就要根据试验动物单位质量施用的药物质量并，优选，根据在试验动物和人类患者之间体表面积的差异。所有这种计算对本领域技术人员来说是熟知和常规的。因此，治疗有效剂量的测定是在本领域技术人员的能力之内的。

例如，在细胞培养物分析和小鼠研究中得到分子式(I)至(VI)的化合物的成功剂量，并基于质量和表面积应用标准的计算，用于成人患者的有效剂量将是在每患者每天大约1000mg和大约6000mg的分子式(I)至(VI)的化合物之间，并且优选每患者每天大约500mg和大约1000mg之间。因此，利用这种信息，在本文中设想的，用于人类施用的治疗剂(例如，SN 1、SN 2、阿昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦和相应前体药物，即，缬昔洛韦、缬更昔洛韦和泛昔洛韦)的低剂量可以是大约1、5、10、20、25或大约30mg左右每患者每日；用于人类施用的治疗剂的高剂量可以是大约250、300、400、450、500或大约600mg左右每患者每日。有用的中间剂量可以是从大约40至大约200mg左右每患者的范围。

尽管给出了这些范围，应当认识到本文给出的给定参数和详述指导在活性或优选范围内的进一步变化也包含在本发明之内。本发明治疗方案的意图通常是产生显著的抗肿瘤作用，同时仍保持剂量低于与不能接受的毒性相关的水平。除了改变剂量本身之外，也可以调整施用方案以优化治疗策略。目前优选的治疗策略是施用在大约1-500mg之间，和优选在大约10-100mg之间的端粒末端转移酶抑制剂或拮抗剂或包含这些药物的治疗性鸡尾酒，这是在大约60天的时间内大约4次。例如，在大约第1天、第3或4天和第6或7天服用。施用可以通过单一或多个剂量来完成，口服或例如，通过直接施用到实体肿瘤的位点或以缓释剂型形式。负责施用的医师，根据本发明的公开，能确定对于个体患者的合适的剂量、施用形式和途径。这种优化和调整在本领域内是常规进行的和决没有导致过度数量的试验。在特定剂量本身的施用中，优选依据人类患者全身性应用的无菌、致热原性、纯净和一般安全性的管理标准提供药学可接受的组合物。当然，在治疗之前和治疗后一至几个月间隔，进行身体检查、肿瘤测量和实验室检查，并且本领域技术人员知道怎样进行这种常规步骤。通过任何可接受的测量来定义临床反应。例如，完全有效可以定义为在治疗后给定时期内所有可测量肿瘤的消失。

然而，应当理解，对于任意特异患者的特定剂量水平和服药频率可以改变，并依赖于各种因素，包括所使用的特定化合物的活性、新陈代谢的稳定性和该化合物起作用的长度、年龄、体重、一般健康情况、性别、饮食、施用的方式和时间、排泄比率、药物的组合、特异病况的严重性和患者经历的治疗。其最终是由值班医师或兽医来判断。

实施例

提供下述实施例以说明本发明的优选方案，但是当然，不应看作以任何方式限定本发明的范围。使用传统技术来进行下述实施例，除非另外详细描写，所述传统技术对本领域技术人员是众所周知和常规的。此外，本领域技术人员应当理解在实施例中公开的技术显示了是发明人发现的技术，以便在实施本发明中较好发挥作用，并因此被认为构成优选的实践方式。然而，根据本发明的公开，本领域技术人员应当理解在公开的特定具体实施方式中可以作许多改变，和在不偏离本发明精神和范围的基础上仍然获得类似或相似的结果。

实施例1.通过无环核苷类似物三磷酸盐体外直接抑制端粒末端转移酶

如所述的生物合成和分离无环类似物三磷酸盐(Agbaria R et al.Biosynthetic ganciclovir triphosphate：its isolation andcharacterization from ganciclovir-treated herpess implexthymidine kinase-transduced murine cells.Biochem Biophys ResCommun.2001，289：525-30)。

简短的，用90mM的ACV，或45mM的GCV，或45mM的PCV培养10⁷个U-2OS细胞48小时。细胞用PBS洗涤并通过胰蛋白酶化来收集。在离心后，用60％甲醇提取细胞沉淀。在95℃加热所述提取物2分钟，接着在真空下蒸发。将干燥沉淀溶于100μl的PCR级水中。

如上所述进行利用HeLa细胞提取物的实时TRAP分析。为表明无环核苷类似物三磷酸盐主要的混合物对端粒末端转移酶直接抑制，对于TRAP分析补充了5μl的来自无环核苷治疗U-2OS细胞的粗提物。

因此，其证明在这个条件下酸PCV-TP、三磷酸GCV和ACV-TP从10至100倍直接地抑制端粒末端转移酶。

实施例2.在端粒末端转移酶阴性ALT细胞和端粒末端转移酶阳性细胞中对端粒缩短、G2停滞和细胞调亡的诱导

(a)在AZT治疗或更昔洛韦治疗后，在端粒末端转移酶阴性ALT细胞中对端粒缩短、G2停滞和细胞凋亡的诱导按如下方式进行：

为在两个细胞系(U-2OS和Saos-2骨肉瘤)中检测L1特异的RNA，据报道所述细胞系被报道为通过ALT来维持端粒，通过斑点印迹法用L1逆转录转座子特异探针来分析总mRNA。报道的端粒末端转移酶阳性细胞系(HEC-1和HeLa)用作对照。在这个试验中，两种ALT细胞系(U-2OS和Saos-2骨肉瘤)都是阳性的。如前报道的，HEC-1细胞是完全阴性的，在HeLa细胞中仅有痕量L1转录物。

用治疗浓度的AZT处理所述ALT细胞系，以确定滑动端粒DNA合成能被AZT-TP抑制，和从而诱导端粒缩短。通过流式细胞计用端粒特异肽核酸(PNA)探针来测量在AZT处理和未处理细胞系中的端粒长度。为确定细胞周期分布，细胞用碘化丙啶(PI)染色。在AZT处理14天后，两种ALT细胞系显示了端粒缩短、大量细胞凋亡和G2停滞。为了确证AZT诱导的端粒缩短对于ALT细胞的专一性，在相同条件下用AZT处理已知对于端粒末端转移酶是阳性的HeLa细胞系。选定浓度下的AZT在HeLa细胞中对端粒长度或细胞周期分布没有影响。

为表明端粒缩短和在DNA合成比率、动态中的改变，将U-2OS细胞用AZT处理不同量的时间，并同时通过流式细胞计来分析。通过加入5-溴脱氧尿核苷(BdU)来确定DNA合成比率。结果显示进行性的端粒缩短和DNA合成的下降。重要的是注意，在细胞周期分布、DNA合成和端粒长度中的改变是快速的，并且仅在AZT治疗10天之后就能被检测到。

同时，PI染色表明与未处理细胞相比，在治疗后期AZT治疗的细胞中更高的DNA含量。这种事实的合理解释是短端粒诱导的染色体端到端连接。在AZT治疗的ALT细胞中细胞凋亡的诱导似乎是单独p53，因为U-2OS和Saos-2代表p53+/+和p53-/-癌细胞系两者。

分别地，也用治疗浓度的鸟嘌呤类似物，更昔洛韦(GCV)处理U-2OS细胞，以表明滑动端粒DNA合成能被GCV-TP所抑制，并能诱导端粒缩短。通过流式细胞计用如上所述的端粒特异PNA探针来测量在未处理和更昔洛韦处理细胞中的端粒长度。

为确定细胞周期分布，细胞用碘化丙啶(PI)染色。在用0.3

g/ml浓度的GCV处理14天之后，U-2OS细胞显示了端粒缩短、大量的细胞凋亡(程序细胞死亡)和G2停滞。

(b)在端粒末端转移酶阳性癌细胞中更昔洛韦(GCV)和阿昔洛韦(ACV)治疗之后端粒缩短、G2停滞和细胞调亡的诱导按如下方式进行。

为检测在两种细胞系(Hela和NuTu-19)中端粒末端转移酶特异活性，进行实时TRAP分析行。报道的端粒末端转移酶阳性细胞系(HeLa)用于比较。在这种试验中两种细胞系都是阳性的。

用治疗浓度的GCV(1.5μM)或ACV(3.0μM)处理端粒末端转移酶阳性细胞系，以表明在细胞内抑制所述端粒的DNA合成，从而诱导端粒缩短。通过流式细胞计用端粒特定肽核酸(PNA)探针来测量在更昔洛韦和阿昔洛韦处理和未处理的细胞系中的端粒长度。为确定细胞周期分布，细胞用碘化丙啶(PI)染色。在两种处理14天后，两种细胞系显示了端粒缩短、大量细胞凋亡和G2停滞。

为表明在细胞周期分布中的改变，用更昔洛韦或阿昔洛韦处理HeLa和NuTu-9细胞14天，用PI染色，并同时通过流式细胞计来分析。结果展示了细胞周期的G2停滞。重要的是注意，改变是快速的并仅在阿昔洛韦处理14天之后就能被检测到。相反，在端粒末端转移酶阳性细胞，HeLa和NuTu-19中，核苷类似物，AZT对端粒长度或细胞周期分布无作用，甚至在升高的浓度例如，100μM。

同时，PI染色表明了与未处理细胞相比，在治疗后期GCV或ACV处理的细胞中更高的DNA含量。这种事实的合理解释是短暂的端粒诱导的染色体端到端连接。

细胞系的来源是子宫颈(HeLa)和卵巢上皮(NuTu-19)。在37℃的5％的CO₂湿润空气内，在补充有10％胎牛血清的D-MEM培养基中培养细胞。对于用GCV处理的细胞，向培养基补充1.5μM的GCV(Cymevene，Hoffman-La Roche)。对于用ACV处理的细胞，向培养基补充3μM的阿昔洛韦(Acyclovir，TEVA Pharm.Ind.Ltd，Israel)。

实时TRAP分析按(Wege et al.，SYBR Green real-timetelomeric repeat amplification protocol for the rapidquantification of telomeraseactivity.Nucleic Acids Res.2003；31(2)：E3-3)所述的进行。对于用流式细胞计的端粒长度测量，细胞用缀合(C₃TA₂)₃PNA探针的端粒特异FITC(Applied Biosystems)染色，并用0.06μg/ml PI反相染色，如(Rufer，N.，Dragowska，W.，Thornbury G.，Roosnek，E.，Lansdorp P.M.Telomere lengthdynamics in human lymphocyte subpopulations were measured byflow cytometry.Nat.Biotechnol.16，743-747(1998))所述。

因此，本文已经证明，在广泛地可接受模型系统中，核苷类似物GCV和ACV明显地阻断端粒末端转移酶阳性癌。

(c)在端粒末端转移酶阳性癌细胞中阿昔洛韦(ACV)更昔洛韦(GCV)和喷昔洛韦(PCV)治疗之后端粒缩短、G2停滞和细胞凋亡的诱导按如下方式进行。

使用端粒末端转移酶阳性(HeLa)和端粒末端转移酶阴性(U-2OS)两种细胞系。进行合适的分析，以检测和证实在这些细胞中端粒末端转移酶/L1RT的特异活性。用治疗浓度的ACV(3.0μM)、GCV(1.5μM)或PCV(1.5μM)处理所述细胞系，以表明端粒DNA合成在细胞内被抑制，并从而诱导端粒缩短。通过流式细胞计用端粒特异肽核酸(PNA)探针来测量在ACV、GCV和PCV处理和未处理的细胞系中的端粒长度。为确定细胞周期分布，细胞用碘化丙啶(PI)染色。在处理10和14天后，两种细胞系显示了端粒缩短、大量细胞凋亡和G2停滞。

为表明在细胞周期分布中的改变，用ACV、GCV或PCV处理eLa和U-2 OS细胞14天，用PI染色，并同时通过流式细胞计来分析。结果展示了细胞周期的G2停滞。重要的是注意，改变是快速的并仅在ACV处理几天之后就能被检测到。

用于这个研究中的U-2 OS(骨肉瘤)和HeLa(子宫颈)细胞系是获得自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，MD)。在补充有10％胎牛血清的D-MEM介质中，在37℃的5％CO₂的湿润空气中培养细胞。对于用ACV处理的细胞中，向培养基补充3μM的阿昔洛韦(acyclovir，TEVA Pharm.Ind.Ltd，Israel)。对于用GCV处理的细胞，向培养基补充1.5μM的GCV(Cymevene，Hoffman-La Roche)。对于用PCV处理的细胞，向培养基补充1.5μM的PCV(penciclovir，Merck & Co.)。

实时TRAP分析按(Wege et al.，SYBR Green real-timetelomeric repeat amplification protocol for the rapidquantification of telomerase activity.Nucleic Acids Res.2003；31(2)：E3-3)所述的进行。对于用流式细胞计的端粒长度测量，细胞用缀合(C₃TA₂)₃PNA探针端粒特异FITC(Applied Biosystems)染色，并用0.06μg/ml PI反相染色，如(Rufer，N.，Dragowska，W.，Thornbury G.，Roosnek，E.，Lansdorp P.M.Telomere lengthdynamics in human lymphocyte subpopulations were measured byflow cytometry.Nat.Biotechnol.16，743-747(1998))所述。

因此，本文已经证明，核苷类似物阿昔洛韦、更昔洛韦和PCV清楚的导致端粒长度的降低。

实施例3.端粒末端转移酶阴性(ALT)肿瘤产生的预防

(a)注射了U-2OS/RAS细胞的裸鼠：Cr11：CD1-/nu小鼠购买自Charles River Laboratories，Charles River Deutschland GmbH(23.12.2004)。总共12只裸鼠皮下注射6 x 10⁵ U-2 OS/RAS细胞。将这些小鼠分为实验和对照组。

实验组的小鼠从第一天开始就接受在饮用水中的AZT(1mg/ml)。在对照组中，小鼠产生肿瘤(在肿瘤细胞注射后，在N1中为第26天；在N2中为第34天和在N3中为第41天)。

处死所用没有肿瘤的小鼠。产生肿瘤的对照组的一只小鼠，首先在肿瘤细胞注射后的第51天被处死。机械性分离肿瘤组织以产生细胞混悬液。将大约2000万个细胞接种到补充有10％FCS的McCoy’s 5A培养基中。将所述组织培养细胞用于进一步的分析。

对照组中有肿瘤的两小鼠从第52天开始接受在饮用水中的AZT(1mg/ml)。一只小鼠在第80天死亡。第二只在肿瘤细胞注射后第110天被处死。收集肿瘤组织并储存在-80℃用于进一步的分析。

1.在对照组中六只小鼠中的三只产生了ALT肿瘤。AZT处理组中没有小鼠产生肿瘤。

2.从ALT肿瘤产生的组织培养是端粒末端转移酶阳性的。其表明在端粒末端转移酶阴性肿瘤内，某些细胞自发地激活端粒末端转移酶。

3.用AZT处理并有ALT肿瘤的小鼠显示出了肿瘤生长减缓。

(b)注射了HeLa细胞的裸鼠：对裸鼠皮下注射Hela细胞(3 x10⁵)，以表明在体内对端粒末端转移酶阳性肿瘤的治疗和产生的预防。实验组从第0天接受在饮用水中的缬更昔洛韦。人癌HeLa细胞培养物是购买自ATCC。全部12只CD1/-nu和12只NMRiI/-nu裸鼠都购买自Charles River Laboratories，CharlesRiver Deutschland GmbH。这些裸鼠皮下注射3 x 10⁵个HeLa细胞。实验组中的小鼠(每株6只小鼠)从第0天接受在饮用水中的

(val-ganciclovir)(1mg/ml)。

在对照和治疗组中的所有小鼠都产生了肿瘤。在大约14天内，所有小鼠都产生了肿瘤。治疗组的一只小鼠中的肿瘤开始退化，并在大约第30天，这个肿瘤被使用

的单一疗法清除了。治疗组中的其他小鼠显示了肿瘤生长的减缓。

实施例4.端粒维持的ALT机制向依赖端粒末端转移酶机制的切换：

在U2-OS细胞和HeLa细胞中检验在本文中描述的AZT对生长细胞周期和端粒的作用。U2-OS细胞，其是端粒末端转移酶阴性的，表达L1RT，而Hela细胞，其是端粒末端转移酶阳性的，表达端粒末端转移酶。

(a)体外分析：用0.2μM的AZT培养U-2OS细胞22天。通过flow-FISH用端粒特异PNA探针来分析活跃生长的克隆，并在实时TRAP分析中使用Hela细胞作为阳性对照。分析的活跃生长克隆在DNA含量和端粒长度方面不同于亲本细胞。并且所有的分离活跃生长克隆在TRAP分析中，是端粒末端转移酶阳性的。

(b)体内分析：处死来自对照未处理组的从改良人U-2OS骨肉瘤产生肿瘤的裸鼠。被机械性分离肿瘤组织为细胞混悬液。将2000万个细胞接种到补充有10％FCS的McCoy′s 5A培养基中。少数细胞附着到塑料表面，产生了组织培养物，其在实时TRAP分析中用Hela细胞作为阳性对照进行分析。通过RT-PCR证明产生的组织培养物的人来源。使用选择性引物来表明人GAPDH mRNA的存在和鼠GAPDH mRNA的缺失。

结果清楚地显示，从ALT肿瘤产生的组织培养物是端粒末端转移酶阳性的。其表明在端粒末端转移酶阴性肿瘤内，某些细胞自发地激活端粒末端转移酶。

换句话说，使用AZT对端粒末端转移酶阴性癌细胞的治疗允许选择阳性细胞，并且癌能复发。

实施例5.在施用双鸡尾酒，缬更昔洛韦和叠氮胸苷(AZT)或伐昔洛韦和

后小鼠中肿瘤尺寸减少的验证：

本实施例示例说明了在小鼠模型中双鸡尾酒的抗肿瘤活性和效力。

(a)使用缬更昔洛韦和叠氮胸苷(AZT)组合的体内分析人癌HeLa细胞培养物是购买自ATCC。全部24只CD1/-nu裸鼠都购买自Charles River Laboratories，Charles River Deutschland GmbH。对这些小鼠皮下注射1 x 10⁵个HeLa细胞。通过测量肿瘤的最大和最小直径来确定肿瘤体积。使用公式V＝4/3π R_max x R_min ²进行计算，其中R_max-肿瘤最大直径的_1/2，和R_min-肿瘤最小直径的_1/2。对裸鼠皮下注射1 x 10⁵个HeLa细胞。

在注射后第35天所有小鼠都产生了肿瘤，在这时对治疗组的12只小鼠施用双鸡尾酒

和

每个浓度为在饮用水中1mg/ml。在20天的双鸡尾酒治疗后，对12只处理小鼠中待6只小鼠施用三鸡尾酒(

+ddI)额外21天，以在饮用水中每个1mg/ml的剂量(见下文的实施例7)，并且仅6只小鼠继续接受双鸡尾酒另外21天，这时对所有注射了Hela细胞的小鼠测量肿瘤。在保留的12只注射了Hela细胞但迄今未用任意鸡尾酒或抗癌剂治疗的小鼠中，6只养殖作为试验剩余持续时间的对照。其他6只在注射Hela细胞后被用

治疗67天(见下文的实施例7)。

来自双鸡尾酒治疗组的小鼠显示了50％的存活率。治疗和未治疗小鼠的肿瘤体积于本实施例的表格中。与未治疗组相比，一只小鼠显示了99.3％的肿瘤尺寸减小。与未治疗组相比，一只小鼠显示了98.9％的肿瘤尺寸减小，并且与未治疗组相比一只小鼠显示了95.8％的肿瘤尺寸减小。

实施例5的表格-在双鸡尾酒治疗后裸鼠中的肿瘤退化

 

治疗	小鼠的编号*	在注射Hela细胞后第75天裸鼠中的肿瘤体积(mm3)
			缬更昔洛韦+叠氮胸苷20天	小鼠1小鼠2小鼠3	14.123.691.7
未治疗的对照	4	2178.0(平均值)

*所有用缬更昔洛韦

和

治疗的小鼠都显示了毒性症状，也许是由于

和组合的不相容，在本领域中已知这种组合在某些病例中诱导严重的毒性。

和

组合的部分或全部副作用能通过使用已知的防护剂和支持疗法来抵消，但在本试验的小鼠中没有使用。

(b)使用伐昔洛韦和叠氮胸苷(AZT)组合的体内分析：小鼠肝癌MH22A购买自细胞学研究所得组织培养物保藏中心(the tissueculture collection of the Institute of Cytology)(RussianAcademy of MedicalScience，Petersburg，Russia)。将冷冻细胞解冻，转移至补充有10％胎牛血清的培养基MEM。在37℃的5％CO₂湿润空气中培养细胞。为测定MH22A细胞的端粒末端转移酶状态，如上所述在实时TRAP分析中使用Hela细胞作为阳性对照进行分析这些细胞。结果清楚地显示MH22A细胞是端粒末端转移酶阳性的。

八个星期大的雄性C3HA自交小鼠购买自Laboratory AnimalsBreading Facility of Russian Academy of Medical Science(Rappalovo，Leningrad region)。将大约2 x 10⁵个MH22a细胞皮下注射入35只小鼠的背侧。在注射之后，将小鼠随机分为不同的实验组。

(a)一组7只小鼠从第0天开始接受伐昔洛韦(Valtrex

，GlaxoSmithKline)，浓度为在饮用水中1mg/ml。在第30天，小鼠开始接受在饮用水中的1mg/ml伐昔洛韦、1mg/ml AZT和1mg/ml的Xeloda

的混合物。

(b)一组7只小鼠从第0天开始接受在饮用水中的1mg/ml伐昔洛韦和1mg/ml AZT 

.V.，GlaxoSmithKline)的混合物。

(c)一组7只先前没有治疗的小鼠从第14天开始接受在饮用水中的1mg/ml伐昔洛韦和1mg/ml的AZT的混合物。

(d)一组7只先前没有治疗的小鼠从第16天开始接受在饮用水中的1mg/ml伐昔洛韦和1mg/m的1AZT的混合物。从30天之后，小鼠开始接受在饮用水中的1mg/ml伐昔洛韦、1mg/ml AZT和1mg/ml的Xeloda

的混合物。

(e)一组7只未治疗的小鼠作为阳性对照。

所有对照组的小鼠在第14天已经产生直径5-8mm的肿瘤。在实验的第17天，接受了

和AZT组合的组中的5只小鼠没有肿瘤。相同组的两只小鼠具有直径为3mm的肿瘤。来自另一个组的所有小鼠已经产生了平均直径10mm的肿瘤。

在试验的第45天，从第0天单独接受伐昔洛韦的7只小鼠和从第16天接受

和

组合的7只小鼠开始在饮用水中接受

浓度为1mg/ml。

在试验的第60天，从第0天接受和

组合的7只小鼠中的四只保持无肿瘤。在所有其他治疗组中，仅两只小鼠保持无肿瘤。所有的对照小鼠具有比治疗组尺寸更大的肿瘤。

在试验的第75天，对照和治疗组中的小鼠开始死亡。在试验的第85天，在对照未治疗组中所有小鼠都死亡了。预防组中只有四只小鼠(从第0天和

)和各个治疗组中的两只小鼠(从第0天

和从第45天从第16天和

和从第45天

、从第14天

和)存活且无肿瘤。在这个时间点，所有的治疗都被停止。在试验的150天，预防组中的四只小鼠和各个治疗组中的两只小鼠仍然存活和无肿瘤的。

实施例6.在暴露于三鸡尾酒，阿昔洛韦+AZT+ddI，的培养基中培养的培养细胞内端粒缩短的验证：

用AZT和ACV对端粒末端转移酶阴性ALT细胞(U-2OS)治疗28天允许选择对两种药物都有抗性的增殖细胞。这些被选择的细胞用AZT、ACV和0.01mg/L的ddI组合的治疗诱导进行性的端粒缩短和细胞凋亡。

实施例7.在施用双鸡尾酒

和

或

和

后，小鼠中肿瘤尺寸减小的验证：

这个实施例示例说明三鸡尾酒通过选择性的增加小鼠模型中肿瘤细胞的敏感性增强DNA损害化学治疗剂的效力的潜能。

如同在上文实施例5中提及的，全部6只小鼠，在20天的双鸡尾酒治疗后，再施用三鸡尾酒(

+ddI，在饮用水中剂量分别为1mg/ml)额外的21天。在14天的三鸡尾酒治疗后，将浓度为1mg/ml的

添加到所述三鸡尾酒中。6只先前没有用任意药物治疗的小鼠在注射Hela细胞后第67天用在饮用水中浓度为1mg/ml的

治疗。在注射Hela细胞后第75天，采集所有小鼠肿瘤测量数据。

来自对照未治疗和仅用

治疗组的小鼠显示了66％的存活率。与未治疗对照组相比，仅用

治疗组小鼠的肿瘤平均尺寸要小17％。

用三鸡尾酒和

组合治疗的小鼠显示了100％的存活率。治疗和未治疗小鼠的肿瘤体积在本实施例的表格中。组内6只小鼠中的两只，肿瘤完全消失。在其余的四只小鼠中，肿瘤仅能通过触诊确定。对于肿瘤减小，与仅有

治疗的组相比，两只小鼠显示了99.8％的肿瘤减小。与仅有

治疗的组相比，一只小鼠显示了98.2％的肿瘤尺寸减小。与仅有

治疗的组相比，一只小鼠显示了90.0％的肿瘤尺寸减小。

实施例7的表格-在用鸡尾酒和遗传毒性试剂组合治疗后裸鼠中肿瘤的退化/消失

*所有用

和

治疗的小鼠都显示了毒性症状，也许是由于

和

组合的不相容，在本领域中已知这种组合在某些病例中诱导严重的毒性。

和

组合的部分或全部副作用能通过使用已知的防护剂和支持疗法来抵消，但在本试验的小鼠中没有使用。

实施例8.使用有遗传毒性化学治疗干扰的细胞毒肿瘤治疗(基础治疗)对人类患者的治疗：

这个实施例示例说明了引入DNA损害遗传毒性化学治疗的基础治疗(使用双或三鸡尾酒)在人类患者中的治疗效力。所述患者是女性，65岁，被诊断为不能手术的胃癌，如下更全面的描述：

该患者，在胃痛、重量减轻、恶心和呕吐的不适后，被诊断为扩散浸润胃癌，Ascitis的等级IV。作为诊断的一部分，临床、放射和外科步骤的组合。这些评价有助于定义这个患者癌的阶段，并提供对预后的了解和对于治疗计划的良好基础。

更具体地说，作为初步检查的一部分，对该患者上进行纤维胃镜检查术。在此初步检查期间，发现患者的胃变形、僵硬并在注气时相对不可扩张。并且，在胃的上三分之二处，检测到失血组织。胃窦没有任何病变。从胃组织进行多位活组织检查。依据组织分析，发现该患者具有较低分化等级的胃腺癌。使用反差的胃的X射线检查揭示出以下临床特征：从胃的贲门下部分开始至胃的下三分之一，胃壁是僵硬的。胃在中间的三分之一的直径是2.5厘米。胃小弯上的肿瘤的长度是7厘米，和在胃大弯上是从11至12厘米。在胃大弯的中间，也检测到了溃疡。胃窦和十二指肠没有任何病变。也进行了诊断性腹腔镜检查。其揭示了壁腹膜和脏腹膜的总癌变数。发现癌是不能手术的。该患者用基础治疗预治疗30天，继之以引入了治疗的基础治疗53天，如下文更详细的描述：

(a)基础治疗：1片(AZT)300mg和1片Zovirax(阿昔洛韦，Glaxo Wellcome)，400mg/(缬更昔洛韦)450mg/

(缬氨酸-ACV)500mg全部每日两次。在基础治疗的83天期间使用不同的无环核苷类似物，原因是与市场可购得相关。基础治疗初始是用阿昔洛韦，其被使用9天，继之以

30天并然后继续在剩余的治疗期间用

这些药物在摄入食物之前2小时或之后2小时口服施用。所述基础治疗持续11.9星期。

(b)DNA损害治疗：从所述基础治疗的第31天，

与所述基础治疗药物一起以4片500mg(2g)每日两次(即，一天共4g)的剂量口服施用。用

的干扰由三个

过程组成，第一疗程9天，继之以14天的休息，然后第二疗程7天，继之以14天的休息，和然后最后一个疗程是10天。在整个这个时期内维持所述基础治疗。

在上述癌治疗停止后大约4星期内，进行剖腹术。在腹腔中发现了大约2升腹水(ascetic fluid)。然而，没有检测到腹膜癌变的迹象。肝和膈膜没有病变。在触诊中胃壁是僵硬的。然而，胃浆膜没有病态迹象。

通过常规临床和图像检查按时的监测所述患者超过一年。这些检查证实疾病的阳性动态是稳定的或在控制之下。

使用

的遗传毒性化学治疗在该患者中引起毒性，因此，不能无限期的施用直到患者获得完全的反应。相反，在患者中维持的作为基础治疗的双鸡尾酒和三鸡尾酒组分的数量在维持期间对患者或者是最低毒性的或者是无毒的。可以长期施用给定的鸡尾酒药物并对抗癌症，而不用担心在中止

治疗期间肿瘤的再生。因此，很显然，能够影响肿瘤细胞中端粒维持或诱导端粒缩短、G₂/M停滞和/或大量细胞凋亡的基础治疗，提供了预防肿瘤生长和存活率优势的良好的风险-效益比。

简而言之，没有接受本文所公开的基础治疗的患者的癌症处于急性期。患有不能手术胃癌的患者对治疗的反应确实是使人惊讶的，因为对不能手术胃癌的良好反应是非常罕见的。

虽然在本文提供了用包含核苷类似物的三鸡尾酒和使用本公开的治疗方案来成功治疗胃癌的人类患者的数据，应当理解与本发明的抑制剂组合的常规改良的治疗方案能用于其他形式癌的治疗，例如黑素瘤、NSCLC、肾细胞癌及其他本领域已知的癌，并在此举例说明。此外，本发明提供了在所有类型癌的治疗中的改良，所述癌能用包含遗传毒性化学治疗剂的DNA损害癌治疗剂来治疗，因为通过使用本发明的施用方案，与现有技术用于施用抗赘生物有效数量或剂量的DNA损害剂的相应方案相比有更低的毒性和/或需要更少的时间。

实施例9.本发明无环核苷类似物和前体药物的制备：

按照在核苷和核苷酸化学实践中公认的合成方法来制备本发明的无环核苷类似物。本发明化合物制备中使用的合成方法的说明参考下文：“Chemistry of Nucleosides and Nucleotides，”L.B.Townsend，ed.，Vols.13，Plenum Press，1988，其在此通过参考全部引入本文。

根据下述实施例详述的步骤来制备本发明分子式I-IV的无环核苷类似物。实施例不是意图以任何方式限定本发明的范围，并且对它们将不做此解释。核苷和核苷酸合成领域的技术人员容易理解，以下制备步骤的条件和过程的已知改变能用于制备本发明的这些和其他化合物。除非另作说明，所有的温度都是摄氏度。

(a)分子式(I)或SN 1的合成

2-羟乙基苯甲酸酯。

将苯基氰(200ml)和重蒸镏的乙烷-1，2-二醇(600ml)(防止有水分；NaOH)回流，直至停止放出氨气(3天)，然后冷却。添加水(4000ml)并用醚(3×200ml)提取析出的油。在干燥和除去溶剂后，在减压下通过实验室塔精馏残渣。这种精馏产生241g(74％)的2-羟乙基苯甲酸酯，沸程160-162℃(14mm)。

2-(氯甲氧基)苯甲酸乙酯。

干HCl气体在0℃搅拌3h，通过在200ml的干C₂H₄Cl₂和40g(0.44mol)的多聚甲醛内的50g(0.3mol)2-羟乙基苯甲酸酯的混合物。溶液被在CaCl₂上干燥18h，过滤，并在真空下蒸发。将残留的油蒸馏，产生52.5g(93％)的2-(氯甲氧基)苯甲酸乙酯，bp126-129℃(0.5mm)。

1-[[2-(苯甲羧基)乙氧基]甲基]-5-甲基尿嘧啶。

6.30g(50mmol)胸腺嘧啶、100ml六甲基二硅氮烷和1ml的三甲基甲硅烷基氯化物的混合物在氮气下搅拌回流20h。产出溶液在真空下旋转蒸发为油。向50ml二氯甲烷中的残留油添加10.60g(49.4mmol)的2-(氯甲氧基)苯甲酸乙酯。溶液在冰上冷却，并快速滴加在50ml的二氯甲烷中的11ml(80mmol)三乙胺。产出溶液在环境温度下搅拌72h。将反应物倾倒入300ml含水(1:1)乙醇溶液中，并在分液漏斗中振摇。产出混合物用500ml水稀释。有机层分离、过滤并在真空中旋转蒸发。在包含少量EtOAc的环己烷条件下结晶残渣：得到9.29g(61％)；mp94-99℃，其包含一些杂质。从EtOAc再结晶几次得到纯物质：得到4.60g(30％)；mp115-116℃。

NMR(500MHz，DMSO-d6)δ，1.77(s，3H)3.87(t，2H)，4.39(t，2H)5.13(s，2H)，7.44-7，98(2t+d，5H)，11.16(s，1H)。

1-[(2-羟乙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶。

将0.870g(2，86mmol)1-[[2-(苯甲羧基)乙氧基]甲基]-5-甲基尿嘧啶和20ml的40％含水甲胺的溶液在50℃的水浴上加热3h。将反应物冷却并在真空中旋转蒸发。残留浆用乙醚研磨，以得到固体其用EtOAc消化以移除N-甲基苯甲酰胺。收集白色固体并用Et₂O清洗：得到0.495g(86％)；mp138-140℃。从乙酸乙酯再结晶得到分析纯的物质：得到0.375g(65％)；mp139-140℃。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，1.81(s，3H)，3.52(s，4H)，4.37(brs，1H)，5.07(s，2H)，7.41(s，1H)，11.06(s，1H).

(b)分子式(II)或SN 2的合成

9-[(2-(苯甲羧基)乙氧基)甲基]-腺嘌呤。

在石蜡中60％分散氢化钠，(3.26g，82mmol)用己烷洗涤(3×100ml)，然后在0℃悬浮于DMF(250ml)中。在搅拌下向此溶液缓慢加入腺嘌呤(10.0g，74mmol)。在添加完成后，将反应混合物加热至室温并搅拌2h，然后在持续搅拌下添加2-(氯甲氧基)苯甲酸乙酯(24g，1.5eq.)超过3h。反应混合物在室温下再搅拌24h，然后溶液被浓缩为糊。添加水(100ml)，采集沉淀，并从1-丁醇再结晶，以得到标题的酯(8.1g，35％)。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，3.91(t，2H)，4.37(t，2H)，5.64(s，1H)，6.93(br.s，2H)，7.44-7.89(2t+d，5H)，8.118(s，1H)，8.123(s，1H).

9-[(2-羟乙氧基)甲基]-腺嘌呤。

将1.2g(3.83mmol)的9-[[2-(苯甲羧基)乙氧基]甲基]-腺嘌呤和20ml 40％含水甲胺的溶液在50℃的水浴上加热3h。将反应物冷却并在真空中旋转蒸发。残留浆用Et₂O研磨，以得到固体，其用Et₂O消化以移除N-甲基苯甲酰胺。收集白色固体并用乙醚洗涤：得到0.672g(84％)。从1-丁醇再结晶得到分析纯物质：得到0.600g(75％)。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，3.51(t，2H)，3.55(t，2H)，4.44(s，1H)，5.59(s，2H)，6.89(br.s，2H)，8.12(s，2H).

(c)分子式(III)或SN3的合成

1，3-二-O-苯甲基甘油。

将氢氧化钠(100g，2.5mol)的水(200mL)溶液以添加到苯甲醇(400g，3.9mol)中超过10min。将混合物冷却至25℃，然后在快速搅拌下超过30min添加表氯醇(100g，1.08mol)。继续强烈搅拌16h。然后用水(1000mL)稀释该混合物，并用甲苯(3×500mL)提取。甲苯提取物用水(500mL)洗涤，在Na₂SO₄上干燥并蒸发为油，其被蒸馏以得到150g(50％)的1，3-二-O-苯甲基甘油，bp155℃(0.5mm)。

2-O-氯甲基，1，3-二-O-苯甲基甘油。

将氯化氢气体(通过浓缩的H₂SO₄干燥)在0℃通气进入多聚甲醛(32g，0.8mol)和1，3-二-O-苯甲基甘油(100g，0.37mol)在二氯甲烷(1000mL)内的搅拌混合物中，直至所有的固体被溶解(3h)。产物溶液在0℃储存16h，在MgSO₄上干燥，然后蒸发得到作为非常不稳定透明油的2-O-氯甲基，1，3-二-O-苯甲基甘油。

1-[(1，3-二苄氧基-2-丙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶。

将20g(159mmol)胸腺嘧啶、100ml六甲基二硅氮烷和1ml的三甲基硅烷基氯化物的混合物在氮气下搅拌回流20h。将产出溶液在真空下旋转蒸发得到油。向300ml二氯甲烷中的残留油中添加56g(175mmol)的2-O-氯甲基，1，3-二-O-苯甲基甘油。将溶液在冰上冷却，并快速滴加在60ml的二氯甲烷中的33ml(240mmol)三乙胺中。产出溶液被在环境温度下搅拌72h。将反应物倾倒入500ml含水(1:1)乙醇溶液中，并在分液漏斗中振摇。用500ml水稀释产出混合物。有机层分离、过滤并在真空中旋转蒸发。残留物在包含少量EtOAc的己烷条件下结晶。从EtOAc再结晶几次得到纯物质：得到17.6g(27％)；mp96-98℃。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，1.74(s，3H)，3.51(m，4H)，3.99(m，1H)，4.48(s，4H)，5.17(s，2H)，7.26(s，10H)，7.53(s，1H)，11.12(s，1H).

1-[(1，3-二羟-2-丙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶。

将1-[(1，3-二苄氧基-2-丙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶(30g，73mmol)、在碳上的20％氢氧化钯(Pearlman′s催化剂)(1000mg)、环己烯(400mL)、和乙醇(200mL)的混合物被在氮气下加热回流。在8和24h后，添加额外的催化剂(250mg)。在36h后，将该溶液冷却至室温并过滤。蒸发滤液，并用苯(100mL)研磨残留物得到14g(83％)的粗1-[(1，3-二羟-2-丙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶。从1-丁醇再结晶得到纯物质：mp156-157℃。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，1.81(s，3H)，3.37(m，2H)，3.44(m，2H)，3.53(m，1H)，4.33(br.s，2H)，5.15(s，2H)，7.45(s，1H)，11.09(s，1H).

(d)分子式(IV)或SN4的合成

9-[(1，3-二苄氧基-2-丙氧基)甲基]-腺嘌呤。

在石蜡中60％分散的氢化钠(6.2g，156mmol)用己烷洗涤(3×100ml)，然后在0℃悬浮在DMF(500ml)中。在搅拌下向此溶液缓慢加入腺嘌呤(19g，141mmol)。添加完成后，将反应混合物加热至室温并搅拌2h，然后在持续搅拌下以超过2h添加2-O-氯甲基，1，3-二-O-苯甲基甘油(68g，1.5eq.)。反应混合物被在室温下再搅拌24h，然后浓缩该溶液。添加水(400ml)和收集沉淀物，并从EtOAc再结晶。从EtOAc再结晶几次得到17.2g(29％)的9-[(1，3-二苄氧基-2-丙氧基)甲基]-腺嘌呤。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，3.45(m，2H)，3.50(m，2H)，4.10(m，1H)，4.42(s，4H)，5.68(s，2H)，6.93(br.s，2H)，7.21(m，5H)，7.27(m，5H)，8.08(s，1H)，8.13(s，1H).

9-[(1，3-二羟-2-丙氧基)甲基]-腺嘌呤。

将9-[(1，3-二苄氧基-2-丙氧基)甲基]-腺嘌呤(35g，83mmol)、在碳上的20％氢氧化钯(Pearlman′s催化剂)(1000mg)、环己烯(400mL)和乙醇(200mL)的混合物在氮气下加热回流。在16和36h后，添加额外的催化剂(250mg)。在48h后，将溶液冷却至室温并过滤。蒸发滤液，并用甲苯(100mL)研磨残留物得到14g(83％)的粗9-[(1，3-二羟-2-丙氧基)甲基]-腺嘌呤。从1-丁醇再结晶得到13g的纯物质。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，3.36(m，2H)，3.45(m，2H)，3.61(m，1H)，4.43(br.s，2H)，5.69(s，2H)，6.98(br.s，1H)，8.15(s，1H)，8.18(s，1H)。

(e)分子式(V)或SN5的合成

三乙基1，1，2-乙烷三羧酸酯。

金属钠(23g，1mol)在搅拌下溶于无水乙醇(0.5L)中，然后以超过10分钟添加丙二酸二乙酯(153ml，1mol)。然后滴加氯乙酸乙酯(117g，0.95mol)到搅拌的混合物。在添加完成后，将反应混合物加热回流4小时，然后倾倒入2L的水中并用醚提取(3×500mL)。将醚部分合并，在MgSO₄，上干燥，过滤和蒸发得到油。其被真空蒸馏得到197g(84％)的三乙基1，1，2-乙烷三羧酸酯。

2-(羟甲基)丁烷-1，4-二醇。

向在900mL无水叔丁醇中的100mL三乙基1，1，2-乙烷三羧酸酯(108g，0.44mol)和50g氢化硼钠的回流溶液中，以超过150分钟滴加100mL的甲醇。将产物溶液再回流90分钟，然后冷却至10℃。在强烈搅拌下小心添加10％盐酸以中和该溶液。

过滤溶液并用300mL的无水乙醇洗涤无机残留物。合并有机溶液并在真空中旋转蒸发。

用400mL无水乙醇提取残留物并过滤溶液。在减压(0.5mm)下移除溶剂以得到48g(92％)的2-(羟甲基)丁烷-1，4-二醇的粘的透明油。

5-(2-羟乙基)-2，2-二甲基-1，3-二氧六环

向在200ml无水THF中的2-(羟甲基)丁烷-1，4-二醇(48g，0.4mol)和2，2-二甲氧基丙烷(55g，0.45mol)的溶液中添加3g对-甲苯磺酸一水化物。将溶液在室温下搅拌60分钟，然后通过添加三乙胺来中和。

过滤溶液并在减压下蒸发。将残留物溶于1000ml的二乙醚，过滤并再蒸发。

产生对混合物由47％5-(2-羟乙基)-2，2-二甲基-1，3-二氧六环、21％七-元环缩酮及其他产物组成(基于GCMS数据)。

残留物通过柱层析纯化，在硅胶上用1-氯丁烷、氯仿和氯仿甲醇混合物(25:1)洗脱，以得到24g(38％)的5-(2-羟乙基)-2，2-二甲基-1，3-二氧六环的无色液体。

5-(2-溴乙基)-2，2-二甲基-1，3-二恶烷。

将在500ml N，N-二甲基甲酰胺中的24g(0.15mol)的5-(2-羟乙基)-2，2-二甲基-1，3-二恶烷和76g(0.23mol)四溴化碳的溶液，放置在冰浴(0-+5℃)中，并快速搅拌同时添加60g(0.23mol)三苯基膦。搅拌该溶液1小时。然后用饱和碳酸氢钠水溶液(200ml)稀释该溶液，然后用水(300ml)稀释并用己烷提取(3×200ml)。合并的有机层在硫酸镁上干燥，过滤和在减压下移除溶剂。残留物被放置在真空下(0.5mm)，通缓慢流动的干燥氩气2小时以移除三溴甲烷。残留物被溶于己烷。过滤该溶液并移除溶剂以得到26g(81％)的5-(2-溴乙基)-2，2-二甲基-1，3-二恶烷的透明无色液体。

1-[2-(2，2-二甲基-1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-5-甲基尿嘧啶。

将6.3g(50mmol)胸腺嘧啶、100ml六甲基二硅氮烷和1ml的三甲基甲硅烷基氯化物的混合物在氮气下搅拌回流20小时。将产出溶液在真空下旋转蒸发为油。向在50ml二氯甲烷中的残留油中添加11g(50mmol)的5-(2-溴乙基)-2，2-二甲基-1，3-二恶烷。将溶液在冰上冷却，并快速滴加在50ml的二氯甲烷中的11ml(80mmol)三乙胺重。在环境温度下搅拌产出溶液72小时。将反应物倾倒入300ml含水(1:1)乙醇溶液中，并在分液漏斗中振摇。用500ml水稀释产出混合物。将有机层分离、过滤并在真空中旋转蒸发。

在含有部分乙酸乙酯的环己烷中结晶残留物：得到7.3g(54％)，其包含部分杂质。从乙酸乙酯再结晶几次得到纯的1-[2-(2，2--1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-5-甲基尿嘧啶：得到6.1g(45％)。LCMS纯度-98.4％

1-[4-羟基-3-(羟甲基)丁-1-基]-5-甲基尿嘧啶。

将在30mL的2M盐酸中的6.1g(23mmol)(1-[2-(2，2-二甲基-1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-5-甲基尿嘧啶溶液加热回流90分钟。通过添加NaOH水溶液(10％)中和该溶液，然后冷却至10℃。过滤该溶液，并用水洗涤固体以得到3.5g(67％)的1-[4-羟基-3-(羟甲基)-1-丁基]-5-甲基尿嘧啶。LCMS纯度-97.2％。

(f)分子式(VI)或SN6的合成

9-[2-(2，2-二甲基-1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-腺嘌呤。

将在石蜡中60％分散的氢化钠(1.67g，42mmol)用己烷洗涤(3×50mL)，然后在0℃悬浮在150mL无水DMF中。在搅拌下向此溶液缓慢加入腺嘌呤(5.0g，37mmol)。在添加完成后，将反应混合物加热至室温并搅拌二小时，然后在持续搅拌下以超过三个小时添加12.4g(56mmol，1.5eq.)的5-(2-溴乙基)-2，2-二甲基-1，3-二恶烷。在室温下在搅拌反应混合物24小时，然后将该溶液减压浓缩为糊。添加水(100mL)和收集沉淀物，并从1-丙醇结晶，以得到9-[2(2，2-二甲基-1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-腺嘌呤(4.8g，46％)。

再结晶后LCMS纯度为-98.1％。

9-[4-羟基-3-(羟甲基)丁-1-基]-腺嘌呤。

将在20ml的2M盐酸中的4.3g(15.5mmol)9-[2-(2，2-二甲基-1，3-二恶烷-5-基)-乙基]-腺嘌呤溶液加热回流90分钟。通过添加NaOH水溶液(10％)中和该溶液，然后冷却至10℃。过滤该溶液，用水洗涤固体以得到2.6g(71％)的9-[4-羟基-3-(羟甲基)丁-1-基]-腺嘌呤。LCMS纯度-97.7％。

(g)SN1的缬氨酸酯(VSN1)的合成

2-[(5-甲基尿嘧啶-1-基)甲氧基]-乙基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯。

将3g的1-[(2-羟乙氧基)甲基]-5-甲基尿嘧啶和200ml无水二甲基甲酰胺的混合物加热至60℃，得到溶液。将4g的N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸、400mg的4-二甲基氨基吡啶和4g的二环己基碳二亚胺添加到该热溶液中。使产物溶液冷却至室温并搅拌16小时。向反应混合物中再次补充另一份N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸、4-二甲基氨基吡啶和二环己基碳二亚胺，并在室温下搅拌两天。过滤该混悬液，在减压下浓缩无色滤液，并将残留物溶于甲醇/二氯甲烷并通过快速色谱法，在硅胶上纯化，用10％甲醇/二氯甲烷洗脱以获得2-[(5-甲基尿嘧啶-1-基)甲氧基]-乙基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯，为5.5g(85％)的白色固体。

2-[(5-甲基尿嘧啶-1-基)甲氧基]-乙基L-缬氨酸酯盐酸盐一水化物。

将4g的2-[(5-甲基尿嘧啶-1-基)甲氧基]-乙基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯、500mg在碳上的5％钯、100ml甲醇、100mlTHF和10ml的0.5M含水HCI溶液的混合物在5atm的H₂下振摇4小时。将反应混合物过滤并浓缩和干燥滤液，以得到标题的化合物，为白色固体。从含水乙醇(1:3)结晶固体，得到1.92g(62％)2-[(5-甲基尿嘧啶-1-基)甲氧基]-乙基L-缬氨酸酯盐酸盐一水化物，为白色粉末。

NMR(500MHz，DMSO-d6)δ，0.96(d，3H)，1.02(d，3H)，1.79(s，3H)，2.21(m，1H)，3.22(m，3H)，4.25-4.34(m，2H)，5.09(s，2H)，7.52(s，1H)，8.68(brs，3H)，11.23(s，1H).

(h)SN2的缬氨酸酯(VSN 2)的合成

2-[(腺嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯。

将4g的9-[(2-羟乙氧基)甲基]-腺嘌呤和200ml无水二甲基甲酰胺的混合物加热到60℃，得到溶液。将5g的N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸、500mg的4-二甲基氨基吡啶和5g的二环己基碳二亚胺添加到该热溶液中。使产物溶液冷却至室温并搅拌16小时。向反应混合物中再次补充另一份N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸、4-二甲基氨基吡啶和二环己基碳二亚胺，并在室温下搅拌24小时。过滤该混悬液，在减压下浓缩无色滤液，并将残留物溶于二氯甲烷并通过快速色谱法，在硅胶上纯化，用二氯甲烷洗脱以获得2-[(腺嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基氮-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯，为6.7g(79％)的白色固态。

2-[(腺嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基L-缬氨酸酯盐酸盐一水化物。

将5g的2-[(腺嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基N-[(苄氧基)羰基]-L-缬氨酸酯、700mg在碳上的5％钯、130ml甲醇、130mlTHF和20ml的0.5M含水HCI溶液的混合物在5atm的H₂下振摇8小时。将反应混合物过滤并浓缩和干燥滤液，以得到标题的化合物，为白色固体。从乙醇中结晶固体，得到2.24g(58％)2-[(腺嘌呤-9-基)甲氧基]-乙基L-缬氨酸酯盐酸盐一水化物，为白色粉末。

NMR(500MHz，DMSO-d₆)δ，0.91(d，3H)，0.95(d，3H)，2.18(m，1H)，3.68(s，2H)，3.81(br.s，2H)，4.26(m，2H)，5.72(s，2H)，8.55(s，1H)，8.71-8.77(m，3H)，9.03(br.s，1H)，9.68(br.s，1H).

实施例10.涉及SN化合物的生物分析

(a)细胞毒性分析：使用本领域熟知的药理学模型，即MTT-微孔板四唑细胞毒性分析，来确定本发明化合物的细胞毒性作用。特别地，使用在Mosmann，1983，Rapid colorimetric assay for cellulargrowth and survival：application to proliferation andcytotoxicity assays，JImmunol Methods，65：55-63描述的MTT分析步骤来进行细胞毒性分析。简要地说，通过使用以在200mL的生长培养基中10⁴个MDCK(ATCC)细胞/孔放置的96-孔微孔板，来进行该分析。

为了测定IC₅₀，将细胞连续两天暴露给不同浓度的SN1，SN2，SN3，SN4和SN1的缬氨酸酯。在第二天结束时进行MTT分析。每个分析都使用不含有任意药物的对照来进行。所有分析都在3个重复的孔中进行至少2次。

如下计算IC₅₀细胞毒剂量(微克/毫升)：

SN1-750

SN2-750

SN3->1000

SN4->1000

VSN1->1000.

(b)体外分析

在端粒末端转移酶阳性癌细胞中对端粒缩短、G2停滞和细胞调亡的诱导按如下方式进行。

使用端粒末端转移酶阳性(HeLa)和端粒末端转移酶阴性(U-2OS)两种细胞系。进行合适的分析，以检测和证实在这些细胞中的端粒末端转移酶/L1RT特异活性。

用治疗浓度的SN1(1.5μM)或SN2(1.5μM)处理所述细胞系，以证明在该细胞内的端粒DNA合成被抑制，并从而诱导端粒缩短。通过流式细胞计用端粒特异肽核酸(PNA)探针来测量在SN1或SN2处理和未处理的细胞系中的端粒长度。为确定细胞周期分布，细胞用碘化丙啶(PI)染色。在治疗14天后，Hela细胞显示了端粒缩短、大量的细胞凋亡和G2停滞(图7A)，而细胞(U-2OS)没有(图7B)。

为表明在细胞周期分布中的改变，对HeLa和U-2OS细胞分别用SN1和SN2处理14天，用PI染色，并同时通过流式细胞计来分析。结果展示了细胞周期的G2停滞。

这个研究中使用的U-2OS(骨肉瘤)和HeLa(子宫颈)细胞系是获得自美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(Rockville，MD)。将细胞培养在补充有10％胎牛血清的D-MEM培养基，在37℃的5％CO₂的湿润空气中。对于用SN1或SN2的细胞治疗，向培养基中补充1.5μM的SN1或SN2。

实时TRAP分析按所述的进行(Wege et al.，SYBR Greenreal-time telomeric repeat amplification protocol for the rapidquantification of telomerase activity.Nucleic Acids 

2003；31(2)：E3-3)。

对于通过流式细胞计的端粒长度测量，将细胞用缀合结合的(C₃TA₂)₃PNA探针的端粒特异的FITC(Applied Biosystems)染色，并用0.06μg/ml PI反相染色，如(Rufer，N.，Dragowska，W.，Thornbury G.，Roosnek，E.，Lansdorp P.M.Telome relengthdynamics in human lymphocyte subpopulations were measured byflow cytometry.Nat.Biotechnol.16，743-747(1998))所述。

因此，本文已经证明，核苷类似物SN1和SN2导致端粒末端转移酶阳性细胞中的端粒长度降低。然而，有益的抑制化合物不以任何方式限制到上述具体举例说明的化合物或核苷酸类似物和衍生物。事实上，可以证明，按照本发明设计和合成的最有益药理化合物是第二代衍生物或进一步化学修饰的无环核苷类似物。

(c)体内分析：

使用与AZT和ddI组合的分子式(I)或(II)的化合物的体内分析按如下方式进行：

小鼠肝癌MH22A购买自细胞学研究所的组织培养物保藏中心(thetissue culture collection of the Institute of Cytology)(RussianAcademy of Medical Science，Petersburg，Russia)。冷冻细胞解冻，转移至补充有10％胎牛血清的培养基MEM中。将细胞培养在37℃的5％CO₂的湿润空气中。为确定MH22A细胞的端粒末端转移酶状态，如上所述在实时TRAP分析中使用Hela细胞作为阳性对照分析这些细胞。结果清楚地显示MH22A细胞是端粒末端转移酶阳性的。

八个星期大的雄性C3HA自交小鼠(免疫活性小鼠)购买自Laboratory Animals Breading Facility of Russian Academy ofMedical Science(Rappalovo，Leningrad region)。将大约2 x 10⁵个的MH22a细胞皮下注射到80只小鼠的背侧。在注射两星期后，选择66只显示了活跃生长肿瘤(直径2mm至1cm)的小鼠，并随机分为不同的实验组，如下所述：

对照组-18只小鼠

SN-1(0.5mg/ml)+AZT(0.05mg/ml)+ddI(0.033mg/ml)-10只小鼠

SN-2(0.5mg/ml)+AZT(0.05mg/ml)+ddI(0.033mg/ml)-10只小鼠

(0.083mg/ml)+AZT(0.05mg/ml)+ddI(0.033mg/ml)-20小鼠

(由GlaxoSmithKline制造)是阿昔洛韦的前体药物，所述阿昔洛韦是无环核苷类似物。去羟肌苷(ddI)和AZT是非无环核苷类似物。将所述药物以如上所述浓度的药物在饮用水中施用至小鼠。饮用水或所述药物溶液的消耗量是大约4ml每小鼠每日。在所有的组中，除+AZT+DDI组的小鼠之外，小鼠都死于进行性的肿瘤(直径2.0cm-2.5cm)。在20只小鼠的这个组中，仅5只产生了尺寸上与对照组可比的肿瘤，7只没有肿瘤，8只有最大仅为1cm的小肿瘤。这个组也有部分小鼠在治疗过程中死亡。部分死亡率可以归因于免疫反应，因为用于实验的小鼠是具有免疫能力的。在用核苷类似物的不同联合治疗后5星期内记录以下结果。

对照组：对照组没有接受核苷类似物。因此，所有的小鼠都死亡了，在死亡的时候，肿瘤直径为3.0cm-3.5cm。

SN-1+AZT+ddI：共有5只小鼠存活，其中3只没有肿瘤。其余两只小鼠中的肿瘤分别是0.7cm和3.5cm。

SN-2+AZT+ddI：共有7只小鼠存活，其中2只没有肿瘤。四只小鼠中肿瘤直径是3.0cm至3.5cm，而在剩余的一只小鼠中的肿瘤直径是1.0cm。

+AZT+ddI：共有5只小鼠存活，其中3只没有肿瘤。其余两只小鼠中的肿瘤分别是1.0cm和0.5cm。在这个组中，共15只小鼠死亡，其中5只死于肿瘤生长，其余10只小鼠死亡时有小肿瘤或无肿瘤。

使用分子式(I)至(IV)的化合物以及分子式I和II的缬氨酸酯分别在具有其他核苷类似物的三鸡尾酒中，和与AZT和ddI组合治疗肿瘤的体内分析按如下方式进行

8-10个星期大的雄性C3HA自交小鼠(免疫活性小鼠)购买自Laboratory Animals Breading Facility of Russian Academy ofMedical Science(Rappalovo，Leningrad region)。将3 x 10⁵个MH22a细胞皮下注射到200只小鼠的背侧。注射10天后，选择具有发展的肿瘤(14.15mm³)的小鼠(使用公式π/6 DmaxDmin²计算肿瘤体积)，并随机分为不同的实验组，如下所述：

鸡尾酒1-伐昔洛韦(0.166mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-40只小鼠；

鸡尾酒2-SN-1(1mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-10只小鼠；

鸡尾酒3-SN-3(1mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-10只小鼠；

鸡尾酒4-SN-4(1mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-10只小鼠；

鸡尾酒5-缬氨酸-SN-1(0.166mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-20只小鼠；和

鸡尾酒6-缬氨酸-SN-2(0.166mg/ml)+AZT(0.1mg/ml)+ddI(0.066mg/ml)-20只小鼠；和对照组-在饮用水中的卡培他滨

(1mg/ml)-8只小鼠。

伐昔洛韦(由G1axoSmithKline制造的

)是阿昔洛韦的前体药物，所述阿昔洛韦是无环核苷类似物。去羟肌苷(ddI)和AZT是非无环核苷类似物。将所述药物以如上所述浓度在饮用水中施用至小鼠。在鸡尾酒治疗后两星期，将

(1mg/ml)添加到各个鸡尾酒中，并继续剩余的试验期。在对照组中，小鼠仅用在饮用水中的

(1mg/ml)治疗，并且这种治疗的开始时间与在鸡尾酒组中治疗的时间相同。饮用水或所述药物溶液的消耗量是平均2.5ml每小鼠每日。在用所述药物的治疗开始后连续四个星期，每星期计算在每个被注射的小鼠中的肿瘤体积(mm³)，使用公式π/6DmaxDmin²。在所有的实验组中，除用SN4组合的组之外，小鼠都死于进行性的肿瘤。

记录在用如上所述的鸡尾酒1-6和治疗后4星期内的结果。

实施例10，表1.体内治疗的效力

实施例10，表2.在用实施例10表1中指明的各种药物治疗后在试验期结束时小鼠内的肿瘤体积形态。仅来自实施例10表1中的具有肿瘤的小鼠的测量数据被归入了本表格。

在说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请显示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物、专利和专利申请都通过参考引入本文，如同各个单独的出版物或专利申请被特定地和分别地指明通过参考引入本文一样。

前述说明书教导了本发明的原理，与优选实施方式的描述一起，并且与用于示例说明的实施例一起，使本领域技术人员能够制造和使用本发明。对这些具体实施方式的各种改良对本领域技术人员是显而易见的，并且在本文中定义的一般原理可以应用到其他具体实施方式而不需要使用创造性能力。因此，不旨在将本发明限制到本文显示的具体实施方式，而符合按照本文公开的原理和新技术特征以及下文权利要求及其等效的最宽范围。

Claims (75)

1、一种治疗的方法，包括施用基础治疗。

2、如权利要求1所述的方法，其中所述的治疗是患者中癌症的治疗。

3、如权利要求2所述的方法，其中所述患者是人。

4、如权利要求3所述的方法，其中所述的基础治疗包括施用在药学上可接受载体中的治疗有效量的三鸡尾酒。

5、如权利要求4所述的方法，其中所述三鸡尾酒包括无环核苷类似物。

6、如权利要求5所述的方法，其中所述无环核苷类似物是阿昔洛韦或其前体药物。

7、如权利要求5所述的方法，其中所述无环核苷类似物是更昔洛韦或其前体药物。

8、如权利要求5所述的方法，其中所述无环核苷类似物是喷昔洛韦或其前体药物。

9、如权利要求4所述的方法，其中所述三鸡尾酒包括叠氮基-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)。

10、如权利要求4所述的方法，其中所述三鸡尾酒包括2’，3’-双去氧肌苷(ddI)。

11、如权利要求4所述的方法，其中所述三鸡尾酒是全身性施用的。

12、如权利要求4所述的方法，其中所述三鸡尾酒是局部施用的。

13、如权利要求1所述的方法，其还包括与另一种抗增殖治疗组合施用基础治疗。

14、如权利要求13所述的方法，其中所述另一种抗增殖治疗是DNA损害治疗。

15、如权利要求14所述的方法，其中所述DNA损害治疗是遗传毒性化学治疗、放射治疗和光动力学治疗中的至少一种。

16、如权利要求15所述的方法，其中所述遗传毒性化学治疗包括施用为治疗癌症开发的抗癌剂，其中抗癌剂选自环磷酰胺、卡培他滨、紫杉醇、顺铂、卡铂、喜树碱和多柔比星。

17、如权利要求13所述的方法，其中所述基础治疗与用于移除异常增殖细胞团块的手术组合施用。

18、如权利要求13所述的方法，其中将所述基础治疗施用到已经接受了移除异常增殖细胞团块手术的患者。

19、如权利要求13所述的方法，其中所述癌为实体瘤。

20、如权利要求19所述的方法，其中所述肿瘤选自胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌和黑素瘤。

21、一种使哺乳动物对另一种抗癌治疗或另一种抗增殖治疗敏感的方法，包括施用在药学可接受载体中的致敏有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒。

22、如权利要求21所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

23、如权利要求21所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗或另一种抗增殖治疗是选自遗传毒性化学治疗、放射治疗和光动力学治疗中的一种或多种。

24、如权利要求23所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗包括放射治疗。

25、如权利要求24所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗是放射治疗。

26、如权利要求23所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗是施用5-氟尿嘧啶(5-FU)、环磷酰胺、顺铂、奥沙利铂、卡培他滨、白消安、卡铂、亚硝脲氮芥、苯丁酸氮芥、多柔比星、柔红霉素、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、替莫唑胺、异环磷酰胺、洛莫司汀、达卡巴嗪、氮芥、苯丙氨酸氮芥、丝裂霉素C、米托蒽醌、依立替康和托泊替康中的一个或多个。

27、如权利要求26所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗是施用环磷酰胺、卡铂或卡培他滨。

28、如权利要求27所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗是施用环磷酰胺、卡铂或卡培他滨作为单一治疗。

29、如权利要求28所述的方法，其中环磷酰胺、卡铂或卡培他滨的服药是以大约1-5星期的间隔。

30、如权利要求29所述的方法，其中所述的服药是以大约2、3或4星期的间隔。

31、一种在哺乳动物中改善另一种抗癌治疗或另一种抗增殖治疗的副作用的方法，包括在一段时期内施用在药学上可接受载体中的致敏有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒，期间停止所述的另一种治疗足够使哺乳动物恢复或矫正副作用的时间。

32、如权利要求31所述的方法，其中所述另一种抗癌治疗或另一种抗增殖治疗是以所述另一种治疗的初始剂量的大约10-75％重新开始。

33、如权利要求32所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

34、一种治疗癌症的方法，包括向患者施用基础治疗，其中所述治疗包括施用与另一种抗增殖治疗组合的治疗有效量的三鸡尾酒。

35、一种用于治疗具有以异常哺乳动物细胞增殖为特征的病况的患者的方法，包括：向需要这种治疗的患者施用抑制所述增殖有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒，并且其中所述病况的特征还在于与正常细胞相比，异常增殖细胞在连续的细胞分裂中显示出端粒维持。

36、一种在需要这种治疗的哺乳动物的细胞内抑制一种或多种反转录酶的方法，包括向哺乳动物施用在药学可接受载体中的有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒。

37、一种在由此需要的哺乳动物内诱导肿瘤细胞凋亡的方法，包括：向哺乳动物施用在药学可接受载体中的治疗有效量的双鸡尾酒或三鸡尾酒。

38、如权利要求37所述的方法，其中所述双或三鸡尾酒包括无环核苷类似物和叠氮基-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)。

39、如权利要求37所述的方法，其中所述三鸡尾酒还包括2’，3’-双去氧肌苷(ddI)。

40、一种用于在癌细胞内诱导细胞凋亡的方法，包括将肿瘤细胞与在药学上可接受载体中的三鸡尾酒相接触，以便产生对细胞凋亡的诱导。

41、如权利要求40所述的方法，其中所述三鸡尾酒包括无环核苷类似物和叠氮基-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)。

42、如权利要求40所述的方法，其中所述三鸡尾酒包括2’，3’-双去氧肌苷(ddI)。

43、一种化合物的组合，包括有效量的

第一核苷类似物或其前体药物，其是端粒末端转移酶反转录酶(TERT)抑制剂，

第二核苷类似物或其前体药物，其是Line-1逆转录转座子编码的反转录酶(L1RT)抑制剂，和备选地

第三核苷类似物，其是反转录酶(RT)抑制剂，所述RT是非TERT和非L1RT的，其中所述第二核苷类似物或其前体药物与所述第一核苷类似物或其前体药物不相同，其中所述第三核苷类似物或其前体药物与所述第一和第二核苷类似物或其前体药物不相同。

44、如权利要求43所述的组合，其中所述第一、第二和第三核苷类似物或其相应前体药物是三个独立药学组合物的形式或单一药物组合物的形式。

45、如权利要求44所述的组合，其中所述第一核苷类似物是无环核苷类似物或其前体药物，其中所述第二核苷类似物是无环核苷类似物或其前体药物或叠氮基-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)或AZT的前体药物，其中所述第三核苷类似物是2’，3’-双去氧肌苷(ddI)。

46、一种治疗患有癌症的人类患者的方法，包括向人类患者施用如权利要求45所述的组合。

47、如权利要求46所述的方法，其中所述第一核苷是阿昔洛韦或阿昔洛韦的前体药物或更昔洛韦的前体药物而所述第二核苷类似物是AZT。

48、如权利要求47所述的方法，其中所施用的组合是双鸡尾酒或三鸡尾酒。

49、如权利要求48所述的方法，还包括施用与遗传毒性化学治疗组合的双鸡尾酒或三鸡尾酒。

50、如权利要求49所述的方法，其中所述遗传毒性化学治疗包括施用为治疗癌症开发的抗癌剂，其中所述抗癌剂选自环磷酰胺、卡培他滨或卡铂。

51、如权利要求50所述的方法，其中所述抗癌剂的服药是以大约1-5星期的间隔。

52、如权利要求51所述的方法，其中所述的服药是以大约2、3或4星期的间隔。

53、如权利要求52所述的方法，其中所述肿瘤选自胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌和黑素瘤。

54、一种医药学鸡尾酒，包括在药学上可接受载体中的组合的治疗有效量的

无环核苷类似物或其前体药物；

叠氮基-2’，3’-二脱氧胸腺嘧啶核苷(AZT)；和

2’，3’-双去氧肌苷(ddI)。

55、一种选自分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)和(VI)的分子式或其生理上可接受的盐、光学异构体或前体药物的胸腺嘧啶或腺嘌呤衍生物。

56、如权利要求55所述的衍生物，其是1-(2-羟基乙氧基甲基)胸腺嘧啶。

57、如权利要求55所述的衍生物，其是9-(2-羟基乙氧基甲基)腺嘌呤。

58、如权利要求55、56或57任一项所述的衍生物，为其光学异构体的形式。

59、如权利要求55、56或57任一项所述的衍生物，为其生理上可接受盐的形式。

60、如权利要求59所述的衍生物，为其钠盐或盐酸盐的形式。

61、一种药物制剂，包括作为活性成分的分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其生理上可接受的盐或光学异构体；连同药学上可接受的载体。

62、如权利要求61所述的药物制剂，经设计为用于全身性施用。

63、如权利要求62所述的药物制剂，经设计为用于局部施用。

64、一种用于治疗在需要治疗的动物或人宿主中癌症的方法，包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含作为活性成分的分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，或其生理上可接受的盐或光学异构体；连同在药学上可接受载体中的AZT和去羟肌苷。

65、如权利要求64所述的方法，包括施用治疗有效量的分子式I或其生理上可接受的盐。

66、如权利要求64所述的方法，包括施用治疗有效量的分子式II或其生理上可接受的盐。

67、如权利要求64所述的方法，其中所述组合物包含单位剂量形式的选自AZT和去羟肌苷的至少一种其他核苷类似物。

68、如权利要求64所述的方法，还包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物除核苷类似物以外还包含抗癌剂。

69、如权利要求68所述的方法，其中所述抗癌剂选自环磷酰胺、卡培他滨、紫杉醇、顺铂、卡铂、喜树碱和多柔比星。

70、如权利要求64-69任一所述的方法，其中癌为实体瘤。

71、如权利要求70所述的方法，其中所述肿瘤选自胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、结肠癌、卵巢癌、白血病和黑素瘤。

72、一种在由此需要的哺乳动物中诱导肿瘤细胞凋亡的方法，包括：

向哺乳动物施用治疗有效量的

分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物或其生理上可接受的盐或光学异构体；备选地连同在药学上可接受的载体中的AZT和去羟肌苷；和

施用另一种抗癌核苷类似物和，备选地连同抗癌剂。

73、如权利要求72所述的方法，其中分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，和另一种抗癌核苷类似物和抗癌剂是作为鸡尾酒的形式来施用的。

74、如权利要求72所述的方法，其中分子式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)或(VI)的化合物，和另一种抗癌核苷类似物和抗癌剂是作为独立单位剂量形式来施用的。

75、如权利要求72-74任一项所述的方法，其中所述抗癌剂选自环磷酰胺、卡培他滨、紫杉醇、顺铂、卡铂、喜树碱和多柔比星。