CN110290794A - 5-卤代尿嘧啶修饰的微rna及其在癌症治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供掺入一个或多个卤代尿嘧啶分子的核酸组合物。更具体地，本公开内容揭示用5‑卤代尿嘧啶取代微RNA核苷酸序列内的尿嘧啶核苷酸增加微RNA抑制癌症进展和肿瘤发生的能力。因此，本公开内容提供在其核酸序列中掺入5‑卤代尿嘧啶分子的各种核酸(例如，微RNA)组合物和其使用方法。本公开内容进一步提供包含所述修饰的核酸组合物的药物组合物(例如，制剂)和用于治疗癌症例如结肠直肠癌、胰腺癌和肺癌的方法。

Description

5-卤代尿嘧啶修饰的微RNA及其在癌症治疗中的用途
与相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年2月28日提交的美国临时申请号62/464,491、于2016年11月15日提交的美国临时申请号62/422,298和于2016年11月1日提交的美国临时申请号62/415,740的优先权，所述临时申请的全部内容通过引用结合到本文中。
政府支持
本公开内容在政府支持下在国立卫生研究院授予的基金号HL127522和CA19709802下进行。政府在本公开内容中具有一定的权利。
序列表通过引用的结合
ASCII文本文件中的序列表命名为R8859_PCT_SequenceListing.txt，7 KB，创建于2017年10月30日，并经由EFS-Web提交给美国专利与商标局，其通过引用结合到本文中。
本公开内容的领域
本公开内容一般地涉及用于治疗癌症的组合物和方法，更具体地，涉及其中将单独或与5-氟尿嘧啶相结合的修饰的微RNA用于治疗癌症，特别是结肠直肠癌、肺癌或胰腺癌的方法。
背景
微RNA (miRNA, miR)为一类高度保守的非编码小RNA分子，通过负调节它们的靶基因的表达并因此导致翻译停滞、mRNA切割或其组合在细胞或生物体中介导翻译。参见BartelDP. Cell. (2009) 136(2):215-33。通过靶向多个转录物，miRNA调节广泛的生物过程，包括凋亡、分化和细胞增殖，因此异常的微RNA功能可导致癌症(参见Ambros V. Nature.(2004) 431(7006):350-5)并且因此，miRNA最近已经被鉴定为生物标志、癌基因或肿瘤抑制基因。参见，例如，Croce, CM, Nat Rev Genet. (2009) 10:704-714。
在美国结肠直肠癌(CRC)是第三最常见的恶性肿瘤和第二最常见的癌症相关死因。参见，Hegde SR, 等人, Expert review of gastroenterology & hepatology.(2008) 2(1):135-49。存在许多用于治疗癌症的化疗剂；然而嘧啶拮抗剂，例如基于氟嘧啶的化疗剂(例如，5-氟尿嘧啶，S-1)为用于治疗结肠直肠癌的金标准。嘧啶拮抗剂阻断包含嘧啶的核苷酸(DNA中的胞嘧啶和胸腺嘧啶；RNA中的胞嘧啶和尿嘧啶)的合成。由于当与内源核苷酸相比时嘧啶拮抗剂具有相似的结构，其与天然嘧啶竞争以抑制复制过程中牵涉的关键酶活，导致阻止DNA和/或RNA合成和抑制细胞分裂。
胰腺癌为非常难以治疗的致死癌症。参见Siegel, RL等人CA Cancer J. Clin.(2015) 65: 5-29。胰腺癌的独特方面包括非常低的小于7%的5年存活率(同上)、晚期症状、早期转移和对化疗和放射响应差。参见Maitra A和Hruban RH, Annu Rev. Pathol.(2008) 3:157-188。目前基于吉西他滨的化疗(2',2'-二氟2'脱氧胞苷)为用于治疗胰腺癌的金标准，然而由于耐药性，治疗干预的效果有限。Oettle, H等人 JAMA (2013) 310:1473-1481。
5-氟尿嘧啶(即，5-FU，或更具体地，5-氟-1H-嘧啶-2,4-二酮)为众所周知的嘧啶拮抗剂，用在许多辅助的化疗药物例如Carac®乳膏、Efudex®、Fluoroplex®和Adrucil®中。已经充分确证5-FU靶向关键酶胸苷酸合酶(TYMS或TS)，其催化脱氧尿苷一磷酸(dUMP)甲基化为脱氧胸苷一磷酸(dTMP) (DNA生物合成中的必要步骤)。Danenberg P. V.,Biochim. Biophys. Acta. (1977) 473(2):73-92。然而，尽管基于5-FU的治疗的稳定改善，由于耐药性的发展，患者对基于5-FU的化疗的响应率仍为适度。Longley D. B,等人,Apoptosis, Cell Signaling, and Human Diseases, (2007)第263-78页。
然而，现有的癌症疗法仍在它们的初期，许多障碍仍待改善或克服。例如，众所周知，尽管5-FU在治疗各种癌症中相当有效，5-FU具有实质上的毒性并且可引发宿主的有害副作用。关于miRNA，已知这些化合物在给予时易受酶降解，这导致差稳定性。此外，已知肿瘤细胞通过发展对常见治疗剂例如5-FU和吉西他滨的抗性规避凋亡途径。参见GottesmanM. M.等人, Nature Reviews Cancer, (2002) 2(1):48-58。因此，更有效、稳定和较低毒性的用于治疗癌症的药物将会有显著益处。
本公开内容的概述
本公开内容证明掺入5-卤代尿嘧啶碱基的核酸组合物(即，微RNA)作为抗癌剂具有非凡的功效。此外，本文的数据显示使细胞与本公开内容的修饰的微RNA组合物接触调节细胞周期进展和通过例如减少癌细胞增殖和增加化疗剂的功效减少肿瘤发生。本公开内容基于微RNA的核苷酸序列内掺入5-卤代尿嘧啶碱基相对于单独的癌症治疗剂和/或天然微RNA增加微RNA作为抗癌治疗剂的功效这一发现。
因此，在本公开内容的一个方面描述了包含修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物，所述修饰的微RNA核苷酸序列具有至少一个被5-卤代尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶(5-FU)取代的尿嘧啶碱基(U，U碱基)。在某些实施方案中，修饰的微RNA具有超过一个或恰好一个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶。在一些实施方案中，修饰的微RNA核苷酸序列包含2、3、4、5、6、7、8或更多个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶碱基。在其它实施方案中，修饰的mRNA的所有尿嘧啶核苷酸碱基已被5-卤代尿嘧啶取代。
在一些实施方案中，5-卤代尿嘧啶为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体的实施方案中，5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
在某些实施方案中，修饰的微RNA核苷酸序列包含超过一个5-卤代尿嘧啶，其中5-卤代尿嘧啶各自相同。在其它实施方案中，修饰的微RNA核苷酸序列包含超过一个5-卤代尿嘧啶，其中5-卤代尿嘧啶各自不同。在其它实施方案中，修饰的微RNA核苷酸序列包含超过2个5-卤代尿嘧啶，其中修饰的微RNA核苷酸序列包含不同5-卤代尿嘧啶的组合。
在本公开内容的示例性实施方案中，提供包含miR-129核苷酸序列的核酸组合物，所述miR-129核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个尿嘧啶核苷酸碱基而修饰。更具体地，所述核酸组合物包含至少下列天然miR-129核苷酸序列：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC [SEQ ID NO. 1]，其中所示核酸序列中的或可共价附加到所示序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或所有尿嘧啶碱基被5-卤代尿嘧啶取代。
在本公开内容的具体实施方案中，修饰的微RNA具有由CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 4]组成的核酸序列，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在其它实施方案中，天然miR-129核苷酸序列的种子部分GUUUUUGC保持未修饰(即不包含5-卤代尿嘧啶)，而修饰miR-129核苷酸序列的其余部分中的一个或多个(或所有)其余尿嘧啶核苷酸碱基被同等数目的5-卤代尿嘧啶取代。在具体的实施方案中，本公开内容的修饰miR-129微RNA具有由CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 5]组成的核酸序列，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在一些实施方案中，5-卤代尿嘧啶为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体的实施方案中，5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
在本公开内容的另一个实施方案中，提供包含已经通过用5-卤代尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶(5-FU)取代至少一个尿嘧啶核苷酸碱基修饰的miR-15a核苷酸序列的核酸组合物。具体地，所述核酸组合物包含至少下列天然miR-15a核苷酸序列：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG[SEQ ID NO. 2]，其中所示序列中的或可共价附加到所示序列的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或所有尿嘧啶核苷酸碱基为5-卤代尿嘧啶。
在本公开内容的具体实施方案中，修饰的miR-15a微RNA具有由UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO. 6]组成的核酸序列，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在其它实施方案中，天然miR-15a核苷酸序列的种子部分UAGCAGCA未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-15a核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余尿嘧啶碱基被5-卤代尿嘧啶取代。
在具体的实施方案中，修饰的miR-129微RNA具有由UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG[SEQ ID NO. 7]组成的核酸序列，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含经修饰的miR-140核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，天然miR-140核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
在一组实施方案中，天然miR-140核酸序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，天然miR-140核苷酸序列中的精确地或至少2个U碱基被5-卤代尿嘧啶取代。在另一组实施方案中，miR-140核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，天然miR-140核苷酸序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在一些实施方案中，miR-140核苷酸序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在又其它的实施方案中，miR-140核苷酸序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-140核苷酸序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，均为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的修饰的微RNA核酸组合物具有核苷酸序列CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个尿嘧啶碱基修饰的修饰的天然miR-192或miR-215核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，修饰的miR-192核苷酸序列通过用5-氟尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
在另一组实施方案中，修饰的miR-192核苷酸序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，修饰的miR-192核苷酸序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，修饰的miR-192核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-192或miR-215核苷酸序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，修饰的miR-192或miR-215序列中的所有U碱基，无论在核酸的天然部分中的和/或附加部分中的，均为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-192或修饰的miR-215核苷酸序列CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO. 11]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经通过用5-卤代尿嘧啶取代尿嘧啶修饰的修饰的天然miR-502核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，修饰的miR-502核苷酸序列已经通过用5-氟尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
在另一组实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-502核苷酸序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502核苷酸序列中的精确地或至少7个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-502核苷酸序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，均为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的修饰的miR-502核酸组合物具有修饰的核苷酸序列AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ ID NO. 13]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含含有5-卤代尿嘧啶的修饰的miR-506核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
在另一组实施方案中，天然miR-506核苷酸序列中的精确地1个U碱基被5-卤代尿嘧啶取代。在第二组实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的精确地或至少7个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，修饰的miR-506核苷酸序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，均为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的miR-506核酸组合物具有修饰的微RNA核苷酸序列UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在一些实施方案中，5-卤代尿嘧啶为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体的实施方案中，5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶，或其组合。
本公开内容还涉及本文所描述的修饰的微RNA组合物的制剂或包含其组合的制剂。在某些实施方案中，制剂可包括包含上述核酸组合物和药学上可接受的载体的药物制备物。
在另一个方面，本公开内容涉及用于治疗癌症的方法，所述方法包括给予受试者有效量的一种或多种本文所述的核酸组合物。在本方法的某些实施方案中，核酸组合物包含修饰的miR-129、miR-15a、miR-192、miR-215、miR-140、miR-502或miR-506核苷酸序列，其中天然(未修饰的)核苷酸序列中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个尿嘧啶核苷酸碱基被5-卤代尿嘧啶取代。在具体的实施方案中，本方法包括给予具有癌症或癌症倾向的受试者本公开内容的核酸组合物，其中所述核酸组合物为修饰的miR-129或修饰的miR-15a核酸。在本公开内容的具体实施方案中，所给予的修饰的微RNA具有选自以下的核酸序列：CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 4]、CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ IDNO. 5]、UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO.6]、UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG[SEQ ID NO. 7]、 CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]、CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO. 11]、AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ IDNO. 13]和UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]。
在某些实施方案中，受试者为哺乳动物。在其它实施方案中，治疗的受试者为人、狗、马、猪、小鼠或大鼠。在具体的实施方案中，受试者为经诊断具有癌症或鉴定为具有发展癌症的倾向的人。在一些实施方案中，治疗的癌症可为例如结肠直肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌或宫颈癌。在某些实施方案中，本公开内容的方法治疗受试者的结肠直肠癌、胰腺癌或乳腺癌。
本文提供的数据出乎意料地显示在几个不同的癌症模型(包括结肠直肠癌、胰腺癌和肺癌)中本文所述的修饰的微RNA与已知的抗癌剂例如仅5-FU相比增加的效能。例如，本公开内容提供意外的发现，即所描述的修饰的核酸组合物比仅5-FU、miR-15a、miR-129、miR-140、miR-192、miR-215、miR-502或miR-506或比5-FU和相应的天然微RNA的组合显著更有效抑制癌症进展和肿瘤发生。
因此，本组合物和方法提供允许较低的剂量的额外益处，所述较低的剂量导致较低的毒性和较少的副作用。所描述的核酸组合物显示的进一步的明显优点为与未用卤代尿嘧啶修饰的miR-140、miR-192、miR-215、miR-502或miR-506序列相比本组合物具有显著改善的功效。因此，至少鉴于所指出的优点，本文所公开的核酸组合物代表癌症治疗的实质进步。
附图简述
图1A-1H. 示例性的本公开内容的修饰的微RNA核苷酸序列的化学表示。(A) miR-129核苷酸序列的化学表示，其中所有U碱基被卤代尿嘧啶(即UF)取代，如SEQ ID NO: 4中所示。(B) miR-129的化学表示，其中仅miR-129的非种子部分具有用卤代尿嘧啶取代的U碱基，如SEQ ID NO: 5中所示。(C) miR-15a核苷酸序列的化学表示，其中所有U碱基被卤代尿嘧啶取代，如SEQ ID NO: 6中所示。(D) miR-15a的化学表示，其中仅miR-15a的非种子部分具有用卤代尿嘧啶取代的U碱基，如SEQ ID NO: 7中所示。(E) miR-140核苷酸序列的化学表示，其中某些(3个) U碱基被卤代尿嘧啶取代，如SEQ ID NO: 9中所示。(F) miR-192核苷酸序列的化学表示，其中某些(5个) U碱基被卤代尿嘧啶取代，如 SEQ ID NO: 11中所示。(G) miR-502核苷酸序列的化学表示，其中某些(7个) U碱基被卤代尿嘧啶取代，如 SEQ IDNO: 13中所示。(H) miR-506核苷酸序列的化学表示，其中所有(即8个) U碱基被卤代尿嘧啶取代，如 SEQ ID NO: 15中所示。
图2A-C. 示例性的修饰的miR-129核酸进入癌细胞并有效减少靶蛋白表达。(A)显示与对照miRNA和未修饰的miR-129核酸相比修饰的miR-129 (所有U碱基用5-FU取代，5-FU-miR-129)的靶(E2F3)特异性和能力的图。(B) 定量实时PCR分析，其显示miR-129模拟物进入癌细胞。(C) MiR-129模拟物比仅5-FU显著更好地进入癌细胞和分解TS-FdUMP。
图3. 显示与非特异性(阴性对照，)对照和异位表达的天然miR-129 ()相比，所有U碱基被5-FU取代的示例性的修饰miR-129核酸(模拟物)()在4种不同结肠癌细胞系(HCT116、RKO、SW480和SW620)中抑制结肠癌细胞增殖的图。
图4. 5-FU和本公开内容的修饰的微RNA组合物的组合疗法有效抑制癌细胞增殖。用阴性对照(NC)、天然miR-129、5-FU、示例性的本公开内容的修饰的miR-129核酸模拟物(5-FU-miR-129)和5-FU与示例性的本公开内容的miR-129模拟物的组合(5-FU-miR-129 +5-FU)治疗的癌细胞的结肠癌细胞增殖的图示比较。
图5A-B. 示例性的微RNA模拟物诱导结肠癌细胞凋亡并导致细胞周期停滞。(A)细胞死亡通过FITC-膜联蛋白V凋亡测定定量，显示在几种不同的结肠直肠癌细胞系中本公开内容的修饰的miR-129核酸组合物以比阴性对照或异位表达的天然miR-129显著更高的水平诱导癌细胞凋亡。(B) 进行流式细胞术，显示本公开内容的修饰的miR-129核酸组合物(模拟物-1)以比阴性对照或异位表达的天然miR-129显著更高的水平增加G1细胞周期停滞。
图6. 本公开内容的修饰的微RNA核酸组合物消除耐化疗的癌干细胞。将HCT116衍生的结肠癌干细胞用逐渐增加的浓度的示例性的本公开内容的修饰的miR-129核酸()或5-FU ()处理。结果显示修饰的miR-129核酸以剂量依赖的方式杀死耐5-FU的癌干细胞。
图7. 用示例性的修饰的miR-129核酸组合物体内全身性治疗抑制结肠癌转移而无有毒的副作用。结肠癌转移小鼠模型通过尾静脉注射转移的人结肠癌细胞建立。建立转移两周后，以每隔一天一次注射的治疗频率持续两周通过静脉注射递送40 µg如SEQ IDNO: 4中所示的修饰的miR-129核酸组合物。示例性的修饰的miR-129核酸(模拟物)能够抑制结肠癌转移(右图)，而阴性对照miRNA (左图)无作用。用修饰的miR-129核酸治疗的小鼠不显示任何毒性。
图8A-B. 第二种示例性的本公开内容的修饰的微RNA的抗癌活性。(A) 比较未修饰的miR-15a (miR-15a)和修饰的miR-15a核酸组合物(模拟物-1)调节结肠癌细胞中的蛋白表达的能力的代表性蛋白质印迹。如SEQ ID NO: 6中所示的修饰的miR-15a (模拟物-1)保留调节miR-15a靶(YAP1、BMI-1、DCLK1和ECL2)的能力并分解结肠直肠癌细胞中的TS-FdUMP。(B) 与未修饰的miR-15a (miR-15a)相比，在三种不同的结肠直肠癌细胞系(HCT116, RKO, SW620)中，修饰的miR-15a (模拟物-1)显示增强的抑制结肠癌细胞增殖的能力。
图9. 显示对照(阴性)、未修饰的miR-15a (miR-15a)和如SEQ ID NO: 6中所示的示例性的修饰的miR-15a核酸组合物(模拟物-1)的细胞周期控制的图。与未修饰的miR-15a相比，给予修饰的miR-15a核酸诱导细胞周期停滞，如当与异位表达天然miR-15a和阴性对照的细胞相比时表达修饰的miR-15a的结肠直肠癌细胞显示增加的G1/S比率所显示的。
图10. 修饰的miR-15a表达减少癌干细胞诱导癌细胞集落形成的能力。在结肠癌干细胞中，当与提供非特异性对照微RNA (阴性)的癌干细胞相比时，表达未修饰的miR-15a(miR-15a)抑制癌细胞集落形成。用示例性的本公开内容的修饰的miR-15a (5-FU-miR-15a)处理完全阻止癌细胞集落形成。
图11. 修饰的miR-15a为有效的体内抗癌剂。结肠癌转移小鼠模型通过尾静脉注射转移的人结肠癌细胞建立。建立转移两周后，以每隔一天一次注射的治疗频率持续两周通过静脉注射递送40 µg如SEQ ID NO: 6中所示的修饰的miR-15a核酸组合物。示例性的修饰的miR-15a核酸(模拟物)能够抑制结肠癌转移，而阴性对照miRNA (阴性)无作用。用修饰的miR-15a核酸治疗的小鼠不显示任何毒性。
图12 A-D. 与未修饰的miR-15a (miR-15a)或未修饰的miR-129 (miR-129)或用阴性对照处理的细胞相比，示例性的本公开内容的修饰的miR-15a和miR-129模拟物显示提高的抑制人乳腺癌(A549;C,D)和胰腺癌(Panc-1(A); AsPC-1(B))细胞增殖的能力。
图13 A-B. 示例性的本公开内容的修饰的微RNA显示提高的抑制人结肠直肠癌细胞增殖的能力。在HCT116人结肠直肠癌细胞中测试另外的示例性的修饰的微RNA抑制结肠直肠癌细胞增殖的能力。(A) 将如SEQ ID NO: 9中所示的示例性的修饰的miR-140模拟物给予人结肠直肠癌细胞，当与阴性对照微RNA相比时显示增加的抑制结肠直肠癌细胞增殖的能力。(B) 将如SEQ ID NO: 11中所示的示例性的修饰的miR-192模拟物给予人结肠直肠癌细胞，当与阴性对照微RNA相比时显示增加的抑制结肠直肠癌细胞增殖的能力。
图14A-D. 示例性的本公开内容的修饰的微RNA显示提高的抑制人胰腺癌和乳腺癌细胞增殖的能力。通过检查其对癌细胞增殖的影响测试另外的示例性的修饰的微RNA抑制不同类型的人癌症的能力。将如SEQ ID NO: 13中所示的示例性的修饰的miR-502模拟物给予人胰腺癌细胞(PANC1, A)和人乳腺癌(A549, C)，当与阴性对照微RNA相比时显示增加的抑制两种类型的癌细胞增殖的能力。将又一种示例性的修饰的微RNA即如SEQ ID NO: 15中所示的miR-506模拟物给予人胰腺癌细胞(PANC1, B)和人乳腺癌(A549, D)，当与阴性对照微RNA相比时显示增加的抑制两种类型的癌细胞增殖的能力。
本公开内容的详述
本公开内容提供掺入一个或多个卤代尿嘧啶分子的核酸组合物。不受任一个具体理论限制，令人惊讶地，本公开内容揭示用5-卤代尿嘧啶取代微RNA寡核苷酸序列中的尿嘧啶核苷酸增加微RNA抑制癌症发展、进展和肿瘤发生的能力。因此，本公开内容提供在其核酸序列中掺入5-卤代尿嘧啶分子的各种核酸(例如，微RNA)组合物和使用其的方法。本公开内容进一步提供制剂，例如包含修饰的核酸组合物的药物组合物，和用于治疗癌症的方法，所述方法包括给予有需要的受试者所述制剂。
核酸组合物
术语“微RNA”或“miRNA”或“miR”可交换使用，指能够通过与信使RNA分子(mRNA)、DNA或蛋白质相互作用调节基因表达的小的非编码核糖核酸(RNA)分子。通常，微RNA由约19-28个核苷酸(碱基)的核酸序列组成，存在于哺乳动物细胞中。
术语“修饰的微RNA”、“修饰的miRNA”、“修饰的miR”或“模拟物”在本文中可交换使用，指与天然或内源微RNA(未修饰的微RNA)多核苷酸不同的微RNA。更具体地，在本公开内容中修饰的微RNA与未改变的或未修饰的微RNA核酸序列因一个或多个碱基而不同。在本公开内容的一些实施方案中，本公开内容的修饰的微RNA包含至少一个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶(U)核苷酸碱基。在其它实施方案中修饰的微RNA包含额外的核苷酸(即，腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和鸟嘌呤(G))和至少一个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶碱基。
在本公开内容的一个方面，描述了包含具有至少一个被5-卤代尿嘧啶例如5-氟尿嘧啶(5-FU)取代的尿嘧啶碱基(U，U碱基)的修饰的微RNA核苷酸序列的核酸组合物。如本文所进一步讨论的，本公开内容的核酸组合物可至少用于治疗癌症，特别是结肠直肠癌、胰腺癌和乳腺癌。
在一些实施方案中，核酸组合物包含已经通过用提供与卤素原子相似效果的基团在5-位衍生至少一个尿嘧啶核碱基修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供相似效果的基团在重量或空间尺寸上具有与卤素原子相似的尺寸，例如，至多或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80 g/mol的分子量。在某些实施方案中，提供与卤素原子相似的效果的基团可为例如甲基、三卤代甲基(例如，三氟甲基)、拟卤化物(例如，三氟甲磺酸根、氰基或氰酸根)或氘(D)原子。提供与卤素原子相似的效果的基团可在微RNA核苷酸序列中在不存在5-卤代尿嘧啶碱基时或除5-卤代尿嘧啶碱基之外存在。
此外，在其它实施方案中，提供与卤素原子相似的效果的基团可位于微RNA核苷酸序列的天然(或种子)部分和/或附加部分中，这将由本领域普通技术人员容易地确定。在一些实施方案中，从修饰的miRNA核苷酸序列排除一个或多个(或所有)以上类型的提供与卤素原子相似的效果的基团。当排除所有这些替代基团时，仅一个或多个卤素原子作为微RNA核苷酸序列中一个或多个尿嘧啶基团5-位的取代基存在。
在某些实施方案中，修饰的微RNA具有超过一个，或精确地1个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶。
在一些实施方案中，修饰的微RNA核苷酸序列包含3、4、5、6、7、8或更多个被5-卤代尿嘧啶取代的尿嘧啶碱基。
在其它实施方案中，修饰的mRNA的所有尿嘧啶核苷酸碱基被5-卤代尿嘧啶取代。
在一些实施方案中，5-卤代尿嘧啶为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。在具体的实施方案中，5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
如本文所使用的术语“miR-129”意在与术语“微RNA-129”或“miRNA-129”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC [SEQ ID NO. 1]，其中理解的是，C = 胞嘧啶，U = 尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为未修饰的miR-129 (即，“天然的”)序列，除非另有说明。MiR-129在本领域中也可称为hsa-miR-129或hsa-miR-129-5p，登录号MI0000252和MIMAT0000242。MiR-129为熟知的并且已经详细研究。参见，例如，J. Wu等人, Cell Cycle, (2010) 9:9, 1809-1818。如也为本领域所熟知的，可将miR-129序列修饰以产生“miR-129模拟物”，其具有从天然序列修饰的序列，但保留天然miR-129的已知功能或活性。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-129组合物在如本文所使用的术语“miR-129模拟物”的范围内。
一个具体的感兴趣的修饰的miR-129核酸序列(模拟物)包含共价附加到miR-129天然序列的末端的两个U碱基(即两个包含U的核苷酸)，例如在CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC-UU[SEQ ID NO. 3]中。在前述序列中，两个末端U碱基使miR-129天然序列从21个核苷酸碱基继续或延伸至23个核苷酸碱基。一般地，miR-129模拟物包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-129天然序列的额外的碱基(即，作为额外的核苷酸)，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-129以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一个实施方案中，本公开内容涉及包含已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个尿嘧啶核碱基(即，U碱基)修饰的miR-129核苷酸序列的核酸组合物，即，其中miR-129序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在第一组实施方案中，miR-129序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-129序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第三组实施方案中，miR-129序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第四组实施方案中，miR-129序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第五组实施方案中，miR-129序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第六组实施方案中，miR-129序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在具体的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有如SEQ ID NO. 4中所示的修饰的微RNA核苷酸序列CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在miR-129序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-129序列的未修饰部分(如上所提供的)，或在miR-129模拟物的情况下，可位于共价附加到天然miR-129的一个或多个U碱基(也如上文所提供的)。在其它实施方案中，天然miR-129核苷酸序列的种子部分GUUUUUGC保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-129核苷酸序列的其余部分中的一个或多个(或所有)其余U碱基被同等数目的5-卤代尿嘧啶取代。
例如，在具体的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有如SEQ ID NO. 5中所示的修饰的微RNA核苷酸序列CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在备选的实施方案中，所述核酸组合物包含已经通过用提供与卤素原子相似的效果的基团在5位衍生至少一个尿嘧啶(U)核碱基修饰的miR-129核苷酸序列。在一些实施方案中，提供相似效果的基团在重量或空间尺寸上具有与卤素原子相似的尺寸，例如，至多或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80 g/mol的分子量。提供与卤素原子相似的效果的基团可为例如甲基、三卤代甲基(例如，三氟甲基)、拟卤化物(例如，三氟甲磺酸根、氰基或氰酸根)或氘(D)原子。提供与卤素原子相似的效果的基团可在miR-129核苷酸序列中在不存在5-卤代尿嘧啶碱基时或除5-卤代尿嘧啶碱基之外存在。此外，提供与卤素原子相似的效果的基团可位于miR-129核苷酸序列的天然(或种子)部分和/或附加部分中。在一些实施方案中，从miR-129核苷酸序列排除一个或多个(或所有)以上类型的提供与卤素原子相似的效果的基团。当排除所有这些替代基团时，仅一个或多个卤素原子作为miR-129核苷酸序列中一个或多个尿嘧啶基团5-位的取代基存在。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经修饰的miR-15a核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，miR-15a核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
如本文所使用的术语“miR-15a”意在与术语“微RNA-15a”或“miRNA-15a”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：UAGCAGCACAUAAUGGUUUGUG [SEQ ID NO. 2]，其中理解的是，A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，U = 尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为miR-15a未修饰的(即，“天然”)序列，除非另有说明。MiR-15a在本领域中也可称为hsa-miR-15a或hsa-miR-15a-5p，登录号MI0000069。miR-15a为熟知的并且已经详细研究，例如，Xie T,等人Clin Transl Oncol. (2015) 17(7):504-10; 和Acunzo M,和Croce CM,Clin. Chem. (2016) 62(4):655-6。如上文对于miR-129模拟物所说明的，用于创建miR-15a模拟物的方法为本领域普通技术人员所已知。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-15a形式在如本文所使用的术语“miR-15a模拟物”的范围内。
一般地，修饰的miR-15a (即，miR-15a模拟物)包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-15a天然序列的额外的核苷酸，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-15a以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一些实施方案中，miR-15a序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在一组实施方案中，miR-15a序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-15a序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-15a寡核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-15a序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在一些实施方案中，miR-15a序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在又其它的实施方案中，miR-15a序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-15a序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在一个实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的微RNA核苷酸序列UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO. 6]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在miR-15a序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-15a序列的未修饰部分(如上文所提供的)，或在miR-15a模拟物的情况下，可位于附加到天然miR-15a的一个或多个尿嘧啶碱基(也如上文所提供的)。
在其它实施方案中，天然miR-15a核苷酸序列的种子部分UAGCAGCA保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-15a核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余U碱基被5-卤代尿嘧啶取代。
在具体的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-15a核苷酸序列UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO. 7]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
在某些实施方案中，所述核酸组合物包含已经通过用提供与卤素原子相似的效果的基团在5位衍生至少一个尿嘧啶(U)核碱基修饰的miR-15a核苷酸序列。在一些实施方案中，提供相似效果的基团在重量或空间尺寸上具有与卤素原子相似的尺寸，例如，至多或小于20、30、40、50、60、70、80、90或80 g/mol的分子量。提供与卤素原子相似的效果的基团可为例如甲基、三卤代甲基(例如，三氟甲基)、拟卤化物(例如，三氟甲磺酸根、氰基或氰酸根)或氘(D)原子。提供与卤素原子相似的效果的基团可在miR-15a核苷酸序列中在不存在5-卤代尿嘧啶碱基时或除5-卤代尿嘧啶碱基之外存在。此外，提供与卤素原子相似的效果的基团可位于miR-15a核苷酸序列的天然(或种子)部分和/或附加部分中。
在一些实施方案中，从miR-15a核苷酸序列排除一个或多个(或所有)以上类型的提供与卤素原子相似的效果的基团。当排除所有这些替代基团时，仅一个或多个卤素原子作为miR-15a核苷酸序列中一个或多个尿嘧啶基团5-位的取代基存在。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经修饰的miR-140核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，miR-140核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
如本文所使用的术语“miR-140”意在与术语“微RNA-140”或“miRNA-140”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：CAGUGGUUUUACCCUAUGGUAG [SEQ ID NO. 8]，其中理解的是，A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，U = 尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为miR-140未修饰的(即，“天然”)序列，除非另有说明。MiR-140也可通过登录号NT_010498或通过miRBase登录号MI0000456提及。MiR-140为熟知的并且已经详细研究，例如，Zhai,H.等人, Oncotarget. (2015) 6: 19735-46。如上文对于示例性的模拟物miR-129和miR-15a所说明的，用于创建miR-140模拟物的方法为本领域普通技术人员所已知。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-140形式在如本文所使用的术语“miR-140模拟物”的范围内。
一般地，修饰的miR-140核酸(即，miR-140模拟物)包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-140天然序列的额外的核苷酸，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-140模拟物以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一些实施方案中，miR-140序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在一组实施方案中，miR-140模拟物序列中的精确地1个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-140序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-140寡核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-140序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在一些实施方案中，miR-140模拟物序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在又其它的实施方案中，miR-140模拟物序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-140序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-140核苷酸序列CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
miR-140模拟物序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-140序列的未修饰部分(如上文所提供的)，或可位于附加到天然miR-140序列的一个或多个尿嘧啶碱基(如上文所提供的)。
在其它实施方案中，天然miR-140核苷酸序列的种子部分保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-140核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余U碱基被5-卤代尿嘧啶取代。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经修饰的miR-192核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，miR-192核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
如本文所使用的术语“miR-192”意在与术语“微RNA-192”、“miRNA-192”、“微RNA-215”、“miR-215”或“miRNA-215”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：CUGACCUAUGAAUUGACAGCC [SEQ ID NO. 10]，其中理解的是，A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，U =尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为miR-192未修饰的(即，“天然”)序列，除非另有说明。MiR-192也可称为hsa-mir-192、has-mir-215或通过miRBase登录号MI0000234或MIMAT0000222提及。MiR-192为熟知的并且已经详细研究，例如，Song, B.等人, Clin. Cancer Res. (2008), 14: 8080-8086，和Song, B.等人, Mol. Cancer.(2010), 9:96 第1476-4598页。如上文对于示例性的模拟物miR-129、miR-140和miR-15a所说明的，用于创建miR-192模拟物的方法为本领域普通技术人员所已知。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-192核酸形式在如本文所使用的术语“miR-192模拟物”的范围内。
一般地，修饰的miR-192 (即，miR-192模拟物)包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-192天然序列的额外的核苷酸，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-192模拟物以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一些实施方案中，miR-192或miR-215序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在另一组实施方案中，miR-192模拟物序列中的精确地一个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-192序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-192寡核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-192序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-192序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-192核苷酸序列CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO. 11]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
miR-192模拟物序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-192序列的未修饰部分(如上文所提供的)，或可位于附加到天然miR-192序列的一个或多个尿嘧啶碱基(如上文所提供的)。
在其它实施方案中，天然miR-192核苷酸序列的种子部分保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-192核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余U碱基被5-卤代尿嘧啶或其组合取代。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经修饰的miR-502核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，miR-502核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
如本文所使用的术语“miR-502”意在与术语“微RNA-502”或“miRNA-502”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：AUCCUUGCUAUCUGGGUGCUA [SEQ ID NO. 12]，其中理解的是，A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，U = 尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为miR-502未修饰的(即，“天然”)序列，除非另有说明。MiR-502也可称为hsa-mir-502或通过miRBase登录号MI0003186或MIMAT0002873提及。MiR-502为熟知的并且已经详细研究，例如，Zhai, H,等人, Oncogene. (2013), 32:12 第1570-1579页。如上文对于示例性的模拟物miR-129、miR-140、miR-192和miR-15a所说明的，用于创建miR-502模拟物的方法为本领域普通技术人员所已知。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-502核酸形式在如本文所使用的术语“miR-502模拟物”的范围内。
一般地，修饰的miR-502 (即，miR-502模拟物)包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-502天然序列的额外的核苷酸，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-502模拟物以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一些实施方案中，miR-502序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例如5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在另一组实施方案中，miR-502模拟物序列中的精确地一个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-502序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-502寡核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-502序列中的精确地或至少7个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-502序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-502核苷酸序列AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ ID NO. 13]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
miR-502模拟物序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-502序列的未修饰部分(如上所提供的)，或可位于附加到天然miR-502序列的一个或多个尿嘧啶碱基(如上文所提供的)。
在其它实施方案中，天然miR-502核苷酸序列的种子部分保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-502核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余U碱基被5-卤代尿嘧啶或其组合取代。
在另一个示例性的实施方案中，本公开内容涉及包含已经修饰的miR-506核苷酸序列的核酸组合物。在一些实施方案中，miR-506核苷酸序列已经通过用5-卤代尿嘧啶取代至少一个U碱基修饰。
如本文所使用的术语“miR-506”意在与术语“微RNA-506”或“miRNA-506”同义，指具有下列核苷酸序列的寡核苷酸：UAUUCAGGAAGGUGUUACUUAA [SEQ ID NO. 14]，其中理解的是，A = 腺嘌呤，C = 胞嘧啶，U = 尿嘧啶和G = 鸟嘌呤碱基。前述核苷酸序列在本文中称为miR-506未修饰的(即，“天然”)序列，除非另有说明。MiR-506也可称为hsa-mir-506或通过miRBase登录号MI0003193或MIMAT0022701提及。MiR-506为熟知的并且已经详细研究，例如，Li, J,等人, Oncotarget. (2016), 7:38 第62778-62788页,和Li, J.等人,Oncogene. (2016) 35 第5501-5514页。如上文对于示例性的模拟物miR-129、miR-140、miR-502、miR-192和miR-15a所说明的，用于创建miR-506模拟物的方法为本领域普通技术人员所已知。除非另有说明，本文中认为所有这样修饰的miR-506核酸形式在如本文所使用的术语“miR-506模拟物”的范围内。
一般地，修饰的miR-506 (即，miR-506模拟物)包含不超过1个、2个、3个、4个或5个共价附加到miR-506天然序列的额外的核苷酸，其中额外的碱基独立地选自C、U、G和C，或额外的碱基可只为U。通常，miR-506模拟物以单链形式使用，但本文也考虑双链版本。
在一些实施方案中，miR-506序列中的至少一个U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。5-卤代尿嘧啶可为例，5-氟尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶。
在另一组实施方案中，miR-506模拟物序列中的精确地一个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在第二组实施方案中，miR-506序列中的精确地或至少2个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在另一组实施方案中，miR-506寡核苷酸序列中的精确地或至少3个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-506序列中的精确地或至少4个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-506序列中的精确地或至少5个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-506序列中的精确地或至少6个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在其它实施方案中，miR-506序列中的精确地或至少7个U碱基为5-卤代尿嘧啶。在具体的实施方案中，miR-506序列中的所有U碱基，无论天然部分中的和/或附加部分中的，为5-卤代尿嘧啶。
在示例性的实施方案中，本公开内容的核酸组合物具有修饰的miR-506核苷酸序列UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]，其中UF为卤代尿嘧啶，具体地5-氟尿嘧啶。
miR-506模拟物序列中被5-卤代尿嘧啶取代的U碱基可位于miR-506序列的未修饰部分(如上文所提供的)，或可位于附加到天然miR-506序列的一个或多个尿嘧啶碱基(如上文所提供的)。
在其它实施方案中，天然miR-506核苷酸序列的种子部分保持未用5-卤代尿嘧啶修饰，而miR-506核苷酸序列的其余部分(非种子部分)中的一个或多个(或所有)其余U碱基被5-卤代尿嘧啶或其组合取代。
如本文所描述的修饰的微RNA核酸组合物可使用任何众所周知的用于合成核酸的方法合成。在具体的实施方案中，核酸组合物通过自动化寡核苷酸合成，例如任何众所周知的使用亚磷酰胺化学的过程产生。为了在修饰的miR序列(例如，miR-15a序列、miR-140序列、miR-192序列、miR-502序列、miR-506序列或miR-129序列)中引入一个或多个5-卤代尿嘧啶碱基，可将5-卤代尿嘧啶核苷亚磷酰胺作为前体碱基连同包含待包含在核酸序列中的天然碱基(例如，A、U、G和C)的核苷的亚磷酰胺衍生物一起包含。
在一些实施方案中，本公开内容的核酸组合物可生物合成例如通过使用体外RNA转录从质粒、PCR片段或合成的DNA模板或通过使用重组(体内) RNA表达方法产生。参见，例如，C. M. Dunham等人, Nature Methods, (2007) 4(7), 第547-548页。微RNA序列(例如，miR-15a序列、miR-140序列、miR-192序列、miR-502序列、miR-506序列或miR-129序列)可例如通过用聚乙二醇(PEG)或烃或靶向剂、特别是癌细胞靶向剂例如叶酸通过本领域所熟知的技术官能化而进一步化学修饰。为了包含这样的基团，寡核苷酸序列中可首先包含可用于附加期需官能团的反应性基团(例如，氨基、醛基、巯基或羧酸酯基)。尽管这样的反应性基团或官能团可掺入如此产生的核酸序列，可通过使用其中包括包含反应性基团或反应性前体基团的非核苷亚磷酰胺的自动化寡核苷酸合成更轻易地包含反应性基团或官能团。
修饰的核酸制剂
在另一个方面，本公开内容涉及本文所描述的修饰的核酸组合物的制剂。例如，本核酸组合物可配制用于医药用途。在某些实施方案中，制剂为包含本文所描述的核酸组合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在其它实施方案中，本公开内容的制剂包含修饰的miR-129核酸、修饰的miR-15a核酸、修饰的miR-140核酸、修饰的miR-192核酸、修饰的miR-502、修饰的miR-506核酸或其组合和药学上可接受的载体。更具体地，下列核苷酸序列中所示的修饰的微RNA核酸可配制用于医药应用和用途：CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQID NO. 4]、CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 5]、UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG[SEQ ID NO.6]、UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO. 7]、CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]、CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO.11]、AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ ID NO. 13]和UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA[SEQ ID NO. 15]。
术语“药学上可接受的载体”在本文中与药学上可接受的稀释剂、溶媒或赋形剂同义使用。根据药物组合物的类型和预期的给予模式，核酸组合物可溶解或悬浮(例如作为乳剂)在药学上可接受的载体中。药学上可接受的载体可为任何在合理医学判断范围内适于用于接触受试者的组织的那些液体或固体化合物、材料、组合物和/或剂型。从其对其正被提供至的受试者无害和与制剂的其它成分相容(即不改变其生物学或化学功能)的意义上，载体应为“可接受的”。
可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；明胶；滑石；蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如乙二醇和丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和十二烷酸乙酯；琼脂；缓冲剂；水；等渗盐水；pH缓冲溶液和药物制剂中使用的其它非毒性的相容物质。药学上可接受的载体也可包括制造辅助剂(例如，润滑剂、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌或硬脂酸)、溶剂或包封材料。如果期需，也可加入某些甜味剂和/或调味剂和/或着色剂。其它合适的赋形剂可见于标准制药文本中，例如"Remington's Pharmaceutical Sciences", The Science and Practice of Pharmacy,第19版. Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1995)。
在一些实施方案中，药学上可接受的载体可包括稀释剂，其增加固体药物组合物的体积和使药物剂型更易于患者和看护者操作。用于固体组合物的稀释剂包括例如微晶纤维素(例如Avicel®)、超细纤维素、乳糖、淀粉、预胶化纤维素、碳酸钙、硫酸钙、糖、葡萄糖结合剂、糊精、右旋糖、二水合磷酸氢钙、三价磷酸钙、高岭土、碳酸镁、氧化镁、麦芽糊精、甘露醇、聚甲基丙烯酸酯(例如Eudragit®)、氯化钾、粉状纤维素、氯化钠、山梨醇和滑石。
本公开内容的核酸组合物可按照本领域已知的方法配制为组合物和剂型。在某些实施方案中，配制的组合物可专门配制用于以固体或液体形式给予，所述形式包括适合以下的那些：(1) 口服给予，例如，片剂、胶囊、粉剂、颗粒剂、施用于舌的糊剂、含水或不含水的溶液或悬浮液、浸液或糖浆；(2) 胃肠外给予，例如，作为例如无菌溶液或悬浮液通过皮下、肌内或静脉内注射进行；(3) 局部施用，例如，作为乳膏、软膏或喷雾施用于皮肤、肺或粘膜；或(4) 阴道内或直肠内，例如，作为子宫托、乳膏或泡沫；(5) 舌下或经颊；(6) 经眼；(7) 透皮或(8) 经鼻。
在一些实施方案中，本公开内容的制剂包括压实为剂型例如片剂的固体药剂，其可包括赋形剂，所述赋形剂的功能包括帮助活性成分和其它赋形剂在压缩后结合在一起。用于固体药物组合物的粘合剂包括阿拉伯胶、海藻酸、卡波姆(例如卡波普(carbopol))、羧甲基纤维素钠、糊精、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、氢化植物油、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素(例如Klucel®)、羟丙基甲基纤维素(例如Methocel®)、液体葡萄糖、硅酸镁铝、麦芽糊精、甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯、聚维酮(例如Kollidon®、Plasdone®)、预胶化淀粉、海藻酸钠和淀粉。
压实的固体药物组合物在受试者胃中的溶解速率可通过向组合物中加入崩解剂增加。崩解剂包括海藻酸、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠(例如Ac-Di-Sol®,Primellose®)、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交聚维酮(例如Kollidon®、Polyplasdone®)、瓜尔胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、微晶纤维素、波拉克林钾、粉状纤维素、预胶化淀粉、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠(例如Explotab®)和淀粉。
因此，在某些实施方案中，可向制剂中加入助流剂以改善非压实的固体剂的流动性和改善剂量的准确性。可发挥助流剂功能的赋形剂包括胶体二氧化硅、三硅酸镁、粉状纤维素、淀粉、滑石和三价磷酸钙。
当通过压实粉状组合物制造剂型例如片剂时，组合物经受来自冲压机和染料的压力。一些赋形剂和活性成分具有粘附在冲压机和染料表面的倾向，这可导致产品具有孔蚀和其它表面不规则。可向组合物中加入润滑剂以减少粘附和使产品易于从染料释放。润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、棕榈酰硬脂酸甘油酯、氢化蓖麻油、氢化植物油、矿物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、硬脂酰富马酸钠、硬脂酸、滑石和硬脂酸锌。
用于压片或胶囊充填的配制的药物组合物可通过湿法制粒制备。在湿法制粒中，混合一些或所有粉末形式的活性成分和赋形剂，然后在导致粉末团聚成颗粒的液体、通常水的存在下进一步混合。将颗粒筛选和/或碾磨、干燥，然后筛选和/或碾磨成期需的粒度。然后可将颗粒压片，或可在压片之前加入其它赋形剂，例如助流剂和/或润滑剂。压片的组合物可通过干混合常规制备。例如，可将混合的活性物质和赋形剂的组合物压实为小块或薄片，然后粉碎成压实的颗粒。压实的颗粒随后可压缩成片剂。
在其它实施方案中，作为干法制粒的备选，可使用直接压缩技术将混合的组合物直接压缩成压实的剂型。直接压缩产生无颗粒的更均一的片剂。特别良好适于直接压缩压片的赋形剂包括微晶纤维素、喷雾干燥的乳糖、二水合磷酸氢钙和胶体二氧化硅。这些和其它赋形剂在直接压缩压片中的适当使用为本领域在直接压缩压片的特殊制剂挑战中有经验和技巧的人员所已知。胶囊充填可包括关于压片所描述的任何前述共混物和颗粒；然而，其不经受最后的压片步骤。
在本公开内容的液体药物组合物中，试剂和任何其它固体赋形剂溶解或悬浮在液体载体例如水、注射用水、植物油、醇、聚乙二醇、丙二醇或甘油中。液体药物组合物可包含乳化剂以在整个组合物中均一地分散活性成分或不溶于液体载体的其它赋形剂。液体制剂可作为可注射的、肠溶的或软化剂类型的制剂使用。可用在本发明的液体组合物中的乳化剂包括例如明胶、蛋黄、酪蛋白、胆固醇、阿拉伯胶、黄芪胶、角叉菜、果胶、甲基纤维素、卡波姆、十八醇十六醇混合物和鲸蜡醇。
在一些实施方案中，本公开内容的液体药物组合物还可包含增粘剂以改善产品的口感和/或包覆胃肠道的内衬。这样的试剂包括阿拉伯胶、海藻酸、膨润土、卡波姆、羧甲基纤维素钙或钠、十八醇十六醇混合物、甲基纤维素、乙基纤维素、明胶、瓜尔胶、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚乙烯醇、聚维酮、碳酸丙烯酯、海藻酸丙二醇酯、海藻酸钠、羟基乙酸淀粉钠、淀粉、黄芪胶和黄原胶。在其它实施方案中，本公开内容的液体组合物还可包含缓冲剂，例如葡萄糖酸、乳酸、柠檬酸或乙酸、葡萄糖酸钠、乳酸钠、柠檬酸钠或乙酸钠。
可向本公开内容的某些制剂内加入甜味剂例如山梨醇、糖精、糖精钠、蔗糖、阿斯巴甜、果糖、山梨醇和转化糖以改善味道。调味剂和增味剂可使剂型更合患者的口味。可包含在本公开内容的组合物中的用于药品的常见调味剂和增味剂包括麦芽酚、香草醛、乙基香草醛、薄荷醇、柠檬酸、富马酸、乙基麦芽酚和酒石酸。
可以以摄入安全的水平添加防腐剂和螯合剂，例如醇、苯甲酸钠、丁基化羟基甲苯、丁基化羟基苯甲醚和乙二胺四乙酸，以改善储存稳定性。固体和液体组合物也可使用任何药学上可接受的着色剂染色以改善其外观和/或便于患者识别产品和单位剂量水平。
本公开内容的剂量制剂可为在硬壳或软壳内包含组合物、例如本公开内容的粉状或颗粒状的固体组合物的胶囊。壳可由明胶制成，任选包含增塑剂例如甘油和山梨醇，和遮光剂或着色剂。
用于治疗癌症的方法
如上所述，与天然微RNA和/或已知的癌症疗法(化疗)例如5-FU所显示的相比，本公开内容的修饰的微RNA核酸组合物及其制剂显示料想不到的和异常的抗癌活性。因此，本公开内容的另一个方面提供用于通过给予哺乳动物有效量的一种或多种本公开内容的修饰的微RNA核酸组合物或其制剂治疗哺乳动物中的癌症的方法。
如图2A和8A中所显示的，示例性的本公开内容的修饰的微RNA核酸，即修饰的miR-15a和修饰的miR-129抑制受试者的癌细胞中的BCL2表达和活性，这导致增加的可用的促凋亡蛋白的量，其最终导致增加的癌细胞死亡。例如，miR-129通过直接靶向BCL2以及通过影响其它关键的细胞死亡相关蛋白调节凋亡。进一步地，图2A显示miR-129减少E2F3 (调节细胞周期进展和减少胸苷酸合酶(TS)蛋白水平的表达或活性的转录因子蛋白)的表达和因此活性，这导致增加的细胞增殖和增加的化疗剂的功效。
其它示例性的微RNA例如修饰的miR-506、miR-140、miR-192和miR-502也调节癌细胞增殖和癌细胞凋亡，如图13A-B和图14A-D中所显示的。
事实上，图7和11显示用两种示例性的本公开内容的修饰的微RNA (例如，修饰的miR-129和修饰的miR-15a)进行的静脉内治疗通过抑制肿瘤生长和发展有效治疗结肠直肠癌。
一般地，本公开内容的用于治疗癌症的方法包括给予受试者本公开内容的核酸组合物(例如，修饰的微RNA，例如修饰的miR-129核酸、修饰的miR-15a核酸、修饰的miR-140核酸、修饰的miR-192核酸、修饰的miR-502、修饰的miR-506核酸或其组合)。在某些实施方案中，核酸组合物可作为包含核酸组合物和载体的制剂给予。在其它实施方案中，本公开内容的核酸组合物可在载体不存在下(即，裸露的)给予。
如本文所使用的术语“受试者”指任何哺乳动物。哺乳动物可为任何哺乳动物，尽管本文的方法更典型地涉及人。如本文所使用的短语“有需要的受试者”包括在术语受试者内，指需要治疗的任何哺乳动物受试者，特别是癌症或具有医学上确定的提高的癌性或癌前病况的风险。在具体的实施方案中，受试者包括人癌症患者。在一些实施方案中，受试者具有结肠直肠癌或具有医学上确定的提高的患结肠直肠癌的风险。在其它实施方案中，受试者具有胰腺癌，或具有医学上确定的提高的患胰腺癌的风险，例如，诊断有慢性胰腺炎。在又其它的实施方案中，本公开内容的受试者具有肺癌，或具有医学上确定的提高的患肺癌的风险。
术语“治疗”(“treatment”、“treat”和“treating”)与术语“给予有效量”同义。这些术语应意指意图治愈、改善、稳定疾病、病理状况或病症例如癌症、减少其一种或多种症状或预防疾病、病理状况或病症例如癌症的对受试者的医学管理。这些术语可交换使用，包括积极治疗，即明确地针对改善疾病、病理状况或病症的治疗，也包括病因治疗，即针对去除相关疾病、病理状况或病症的原因的治疗。另外，治疗包括姑息治疗，即设计为缓解症状而不是治愈疾病、病理状况或病症的治疗；预防性治疗，即针对最小化或部分或完全抑制相关疾病、病理状况或病症的发展的治疗；和支持性治疗，即用以补充针对改善相关疾病、病理状况或病症的另一种特定疗法的治疗。应理解的是，尽管意欲治愈、改善、稳定或预防疾病、病理状况或病症，治疗不一定实际上导致治愈、改善、稳定或预防。治疗的效果可如本文所描述和如本领域所已知地测量或评估，如对所涉及的疾病、病理状况或病症所适合的。这样的测量和评估可在定性和/或定量方面进行。因此，例如，疾病、病理状况或病症的特性或特征和/或疾病、病理状况或病症的症状可减少至任何效果或减少至任何量。
在某些实施方案中，本公开内容的核酸组合物用于治疗癌症，例如结肠直肠癌。
如本文所使用的术语“癌症”包括由异常细胞的不受控分裂和生长引起的任何疾病，包括例如肿瘤的恶性和转移性生长。术语“癌症”也包括癌前病况或以提高的癌性或癌前病况风险为特征的病况。因此，本文中也考虑癌症的治疗包括用于预防癌症的方法或用于预防癌前病况转化为癌性病况或转化为完全的非癌性病况的方法。癌症或癌前期(肿瘤病况)可位于身体的任何部分，包括内脏和皮肤。可应用的包含癌细胞的身体部分的一些实例包括结肠、直肠(包括肛门)、胃、食管、消化器官、肺、胰腺和肝。癌症或肿瘤也可包括存在一种或多种癌、肉瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤或畸胎瘤(生殖细胞肿瘤)。在一些实施方案中，癌症也可为白血病的形式。
在具体的实施方案中，本文所描述的核酸组合物用于治疗任何阶段的结肠直肠(即，结肠或直肠)癌、胰腺癌或肺癌，如下文所进一步描述的。众所周知，癌症通过经由淋巴结和脉管侵入肿瘤周围的正常非癌性组织和在肿瘤侵入受试者静脉、毛细血管和动脉后通过血液遍及受试者扩散。当癌细胞脱离原发性肿瘤(“转移”)，继发性肿瘤遍及受折磨的受试者出现，形成转移病灶。
例如，存在四个阶段的结肠直肠癌，其一般以转移程度为特征。在第0阶段或原位癌中，异常的潜在癌性细胞存在于结肠壁的粘膜(最内层)。在第I阶段，癌性细胞在结肠壁的粘膜形成并且已经扩散至粘膜下层(粘膜下的组织层)和可能已经扩散至结肠壁的肌肉层。第II阶段由三个亚类组成：阶段IIA，其中癌性组织已经扩散通过结肠壁的肌肉层至结肠壁的浆膜(最外层)；阶段IIB，其中肿瘤已经扩散通过结肠壁的浆膜但尚未扩散至近旁器官；和阶段IIC，其中癌症已经扩散通过结肠壁的浆膜和侵入近旁器官。第III阶段也分为三个亚类：阶段IIIA，其中癌症可能已经扩散通过结肠壁的粘膜至粘膜下层和肌肉层，并且已经扩散至1-3个近旁的淋巴结或淋巴结附近的组织；或癌症已经扩散通过粘膜至粘膜下层和4-6个近旁的淋巴结；阶段IIIB，其中肿瘤已经扩散通过结肠壁的肌肉层至浆膜或已经扩散通过浆膜但未至近旁的器官并且癌症已经扩散至1-3个近旁的淋巴结或淋巴结附近的组织；或已经扩散至肌肉层或至浆膜，和至4-6个近旁的淋巴结；或已经扩散通过粘膜至粘膜下层并且可能已经扩散至肌肉层和已经扩散至7个或更多近旁的淋巴结。在阶段IIIC结肠直肠癌中，肿瘤已经扩散通过结肠壁的浆膜但未至近旁的器官并且癌症已经扩散至4-6个近旁的淋巴结；或癌症已经扩散通过肌肉层至浆膜或已经扩散通过浆膜但未至近旁器官和癌症已经扩散至7个或更多近旁的淋巴结；或癌症已经扩散通过浆膜至近旁器官和至一个或多个近旁的淋巴结或至淋巴结附近的组织。最后，第IV阶段的结肠癌分为两个亚类：阶段IVA，其中癌症已经扩散通过结肠壁并且进入近旁器官和不靠近结肠的一个器官或至远端淋巴结；和阶段IVB，其中癌症已经扩散通过结肠壁并且进入近旁器官和超过一个的不靠近结肠的器官或进入腹壁的内衬。
肿瘤分期的又一个实例包括用于结肠直肠癌的Dukes分类系统。此处，阶段被鉴定为阶段A，其中肿瘤限制在肠壁；阶段B，其中肿瘤显示侵袭通过肠但尚未侵入淋巴结；阶段C，其中癌性细胞或组织在受试者的淋巴结内发现；和阶段D，其中肿瘤显示广泛转移入受试者的几个器官中。
可备选地使用Astler Coller分类系统。此处，阶段A结肠直肠癌被鉴定为仅存在于肠的粘膜中的癌症；阶段B1，其中肿瘤扩展进入固有肌层但未穿透固有肌层并且肿瘤尚未转移进入淋巴结，阶段B2结肠直肠癌被表示为穿透固有肌层并且肿瘤尚未转移进入淋巴结的肿瘤；阶段C1特征在于扩展进入固有肌层但未穿透固有肌层并且肿瘤已经转移进入淋巴结的肿瘤；阶段C2结肠直肠癌分类为穿透固有肌层的肿瘤，其中肿瘤已经转移进入淋巴结；和阶段D描述已经遍及生物体或受试者转移的肿瘤。
在一些实施方案中，本公开内容的治疗方法更具体地涉及显示降低水平的miR-129表达、miR-15a表达、miR-506表达、miR-502、miR-140或其组合的癌症受试者。在此方面，已知miR-15a在癌症中下调。参见，例如，R I Aqeilan, 等人, Cell Death and Differentiation (2010) 17, 第215–220页。进一步地，已知具有降低水平的miR-129表达的癌性细胞耐受5-氟尿嘧啶，如例如美国申请公开号2016/0090636中所描述的，所述申请的内容通过引用以其整体结合。另外，已知胰腺癌细胞显示降低水平的miR-506。参见，例如，Li, J,等人. Oncogene. 35 第5501-5514页。
在又一个实例中，本公开内容的微RNA模拟物用于治疗胰腺癌。胰腺癌起源于称为胰腺上皮内瘤形成或PanIN的前期病变。这些病变通常位于外分泌性胰腺的小管，根据细胞非典型性的程度可分为低度发育异常、中度发育异常或高度发育异常病变。这样的病变通常显示存在KRSA基因中的激活突变，连同CDKN2A、TP53和SMAD4中的某些失活性突变。这些基因突变共同导致形成浸润性癌症。胰腺癌基于原发性肿瘤的尺寸和其是否已经生长至胰腺外部进入周围器官、肿瘤是否已经扩散进入近旁的淋巴结和其是否已经转移至身体的其它器官(例如，肝、肺、腹)而分阶段。然后组合该信息并用于提供具体阶段，即0、1A、1B、2A、2B、3和4。对于阶段零(0)，胰腺肿瘤限制在胰管细胞的顶层并且尚未侵入较深的组织。原发性肿瘤尚未扩散至胰腺外部，例如在原位胰腺癌或胰腺上皮内瘤形成III中。阶段1A胰腺肿瘤通常限制在胰腺和2 cm宽或更小。进一步地，阶段1A胰腺肿瘤尚未扩散至近旁的淋巴结或远端位点。阶段1B胰腺肿瘤限制在胰腺和大于2 cm宽。阶段1B胰腺肿瘤尚未扩散至近旁的淋巴结或远端位点。阶段2A胰腺肿瘤显示生长至胰腺外部但未进入主要血管或神经的肿瘤，但癌症尚未扩散至近旁的淋巴结或远端位点。显示阶段2B胰腺癌的受试者呈现限制在胰腺或生长至胰腺外部但未进入主要血管或神经但已经扩散至近旁的淋巴结的肿瘤。显示阶段3胰腺癌的受试者呈现生长至胰腺外部进入主要血管或神经但已经扩散至远端位点的肿瘤。阶段4胰腺癌已经转移至远端位点、淋巴结和器官。
在另一个实例中，使用本公开内容的修饰的微RNA核酸组合物治疗肺癌。本方法包括治疗非小细胞肺癌，例如鳞状细胞癌、腺癌和大细胞癌。肺癌常常源于肺支气管中的恶性肿瘤并扩散至身体的其它部分，例如淋巴结。例如，在小细胞肺癌的情况下，癌性病灶常见于一个肺然后扩散至第二个肺、肺周围的流体(胸膜)或近旁的器官。肺癌基于原发性肿瘤的尺寸和其是否生长至肺外部进入淋巴结和其是否转移至身体的其它器官(例如，骨、肝、乳腺、脑)而分阶段。然后组合此信息并用于提供具体阶段，即0、1、2、3和4。对于阶段零(0)，即原位癌，癌症尺寸小并且尚未扩散入较深的肺组织或肺外部。阶段1肺癌显示下面的肺组织中存在癌细胞，但淋巴结未受影响。阶段2肺癌显示癌症已经扩散至近旁的淋巴结或进入胸壁。阶段3肺癌通过从肺至淋巴结或近旁结构和器官例如心脏、气管和食管的连续扩散而分类。阶段4肺癌显示遍及全身转移的癌症，其可影响肝、骨和脑。
本公开内容的核酸组合物可通过任何本领域通常知道的途径给予。这包括例如(1) 口服给予；(2) 胃肠外给予，例如，通过皮下、肌内或静脉内注射；(3) 局部给予；或(4)阴道内或直肠内给予；(5) 舌下或经颊给予；(6) 经眼给予；(7) 透皮给予；(8) 经鼻给予；(9) 直接给予有需要的器官或细胞。
给予的本公开内容的核酸组合物的量(剂量)取决于几个因素，包括癌症的类型和阶段、辅佐药物或佐药的存在或不存在和受试者的体重、年龄、健康和对药剂的耐受性。根据这些不同的因素，剂量可为例如约2 mg/kg体重、约5 mg/kg体重、约10 mg/kg体重、约15mg/kg体重、约20 mg/kg体重、约25 mg/kg体重、约30 mg/kg体重、约40 mg/kg体重、约50mg/kg体重、约60 mg/kg体重、约70 mg/kg体重、约80 mg/kg体重、约90 mg/kg体重、约100mg/kg体重、约125 mg/kg体重、约150 mg/kg体重、约175 mg/kg体重、约200 mg/kg体重、约250 mg/kg体重、约300 mg/kg体重、约350 mg/kg体重、约400 mg/kg体重、约500 mg/kg体重、约600 mg/kg体重、约700 mg/kg体重、约800 mg/kg体重、约900 mg/kg体重或约1000mg/kg体重，其中术语“约”一般理解为在标明值的± 10%、5%、2%或1%内。剂量也可在任何两个前述值界定的范围内。可使用常规实验通过监测化合物对癌性或癌前病况的作用或对微RNA (例如，miR-15a、miR-129、miR-140、miR-192、miR-502、miR-506)表达水平或活性的作用或对BCL2水平或活性的作用或对TS水平或活性的作用或对E2F3水平的作用或疾病病理学(所有这些可按照本领域已知的方法时常和容易地监测)确定对于每一患者适当的剂量方案。根据上文讨论的各种因素，任何上文示例性的核酸剂量可每天给予1次、两次或多次。
本文所描述的核酸组合物和任选地任何额外的化疗剂与当前方法一起使用的能力可使用本领域熟知的药理学模型，例如细胞毒性测定、凋亡染色测定、异种移植测定和结合测定而确定。
本文所描述的核酸组合物也可与或不与一种或多种化疗剂共给予，所述化疗剂可为与本文所描述的核酸组合物不同的辅助药物或佐药。
如本文所使用的，“化疗”或短语“化疗剂”为可用于治疗癌症的药剂。可与本文所述方法联合使用的化疗剂包括直接或间接调节BCL2、E2F3或TS的任何药剂。化疗剂的实例包括：抗代谢药例如甲氨蝶呤和基于氟嘧啶的嘧啶拮抗剂、5-氟尿嘧啶 (5-FU) (Carac®乳膏、Efudex®、Fluoroplex®、Adrucil®)和S-1；抗叶酸剂，包括聚合谷氨酸的(polyglutamatable)抗叶酸化合物；雷替曲塞(Tomudex®)、GW1843和培美曲塞(Alimta®)，和非聚合谷氨酸的(nonpolyglutamatable)抗叶酸化合物；诺拉曲塞(Thymitaq®)、普来曲塞、BGC945；叶酸类似物例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；和嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷。在当前公开内容的具体实施方案中，化疗剂为能够抑制异常细胞增殖或凋亡所牵涉的信号传导途径中涉及的基因或基因产物例如YAP1、BMI1、DCLK1、BCL2、胸苷酸合酶或E2F3的表达或活性的化合物，和任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
在一些实施方案中，化疗剂为抗癌药或抗癌药物的组织敏化剂或其它促进剂。在一些实施方案中，联合药物可为另一种核酸或另一种miRNA，例如本公开内容的微RNA模拟物、吉西他滨或游离5-FU。
在具体的实施方案中，其它核酸为短发夹RNA (shRNA)、siRNA或与BCL2 3’UTR的部分互补的核酸。
在其它实施方案中，化疗可为任何下列癌症药物，例如以下的一种或多种：甲氨蝶呤、多柔比星、环磷酰胺、顺铂、奥沙利铂、博来霉素、长春碱、吉西他滨、长春新碱、表柔比星、亚叶酸、紫杉醇和多西他赛。化疗剂可在开始用核酸组合物治疗之前、期间或之后给予。
在一些实施方案中，化疗剂为联合药物。
E2F转录因子3，即E2F3 (RefSeq NG_029591.1, NM_001243076.2, NP_001230005.1)为结合DNA和与效应蛋白(包括但不限于视网膜母细胞瘤蛋白)相互作用以调节细胞周期调节中涉及的基因的表达的转录因子。因此，本文可考虑抑制E2F3表达的任何药物作为联合药物。
B细胞淋巴瘤2 (BCL2) (RefSeq NG_009361.1, NM_000633, NP_000624)，包括其同种型α (NM_000633.2, NP_000624.2)和β(NM_000657.2, NP_000648.2)，由Bcl-2基因编码，为通过固有的凋亡途径调节线粒体调节的细胞死亡的调节物蛋白的BCL2家族的成员。BCL2为整合线粒体外膜蛋白，其通过结合BAD和BAK蛋白阻断细胞的凋亡性死亡。BCL2抑制物的非限制性实例包括反义寡核苷酸，例如Oblimersen (Genasense; Genta Inc.,)，BH3模拟小分子抑制剂，其包括ABT-737 (Abbott Laboratories, Inc.)、ABT-199 (AbbottLaboratories, Inc.)和Obatoclax (Cephalon Inc.)。本文中可考虑抑制BCL2表达的任何药物均作为联合药物。
胸苷酸合酶(RefSeq: NG_028255.1, NM_001071.2, NP_001062.1)为遍在的酶，其催化必要的dUMP甲基化生成dTMP，即组成DNA的4种碱基之一。该反应需要CH H4-叶酸作为辅因子，其既作为甲基供体，和独特地又作为还原剂。对CH H4-叶酸的恒定需求意味着胸苷酸合酶活性与负责再补充细胞叶酸池的两个酶二氢叶酸还原酶和丝氨酸转羟甲基酶强烈相关。胸苷酸合酶为30-35 kDa亚基的同二聚体。活性位点同时结合叶酸辅因子和dUMP底物二者，dUMP经由亲核的半胱氨酸残基共价结合到该酶(参见，Carreras等人, Annu. Rev.Biochem., (1995) 64:721-762)。胸苷酸合酶反应为嘧啶生物合成途径的关键部分，嘧啶生物合成途径产生dCTP和dTTP用于掺入DNA中。该反应为DNA复制和细胞生长所需。因此所有迅速分裂的细胞例如癌细胞都需要胸苷酸合酶活性。由于其与DNA合成以及因此细胞复制的关联，胸苷酸合酶多年来已经成为抗癌药物的靶。胸苷酸合酶抑制剂的非限制性实例包括叶酸和dUMP类似物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU)。本文可考虑任何抑制胸苷酸合酶表达的药物作为联合药物。
如果需要，给予本文所述的核酸组合物可与一种或多种非药物疗法例如放疗和/或手术组合。如本领域所熟知的，放疗和/或给予化疗剂(在该情况下，本文所述核酸组合物和任选地，任何额外的化疗剂)可在手术之前给予以例如在手术之前缩小肿瘤或停止癌症扩散。同样如本领域所熟知的，放疗和/或给予化疗剂可在手术之后给予以破坏任何剩余癌症。
已在下文中阐述实施例用于说明的目的和描述本发明的某些具体实施方案。然而，本发明的范围不以任何方式受本文所阐述的实施例限制。
实施例
实施例 1. 材料和方法
修饰的miR-129：5-FU修饰的miR-129分子通过自动化寡核苷酸合成过程合成和通过HPLC纯化。将两条链退火以制造成熟的修饰的5-FU-miR-129。更具体地，使用称为“2'-ACERNA合成”的过程。2'-ACE RNA合成基于保护基团方案，其中利用甲硅烷基醚与2'-羟基上的酸敏感性原酸酯保护基团(2'-ACE)组合保护5'-羟基。该保护基团的组合然后与标准亚磷酰胺固相合成技术一起使用。参见，例如，S.A. Scaringe, F.E. Wincott, 和M.H.Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 120 (45), 11820-11821 (1998);国际PCT申请WO/1996/041809; M.D. Matteucci, M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc., 103, 3185-3191 (1981); S.L. Beaucage, M.H. Caruthers, Tetrahedron Lett. 22, 1859-1862(1981)，其各自的全部内容清楚地结合到本文中。
示例性的修饰的miR-15a核酸、修饰的miR-140核酸、修饰的miR-192核酸、修饰的miR-502、修饰的miR-506核酸或用5-卤代尿嘧啶取代尿嘧啶的任何其它修饰的微RNA可以以与miR-129a相同的方式合成。
当前使用的保护的和官能化的核糖核苷亚磷酰胺的一些示例性结构在下面示出：
细胞培养：人结肠癌细胞系HCT116、RKO、SW480、SW620和正常结肠细胞系CCD 841 CoN、胰腺癌细胞系ASPC-1、Panc-1和肺癌细胞系A549从美国典型培养物保藏所(ATCC)获得并在McCoy's 5A培养基(HCT-116)、DMEM (RKO, SW480, SW620)和MEM (CCD 841 CoN) (ThermoFischer)中维持。培养基补充有10%胎牛血清(Thermo Fischer)。
对于转染，将1×105个细胞铺板在六孔板中并在24小时后使用Oligofectamine(Thermo Fischer)按照制造商的方案用100 nM miR-15a前体、非特异性miRNA (ThermoFischer)或修饰的miR-15a模拟物(Dharmacon)转染。对于无试剂转染，将细胞以1x105个细胞/孔铺板在六孔板中。24小时后将100 pmol miRNA (对照、miR-15a、模拟物-1)在Optimem(Thermo Fischer)中稀释并加入板中。24小时后改变培养基。培养基补充有10%胎牛血清(Thermo Fischer)。简言之，细胞在补充B27、10 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF (LifeTechnologies)的DMEM/F12中在超低附着烧瓶中培养。球形细胞通过温和离心收集、分离成单细胞和重新铺板而维持。
蛋白质免疫印迹分析：转染48小时后，将从在具有蛋白酶抑制剂(Sigma)的RIPA缓冲液中裂解的细胞提取的等量蛋白(15 µg)在10%-12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上使用标准程序分离。用于分析的一抗为兔抗YAP1单克隆抗体(1:10000) (Cell SignalingTechnologies)、抗DLCK1 (1:500) (Abcam)、抗BCL2 (1:500) (NeoMarkers)、抗BMI-1 (1:10000) (Cell Signaling Technologies)、小鼠抗人TS抗体(1:500)、抗α-微管蛋白(1:50000) (Santa Cruz Biotech Inc.)、抗GAPDH (1:100000) (Santa Cruz BiotechInc.)、抗E2F3 (1:500) (Santa Cruz Biotech Inc.)。辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠或兔抗体(1:5000, Santa Cruz Biotech Inc.)用作二抗。蛋白带用放射自显影膜使用SuperSignal West Pico化学发光底物(Thermo Fischer)可视化。蛋白质印迹密度使用Image J软件定量。
细胞增殖测定：转染24小时后，将细胞以2000个细胞/孔的密度接种在96孔板中。细胞增殖测定在第1-5天通过在培养基中孵育10 μl WST-1 (Roche Applied Science,Mannheim, Germany) 1 h和在450 nm和630 nm处读取吸光度进行。细胞增殖速率通过630nm处的吸光度减去450 nm处的吸光度计算。细胞增殖测定实验进行至少3次。O.D.通过450nm处的吸光度减去630 nm处的吸光度计算。增殖实验进行三次。
研究不依赖于贴壁的增殖以测定癌细胞集落形成能力。将癌细胞胰蛋白酶消化和计数，将总计1×105个细胞/孔在6孔板中用25 nM修饰的微RNA或天然miR或阴性对照miRNA用oligofectamine转染，转染6小时后，重新计数细胞。将在0.35%琼脂(Bacto Agar;Becton Dickinson)中的总计20,000个细胞铺在35-mm平皿中1 mL固体化的0.6%琼脂层上方。两层中均包含具有B27、10 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF的生长培养基。孵育2周后，计数直径超过50 mm的集落。
细胞周期分析：转染24小时后，收获细胞并以0.5 - 1 x 106个细胞/mL重悬在补充0.02 mg/mL RNA酶H和0.05 mg/mL碘化丙啶的改良的Krishan缓冲液中。染色的细胞通过流式细胞术检测，结果用Modfit LT™软件分析。细胞周期分析实验进行至少三次。
凋亡测定：为了区分早期和晚期凋亡，进行异硫氰酸荧光素(FITC)-膜联蛋白测定(Becton Dickinson)。将HCT116、RKO、SW480和SW620细胞以1×105个细胞/孔铺板在6孔板中，24 h后，细胞使用Oligofectamine用25 nM修饰的miRNA转染。转染48小时后，收获细胞，用碘化丙啶和抗膜联蛋白V抗体 (膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒, Invitrogen, CA,USA)按照制造商的方案染色，染色的细胞通过流式细胞术检测。
5-FU处理和细胞毒性测定：转染24小时后，将癌细胞以2 x 103个细胞/孔一式三份在100 µL培养基中铺板在96孔板中。24小时后，加入包含仅2 µM 5-FU、50 nM天然微RNA、50 nM修饰的微RNA (例如，修饰的miR-129)或2 mM 5-FU与50 nM本公开内容的修饰的微RNA例如修饰的miR-129的组合的新鲜培养基，细胞另外培养72小时。细胞活力使用WST-1测定测量。
慢病毒产生：简言之，将1.5 x 106个293T细胞铺板在具有10 mL DMEM + 10% FBS的10-cm平皿中。两天后，用Lenti-Pac HIV表达包装试剂盒按照制造商的方案转染pEZX-MR03，即表达miR-129或hsa-miR-15a的慢病毒质粒。48小时后，收获病毒并用Lenti-Pac慢病毒浓缩溶液浓缩。然后用Lenti-Pac™ HIV qRT-PCR滴定试剂盒测定病毒的滴度(大约1011个病毒颗粒/mL)。另外，使用连续稀释的病毒(0.1 µL、0.5 µL、2 µL、10 µL、50 µL)转导5 x 104 HCT116 CSC以测定转导效率。对于小鼠体内治疗实验使用达到100%阳性表达的最低浓度(2 µL)感染细胞。
核酸表达的实时qRT-PCR分析：定量癌细胞中的微RNA的表达水平。简言之，对目的微RNA和内部对照RNU44基因特异性的引物购自Ambion。cDNA合成通过高容量cDNA合成试剂盒(Applied Biosystems)用miRNA特异性引物进行。实时qRT-PCR在Applied Biosystems7500 Real-Time PCR机器上用miRNA特异性引物通过TaqMan基因表达测定(AppliedBiosystems)进行。示例性的本公开内容的miR的表达水平通过ΔΔCT方法基于内部对照RNU44计算，对对照组归一化和作为相对定量绘图。
人癌干细胞分析器(Profiler): RNA使用TRIzol试剂(Thermo Fischer)按照制造商的方案从用示例性的本公开内容的微RNA或阴性miRNA转染的癌细胞提取。使用RT2第一链试剂盒(Qiagen)将RNA转录为第一链cDNA。接着，将cDNA与RT2 SYBR Green Mastermix(Qiagen)混合，将该混合物等分到人癌干细胞RT2分析器PCR阵列(Human Cancer StemCell RT2 Profiler PCR Array) (Qiagen)的孔中。使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR机器用于qRT-PCR (Applied Biosystems)，相对表达值使用ΔΔCT方法测定。
小鼠皮下肿瘤植入模型：注射两天前，将HCT116癌干细胞以5 x 105/孔铺板在6孔超低附着板中。使用20 µL病毒或100皮摩尔示例性的修饰的miR-129或修饰的miR-15a转导或转染细胞。48小时后，收集细胞并以106/ml重悬在具有30%基质胶的DMEM/F12敲除培养基中。使用10-12周龄的NOD/SCID小鼠(Jackson Laboratories, Bar Harbor, MA, USA)用于肿瘤植入。小鼠通过吸入异氟烷麻醉。将100 µL细胞悬浮液皮下注射入下背区域的两侧。肿瘤尺寸使用卡尺测量，肿瘤体积使用式V = 长度 x 宽度2/2计算。
对于体内miRNA递送实验，我们通过用重组慢病毒感染亲本HCT116细胞创建了表达lenti-luc报告物基因的结肠癌细胞。将表达萤光素酶的HCT116细胞(2.0x106个细胞/小鼠)悬浮在0.1 mL PBS溶液中并通过小鼠各自的尾静脉注射。注射结肠癌细胞两周后，将小鼠通过尾静脉注射40 µg用体内jetPEI (Polyplus Transfection)包装的阴性对照或修饰的miR治疗。每隔一天治疗小鼠，持续2周 (8次)。治疗后，使用IVIS光谱体内成像系统(IVIS) (PerkinElmer)筛查小鼠。
RNA分离：对于小鼠异种移植物，将切片组织分别脱石蜡、水化和用蛋白酶K消化。随后，使用TRIzol®试剂分离总RNA。总RNA也通过基于TRIzol®的方法从临床样本分离。
统计分析：所有实验重复至少3次。所有统计分析用SigmaPlot软件进行。两组之间的统计显著性使用Student t-检验(对于临床样品为配对t-检验，对于所有其它样品为未配对t-检验)确定。对于超过两组的比较，使用单向ANOVA接着Bonferroni-Dunn检验。数据表述为平均值±平均值的标准误差(SEM)。统计显著性在图注中描述或用星号(*)指示。*=P<0.05; **=P<0.01; ***=P< 0.001。
实施例2：本公开内容的修饰的微RNA具有抗癌活性
如图3、8B、12A-B、13A-B和14A-D中所显示，修饰的miRNA (修饰的miR: 129、15a、192(215)、140、502和506)比非修饰的miRNA前体更有效抑制结肠癌、胰腺癌和肺癌细胞增殖。另外，修饰的miRNA可在无转染试剂的情况下递送入癌细胞中(数据未示出)。值得注意地，结果显示当与用对照微RNA处理的癌细胞相比时，跨越几种不同的结肠直肠癌细胞系、胰腺癌细胞系和肺癌细胞系的癌细胞增殖受到显著抑制。
实施例3：修饰的miR-129核酸具有抗癌活性
在下列实验中，5-FU掺入miR-129中。在一个实验中，miR-129中的所有U碱基用5-FU取代，如图1A所提供的结构中显示的，其中“UF”代表5-氟尿嘧啶或其它5-卤代尿嘧啶。在另一个实验中，除了miR-129的种子区域，所有U碱基用5-FU取代，如图1B所提供的结构中显示的。
靶特异性分析：结肠癌HCT-116细胞中的蛋白质免疫印迹实验的结果证明示例性的本公开内容的修饰的miR-129多核苷酸能够保留其对TS、BCL2和E2F3的靶特异性。结果在图2A和2B中示出，该图显示对于具有所有U碱基被5-FU取代的修饰的miR-129核酸(如通过如SEQ ID. NO: 4中所示的两个单独的操纵基因所获得的)的结果。更具意义的是，发现示例性的miR-129模拟物在减少TS、BCL2和E2F3的表达水平方面比未修饰的(对照)miR-129更有效。
本公开内容的修饰的微RNA的功能增强：比较示例性的修饰的miR-129对结肠癌细胞增殖的影响与天然miR-129对结肠癌细胞增殖的影响。结果显示，在50 nM浓度，5-FU-miR-129可完全抑制HCT-116肿瘤细胞生长。此外，如图3中的结果所显示的，5-FU-miR-129远比天然miR-129更有效，因此提供显著更高的抑制效果。这样的抑制为特异性的，因为杂乱对照miR对细胞增殖无效果。
接着，使用HCT-16结肠癌细胞比较修饰的miR-129和5-FU对细胞增殖的效能。如图4提供的结果所显示的，50 nM (5-FU的1/40)修饰的miR-129出乎意料地比2 μM 5-FU更有效得多地抑制肿瘤细胞增殖。
示例性的本公开内容的修饰的微RNA在结肠癌细胞中诱导凋亡：鉴于BCL2为miR-129的重要的靶，调查了本公开内容的修饰的miR对凋亡的影响。具体地，在用阴性对照miRNA、天然miR-129或SEQ ID NO: 4的示例性的miR-129模拟物转染的HCT116、RKO、SW480和SW620结肠癌细胞中使用凋亡测定定量细胞死亡。结果显示通过基于荧光活化细胞分选(FACS)的FITC-膜联蛋白测定，miR-129模拟物能够在所有4种结肠癌细胞系中以天然miR-129和阴性对照miRNA的2-30倍诱导凋亡(图5A)。
miR-129模拟物触发G1/S细胞周期检查点控制：细胞周期分析使用流式细胞术在用杂乱对照、miR-129前体和示例性miR-129模拟物处理的HCT-116细胞中进行。如图5B中所显示的，细胞周期分析显示miR-129模拟物通过诱导G1停滞影响结肠癌细胞生长，并且这种影响比天然miR-129强得多(超过2倍)。
miR-129模拟物消除耐化疗的结肠癌干细胞：为了测定某些示例性的本公开内容的修饰的微RNA (即，miR-129模拟物)对耐5-FU结肠癌干细胞的影响，用各种浓度的模拟物-1或5-FU处理HCT116衍生的结肠癌干细胞。图6中示出的数据显示在100 nM浓度下示例性的本公开内容的微RNA模拟物能够消除超过80%的耐5-FU的结肠癌干细胞，而5-FU在100µM的致死剂量对肿瘤干细胞活力具有极小的作用。
总之，这些结果显示本公开内容的示例性的修饰的微RNA多核苷酸能够抑制HCT116结肠癌干细胞的增殖(图6)。修饰的miR-129的这种抑制效果远比天然miR-129更有效，因为在第6天增殖几乎完全被25 nM miR-129阻断(图6)。我们还使用软琼脂测定证明了用修饰的miR-129处理细胞对不依赖贴壁的细胞生长的影响。与用天然miR-129或对照miRNA处理的细胞相比修饰的miR-129处理的结肠癌干细胞不形成可见的球体(与在图10中见到的那些相似)。
miR-129模拟物在体内抑制结肠癌转移：使用结肠癌转移模型评估修饰miR-129核酸的治疗影响。建立转移两周后，通过静脉注射以每隔一天一次注射的治疗频率持续2周递送40 µg SEQ ID NO: 4的miR-129核酸。
图7中示出的结果显示修饰的微RNA-129抑制结肠癌转移，而阴性对照miRNA无效果，同时显示无有毒副作用。
实施例3. 修饰的miR-15a及其抗癌活性
示例性的修饰的miR-15a组合物具有抗癌活性：如图1C和图1D中所示出的，如上文所述合成示例性的修饰的miR-15a模拟物，其中miR-15a核酸序列的所有尿嘧啶碱基(图1C)或仅非种子区域的尿嘧啶碱基(图1D)被5-卤代尿嘧啶(即，5-氟尿嘧啶)取代。
如图1C中所示的示例性的修饰的miR-15a转染入HCT-116结肠癌干细胞3天后，收集蛋白并进行蛋白质印迹以证实本公开内容的修饰的miR-15a核酸组合物维持调节关键miR-15a靶的能力。如图8A中所显示的，miR-15a靶YAP1、BMI1、DCLK1和BCL2显示当用未修饰的miR-15a (天然-miR15a)或修饰的miR-15a组合物转染时减少的蛋白水平，表明5-卤代尿嘧啶修饰不抑制miR-15a在细胞内调节其靶的能力。
修饰的miR-15a在体外具有增加的治疗功效：为了确定与未修饰的miR-15a相比在结肠癌细胞系中本公开内容的修饰的miR-15a组合物是否显示增加的效能，用阴性对照(非特异性寡核苷酸)、未修饰的miR-15a或图1C中所示的示例性的修饰的miR-15a组合物转染HCT-116结肠癌细胞。
使用WST-1测定评估癌细胞增殖。如图8B中所显示的，转染6天后，与对照相比未修饰的miR-15a的细胞增殖降低53%。在修饰的miR-15a的情况下，细胞增殖降低84%。总之，实验结果显示与未修饰的miR-15a相比修饰的miR-15a更有效降低癌细胞增殖。
还分析了修饰的miR-15a核酸抑制癌细胞中的细胞周期进展的能力。图9显示未修饰的miR-15a诱导细胞周期停滞，导致G1/S比率约3倍的增加。图9还显示当与其天然对应物相比时示例性的本公开内容的修饰的miR-15a组合物更有效停止细胞周期进展。例如，与对照相比表达示例性的本公开内容的修饰的miR-15a核酸的细胞显示G1/S比率增加至7倍。因此，在结肠癌细胞中修饰的miR-15a比未修饰的miR-15a更有效诱导细胞周期停滞。
还检查了示例性的修饰的miR-15a组合物对结肠癌干细胞在基质胶(Matrigel)基质中的集落形成的影响。如图10中所显示的，尽管许多集落由用对照miRNA转染的细胞产生(图10，阴性)，非常少的集落由用未修饰的miR-15a转染的细胞产生(图10，miR-15a)。相比之下，在用修饰的miR-15a转染的细胞的情况下，未观察到集落(图10，5-FU-miR-15a)。这些结果表明示例性的本公开内容的修饰的miR-15a组合物确实是肿瘤发生和结肠直肠癌进展的更有效的抑制剂。
修饰的miR-15a在体内抑制癌症发展和进展：为了加深我们对在结肠CSC中的miR-15a的理解，建立包含已经用修饰的miR-15a或阴性对照miRNA预先转染的结肠直肠癌细胞的小鼠异种移植物模型。注射8周后，测量和收获肿瘤。对于从表达修饰的miR-15a模拟物的CSC建立的肿瘤，肿瘤尺寸大幅减小(>25x) (n=8)，如图11中所示出的。
本文所呈现的数据支持新型修饰的可行性，其中将卤代尿嘧啶(例如，5-FU)掺入miRNA核酸序列中以增强天然微RNA分子(伴随或不伴随使用其它化疗剂)的化疗功能。

Claims (22)

1.一种核酸组合物，其包含含有至少一个尿嘧啶核酸的修饰的微RNA核苷酸序列，其中一个或多个所述至少一个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
2.权利要求1的核酸组合物，其中所述修饰的微RNA核苷酸序列包括选自miR-129、miR-15a、miR-140、miR-192、miR-502和miR-506的微RNA核苷酸序列。
3. 权利要求2的核酸组合物，其中所述修饰的微RNA核苷酸序列包括选自CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 4]、CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ IDNO. 5]、UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO.6]、UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG[SEQ ID NO. 7]、 CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]、CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO. 11]、AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ IDNO. 13]和UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]的微RNA核苷酸序列。
4. 权利要求2的核酸组合物，其中所述修饰的微RNA核苷酸序列包括如SEQ ID NO. 1所示的miR-129或如SEQ ID NO. 2所示的miR-15a的微RNA核苷酸序列。
5. 权利要求4的核酸组合物，其中所述微RNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 1所示的miR-129核苷酸序列，其中至少一个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
6. 权利要求4的核酸组合物，其中所述微RNA核苷酸序列为SEQ ID NO. 2所示的miR-15a核苷酸序列，其中至少一个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
7.权利要求1的组合物，其中所述5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
8.权利要求1的组合物，其中核苷酸序列中的至少2个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
9.权利要求8的组合物，其中核苷酸序列中的至少3个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
10.权利要求9的组合物，其中核苷酸序列中的至少4个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
11.权利要求10的组合物，其中核苷酸序列中的至少5个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
12.权利要求11的组合物，其中核苷酸序列中的至少6个尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
13.权利要求1的组合物，其中核苷酸序列中的所有尿嘧啶核酸为5-卤代尿嘧啶。
14.权利要求2的组合物，其中所述5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
15.一种药物组合物，其包含权利要求1的核酸组合物和药学上可接受的载体。
16. 权利要求14的药物组合物，其中所述核酸组合物选自CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 4]、CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ IDNO. 5]、UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO.6]、UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG[SEQ ID NO. 7]、CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]、CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQ ID NO. 11]、AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ IDNO. 13]和UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]，其中UF为5-卤代尿嘧啶。
17.权利要求15的药物组合物，其中所述5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
18.用于治疗癌症的方法，其包括：
给予受试者有效量的权利要求1的核酸组合物，其中所述受试者具有癌症或经诊断有发展癌症的倾向，并且其中所述癌症的进展受到抑制。
19.权利要求18的方法，其中所述哺乳动物为人。
20.权利要求19的方法，其中所述受试者具有选自结肠直肠癌、胰腺癌或肺癌的癌症。
21.权利要求20的方法，其中所述受试者具有结肠直肠癌。
22. 权利要求17的方法，其中所述核酸组合物选自CUFUFUFUFUFGCGGUFCUFGGGCUFUFGC[SEQ ID NO. 4]、CUUUUUGCGGUFCUFGGGCUFUFGC [SEQ ID NO. 5]、UFAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ ID NO.6]、UAGCAGCACAUFAAUFGGUFUFUFGUFG [SEQ IDNO. 7]、 CAGUFGGUUUUACCCUFAUGGUFAG [SEQ ID NO. 9]、CUFGACCUFAUFGAAUFUFGACAGCC [SEQID NO. 11]、AUFCCUFUFGCUAUFCUFGGGUFGCUFA [SEQ ID NO. 13]和UFAUFUFCAGGAAGGUFGUFUFACUFUFAA [SEQ ID NO. 15]，其中所述5-卤代尿嘧啶为5-氟尿嘧啶。
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