KR101953300B1

KR101953300B1 - 탁산계 항암제 내성 암의 진단 및 치료를 위한 조성물, 키트 및 방법

Info

Publication number: KR101953300B1
Application number: KR1020180072219A
Authority: KR
Inventors: 안희정; 김태헌; 강혜윤
Original assignee: 의료법인 성광의료재단
Priority date: 2018-06-22
Filing date: 2018-06-22
Publication date: 2019-02-28
Also published as: WO2019245135A1; US11639531B2; US20220119888A1

Abstract

탁산계 항암제 내성 진단용 조성물, 키트 및 방법 및 탁산계 항암제 내성 암을 치료하기 위한 조성물 및 이를 위한 물질을 스크리닝하는 방법에 의하면, 탁산계 함암제 내성 암을 효율적으로 진단, 또는 치료할 수 있으며, 탁산계 항암제 내성 암을 치료할 수 있는 후보 물질을 효율적으로 선별할 수 있다.

Description

탁산계 항암제 내성 암의 진단 및 치료를 위한 조성물, 키트 및 방법{A composition, kit and method for diagnosing and treating taxane-based anticancer drugs resistance cancer}

탁산계 항암제 내성 암의 진단 및 치료를 위한 조성물, 키트 및 방법에 관한 것이다.

난소 암종(ovarian carcinoma)은 여성 암 중 가장 높은 치사율을 나타내는 암이다. 이러한 높은 치사율은 난소 암종의 화학 내성(chemoresistance) 및 빈번한 재발로 인한 것이다. 난소 암종을 예방 또는 치료하기 위한 여러 제제가 개발되어 왔으나, 난소 암종은 여전히 높은 재발율 및 치사율을 가지고 있다.

최근 들어 종양 내 적은 수로 존재하지만 높은 암 유발 능력을 지닌 암 줄기 세포(cancer stem cell:CSC)에 대한 관심도가 높아지고 있다. CSC는 스페로이드 형성 분석으로 장액성 난소 암종(ovarian serous carcinoma: OSC)으로부터 최초로 분리되었으며, 이들이 암의 재발 및 화학 내성에 대한 주요 원인 중 하나일 것으로 추측되고 있다(한국 공개특허 10-2017-0063198). 그러나 아직까지 난소 CSC를 줄이고, 난소암의 높은 재발율 및 치사율을 줄이기 위한 효과적인 전략은 개발되지 않고 있는 실정이다.

일 양상은 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

다른 양상은 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 진단용 키트를 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 개체의 시료로부터 miR-150의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 탁산계 항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 miR-150을 유효성분으로 포함하는, 탁산계 항암제 내성 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

또 다른 양상은 탁산계 항암제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 miR-150의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 탁산계 항암제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

일 양상은 miR-150(MicroRNA-150)의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 진단용 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "miR, miRNA, 또는 microRNA"는 암호화되지 않은(non-coding) 짧은 길이의 RNA로서, 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자로서 기능을 한다. 이들은 상보적인 염기서열을 갖는 표적 mRNA에 상보적으로 결합함으로써, 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다. 구체적으로, miRNA는 pre-miRNA라 불리는 헤어핀 구조를 갖는 약 70-80nt 길이의 전구체로 전사된 후, RNAse Ⅲ 효소인 dicer에 의해 잘려 성숙한 형태로 생성된다. miRNA는 miRNP라 불리는 리보뉴클레오 복합체를 형성하여 표적 부위에 상보적으로 결합하여 표적 유전자를 절단하거나, 번역을 억제한다. 30% 이상의 인간 miRNA는 클러스터로 존재하며, 하나의 전구체로 전사된 후, 절단 과정을 거쳐 성숙 miRNA가 최종적으로 생성된다. 본 명세서에서, miRNA는 중간 형태의 RNA 전사체(transcript), 즉, pri-miRNA(초기 전사체) 또는 pre-miRNA(전구체)까지 포함하는 의미로 사용될 수 있다. 한편,"miR-150"은 인간을 포함하는 포유동물에서 발견되는 miRNA 전구체 패밀리 중 하나로서, 자연 살해세포(Natural killer cell)의 독성, 장내 면역 세포의 기능성과 밀접한 관계가 있다고 알려져 있다.

본 명세서에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 탁산계 항암제 내성의 존재 여부, 탁산계 항암제 내성 암의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "항암제 내성"은 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나 초기에는 암 치료 효과가 있으나 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것을 의미한다. 항암제 치료에 있어서 일반적인 치료 효과 판정은 WHO에서 제정한 기준에 따라 4가지로 분류되는데, (1) 종양이 모두 소실되고 4주 이상 지속되는 경우(완전 반응, complete response); (2) 종양의 크기가 50% 이상 감소하는 경우(부분 반응, partial response); (3) 종양의 크기가 50% 미만 감소하는 경우(불변, stable disease); 및 (4) 종양의 크기가 25% 이상 증가하는 경우(진행, progressive disease)로 구분된다. 즉, 상기 WHO의 기준을 토대로 하면, 항암제를 이용하여 암 환자를 치료할 때, 치료 초기부터 치료 효과가 없거나, 초기에는 암 치료 효과가 있으나[상기 (1) 및 (2)] 계속적인 치료 과정에서 암 치료 효과가 상실되는 것 [상기 (3) 및 (4)]을 의미한다. 여기에서, 상기 항암제는 탁산계 항암제 (Taxane-based anticancer drugs)일 수 있고, 예를 들어, 파크리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 라로탁셀(Larotaxel), 카바지탁셀(Cabazitaxel), 및 이들의 조합으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

상기 "발현 수준의 측정"은 miRNA 유전자 자체, 또는 상기 miRNA 유전자가 발현된 수준, 즉, miRNA 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있다. 예를 들어, 상기 miR-150와 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 또는 프로브를 사용하여 miR-150의 발현 수준을 측정할 수 있다.

상기 "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 miRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭하는 것일 수 있다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

상기 "프라이머"는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약 (즉, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지의 뉴클레오시드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 예를 들면 miR-150에 대한 특이적인 프라이머로서 7개 내지 50개의 뉴클레오티드 서열을 가진 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 개체의 탁산계 항암제 내성을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기 프라이머는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

상기 "프로브"는 표적 핵산 예를 들면, miRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 특정 miRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링(labeling)되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단일가닥 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중가닥 DNA(double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 예를 들면, miR-150과 상보적인 핵산 서열을 갖는 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 정도를 통해 발현량을 측정함으로써 개체의 탁산계 항암제 내성을 진단할 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 프로브는 10 내지 100, 15 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 30, 10 내지 20, 15 내지 80, 15 내지 50, 15 내지 30, 15 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 또는 20 내지 30 nt를 갖는 것일 수 있다.

또한, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 이러한 핵산 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 또한, 프라이머 또는 프로브는 검출 가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형될 수 있다. 상기 표지의 예는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 또는 바이오틴을 포함할 수 있다.

일 실시예에 따르면, 종양 세포 또는 조직 내 miR-150의 발현 감소는 탁산계 항암제 내성과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, miR-150의 발현 수준은 탁산계 항암제 내성을 진단하는데 사용될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 여기에서, miR-136의 발현 감소; 또는 miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, 및/또는 miR-503의 발현 증가를 통해 탁산계 항암제 내성을 진단할 수 있다.

한편, 상기 miR-150, miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503의 서열은 www.microRNA.org, www.mirbase.org, 또는 www.mirz.unibas.ch/cgi/miRNA.cgi.와 같은 공개된 이용가능한 데이터베이스에서 평가할 수 있다. miRNAs는 "mir-[숫자]"와 같은 작명 협정에 따라 일반적으로 번호를 할당받는다. miRNA의 숫자는 이미 확인된 miRNA 종에 대해 발견된 순서에 따라 할당된다. miRNA가 상이한 유기체의 공지의 miRNA에 유사한 것으로 발견되었다면, 이름은 [유기체 확인자]- mir-[숫자]의 형태로, 선택적 유기체 확인자 이름이 제공된다. 성숙한 microRNA는 보통 접두사 "miR"가 붙고, 유전자 또는 전구물질 miRNA는 접두사 "mir"가 붙는다. 본 명세서에서, 접두사 mir-* 또는 miR-*를 가진 임의의 microRNA (miRNA 또는 miR)는 명시적으로 다른 언급이 없는 한, 전구물질 및/또는 성숙 종을 모두 포함하는 것으로 이해해야 한다. miR 명명에 대한 상세한 내용은 www.mirbase.org 또는 Ambros et al., A uniform system for microRNA annotation, RNA 9:277-279 (2003)을 참고한다.

다른 양상은 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 진단용 키트를 제공한다.

상기 키트는 miR-150의 발현 수준을 측정함으로써, 탁산계 항암제 내성을 진단할 수 있는 효과가 있다. 상기 키트에는 탁산계 항암제 내성의 진단을 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, 등 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액, 또는 장치가 더 포함될 수 있으며, RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 칩 키트를 포함할 수 있다.

상기 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합 효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 마이크로어레이 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 상기 유전자를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이를 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용할 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드 (aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것일 수 있다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

또한, 상기 miR-150의 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 (a) 개체의 시료로부터 miR-150의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miR-150의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "개체"는 탁산계 항암제 내성의 존재 여부를 확인 또는 예측하고자 하는 개체를 의미한다. 상기 개체는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유류, 양서류, 파충류, 조류 등일 수 있으며, 보다 구체적으로 포유동물, 예를 들면, 인간(Homo sapiens)일 수 있다.

본 명세서에서 용어, "시료"는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액, 세포, 조직 등을 포함할 수 있고, 예를 들어, 종양 세포 또는 종양 조직일 수 있다.

상기 "발현 수준을 측정하는 방법"은 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 방법에서, 개체의 시료로부터 측정된 miR-150의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 탁산계 항암제 내성을 갖는 것으로 판정할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 정상 대조군 또는 양성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 및 100% 이상 감소하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 개체의 시료로부터 miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하고, 상기의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에서, 개체의 시료로부터 측정된 miR-136의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 탁산계 항암제 내성을 갖는 것으로 판정할 수 있고, 또는 miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, 및/또는 miR-503의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우, 탁산계 항암제 내성을 갖는 것으로 판정할 수 있다.

상기 진단을 위한 정보제공방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 miR-150을 유효성분으로 포함하는, 탁산계 항암제 내성 암의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "치료"는 일 실시예에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 탁산계 항암제 내성 암에 대한 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물에 의한 치료 대상 질병인, "암(Cancer)"은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적(invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암은 발병 부위에 따르면, 난소암, 간암, 대장암, 자궁경부암, 신장암, 위암, 전립선암, 유방암, 뇌종양, 폐암, 자궁암, 결장암, 방광암, 및 췌장암으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있고, 암의 치료적 관점에 따르면, 탁산계 항암제 내성 암일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체(microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 허용될 수 있는 담체에 의해 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반 또는 전달될 수 있다.

일 구체예로서, 상기 약학적 조성물은 유전자 치료를 위하여 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 유전자 치료는 유전자의 전달 및 발현 조절을 통해 질병을 치료하는 기술을 지칭하는 것으로서, 대상 miRNA 및 관련 유전자의 발현을 조절함으로써, 유효한 암 치료 효과를 얻을 수 있다. 이를 위하여, 상기 miR-150은 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터에 포함되어 생체 내로 운반 또는 전달될 수 있다. 상기 바이러스성 벡터로는 예를 들어, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스 등이 있고, 상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 리포솜, 세균인공염색체, 효모인공염색체 등이 있다. 이 밖에도 상기 miR-150은 생체적합성 고분자와 혼합(mixed) 또는 생체적합성 고분자에 봉입되어 생체 내로 운반 또는 전달될 수 있다.

이 외에도, 약학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구투여 (예를 들어, 근육 내, 정맥 내, 복강 내, 피하, 피내, 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 항암제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 항암제와는 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 특히, 일 실시예에 따르면, 상기 조성물은 탁산계 항암제에 대한 종양 세포의 민감성을 유의적으로 향상시킬 수 있으므로, 탁산계 항암제와의 병용을 통해 항암 효과를 증진시킬 수 있다.

상기 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에 활성 성분의 흡수도, 불활성율, 배설 속도, 질병 종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있으며, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라 증감될 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 miR-136을 추가로 포함할 수 있고, 또는 miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 저해시키는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 탁산계 항암제 내성 암의 치료용 약학적 조성물에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

또 다른 양상은 (a) 탁산계 항암제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 miR-150의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 miR-150의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 탁산계 항암제 내성 암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 용어, "후보 물질"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로, 탁산계 항암제 내성 암의 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다.

상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 등으로 투여될 수 있다.

상기 방법에서, 개체의 시료로부터 측정된 miR-150의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우, 탁산계 항암제 내성 암 치료제로 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 발현 수준의 변화는 개체의 발현 수준이 정상 대조군 또는 음성 대조군에 비하여 유사한 수준 또는 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하는 것을 포함할 수 있다.

또한, 상기 방법은 탁산계 항암제 내성 암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하고, 상기의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다. 여기에서, 개체의 시료로부터 측정된 miR-136의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우, 탁산계 항암제 내성암 치료제로 결정할 수 있고, 또는 miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, 및/또는 miR-503의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 탁산계 항암제 내성 암 치료제로 결정할 수 있다.

상기 스크리닝하는 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 진단용 조성물, 키트 또는 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.

일 양상에 따른 조성물은 탁산계 항암제 내성을 진단하는데 효율적으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 탁산계 항암제 내성 암의 치료 및 관련 치료제의 스크리닝에도 기여할 수 있다. 따라서, 탁산계 항암제 내성 암의 진단 및 치료 분야의 핵심 기술로 응용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 양성 난소 장액성 종양 (BT) 및 중증 난소 장액성 암종 (OC)의 샘플에서 miR-150의 발현을 qRT-PCR로 측정한 결과이다. (A) 중증 난소 장액성 암종 (OC) 내 miR-150의 발현은 난소 양성 장약성 종양 (BT)에 비해 0.2배 가량 유의적으로 감소되었다(P<0.05). (B) 부모 SKOV3 난소 암 세포 대비 PTX-내성 SKpac 세포에서 miR-150의 상대적인 발현 수준을 확인한 것이다. PTX-내성 SKpac 세포 내 miR-150의 발현 수준은 부모 SKOV3 난소 암 세포에 비해 0.5-0.6배 가량 유의적으로 하향조절되었다(P<0.05).
도 2는 루시퍼라제 리포터 어세이 등을 실시하여 miR-150이 난소암의 주요 발암 유전자인 Notch3을 직접적으로 표적화하는지 확인한 결과이다. (A) 왼쪽 패널은 Notch 3의 3'UTR 내 추정적인 miR-150의 표적부위 및 이의 돌연변이를 나타낸 것이고, 오른쪽 패널은 SKpac 세포에서 야생형 또는 Notch3 돌연변이 3'UTR을 보유한 리포터 유전자의 루시퍼라제 활성에 대한 miR-150의 효과를 비교한 결과이다. (B) miR-150의 과발현이 Notch 및 NICD3의 발현에 미치는 영향을 확인한 것으로서, pre miR-150 형질감염된 SKpac 세포주에서 48시간 및 72시간째 Notch 3 및 NICD의 유의적인 발현 감소가 관찰되었다.
도 3은 암 줄기세포(CSC)의 활성화에 대한 miR-150 형질감염의 효과를 스페로이드 형성 어세이 등을 통하여 확인한 결과이다. (A) 스페로이드 형성 어세이 실험 결과로서, 스페로이트의 수와 크기는 대조군, PTX 단독(40nM), 또는 pre-miR-음성 siRNA+ PTX 처리군에 비해, PTX 및 pre miR-150로 형질감염시킨 SKpac-17 세포에서 현저하게 감소됨을 확인하였다(*P<0.05). (B) PTX-내성 SKpac 세포(SKpac-12, SKpac-13, 및 SKpac-17 세포)에 pre miR-150이 처리되었고, 핵심적인 줄기세포 표지자의 mRNA 발현을 측정하였다. NOTCH3, ALDH1, CD24, CD133, 및 c-Kit의 평균 mRNA 발현 수준은 각각 대조군에 비해 0.67-배, 0.57-배, 0.70-배, 0.70-배, 및 0.51-배 가량 유의적으로 감소되었다(*P<0.05).
도 4는 SKpac 세포의 세포 생존률, 세포 증식 및 세포사멸에 대한 pre-miR-150의 효과를 확인한 결과이다. (A) WST 어세이의 실험결과로서, PTX 및 pre miR-150 처리군은 PTX 단독 처리 군에 비해 48시간째 SKpac 세포에서의 세포 생존률이 34% 가량 감소되었다. (B) 콜로니 형성 어세이의 실험결과로서, pre miR-150 단독 처리군과 PTX 및 pre miR-150 처리군은 PTX 단독 처리군, 또는 pre miR-음성+PTX 처리군에 비해 SKpac 세포의 증식이 각각 44% 및 43% 가량 감소되었다(*P<0.05). (C) TUNEL 어세이의 실험결과로서, pre miR-150 단독 처리군과 PTX 및 pre miR-150 처리군은 PTX 단독 처리군, 또는 pre miR-음성+PTX 처리군에 비해 SKpac 세포의 세포사멸이 각각 14.4% 및 40.6% 가량 증가되었다(*P<0.05).
도 5는 SKpac 세포의 이동 및 혈관신생에 대한 pre-miR-150의 효과를 확인한 결과이다. (A) 상처 치유 어세이의 실험결과로서, pre miR-150(40nM) 처리군은, PTX 단독 처리군 또는 pre miR-음성+PTX 처리군에 비해 세포의 이동이 각각 각각 28.7% 및 36% 가량 감소되었다(*P<0.05). (B) 관 형성 어세이의 실험결과로서, pre miR-150 형질감염 세포는 pre miR-음성 세포에 의한 대조군 HUVECs에 비해 각각 24시간째 61.1%, 48시간째 50.5%, 72시간째 42.6% 가량 관의 형성을 감소시켰다(*P<0.05).
도 6은 pre-miR-150 형질감염 후, SKpac 세포에서 단백질의 발현을 확인한 결과이다. (A) pre-miR-150 형질감염 이후, Notch 하류 분자의 발현을 확인한 것이다. (B) pre-miR-150 형질감염 이후, 세포 생존 및 세포 주기와 연관된 단백질의 발현을 확인한 것이다. (C) pre-miR-150 형질감염 이후, 세포사멸과 연관된 단백질의 발현을 확인한 것이다.
도 7은 다양한 난소암 세포주에서 miR-136의 발현을 확인한 결과이다. (A) SKOV3 세포주 및 항암제 내성 SKpac 세포주간 miR-135의 발현을 비교한 결과이다. 파크리탁셀-저항성 SKpac-10, SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17 세포에서 miR-136의 발현 수준은 SKOV3 세포주에서의 수준에 비해 유의적으로 낮았다(0.51-배, p< 0.005). 실험 결과는 평균±표준 편차로 나타내었다. 모든 분석은 3회 반복 실시되었고, 값은 상기 3번의 독립적인 실험의 평균을 나타낸다. (B) 다양한 암 세포주에서, Notch3 및 miR-136의 발현간 피어슨 상관 분석 결과이다. miR-136의 발현은 난소 암 세포주에서 발현되는 Notch3 단백질 수준과 반비례 관계에 있었다(n=5, X=-3.339, R²=0.696, p=0.036). (C) 난소암 환자 조직 샘플 (n=44)을 대상으로 qRT-PCR을 실시하여 miR-136의 발현을 확인한 결과이다. 각 그래프에서 내부 막대는 평균 값을 나타낸다. 난소암 환자 조직에서 miR-136의 평균 발현 수준은 대조군에 비해 유의적으로 낮았다(0.53-배, p=0.0001). (D) miR-136의 발현 수준에 따른 37명의 난소암 환자의 KaplaneMeier 생존 곡선을 나타낸 것이다. miR-136의 발현이 낮으면(정상 대조군에 비해 <0.2배), 상기 환자의 생존 기간이 짧아졌다(log rank test, p=0.019). (E) miR-136의 발현과 난소암 환자에서 임상적 단계의 진행(p=0.002) 및 양성 림프절 전이(p=0.048)간 관련성을 확인한 결과이다.
도 8은 항암제 내성과 miR-136 발현의 관련성 확인한 결과이다. (A) 세포를 miR-136 모방체로 형질감염시킨 후, 세포 생존력을 CCK-8을 통해 평가한 결과이다. 40nM 및 80nM의 PTX 존재 하에서, miR-136 모방체로 형질감염된 SKpac 세포의 생존력은 PTX 단독 처리 군에 비해 각각 11%, 및 21% 가량 감소되었다. (B) 콜로니 형성 어세이 결과로서, SKpac 세포는 300 세포/웰의 밀도로 씨딩되었고, 14일 동안 성장시켰다. miR-136 모방체로 형질감염시킨 세포에 형성된 콜로니 수는 PTX 단독 처리 군에 비해, PTX의 부재 하에서는 51.0%(p=0.007), PTX(40nM) 존재 하에서는 34.8% (p=0.026)로 각각 감소되었다. (C) TUNEL 어세이 결과로서, 세포사멸된 세포는 TUNEL 염색 및 유동 세포 계측법으로 검출되었다. miR-136 모방체와 PTX (40nM)의 병용 처리에 의한 세포사멸된 세포의 비율(33.2%)은 PTX (40nM)+ miR-음성 처리군에 비해(4.7%) 높았다(P<0.05). miR-136 모방체와 PTX(80nM)의 병용 처리에 의한 세포사멸된 세포의 비율는 PTX(80nM)+ miR-음성 처리군에 비해 증가되었다 (24시간째: 2.8% vs. 25.6%, p=0.028, 48시간째: 4.6% vs. 49.6%, p=0.001).
도 9는 miR-136 발현에 따른 항암제 내성 암 세포주의 변화를 확인한 결과이다. (A) 스페로이드 형성 어세이 결과로서, miR-136 모방체에 의한 형질감염은 대조군에 비해 스페로이드의 수를 0.76-배 감소시켰으며, 스페로이드의 크기 역시 대조군, PTX 단독 투여군, 및 PTX miR-음성군에 비해 작아졌다. (B) miR-136 모방체로 형질감염된 SKpac 세포를 대상으로 qRT-PCR를 실시한 결과로서, miR-136 모방체에 의한 형질감염은 암 줄기세포 마커인, ALDH1, CD24, CD133, 및 C-kit의 mRNA 발현을 감소시켰다. (C) 상처 치유 어세이 결과로서, miR-135의 이소성 발현은 SKpac 세포에서 이동을 저해시켰다. (D) 관 형성 어세이 결과로서, miR-136의 과발현은 암 줄기세포의 활성화를 저해시키고, SKpac 세포의 이동 및 관 형성능을 제한시켰다.
도 10은 다양한 난소암 세포주에서 ALDH1 (+) 세포의 모집단 분석을 실시한 결과이다. (A) 항암제 감수성 SKOV3 세포주 및 항암제 내성 SKpac 16 세포에서 ALDH1 효소 활성을 Aldefluor 분석을 통해 측정한 결과이다. DEAB는 ALDH1 특이적인 저해제로서, gating 영역을 확인하기 위하여 사용되었다. (B) SKOV3 세포주 및 항암제 내성 SKpac-12, SKpac-16, 및 SKpac-17 세포주에서 ALDH1 (+) 세포의 비율을 비교한 결과이다. (C) FACS-분류된 ALDH1 (+) 및 ALDH1 (-) 세포에서 ALDH1 mRNA의 발현을 비교한 결과이다. 모든 실험 데이터는 최소 2회의 독립적인 실험을 통해 얻은 결과에 대한 평균 값으로 나타내었다.
도 11은 항암제 내성 및 임상병리학적 파라미터와 ALDH1 (+)의 관련성 확인한 결과이다. (A) 다양한 항암제 내성 SKpac 서브라인에서 qRT-PCR을 통해 ALDH1 mRNA 발현을 확인 결과이다. 상대적인 발현 수준은 부모 SKOV3 세포주의 발현 수준으로 정규화되었다. (B) 항암제 내성 난소 암 조직과 항암제 감수성 난소 암 조직간 ALDH1 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인한 결과이다. (C) ALDH1 mRNA의 발현과 임상적 단계의 진행간 관련성을 확인한 결과이다.
도 12는 ALDH (+) 세포에서 microRNA의 발현 패턴 분석을 실시한 결과이다. (A) miRNA 어레이에 의한 miRNA 발현 프로파일의 계층적 클러스터링 결과로서, 상기의 클러스터링은 ALDH(-)와 비교하여, 통계적으로 유의한(p<0.05) ALDH1(+)의 증가 또는 감소를 보여준다. miRNA 발현 수준은 색상으로 구분되어진다. (B) qRT-PCR에 의한 후보 miRNA의 검증 결과로서, 막대 그래프는 ALDH1의 평균 발현 수준과 비교하여, 유동 세포 계측법-분류된 ALDH(+) 세포 내 miRNA의 발현을 보여준다. 모든 실험은 3회 반복 실시되었다.
도 13은 항암제 내성 및 임상병리학적 파라미터와 ALDH1(+)-연관 microRNA의 관련성 확인한 결과이다. (A) SKOV3 및 항암제 내성 SKpac 세포에서, ALDH1(+)-연관 microRNA의 발현 수준을 비교한 결과이다. (B) 항암제 내성 난소 암 조직과 항암제 감수성 난소 암 조직간 ALDH1(+)-연관 microRNA의 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인한 결과이다. (C) miR-503의 발현과 임상적 단계의 진행간 관련성을 확인한 결과이다. (D) miR-27a의 발현과 원격 전이간 관련성을 확인한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

Ⅰ. 항암제 내성 암 세포주에서 miR-150의 발현 변화에 따른 효과

실시예 1. 실험 과정 및 실험재료

1-1. 환자 및 조직 샘플

중증 난소 장액성 암종(HGSC)을 갖는 환자 58명의 샘플은 차 분당 의료 센터의 병리과 기록실로부터 수득하였다. 정량적 RT-PCR을 위하여, 상기 조직을 신선 급속 동결시켰다(fresh snap frozen). 대조군으로서, 양성 난소 장액성 종양 샘플이 사용되었다. 서면 동의서는 수술 전 모든 환자들에 의해 작성되었고, 모든 실험은 차 분당 의료 센터의 윤리 위원회로부터 승인 하에서 실시되었다.

1-2. 난소 암종 세포주

인간 난소 장액성 선암 세포주(SKOV3)는 American Tissue Type Collection (Manassas, VA, USA)으로부터 수득되었다. 다양한 파크리탁셀(PTX)-저항성 서브라인(SKpac-10, SKpac-12, SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17)의 구축은 종전에 기술된 바 있다. 간략히, SKOV3 세포를 단계적으로 증가하는 PTX의 농도 상에 8개월 이상 노출시킴으로써, SKpac 세포주를 구축하였다. 이러한 세포주를 10% 우태아 혈청, 100U/ml 페니실린, 및 10μg/ml의 스트랩토마이신이 첨가된 McCoy's 5A 배지(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA) 상에서 유지시켰다. 이후, 상기 배양물은 5% CO₂를 함유하는 가습 대기 조건, 및 37℃에서 인큐베이팅되었다.

1-3. miRNA 모방체의 형질감염

pre miR-150 및 pre miR-음성(pre miR-negative)은 Ambion(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)으로부터 구매하였고, 제조사의 지침에 따라 Lipofectamine 3000(Invitrogen/Life Technologies Carlsbad, CA, USA)으로 형질감염시켰다.

1-4. 정량적인 실시간 PCR

총 RNA는 TRIzol 시약(Invitrogen/Life Technologies Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 신선 조직 및 세포주로부터 추출되었고, TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 유래 특정 miRNA 프라이머와 시약을 사용하여 이를 역전사시켰다. 성숙 miRNAs에 대한 qRT-PCR은 Bio-Rad CFX96 실시간 PCR 검출 시스템(Bio-Rad, Hercules, CA)을 사용하여 수행되었다. 모든 PCR 반응은 3회 실시되었고, RNU48에 대한 상대적인 유전자 발현은 비교 역치 방법(comparative threshold method)을 사용하여 산출되었다 (2-ΔΔCt).

1-5. 루시퍼라제 리포터 어세이(Luciferase reporter assay )

SKpac-13, SKpac-16, SKpac-17 세포의 게놈 DNA로부터 Notch3(human NOTCH3, NM_000435: chromosome 19:15270445-15271472;1028bp)의 3′UTR 절편을 PCR을 통해 증폭시켰다. Notch3의 3′UTR 내 miR-150과의 추정적인 결합 부위는 TargetScan algorithm(targetscan.org)을 사용하여 확인되었다. 야생형 또는 돌연변이된 결합 자리는 pGL3-대조군 벡터(Promega, Mannheim, Germany)의 Nhel 및 Xhol 부위에 별도로 클로닝하였다. pGL3-대조군(100 ng) 및 pRL-TK 플라스미드(5ng; 정규화)는 24-웰 플레이트에 씨딩된 SKpac 세포에 형질감염되었다(3×10⁴ 세포/웰). 50pmol의 합성 pre miR-150(Ambion/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)이 상기 반응 과정에 첨가되었다. 루시퍼라제 활성은 이중-루시퍼라제-리포터 어세이 시스템을 사용하여 Infinite 200pro 연속 광도계(Tecan Group, Zurich, Switzerland) 상에서 제조사의 지침에 따라 측정되었다. 모든 실험은 3회 실시되었고, 레닐라 루시퍼라제 활성으로 정규화되었다.

1-6. 스페로이드-형성 어세이(Spheroid-forming assay)

스페로이드-형성 어세이는 암 줄기세포 활성에 대한 miR-150의 효과를 검증하기 위하여 수행되었다. SKpac-17 세포는 pre miR-150 또는 pre miR-음성(pre miR-negative)으로 형질감염되었다. 세포는 20ng/ml의 상피 성장인자(Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10ng/ml의 염기성 섬유아세포 성장인자(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0.4%의 우혈청 알부민(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 및 5μg/mL의 인슐린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)이 첨가된 무-혈청 DEME/F12 배지(Gibco/Life Technologies, Grand Island, NY, USA)를 포함하는 초저 부착 표면 6-웰 배양 플레이트(Corning, Acton, MA, USA)에 1000 세포/cm²의 밀도로 플레이팅되었다. 스페로이드의 형성(스페로이드 당 50-100개의 세포)은 씨딩 후 7일째에 평가되었다.

1-7. WST 어세이(WST assay )

SKpac-12, 또는 SKpac-17 세포는 6-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰로 씨딩되었다. 다음날, 세포를 pre miR-150로 형질감염시키고, 48시간 동안 인큐베이팅시켰다. 이후, 처리된 세포를 96-웰 배양 플레이트에 웰당 1×10⁴세포/웰로 재-플레이팅시켰다. 이로부터 48시간 후, 세포는 CCK(Cell Counting Kit-8, Dojindo, Japan)의 프로토콜에 따른 수용성 tetrazoliumsalt(WST) 어세이에 의해 측정되었다. 흡광도는 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 판독되었다. 모든 WST 실험은 3회 실시되었고, 이는 적어도 3회 반복되었다.

1-8. 콜로니-형성 어세이(Colony-forming assay)

SKpac-16, 또는 SKpac-17 세포는 6-웰 플레이트에 웰당 1Х10⁵ 세포/웰로 씨딩되었다. 다음날, 세포에 pre miR-150을 처리하고, 48시간 동안 인큐베이팅시켰다. 이후, 처리된 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 300개의 세포로 재-플레이팅시켰다. 이로부터 14일 후, 콜로니를 10분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정시킨 뒤, 헤마톡실린을 사용하여 시각화시킨 뒤, 50개 이상의 개별 세포를 포함하는 콜로니의 수를 세었다.

1-9. 세포사멸(Apoptosis) 분석을 위한 TUNEL 어세이

SKpac-12 및 SKpac-17 세포에 pre miR-150을 형질감염시킨 뒤, TUNEL 어세이가 수행되었다. 48시간 후, 세포사멸 세포는 In Situ Cell Death Detection kit(Roche, Mannheim, Germany)를 사용하여 분석되었다. 2Х10⁷개의 세포는 75% 에탄올로 2시간 동안 -20℃에서 고정화되었다. 이를 PBS로 2회 세척한 후, 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1% 시트르산 나트륨과 함께, 아이스 상에서 2분 동안 인큐베이션시켰다. PBS로 2회 세척한 후, 상기 세포들은 TUNEL 표지화된 혼합물과 함께 1시간 동안 37℃의 암실 조건에서 인큐베이션되었다. 상기 샘플은 PBS로 2회 세척되었고, 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS, Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 의해 분석되었다.

1-10. 상처 치유 어세이(Wound healing assay)

SKpac-12 및 SKpac-17 세포에 pre miR-150을 형질감염시킨 뒤, 상처 치유 어세이가 수행되었다. 세포는 24-웰 조직 배양 플레이트에 씨딩되었고, 상기 세포는 컨플루언시(confluence) 상태까지 배양되었다. 무세포 영역은 멸균 황색 피펫 팁을 사용하여 세포 표면을 긁어냄으로써 생성되었다. 상처가 유발된 단일층을 PBS로 2회 세척하여 부유 세포 잔해물을 제거하였다. 이후, 상기 단일층은 세포 배양배지에 인큐베이팅되었고, 결손 폐쇄율(defect closure)은 16시간 동안 모니터링되었다. 개별 세포는 각 실험에 대하여 적어도 5개의 필드에서 평균으로서 정량화되었다.

1-11. 혈관신생 어세이(Angiogenesis assay)

메트리겔(BD Biosciences, California, USA)을 넓적 바닥 96-웰 플레이트에 넣고, 37℃에서 1시간 동안 중합시켰다. 1% FBS를 함유하는 M199에서 인큐베이팅한 HUVECs은 트립신 처리 후 수득되었고, 이를 M199에 재부유시킨 뒤, 이를 메트리겔 층 상에 1Х10⁴ 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, pre miR150에 의해 감염된 SKpac-17 세포의 상층액이 첨가되었다. 이로부터 24시간, 48시간, 및 72시간 후, 관 형성을 관찰하였다.

1-12. 웨스턴 블롯

세포를 아이스 상에서 30분 동안 단백질 추출 완충액(Pro-Prep, iNtRON Biotechnology, Korea)으로 용해시켰다. 이를 15분 동안 4℃, 13,000rpm에서 원심분리한 후, 상층액으로부터 단백질을 Bradford 어세이(Sigma, Saint Louis, USA)를 사용하여 측정하였다. 동일한 양의 총 단백질을 10% SDS-PAGE로 분리하고, 이를 니트로셀룰로오스 막(Millipore Co., Bedford, MA, USA)으로 옮겼다. 이를 실온에서 1시간 동안 5% 탈지유로 차단시킨 후, 막을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰고, 뒤이어, 1:5000의 HRP 결합 항마우스 항체 또는 1:5000의 항-토끼 이차 항체와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 다음으로, 막에 형성된 벤드는 ECL(증강된 루민올-기반 화학발광) 검출 키트(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)에 의해 시각화되었다. 단백질의 정량은 Image Lab™ 소프트웨어(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, US) 및 ChemiDoc? XRS+을 사용한 단백질 밴드 농도 측정용 디지털 분석에 의해 수행되었다. 동량의 로딩은 베타-엑틴으로 막을 재조사(reprobing)함으로써 확인되었다.

1-13. 통계적 분석

통계적 분석은 SPSS 소프트웨어 버젼 V20.0.0(IBM SPSS)를 사용하여 수행되었다. Student's t-테스트는 항암제 내성 세포주와 대조군 사이의 통계적 유의성을 결정하기 위하여 사용되었다. 각각의 결과에 대하여, 95% 신뢰 구간 내에서 유의한 변화가 분석되었다(P<0.05).

실시예 2. 중증 장액성 난소 암종(HGSC) 및 PTX-저항성 난소 암세포(SKpac)에서 miR-150의 발현 변화 확인

본 실시예에서는 양성 난소 장액성 종양(BT) 및 중증 난소 장액성 암종(OC)의 샘플에서 miR-150의 상대적인 수준을 비교하고자, 각각의 샘플에서 miR-150의 발현을 qRT-PCR을 통해 분석하였다. 그 결과, 도 1의 A에 나타낸 바와 같이, 중증 난소 장액성 암종 샘플에서 miR-150의 발현 수준은 BT 샘플에 비해 0.2배 가량 유의적으로 하향 조절됨을 확인하였다(P<0.001). 또한, 내인성 miR-150의 수준이 항암제 내성과 연관이 있는지 조사하기 위하여, SKOV3 및 SKpac 세포로부터 분리된 RNA을 대상으로, 실시간 qRT-PCR을 실시하여, 각각의 세포에서 miR-150의 발현 수준을 정량화하였다. 그 결과, 도 1의 B에 나타낸 바와 같이, PTX-내성 SKpac 세포(SKpac-10, SKpac-12, SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17)에서 miR-150의 발현 수준은 SKOV3 암 세포에 비해, 유의적으로 낮게 관찰되었다(P<0.05).

실시예 3. Notch3의 발현 조절에 대한 miR-150의 작용 기작 확인

SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17 세포주에서 miR-150이 Notch3을 직접적으로 표적화하는지 확인하기 위하여, 루시퍼라제 리포터 어세이를 실시하였다. 이를 위하여, SKOV3 세포에 Notch3 3'UTR 상류의 반딧불 루시퍼라제 리포터를 함유하는 pGL3 벡터 또는 Renilla 루시퍼라제를 발현하는 qRL-TK 벡터 (대조군)와, 50pmol의 pre miR-150 또는 대조군 miRNA가 동시-형질감염되었다. 그 결과, 도 2의 A에 나타낸 바와 같이, Pre miR-150으로 형질감염된 세포 내 루시퍼라제 활성은 대조군 miRNA로 형질감염된 세포에 비해 유의적으로 낮았던 반면 (25±5%), pre miR-150의 형질감염은 변이된 NOTCH3 3'UTR을 함유하는 리포터 구조물의 루시퍼라제 활성에는 유의적인 영향을 미치지 않았다.

또한, Notch3 및 NICD의 단백질 발현이 miR-150에 의해 조절될 수 있는지를 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 pre miR-150 형질감염을 이용한 내인성 miR-150의 강제 발현에 의한 SKpac 세포내 기능-획득 분석을 실시하였으며, pre miR-음성 처리군이 음성 대조군으로 사용되었다. miR-150은 SKpac 세포에서 pre miR-150의 형질감염에 의해 안정적으로 과발현되어 mi-150의 발현을 5배 가량 증가시켰다(미도시). 또한, 도 2의 B에 나타낸 바와 같이, miR-150의 강제 발현은 SKpac-12 및 SKpac-17 세포에서, Notch3 및 NICD 모두의 수준을 각각 34%-50%, 및 27%-52% 가량 감소시켰다. 종합하면, miR-150은 SKpac 세포 내 Notch3의 3'UTR을 표적화하여 Notch3 및 NICD의 발현 조절에 직접적으로 관여함을 알 수 있었다.

실시예 4. 암 줄기세포의 활성화에 대한 miR-150의 효과 확인

암 줄기세포(CSC)의 활성화에 대한 miR-150 형질감염의 효과를 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 파크리탁셀-내성 SKpac 세포를 대상으로, 스페로이드-형성 어세이를 실시하였고, 줄기세포능 유전자의 mRNA 변화를 실시간 RT-PCR로 확인하였다. 그 결과, 도 3의 A에 나타낸 바와 같이, pre miR-150+PTX 처리군의 스페로이드의 수는 PTX 단독 처리군(pre miR-150) 또는 PTX+miR-음성 처리군(Pre miR-negative+PTX)에 비해 0.38배 가량 유의적으로 감소되었다. 또한, SKpac 세포에서, 스페로이드의 크기 역시 PTX 처리와 pre miR-150 형질감염을 조합한 경우(pre miR-150+PTX), PTX 단독 처리군 또는 PTX+miR-음성 처리군에 비해 유의적으로 감소되었다. 즉, PTX의 단독 처리는 스페로이드 형성에 어떠한 영향도 미치지 않았으나, PTX와 함께 추가적으로 pre miR-150을 처리한 경우, PTX-내성 난소 암세포에서 암 줄기세포 활성화를 감소시킴을 알 수 있었다. 또한, 도 3의 B에 나타낸 바와 같이, Pre miR-150 형질감염 이후, NOTCH3, ALDH1, CD24, CD133, 및 c-Kit의 평균 mRNA 발현 수준은 대조군에 비해 각각 0.67-배, 0.57-배, 0.70-배, 0.70-배, 및 0.51-배 가량 감소되었다(각각 P=0.046, P=0.019, P=0.012, P=0.031, P=0.002). 이러한 실험결과는 miR-150이 암 줄기세포의 활성 조절에 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다.

실시예 5. miR-150의 상향조절에 따른 항종양 효과 확인

만일 파크리탁셀(PTX)에 대한 저항성 또는 내성이 miR-150의 하향조절과 관련이 있는 것이라면, miR-150 발현 수준의 인위적인 증가는 PTX에 대한 민감도를 조절할 수 있다. 이에, SKpac 세포(SKpac-12, 및 SKpac-17)에서 단일 약제 또는 PTX 화학 요법제와의 병용 제제로서 pre miR-150의 효과를 확인하기 위하여, WST 어세이를 사용하여 세포 생존률을 평가하였다. 5개의 분리된 WST 어세이 실험에서, SKpac 세포를 pre miR-150 단독 처리(pre miR-150), PTX 단독 처리(PTX), Pre miR-음성 단독 처리(Pre miR-negative), PTX 및 miR-음성 처리(Pre miR-negative+PTX), PTX 및 pre miR-150의 처리(pre miR-150+PTX) 중 어느 하나로 치료를 실시하였다. 그 결과, 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 40nM의 PTX 처리와 함께, pre miR-150으로 형질감염된 세포의 경우, 처리 후 48시간 째, SKpac 세포의 수가 PTX 단독 처리군에 비해 34% 가량 감소되었다. Pre miR-150의 투여는 투여 후 48시간 째, 종양 세포의 생존률을 일부 감소시키는 것으로 나타났다. 분석된 모든 경우에 있어서, PTX 단독 처리군, 및 PTX+pre miR 음성 처리군에 비해, PTX 및 pre miR-150을 함께 처리된 SKpac 세포에서 향상된 항-종양 활성이 관찰되었다.

또한, pre miR-150 단독 처리, 또는 PTX 및 pre miR-150의 처리에 따른 SKpac 세포의 성장 저해 효과, 다시 말하면, 항증식 효과를 확인하기 위하여, 콜로니 형성 어세이를 실시하였다. 그 결과, 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, pre miR-150 단독 처리군과 PTX 및 pre miR-150 처리군은 PTX 단독 처리군, 또는 pre miR-음성+PTX 처리군에 비해 각각 44% 및 43% 가량 세포의 증식을 감소시켜, SKpac 세포의 클론 성장을 유의하게 억제시켰다(86%, ^*P<0.05). 종합하면, miR-150이 단독 처리되거나 PTX와 함께 병용될 때, PTX 내성 SKpac 세포에 대하여 항증식 효과를 나타냄을 알 수 있었다.

아울러, 세포사멸에 대한 miR-150의 효과를 확인하기 위하여, SKpac 세포(SKpac-12, SKpac-16, SKpac-17)를 pre miR-150으로 형질감염시킨 후, TUNEL 어세이를 실시하였다. 그 결과, 도 4의 C에 나타낸 바와 같이, pre miR-150 단독, 및 40nM의 PTX의 처리와 함께 Pre miR-150으로 형질감염된 경우, 세포사멸은 PTX 단독 처리군 또는 PTX+pre miR-음성 처리군(3.5% 및 4.3%, ^*P<0.05)에 비해, 각각 14.4% 및 40.6% 가량 증가되었다. 종합하면, pre miR-150 형질감염은 그 자체로써 또는 PTX에 대한 종양 세포의 민감도를 증가시킴으로써, 종양 세포 증식을 감소시키고 PTX-내성 난소암 세포 내 세포사멸을 유도하였다.

실시예 6. 세포의 이동 및 혈관 신생에 대한 miR-150의 효과 확인

세포의 이동 및 혈관신생은 종양의 진행 및 전이에 영향을 미치는 중요한 인자이다. 본 실시예에서는 세포의 이동 및 혈관신생에 대한 miR-150의 효과를 확인하기 위하여, 창상 치료 어세이 및 관 형성 어세이를 실시하였다. 그 결과, 도 5의 A에 나타낸 바와 같이, pre miR-150(40nM) 처리군의 세포 이동은, PTX 단독 처리군 또는 pre miR-음성+PTX 처리군에 비해 유의적으로 감소되었다 (각각 28.7 % 및 36%, ^*P<0.05). 또한, 도 5의 B에 나타낸 바와 같이, pre miR-150 형질감염 세포는 pre miR-음성 세포에 의한 대조군 HUVECs에 비해 각각 24시간째 61.1%, 48시간째 50.5%, 72시간째 42.6% 가량 관의 형성을 감소시켰다 (^*P<0.05). 반면, PTX 단독 처리군 또는 pre miR-음성+PTX 처리군의 세포에서는 상기의 감소 효과가 관찰되지 않았다. 즉, 이러한 실험결과는 pre miR-150의 형질감염은 PTX-내성 난소 암 세포에서 종양 세포의 이동 및 혈관신생을 유의적으로 저해함을 나타내는 것이다.

실시예 7. 기능성 단백질의 발현에 대한 miR-150의 효과 확인

본 실시예에서는 Pre miR-150의 처리에 따른 SKpac-13 세포 내 Notch3 하류 표적 단백질의 발현 변화를 분석하였다. 그 결과, 도 6의 A에 나타낸 바와 같이, NICD3 및 Hey2를 포함하는 Notch3 하류 표적 단백질의 발현은 Pre miR-150 형질감염에 의해 더욱 하향조절되었다. 형질전환 이후 24시간 째, NICD3 및 Hey3의 수준은 대조군에 비해 각각 0.56-배 및 0.67-배 가량 유의적으로 감소된 반면 (P=0.05 및 P<0.05, 각각), Hes1 및 Hey1의 발현에는 큰 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 miR-150이 Notch3 하류 단백질의 발현을 선택적으로 조절함을 나타내는 것이다.

또한, pre miR-150이 처리된 SKpac-13 세포에서, DNA-PK, pS6, S6, NF-

B, p21 및 p27를 포함하는 세포 생존 및 세포 주기와 관련된 단백질의 발현을 분석하였다. 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 형질감염 이후 24시간 째, DNA-PK, pS6, S6, cyclin D3, p21, p27 및 NF-

B의 발현 수준은 현저히 감소되었고 (대조군과 비교하여, DNA-PK: 0.18-배; PS6: 0.25-배; S6: 0.27-배), 세포 주기와 관련된 단백질 역시 하향조절되었다 (대조군과 비교하여, cyclin D3: 0.36-배; p21: 0.4-배 p27: 0.08-배; NF-

B: 0.10-배)(^*P<0.05).

세포사멸과 연관된 단백질에 대해서도, 도 6의 C에 나타낸 바와 같이, pre miR-150의 처리는 BCL-W, BCL-2, 및 BCL-XL을 포함하는 항-세포사멸 단백질의 발현을 대조군에 비해 각각 0.51-배, 0.42-배, 및 0.51-배 가량 유의적으로 감소시켰다(각각 P=0.002, P=0.018, 및 P=0.094). 또한, 5개의 전-세포사멸 단백질 Bad, Bak, Bim, Bid 및 Bax의 수준은 대조군에 비해 각각 3.71-배, 4.57-배, 2.83-배, 1.41-배, 및 1.23-배 가량 증가시켰다. 즉, 이러한 실험결과는 miR-150이 PTX-저항 난소 암 세포에서 항-세포사멸 유전자의 저해 및 세포사멸 유전자의 증가를 통해 세포사멸을 유도할 수 있음을 나타내는 것이다.

Ⅱ. 항암제 내성 암 세포주에서 miR-136의 발현 변화에 따른 효과

실시예 1. 다양한 난소암 세포주에서 miR-136 발현의 확인

miR-136의 발현과 난소암 세포의 항암제 내성 및 Notch3 단백질 발현간 관련성을 확인하기 위하여, 본 실시예에서는 SKOV 난소암 세포주 및 기존에 구축된 PTX-저항성 서브라인, SKpac-10, SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17을 대상으로 PCR을 실시하였다. 이전에 보고된 바와 같이, PTX-저항성 난소암 세포에서 Notch3 단백질의 발현 수준은 부모 SKOV3 세포에서의 수준에 비해 유의적으로 높았다. 또한, 도 7의 A에 나타낸 바와 같이, Notch3를 과발현하는 PTX-저항성 SKpac-10, SKpac-13, SKpac-16, 및 SKpac-17 세포에서 miR-136의 발현 수준은 SKOV3 세포에 비해 유의적으로 낮았다(평균 0.51-배, p<0.05). 또한, miR-136이 Notch3를 조절하는지 여부를 확인하기 위하여, 다양한 난소 암 세포주(SKOV3 및 SKpac-10, SKpac-13, SKpac-16, SKpac-17)에서 Notch3 단백질과 miR-136의 발현 수준간 상관 관계를 조사하였다. 그 결과, 도 7의 B에 나타낸 바와 같이, miR-136의 발현은 상기 난소 암 세포주에서 발현되는 Notch3 단백질 수준과 반비례 관계에 있었다 (Pearson's correlation, X= -3.339, R² =0.696, p=0.036). 한편, 난소암 환자 (OSC)에서 miR-136의 임상적 역할을 추가적으로 확인하기 위하여, 일련의 난소암 환자 조직 샘플(n=44)을 대상으로 qRT-PCR을 실시하여 miR136의 발현을 측정하였다. 그 결과, 도 7의 C에 나타낸 바와 같이, 상기 환자에서 miR-136의 발현은 정상 대조군 조직보다 0.53-배 낮게 관찰되었다(p<0.001). 다음으로, miR-136의 발현과 환자의 생존률간 관련성을 생존 데이터를 확인할 수 있는 38개의 케이스에서 조사하였다. 그 결과, 도 7의 D에 나타낸 바와 같이, KaplaneMeier 곡선은 miR-136의 발현이 낮은 환자(정상 대조군에 비해 <0.2배)는 miR-136의 발현이 높은 환자(정상 대조군에 비해 >0.2배)보다 생존률이 유의적으로 낮음을 확인할 수 있었다(log rank, p=0.019). 또한, 도 7의 E에 나타낸 바와 같이, miR-136의 하향 조절(정상 대조군에 비해 <0.2배)은 임상적 단계의 진행(III-IV, p=0.002), 및 양성 림프절 전이와도 관련이 있었다(p=0.048). 이러한 실험 결과는 miR-136의 낮은 발현은 난소암 환자의 좋지 못한 예후와 관련되어 있음을 나타내는 것이다.

실시예 2. 항암제 내성과 miR-136 발현의 관련성 확인

PTX-저항성 SKpac 세포의 항암제 감수성 및 증식 활성에 있어서, miR-136의 역할을 조사하기 위하여, miR-136 모방체(mimic)로 형질감염된 SKpac 세포를 대상으로 세포 생존력, 세포 증식, 세포사멸 분석을 실시하였다. Notch3을 과발현하는 SKpac 세포에 대한, miR-136 모방체 및 PTX(40nM 및 80nM)의 처리는 처리 후 24시간 째, 세포 생존력을 유의적의 감소시켰으며(각각 11% 및 21%, p=0.5 및 p=0.02), WST 어세이에서 측정된 결과, 도 8의 A에 나타낸 바와 같이, PTX 단독의 처리는 세포 생존력에 아무런 영향을 미치지 못하였다. 또한, 도 8의 B에 나타낸 바와 같이, miR-136 모방체 단독 또는 PTX와의 병용은 miR-음성 형질감염된 대조군 세포 및 PTX 단독 처리 세포에 비해, 각각 51%, 및 36% 정도로 SKpac 세포의 콜로니 형성능을 저해시켰다(p<0.05). 또한, miR-136의 과발현이 PTX에 의해 유도된 세포독성을 증가시키는지를 확인하기 위하여, TUNEL 분석을 통해 세포사멸의 정도를 분석하였다. 그 결과, 도 8의 C에 나타낸 바와 같이, miR-136 모방체로 형질감염된 세포는 miR-음성 형질감염된 대조군 세포에 비해, 처리 후 48시간째, 보다 많은 수의 세포사멸이 관찰되었고(1.63% vs. 7.03%, p=0.05), miR-136 모방체와 PTX (40nM 또는 80nM)의 병용 처리는 PTX (40nM)+ miR-음성 처리군(48시간째: 4.7% vs. 33.2%, p=0.049) 및 PTX (80nM)+miR-음성 처리군(24시간째: 2.8% vs. 25.6%, p=0.028; 48시간째: 4.6% vs. 49.6%, p=0.001)에 비해 세포사멸의 비율을 증가시켰다. 이러한 실험결과를 종합하면, miR-136의 과발현은 그 자체 또는 PTX와 병용함으로써, 항암제 내성 난소암 세포의 세포 생존력, 세포 증식능을 감소시키고, 세포사멸을 증가시킴을 알 수 있다.

실시예 3. miR-136 발현에 따른 항암제 내성 암 세포주의 변화

SKpac 세포에 대한 암 줄기세포(cancer stem cell)의 활성화에 있어서, miR-136의 역할을 조사하기 위하여 스페로이드 형성 어세이를 실시하였다. 그 결과, PTX의 단독 처리에 반응하지 않았던 SKpac 세포에서 miR-136의 과발현은 스페로이드 형성을 저해시켰다. 구체적으로, 도 9의 A에 나타낸 바와 같이, PTX+miR-136 모방체-형질감염된 세포는 이에 상응하는 PTX-miR-음성 모방체-형질감염 세포에 비해 보다 적은 수, 그리고 작은 스페로이드를 형성하였다. 또한, 암 줄기세포 마커인, ALDH1, CD24, CD133, 및 C-kit의 mRNA 발현을 평가한 결과, 도 9의 B에 나타낸 바와 같이, miR-136 모방체에 의한 형질감염은 대조군 세포와 비교하여, 이들 마커의 발현을 각각 0.64-배, 0.84-배, 0.76-배, 및 0.46-배로 발현시켜, 발현 수준을 감소시켰다(각각 p=0.013, p=0.013, p< 0.01, 및 p=0.075). 또한, SKpac 세포의 이동 활성 및 혈관신생의 조절에 있어서, miR-136의 역할을 조사하기 위하여, 상처 치유 및 관 형성 어세이를 실시하였다. 상처 치유 어세이 결과, 도 9의 C에 나타낸 바와 같이, 분석 6시간 후, miR-136 모방체로 형질감염된 세포에서 평균 이동 세포의 평균 수는 miR-대조군 형질감염 세포에 비해 74.5% 가량으로, 보다 낮게 관찰되었는 바(P=0.003), miR-135의 이소성 발현은 SKpac 세포에서 이동을 저해시킴을 확인할 수 있었다. 관 형성 어세이 결과, 도 9의 D에 나타낸 바와 같이, miR-136 모방체로 형질감염된 세포 유래의 상등액이 처리된 HUVECs에서, miR-대조군 형질감염 세포에 의한 경우와 비교하여, 관의 형성이 크게 감소되었는 바(48시간째: 43.6%, 72시간째: 45.0%), miR-136의 과발현은 SKpac 세포에서 관 형성을 저해시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과는 miR-136의 과발현은 암 줄기세포의 활성화를 저해하고, SKpac 세포의 이동 및 관 형성능을 제한시킴을 나타내는 것이다.

Ⅲ. 항암제 내성 암 세포주에서 ALDH1 (+)-연관 microRNA의 발현 변화에 따른 효과

실시예 1. 다양한 난소암 세포주에서 ALDH1 (+) 세포의 모집단 분석

본 실시예에서는, 난소 암 세포주(SKOV3, A2780, 및 OVCAR 3), PTX-저항성 서브라인(SKpac-12, SKpac-16, SKpac-17, A2780pac, 및 A2780cis), 원발성 종양 세포(SCN1-7)에서, 잠재적인 암 줄기세포 마커인 ALDH1(+) 세포 군을 조사하였다.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, ALDH1(+) 세포는 난소 암 세포주에서는 0.9 - 17.2%, 원발성 종양 세포에서는 0.4-4.0%로 존재함을 확인하였다.

FACS 분석에 의한 항암제 내성 SKpac 세포에서의 ALDH(+) 개체군의 비율 (4.46±0.71%)은 도 10의 A 및 B에 나타낸 바와 같이, 부모 SKOV3 세포 (0.9±0.2%)에 비해 유의적으로 증가하였으며, 이를 통해 ALDH 1(+) 세포와 항암제 내성간 관련성을 확인하였다. 또한, FACS-분류된 ALDH (+) 세포가 ALDH-1의 발현을 증가시키는지를 확인하기 위하여, ALDH1 m RNA에 대한 qRT-PCR을 실시하였다. 그 결과, 도 10의 C에 나타내 바와 같이, FACS-분류된 ALDH1(+) 개체군은 ALDH1(-) 개체군에 비해 2.5배 가량 높은 ALDH1 mRNA의 발현을 확인하였다.

실시예 2. 항암제 내성 및 임상병리학적 파라미터와 ALDH1 (+)의 관련성 확인

본 실시예에서는 qRT-PCR을 실시하여 난소 암 세포 및 34개의 난소암 조직 샘플에서 ALDH1 mRNA의 발현을 조사하였다. 항암제 내성 SKpac 세포주의 ALDH1 mRNA 발현 수준을 항암제 감수성 SKOV3 세포주에서의 수준과 비교하였다. 그 결과, 도 11의 A에 나타낸 바와 같이, 항암제 내성 SKpac 세포주에서의 ALDH1 mRNA 발현 수준은 SKOV3 세포주에 비해 12 내지 124-배 가량 현저하게 상승되었다. 또한, 정상 상피세포와 비교하여 ALDH1 mRNA의 상대적인 발현 수준을 산출하여, 인간 난소암 조직 샘플에서 항암제 내성군(chemoresistant group)과 항암제 감수성군 (chemosensitive group)간의 발현양을 비교하였다. 도 11의 B에 나타낸 바와 같이, 항암제 내성 군에서의 ALDH1 mRNA의 발현(11-배)은 항암제 감수성군에서의 발현 (4.29-배)에 비해 현저하게 증가되었다. 아울러, 난소 암에서 ALDH1의 역할을 평가하기 위하여, ALDH1 mRNA의 발현과 임상적 단계의 진행과 같은 임상병리학적 파라미터간 관련성을 확인하였다. 상기의 비교를 위하여, 환자들은 ALDH1 고발현군(2-배 이상), 및 ALDH1 저발현군(2-배 이하)으로 분류되었다. 그 결과, 도 11의 C에 나타낸 바와 같이, ALDH1의 높은 발현은 임상적 단계의 진행과 유의적인 관련성이 있음을 확인하였다(p=0.019).

실시예 3. ALDH(+) 세포에서 microRNA의 발현 패턴 분석

본 실시예에서는 ALDH 1(+) 세포의 mRNA 발현 프로파일을 특성화하기 위하여, 4,560개의 인간 전구체 및 성숙 miRNA 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 Affymetrix GeneChip 마이크로어레이 분석을 실시하였다.

그 결과, 하기 표 2 및 도 12의 A에 나타낸 바와 같이, ALDH1(-) 세포와 비교하여, ALDH1(+) 세포에서 1.5배 이상 과발현되는 총 6종의 miRNA를 확인할 수 있었다(miR-424 [1.98-배], miR-346 [1.95-배], miR-503 [1.86-배], miR-27a [1.66-배], miR-23b [1.53-배], 및 miR-27b [1.50-배]).

ALDH1(+) 세포에서 발현이 하향조절되는 miRNA는 확인되지 않았다. 또한, 상기 마이크로어레이 분석 결과를 검증하기 위하여, 실시간 RT-PCR을 실시하여, ALDH1(+) 세포와 ALDH1(-) 세포간 상기 총 6 종의 miRNA의 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 12의 B에 나타낸 바와 같이, 상기 마이크로어레이 분석과 유사한 결과를 확인할 수 있었다(miR-424 [1.62-배], miR-346 [3.25-배], miR-503 [1.66-배], miR-27a [2.08-배], miR-23b [1.98-배], 및 miR-27b[3.09-배]).

실시예 4. 항암제 내성 및 임상병리학적 파라미터와 ALDH1(+)-연관 microRNA의 관련성 확인

본 실시예에서는 실시예 3의 miRNA가 난소암의 항암제 내성에 미치는 영향을 평가하기 위하여, 난소 암 세포 및 34개의 난소암 조직 샘플을 대상으로 qRT-PCR을 실시하여 이들 miRNA의 발현을 조사하였다. 항암제 내성 SKpac 세포주의 miRNA 발현 수준을 항암제 감수성 SKOV3 세포주에서의 수준과 비교하였다. 그 결과, 도 13의 A에 나타낸 바와 같이, 상기의 miRNA 중에서, miR-23b (2.8-배, p=0.039), miR-27b (3.5-배, p=0.007), miR-346 (2.7-배, p=0.02), 및 miR-503 (2.2-배, p=0.049)의 발현 수준은 SKOV3 세포주에 비해 SKpac 세포주에서 유의적으로 높게 관찰되었다. 또한, 정상 상피세포와 비교하여 상기 miRNA의 상대적인 발현 수준을 산출하여, 인간 난소암 조직 샘플에서 항암제 내성군과 항암제 감수성군 간의 발현양을 비교하였다. 그 결과, 도 13의 B에 나타낸 바와 같이, miR-23b(3.5-배 vs. 0.6-배 p=0.037), miR-27b (5.5-배 vs.1.6-배, p=0.040) 및 miR-424(2.0-배 vs. 0.7-배, p=0.047)의 발현 수준은 항암제 감수성군에 비해 항암제 내성군에서 유의적으로 높게 관찰되었다. 아울러, 난소 암에서 상기 miRNA의 역할을 평가하기 위하여, 상기 mRNA의 발현과 임상적 단계의 진행, 원격 전이(distant metastasis)와 같은 임상병리학적 파라미터간 관련성을 확인하였다. 상기의 비교를 위하여, 환자들은 miRNA 고발현군(1.5-배 이상), 및 miRNA 저발현군(1.5-배 이하)으로 분류되었다. 그 결과, 도 13의 C 및 D에 나타낸 바와 같이, miR-503의 높은 발현은 임상적 단계의 진행(단계 III 및 IV, p=0.033)과, miR-27a의 높은 발현은 원격 전이와 유의적인 관련성이 있음을 확인하였다(p=0.046).

<110> SUNGKWANG MEDICAL FOUNDATION <120> A composition, kit and method for diagnosing and treating taxane-based anticancer drugs resistance cancer <130> PN121702KR <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> miR-150 <400> 1 cugguacagg ccugggggac ag 22 <210> 2 <211> 84 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pre miR-150 <400> 2 cuccccaugg cccugucucc caacccuugu accagugcug ggcucagacc cugguacagg 60 ccugggggac agggaccugg ggac 84

Claims

miR-150 (MicroRNA-150)의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는, 파크리탁셀(Paclitaxel) 내성 난소암 진단용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 제제는 miR-150에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 또는 프로브를 포함하는 것인, 진단용 조성물.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 miR-136(MicroRNA-136), miR-23b(MicroRNA-23b), miR-27b(MicroRNA-27b), miR-326(MicroRNA-326), miR-424(MicroRNA-424), miR-503(MicroRNA-503), 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 추가로 포함하는 것인, 진단용 조성물.
청구항 1, 2, 및 4 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 파크리탁셀(Paclitaxel) 내성 난소암 진단용 키트.
청구항 5에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, 및 DNA 키트로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 진단용 키트.
(a) 개체의 시료로부터 miR-150(MicroRNA-150)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 miR-150의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파크리탁셀(Paclitaxel) 내성 난소암의 진단을 위한 정보제공방법.
청구항 7에 있어서, 상기 (a) 단계는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩에 의하여 miR-150의 발현 수준을 측정하는 것인, 정보제공방법.
청구항 7에 있어서, 상기 시료는 종양 조직인 것인, 정보제공방법.
청구항 7에 있어서, 상기 측정된 miR-150의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 감소된 경우, 파크리탁셀 내성 난소암으로 판정하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
청구항 7에 있어서, 개체의 시료로부터 miR-136, miR-23b, miR-27b , miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하고,
상기의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 정보제공방법.
miR-150 (MicroRNA-150)을 유효성분으로 포함하는, 파크리탁셀(Paclitaxel) 내성 난소암의 치료용 약학적 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 miR-150은 바이러스성 또는 비바이러스성 벡터에 포함되어 있는 형태로 제공되는 것인, 약학적 조성물.
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청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 파크리탁셀과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 병용 투여되는 것인, 약학적 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 miR-136을 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 조성물은 miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 저해시키는 제제를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
(a) 파크리탁셀(Paclitaxel) 내성 난소암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 miR-150(MicroRNA-150)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 miR-150의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 파크리탁셀 내성 난소암 치료제를 스크리닝하는 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 시료는 종양 조직인 것인, 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 (a) 단계는 역전사 중합효소반응, 경쟁적 역전사 중합효소반응, 실시간 역전사 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, 또는 DNA 칩에 의하여 miR-150의 발현 수준을 측정하는 것인, 방법.
청구항 19에 있어서, 상기 측정된 miR-150의 발현 수준이 정상 대조군에 비해 증가된 경우, 투여된 후보 물질을 파크리탁셀 내성 난소암 치료제로 결정하는 단계를 더 포함하는, 방법.
청구항 19에 있어서, 파크리탁셀 내성 난소암의 치료를 위한 후보 물질이 투여된 개체의 시료로부터 miR-136, miR-23b, miR-27b, miR-326, miR-424, miR-503, 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 발현 수준을 측정하고,
상기의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 더 포함하는, 방법.