KR102082462B1 - nc886 유전자를 이용한 난소암 예후 예측을 위한 정보제공방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 nc886 유전자의 발현량을 기준으로 난소암을 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 대한 것이다.
또한 본 발명은, 난소암 환자의 난소암 아형 및 nc886 유전자의 발현 수준을 확인하여 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 대한 것이다. 이때, 상기 정보제공방법은 nc886 유전자의 발현 수준을 nc886과 관련 있는 다른 유전자들의 발현 패턴으로 확인하는 정보제공방법을 포함한다.
따라서, 본 발명은 nc886 유전자의 발현을 억제함으로써 난소암을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있으며, nc886 유전자의 발현 수준을 측정하여 난소암 여부를 진단할 수 있다.
또한 본 발명은 nc886의 발현 수준을 분석하여 난소암의 전이 또는 항암제의 내성 여부를 예측할 수 있어 난소암 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서 효과적이다.

Description

nc886 유전자를 이용한 난소암 예후 예측을 위한 정보제공방법{Method of providing information for predicting ovarian cancer prognostication using nc886 genome}

본 발명은 nc886 유전자의 발현량을 기준으로 난소암을 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 조성물에 대한 것이다.

또한 본 발명은, 난소암 환자의 난소암 아형 및 nc886 유전자의 발현 수준을 확인하여 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법에 대한 것이다. 이때, 상기 정보제공방법은 nc886 유전자의 발현 수준을 nc886과 관련 있는 다른 유전자들의 발현 패턴으로 확인하는 정보제공방법을 포함한다.

형질 전환 성장 인자-β(Transforming growth factor-β; TGF-β)와 마이크로 RNA(micro RNA; miRNA) 경로는 암에서의 유전자 발현 재프로그래밍에 가장 중요하다. SMAD 전사 인자(transcription factors; TFs)를 통해 수많은 표적 유전자를 조절하는 사이토카인인 TGF-β는 암에서 겉으로 보기에 반대되는 두가지 역할을 한다. 초기 단계에서 암세포 증식을 억제하는 종양 억제 인자이지만, 악성 종양이 진행됨에 따라 TGF-β는 상피 간엽 전이(epithelial-mesenchymal transition; EMT) 및 섬유증(fibrosis)을 촉진하여 발암 역할을 수행한다. miRNAs, Dicer 효소에 의해 처리되는 비코딩 RNAs(non-coding RNA; ncRNAs)는 표적 전령 RNA(messenger RNA; mRNA) 발현을 억제한다. miR-21, miR-155 및 miR-17-92a-1 클러스터와 같은 여러 miRNA의 발현이 일부 악성 종양에서 증가하지만 대부분의 miRNA의 발현은 암에서 억제된다. miRNA의 전반적인 하향 조절은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)-매개된 녹다운(knockdown) 또는 Dicer의 단일 대립 상실시 향상된 종양 형성으로 입증되는 바와 같이 종양 형성을 촉진한다.

대부분의 다른 암들과 마찬가지로 난소암에서도 이의 발생, 진행 및 재발에 TGF-β와 miRNA는 중요한 역할을 한다. 대부분의 난소암은 난소 표면 상피(ovarian surface epithelium; OSE)와 난관 상피(tubal epithelium)에서 파생된다. 상피 세포종은 이종의 종양으로 구성되어 있으며 4 가지 주요 조직학적 유형(장액성(serous), 점액성(mucinous), 자궁 내막증(endometrioid) 및 클리어 세포(clear cell))으로 고전적으로 분류되어있다. 난소암의 가장 일반적인 유형은 높은 빈도의 TP53 돌연 변이를 나타내는 높은 등급의 장액성 암(tubal epithelium)이다. 점액성, 자궁 내막증 및 저등급 장액성 암은 KRAS, ERBB2, BRAF 및 PTEN 돌연변이가 나타나는 것이 특징이다. 또한, 난소암의 진단 등을 목적으로 4 가지 분자적 유형(면역 반응(immune-reative), 분화(differentiated), 증식(proliferative) 및 중간엽(mesenchymal))으로 나뉘기도 한다. 최근의 연구에서는 난소암 환자를 2 가지 아형으로 분류하기 위해 mRNA/miRNA 발현 프로파일을 통합 분석하였다. 이 분류에 의하면, miRNA 표적 유전자의 전반적인 발현 수준은 "통합된 중간엽(integrated mesenchymal; iM) 아형" 또는 "섬유증(fibrosis)" 아류 유형으로 명명된 난소암 아형(이하 "iM/섬유증")에서 증가한다. 다른 한편, miRNA 표적 유전자는 "통합 상피(integrated epithelial; iE) 아형"또는 "산화 스트레스(oxidative stress)" 아형(이하 "iE/산화")이라고 불리는 다른 난소암 아형에서는 억제된다. 이처럼 난소암의 아형에 따라 TGF-β 및 miRNA 경로가 반대되는 이유에 대하여는 연구 또는 개시된 바 없다.

nc886은 RNA 중합 효소 Ⅲ(Pol Ⅲ)에 의해 전사되는 101 뉴클레오타이드의 긴 ncRNA이다. nc886 게놈 영역의 흥미로운 특징은 강한 CpG 섬의 존재이다. Pol Ⅲ 활성은 종양 형성 과정에서 일반적으로 높아지기 때문에 암세포에서 nc886 수준이 증가할 것으로 예상되고 있다. 그러나 nc886은 일부 악성 종양에서 발현이 후성적으로 침묵하는 것으로 밝혀졌다. 이때, 상기 nc886 유전자를 난소암과 관련된 바이오마커로서 활용할 수 있는지 여부에 대한 연구 또는 개시는 이루어진 바 없다.

1. Inman GJ. Switching TGFbeta from a tumor suppressor to a tumor promoter. Curr Opin Genet Dev 21, 93-99(2011). 2. Cheng JC, Auersperg N, Leung PC. TGF-beta induces serous borderline ovarian tumor cell invasion by activating EMT but triggers apoptosis in low-grade serous ovarian carcinoma cells. PLoS One 7, e42436(2012). 3. Lin S, Gregory RI. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nat Rev Cancer 15, 321-333(2015). 4. Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol 4, 199-227(2009). 5. Kumar MS, Lu J, Mercer KL, Golub TR, Jacks T. Impaired microRNA processing enhances cellular transformation and tumorigenesis. Nat Genet 39, 673-677(2007). 6. Kumar MS, et al. Dicer1 functions as a haploinsufficient tumor suppressor. Genes Dev 23, 2700-2704(2009). 7. Lambertz I, et al. Monoallelic but not biallelic loss of Dicer1 promotes tumorigenesis in vivo. Cell Death Differ 17, 633-641(2010). 8. Narod S. Can advanced-stage ovarian cancer be cured? Nat Rev Clin Oncol 13, 255-261(2016). 9. Chen VW, Ruiz B, Killeen JL, Cote TR, Wu XC, Correa CN. Pathology and classification of ovarian tumors. Cancer 97, 2631-2642(2003). 10. Kurman RJ, Shih Ie M. Molecular pathogenesis and extraovarian origin of epithelial ovarian cancer--shifting the paradigm. Hum Pathol 42, 918-931(2011). 11. Cancer Genome Atlas Research N. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature 474, 609-615(2011). 12. Yang D, et al. Integrated analyses identify a master microRNA regulatory network for the mesenchymal subtype in serous ovarian cancer. Cancer Cell 23, 186-199(2013). 13. Mateescu B, et al. miR-141 and miR-200a act on ovarian tumorigenesis by controlling oxidative stress response. Nat Med 17, 1627-1635(2011). 14. Butz H, Racz K, Hunyady L, Patocs A. Crosstalk between TGF-beta signaling and the microRNA machinery. Trends Pharmacol Sci 33, 382-393(2012). 15. Davis BN, Hilyard AC, Lagna G, Hata A. SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation. Nature 454, 56-61(2008). 16. Lee K, et al. Precursor miR-886, a novel noncoding RNA repressed in cancer, associates with PKR and modulates its activity. RNA 17, 1076-1089(2011). 17. Canella D, Praz V, Reina JH, Cousin P, Hernandez N. Defining the RNA polymerase III transcriptome: Genome-wide localization of the RNA polymerase III transcription machinery in human cells. Genome Res 20, 710-721(2010). 18. White RJ. RNA polymerase III transcription and cancer. Oncogene 23, 3208-3216(2004). 19. Treppendahl MB, et al. Allelic methylation levels of the noncoding VTRNA2-1 located on chromosome 5q31.1 predict outcome in AML. Blood 119, 206-216(2012). 20. Cao J, et al. DNA methylation-mediated repression of miR-886-3p predicts poor outcome of human small cell lung cancer. Cancer Res 73, 3326-3335(2013). 21. Lee KS, et al. nc886, a non-coding RNA of anti-proliferative role, is suppressed by CpG DNA methylation in human gastric cancer. Oncotarget 5, 3944-3955(2014). 22. Lee HS, et al. Epigenetic silencing of the non-coding RNA nc886 provokes oncogenes during human esophageal tumorigenesis. Oncotarget 5, 3472-3481(2014). 23. Skonier J, Neubauer M, Madisen L, Bennett K, Plowman GD, Purchio AF. cDNA cloning and sequence analysis of beta ig-h3, a novel gene induced in a human adenocarcinoma cell line after treatment with transforming growth factor-beta. DNA Cell Biol 11, 511-522(1992). 24. Kang S, Dong SM, Park NH. Frequent promoter hypermethylation of TGFBI in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol 118, 58-63(2010). 25. Cardenas H, et al. TGF-beta induces global changes in DNA methylation during the epithelial-to-mesenchymal transition in ovarian cancer cells. Epigenetics 9, 1461-1472(2014). 26. Park JL, et al. Epigenetic regulation of RNA polymerase III transcription in early breast tumorigenesis. Oncogene, (2017) Aug 28. doi: 10.1038/onc.2017.285. 27. Kennedy BA, et al. ChIP-seq defined genome-wide map of TGFbeta/SMAD4 targets: implications with clinical outcome of ovarian cancer. PLoS One 6, e22606(2011). 28. Lengyel E. Ovarian cancer development and metastasis. Am J Pathol 177, 1053-1064(2010). 29. Do TV, Kubba LA, Du H, Sturgis CD, Woodruff TK. Transforming growth factor-beta1, transforming growth factor-beta2, and transforming growth factor-beta3 enhance ovarian cancer metastatic potential by inducing a Smad3-dependent epithelial-to-mesenchymal transition. Mol Cancer Res 6, 695-705(2008). 30. Kitagawa K, et al. Epithelial-mesenchymal transformation of a newly established cell line from ovarian adenosarcoma by transforming growth factor-beta1. Int J Cancer 66, 91-97(1996). 31. Kunkeaw N, et al. Cell death/proliferation roles for nc886, a non-coding RNA, in the protein kinase R pathway in cholangiocarcinoma. Oncogene 32, 3722-3731(2013). 32. Cheon DJ, et al. A collagen-remodeling gene signature regulated by TGF-beta signaling is associated with metastasis and poor survival in serous ovarian cancer. Clin Cancer Res 20, 711-723(2014). 33. Yeung TL, et al. TGF-beta modulates ovarian cancer invasion by upregulating CAF-derived versican in the tumor microenvironment. Cancer Res 73, 5016-5028(2013). 34. Marchal JA, et al. The impact of PKR activation: from neurodegeneration to cancer. FASEB J 28, 1965-1974(2014). 35. Guo X, Wang XF. Signaling cross-talk between TGF-beta/BMP and other pathways. Cell Res 19, 71-88(2009). 36. Zhang H, Wang Q, Zhao Q, Di W. MiR-124 inhibits the migration and invasion of ovarian cancer cells by targeting SphK1. Journal of ovarian research 6, 84(2013). 37. Li J, Liang S, Jin H, Xu C, Ma D, Lu X. Tiam1, negatively regulated by miR-22, miR-183 and miR-31, is involved in migration, invasion and viability of ovarian cancer cells. Oncol Rep 27, 1835-1842(2012). 38. Zhao G, et al. miR-203 Functions as a Tumor Suppressor by Inhibiting Epithelial to Mesenchymal Transition in Ovarian Cancer. J Cancer Sci Ther 7, 34-43(2015). 39. Cochrane DR, Howe EN, Spoelstra NS, Richer JK. Loss of miR-200c: A Marker of Aggressiveness and Chemoresistance in Female Reproductive Cancers. J Oncol 2010, 821717(2010). 40. Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell 136, 215-233(2009). 41. Zhang SF, et al. TXNDC17 promotes paclitaxel resistance via inducing autophagy in ovarian cancer. Autophagy 11, 225-238(2015). 42. Su D, et al. PDCD6 is an independent predictor of progression free survival in epithelial ovarian cancer. J Transl Med 10, 31(2012). 43. Prislei S, et al. Role and prognostic significance of the epithelial-mesenchymal transition factor ZEB2 in ovarian cancer. Oncotarget 6, 18966-18979(2015). 44. Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol 15, 509-524(2014). 45. Park JL, Lee YS, Kunkeaw N, Kim SY, Kim IH, Lee YS. Epigenetic regulation of noncoding RNA transcription by mammalian RNA polymerase III. Epigenomics 9, 171-187(2017). 46. Andersson MG, Haasnoot PC, Xu N, Berenjian S, Berkhout B, Akusjarvi G. Suppression of RNA interference by adenovirus virus-associated RNA. J Virol 79, 9556-9565(2005). 47. Haase AD, et al. TRBP, a regulator of cellular PKR and HIV-1 virus expression, interacts with Dicer and functions in RNA silencing. EMBO Rep 6, 961-967(2005). 48. Daher A, et al. Two dimerization domains in the trans-activation response RNA-binding protein(TRBP) individually reverse the protein kinase R inhibition of HIV-1 long terminal repeat expression. J Biol Chem 276, 33899-33905(2001). 49. Yang YI, Ahn JH, Lee KT, Shih Ie M, Choi JH. RSF1 is a positive regulator of NF-kappaB-induced gene expression required for ovarian cancer chemoresistance. Cancer Res 74, 2258-2269(2014). 50. Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res 11, 1475-1489(1983). 51. Lee Y, et al. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425, 415-419(2003). 52. Tothill RW, et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clin Cancer Res 14, 5198-5208(2008). 53. Irizarry RA, et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics 4, 249-264(2003). 54. Simon R, Lam A, Li MC, Ngan M, Menenzes S, Zhao Y. Analysis of gene expression data using BRB-ArrayTools. Cancer Inform 3, 11-17(2007). 55. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 14863-14868(1998). 56. Sohn BH, et al. Inactivation of Hippo Pathway Is Significantly Associated with Poor Prognosis in Hepatocellular Carcinoma. Clin Cancer Res 22, 1256-1264(2016). 57. Kim JH, et al. Genomic predictors for recurrence patterns of hepatocellular carcinoma: model derivation and validation. PLoS Med 11, e1001770(2014). 58. Lee JS, et al. A novel prognostic subtype of human hepatocellular carcinoma derived from hepatic progenitor cells. Nat Med 12, 410-416(2006). 59. Radmacher MD, McShane LM, Simon R. A paradigm for class prediction using gene expression profiles. J Comput Biol 9, 505-511(2002). 60. Lee Y, Hur I, Park SY, Kim YK, Suh MR, Kim VN. The role of PACT in the RNA silencing pathway. EMBO J 25, 522-532(2006).

이에, 본 발명자들은 난소암, 그 중에서도 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형에서 nc886 유전자의 발현이 증가하고, nc886의 발현 수준에 따라 난소암 환자의 예후를 예측할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 nc886 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 nc886 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) 난소암 환자의 난소암 아형을 확인하는 단계;

ii) 상기 단계 i)의 난소암 환자에서 생물학적 시료를 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 시료의 nc886 유전자의 발현 패턴을 확인하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 확인한 nc886의 발현 패턴에 따라 상기 단계 ii)의 난소암 환자를 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 i) A2780_vector, SKOV3_vector, OSE80PC_nc886-kd, SKOV3_nc886, OSE80PC_control-kd, A2780_nc886 및 SKOV3_TGF-β 세포주에서 유전자 발현 데이터를 얻는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 얻은 데이터를 분석하여 패턴을 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 패턴을 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘으로 통합하여 분류기(classifier)를 형성하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 형성된 분류기에 난소암 환자의 유전자 발현 데이터를 적용하여 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 nc886 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 난소암은 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암인 것일 수 있다.

본 발명은 또한, nc886 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암 진단용 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 또한, i) 난소암 환자에서 생물학적 시료를 수득하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 수득한 시료의 nc886 유전자의 발현 패턴을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 nc886의 발현 패턴에 따라 상기 단계 i)의 난소암 환자를 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 단계 iii)의 분류는 ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 으로 이루어진 군의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 iv) 상기 단계 iii)의 분류 결과 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 난소암은 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 예후가 불량하다는 것은 암세포의 전이 발생, 항암제 에 대한 내성 존재 및 환자의 사망을 의미하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 i) A2780_vector, SKOV3_vector, OSE80PC_nc886-kd, SKOV3_nc886, OSE80PC_control-kd, A2780_nc886 및 SKOV3_TGF-β 세포주에서 유전자 발현 데이터를 얻는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 얻은 데이터를 분석하여 패턴을 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 패턴을 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘으로 통합하여 분류기(classifier)를 형성하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 형성된 분류기에 난소암 환자의 유전자 발현 데이터를 적용하여 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유전자는 ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 v) 상기 단계 iv)에서 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 난소암세포의 전이 발생, 항암제에 대한 내성 존재 및 난소암 환자의 사망을 예측하여 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것일 수 있다.

따라서, 본 발명은 nc886 유전자의 발현을 억제함으로써 난소암을 예방 또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있으며, nc886 유전자의 발현 수준을 측정하여 난소암 여부를 진단할 수 있다.

또한 본 발명은 nc886의 발현 수준을 분석하여 난소암의 전이 또는 항암제의 내성 여부를 예측할 수 있어 난소암 예후 예측을 위한 정보제공방법으로서 효과적이다.

[도 1]은 난소암 세포주들에서의 nc886 및 TGFBI의 발현량을 나타낸다.
[도 2]는 SKOV3 및 A2780 세포에 10M의 5-Aza-2'deoxycytidine(AzadC)을 처리한 후 노던 혼성화한 결과를 나타낸다. AzadC을 처리함으로써 각 세포주의 nc886 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[도 3]은 제일 병원의 25 명의 난소암 환자에서 얻은 nc886 및 TGFBI 발현 값의 산점도를 나타낸다.
[도 4]는 SKOV3 세포에 TGF-β 처리한 후 nc886 발현량을 노던 혼성화로, TGFBI 및 SMAD5의 발현량을 qRT-PCR 로 확인한 결과를 나타낸다. TGF-β 처리에 따라 nc886 및 TGFBI의 발현은 유의적으로 증가하였으나, SMAD5의 발현은 미미하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 반면에, DNA 메틸 전이 효소(DNA methyl-transferase; DNMT1)를 발현하도록 형질감염된 SKOV3 세포는 TGF-β 처리에도 불구하고 nc886 발현량이 감소한 것을 확인할 수 있었다.
[도 5]는 5번 염색체의 nc886의 게놈 영역, nc886의 CpG 사이트의 메틸화 정도 및 EpiTYPER 데이터의 히트맵을 나타낸다. 화살표는 전사 방향을 나타낸다. 확대된 보기의 모든 기호(nc886 RNA, 물결 모양 선, CpG 섬, 파란색 막대, EpiTYPER 지역, 진한 자홍색 막대)는 nc886의 5 '끝을 기준으로 계산된 nt 좌표가 +1 인 정확한 축척으로 그려졌다. CpG 위치(수직 막대) 중 EpiTYPER 및 파이로 시퀀싱으로 측정한 것들은 진한 자홍 및 자주색으로 각각 지정되었다.
[도 6]은 노던 혼성화 후 각 세포주의 nc886 발현 수준을 정량화한 것을 나타낸다. nc886을 발현하도록 형질감염된 세포주 및 OSE80PC 세포주가 안정적으로 nc886을 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 'SKOV3_TGF-β'는 TGF-β로 처리된 SKOV3_벡터 세포를 의미한다.
[도 7]은 각 세포주의 세포 부착 분석 결과를 나타낸다. 이미지 및 정량화 그래프를 나타낸 것이며, 그래프는 펜타플리케이트(pentaplicate)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. nc886을 발현하거나, TGF-β를 처리하는 경우 세포 부착능이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[도 8]은 각 세포주의 세포 이주 분석 결과를 나타낸다. 이미지 및 정량화 그래프를 나타낸 것이며, 그래프는 펜타플리케이트(pentaplicate)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. nc886을 발현하거나, TGF-β를 처리하는 경우 세포 이주능이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[도 9]는 각 세포주의 세포 침입 분석 결과를 나타낸다. 이미지 및 정량화 그래프를 나타낸 것이며, 그래프는 펜타플리케이트(pentaplicate)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. nc886을 발현하거나, TGF-β를 처리하는 경우 세포 침입능이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
[도 10]은 SKOV3 세포주에 TGF-β 및/또는 nc886 kd를 처리하는 경우 세포주의 이주능을 나타낸다. TGF-β 처리에 따라 세포 이주능이 증가하나, nc886을 녹다운(knockdown; kd) 시키는 경우 그 효과는 다시 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 대표 이미지, 정량화 그래프 및 노던 혼성화 결과를 표시하였다.
[도 11]은 MTT 값으로 계산한 세포 생존률을 나타내며, 파클리탁셀(paclitaxel)의 농도로 플롯(plotted) 되었다. 반수치사량(IC50, ㎛) 및 반수치사량 농도에서의 사멸세포 비율은 오른쪽에 나타났다. nc886 및 TGF-β는 파클리탁셀에 대한 내성을 발생시키는 것을 확인할 수 있었다.
[도 12]는 누드 마우스에 난소암 세포를 정위 이식(orthotopic implantation)하는 실험 계획 및 각 기관에서 난소암 세포 전이를 나타내는 마우스의 수를 나타낸다. nc886 및 TGF-β을 처리하는 경우 난소암세포가 다른 기관까지 전이된 것을 확인할 수 있었다.
[도 13]은 nc886의 이소성적인 발현("nc886_exp") 또는 TGF-β 처리에 따라 유의적으로 발현량이 변형된 유전자를 나타낸다. 그 중 273개의 유전자가 동일하였으며, fc 값은 log2 스케일이다.
[도 14]는 nc886(x 축) 및 TGF-β(y 축)에 의해 변형된 5221 개의 유전자의 fc 값을 비교하는 산점도를 나타낸다.
[도 15]는 핵형마커로서의 nc886 및 SNORD38B 노던 혼성화 결과를 나타내며, nc886은 세포질에서 주로 발현되는 것을 확인할 수 있었다.
[도 16]은 2636개 유전자의 fc값을 nc886-kd(x 축) 및 nc886(y 축)의 발현으로 비교하는 산점도이다.
[도 17]은 1024개의 유전자 및 118개의 nc886과 발현수준이 관련된 유전자들의 감독되지 않은 계층적 클러스터링(unsupervised hierarchical clustering)을 보여주는 히트맵이다. 각 유전자의 선택기준은 오른쪽에 기재되어 있다. 표본의 중간 값과 관련된 배열 값인 해당 표현 수준은 초록색에서 빨간색으로 표시된다(눈금의 경우 아래의 색상 막대 참조). 각각 3회 실험한 7 가지 실험은 각 조작(nc886 kd 및 TGF-β 처리에 따른 이소성 발현)에 따른 nc886의 발현수준을 nc886-low와 nc886-high(각각 파란 막대와 상단에 빨간색 막대)의 두 그룹으로 나누어 실험하였다. 청색/적색 색상 서명(nc886-low/-high)은 모든 막대 그래프와 플롯에서 사용되었다.
[도 18]은 nc886과 발현수준이 관련된 일부 유전자들의 qRT-PCR 결과를 나타낸다. nc886 발현 또는 TGF-β처리에 따라 유전자들의 발현수준이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
[도 19]는 Biocarta Z-점수에 대한 산점도, TGF-β 처리에 따른 최고 억제(Z-score cutoff = -4)된 Biocarta 경로 및 각 세포주에 대한 웨스턴 블랏팅 내지 노던 블랏팅의 결과를 나타낸다. 붉은색 데이터는 NF-κB 관련 경로이며, 사이즈마커의 분자 크기(kilodalton; kD)는 오른쪽에 나타내었다. 즉, nc886이 관련된 유전자의 조절은 PKR/NF-κB 경로로 설명할 수 없음을 확인할 수 있었다.
[도 20]은 nc886-kd(왼쪽) 및 TGF-β 처리(오른쪽)시 MIR(상단) 및 TFT(transcription factors target; 하단)의 순위 분포(Rank distribution)를 나타낸다.
[도 21]은 nc886 kd와 TGF-β 처리의 MIR 또는 TFT의 Z 점수에 대한 산점도를 왼쪽에 나타낸다. 상위 5 개 후보 nc886 관련 miRNA가 선택되었으며 데이터 포인트는 빨간색으로 강조 표시하였다. 오른쪽의 히트맵은 nc886 kd 및 TGF-β 처리에서 크게 변형된 유전자의 클러스터링을 보여준다. 하나의 클러스터는 CNN, PDCD6 및 ZEB2를 직접 표적으로 만들기 위해 5 개의 miRNA와 교차 비교된 397 개의 후보 miRNA 표적 유전자 를 포함한다.
[도 22]는 정규화 대조군인 소형 핵 RNA U6(small nuclear RNA U6; U6 snRNA)을 포함한 테크맨 miRNA qRT-PCR 분석을 나타낸다.
[도 23]은 난소암에서 nc886/TGF-β와 관련된 miRNA 및 표적 유전자를 확인하는 워크 플로우를 나타낸다. miRNA와 표적 mRNA에 대한 리스트를 만들 때, nc886이 miRNA에 직접적인 영향을 미치기 때문에 "nc886_kd"와 "TGF-β"의 배열 데이터에 "nc886_exp"보다 큰 가중치를 부여하였다. nc886을 발현하는 안정된 세포주에서 그들의 장기간에 걸친 2 차 효과에 의해 경로가 감소했을 것이다. 후보 miRNA 표적에 대해 nc886_kd에서 감소하고 TGF-β에서 증가한 397 개의 유전자를 선택했다(두 실험 모두에서 p <0.05). 개별 표적 mRNA에 대한 단일 miRNA의 조절 능력이 강하지 않기 때문에 우리는 fc cutoff를 적용하지 않았다. 더 중요성이 높은 miRNA를 선택할 때 miRNA 데이터베이스(miRbase : www.mirbase.org/)의 복제빈도로부터 계산한 MIR Z 점수를 고려하였다.
[도 24]는 nc886과 관련된 유전자로 선택된 5 개의 miRNA 중 두 개 이상의 miRNA(노란색으로 강조 표시된 상자)에 대한 인식 사이트가 있는 13 개의 후보 miRNA 표적 유전자 및 그 중 선택된 4가지 유전자의 발현 변화를 qRT-PCR로 검증한 결과를 나타낸다. 유전자들의 발현량은 nc886-kd에서 감소하지만 TGF-β 처리시 증가하는 것을 확인하였다.
[도 25]는 질량분석을 통하여 결정된 nc886 관련 상위 12개의 단백질 및 Dicer 도메인과 절단된 돌연변이를 나타낸다.
[도 26]은 웨스턴 블롯팅 결과 및 nc886-결합 분석 결과를 나타낸다.
[도 27]은 FLAG IP로 정제된 FLAG-Dicer(WT) 및 FLAG-Dicer의 적정량과 함께 nc886과 pre-miR-200c의 In vitro 처리 분석결과를 나타낸다. 나타난 pre-miRNAs의 성숙은 노던 혼성화에 의해 시각화되었다. 그래프의 각 막대는 해당 밴드와 대응된다. Pre-miRNAs, 성숙한 miRNA 및 분해 생성물을 정량화하고 플롯하였다.
[도 28]은 pcDNA3.1-FLAG-Dicer(WT)로 형질감염된 SKOV3_nc886 세포의 qTR-PCR(왼쪽)을 통한 nc886 측정 결과를 나타낸다. 세포들은 형질감염 후 24시간 뒤에 수확하였으며, 웨스턴 블롯팅(오른쪽)은 항-Dicer 항체를 이용해 Dicer를 검출하였다. Dicer 표적 siRNA의 형질감염 후 48시간 뒤의 nc886(왼쪽)의 qRT-PCR 결과 및 Dicer(오른쪽)의 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸다.
[도 29]는 RNA 준비를 위한 세포 수확 한 후 24시간 후에 OSE80PC 세포에 형질감염시킨 miR-mimic(miR-124-3p, -183-5p, -203a-3p, -200c-3p 및 -19b-3p의 혼합물) 또는 비-미생물의 형질 감염에 따른 4 가지 유전자의 qRT-PCR 결과를 나타낸다. PRKCA가 아닌 3 가지 유전자(CNN3, PDCD6, ZEB2)의 mRNA 발현은 miRNA 모조에 의해 억제되어 PRKCA가 이들 miRNA에 의해 조절되지 않음을 나타낸다. 후보 miRNA 표적 유전자의 3'-비번역 영역을 나타낸다. 이 영역은 반딧불이 루시퍼라제(firefly luciferase, Pp) 오픈 리딩 프레임의 하류에 있는 플라스미드로 클로닝되었다. 양성 대조군으로 인위적으로 설계된 완벽한 상보적 표적 부위도 복제되었다. 루시퍼라제는 상기 플라스미드와 함께 miRNA- 모방 또는 대조-모방의 형질 감염시 검정하였다. 분석은 루시퍼라제 플라스미드의 형질 감염 후 24 시간에 수행되었다. 상대적인 루시퍼라제 값(y 축)은 여러 표준화를 통해 계산되었다. 먼저, Pp로부터의 값을 동시 형질 감염된 pRL-SV40으로부터 Renilla 루시퍼라제(Rr) 값으로 정규화 하였다. 각각의 플라스미드에서, 음성 대조 미믹의 Pp/Rr 값을 1로 설정 하였다. 평균 및 표준 편차는 3 개의 샘플로부터 계산하였다. 3 가지 유전자 모두에서 miRNA 표적 부위가 있는 3'-비번역 영역은 루시퍼라제 분석에서 miRNA 모방에 의한 억제를 부여하기에 충분하여 CNN3, PDCD6 및 ZEB2가 TGF-β/nc886 경로에서 직접적인 miRNA 표적임을 입증했다.
[도 30]은 24시간 동안의 Dicer-kd 에 따른 세포 부착 분석의 웨스턴 블롯팅 결과, miRNA qRT-PCR 결과, 대표이미지 및 정량화 그래프를 나타낸다.
[도 31]은 Dicer의 이소성 발현에 따른 세포 이주 분석을 나타낸다. 항-FLAG 항체에 대한 웨스턴 블랏 결과, 대표 이미지 및 정량화 그래프를 나타낸다.
[도 32]는 난소암 환자(GSE9891, n= 285, 실시예 9)의 집단에서, 3 가지 유전자(FRMD6, TAGLN, TPM1)의 각각의 발현 수준(x 축 상의 평준화된 마이크로 어레이 값)을 118개 유전자 표지(y 축 상의 BCCP 확률 값으로 표현됨)에 대하여 플롯된 것 및 난소암 환자(제일 병원 및 여성 건강 관리 센터(주), n=25, 실시예 9) 집단에서 qRT-PCR을 이용하여 3 개의 유전자(FRMD6, TAGLN, TPM1)와 nc886을 측정한 결과를 나타낸다. 양자 모두 유의한 양의 상관관계가 있었고 FRMD6, TAGLN 및 TPM1이 118 유전자 표지의 대표적인 좋은 유전자임과 동시에, 118 유전자 시그니처가 nc886의 표현을 위한 프록시 마커로 사용될 수 있다는 것을 뒷받침한다.
[도 33]은 예측 모델의 매개변수의 개략적인 도면을 나타낸다. BCCP: Bayesian Compound Covariate Predictor, LOOCV: leave-one-out cross-validation. Bayesian probability의 컷오프는 nc886 high>0.7 또는 nc886 low<0.3 이다.
[도 34]는 전체 생존(overall survival; OS) 및 재발 없는 생존(recurrence-free survival; RFS)에 대한 Kaplan-Meier 플롯을 나타낸다. BCCP 알고리즘에 의해 예측된 바와 같이, 총 285 명의 환자가 2 그룹으로 층화 되었다. P 값은 log-rank test에 의해 생성되었으며, + 기호는 검열된 데이터를 나타낸다.
[도 35]는 2 그룹의 난소암 환자들의 약물 민감성을 나타내는 매트릭스 표(matrix table)이다; 총 285 명의 환자 중 미정의 아형(n = 33)과 화학 요법 데이터가 없는 환자(n = 9)를 제외한 나머지 243 개를 분석하였다. P 값은 χ²-검정으로 결정하였다. 또한, 화학요법으로 치료된 난소암 환자들의 nc886 신호값을 위해 ROC 분석을 하였다. 화학요법에 내성이 있는 환자들을 확인하기 위해 nc886 신호에 대한 Bayesian probability을 사용하였다. AUC: area under the curve, CI: confidential interval.
[도 36]은 빨간색/녹색 글자는 프로(pro-)/항(anti-) 종양 형성 특징을 나타낸다. 굵게 강조 표시된 부분은 본 발명에서 nc886에 의해 규제되는 것으로 입증된 기능을 나타낸다.

이하, 본 발명의 용어를 설명한다.

본 발명의 용어 "안티센스"란, 안티센스 올리고머라고도 하고, 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열 내에서 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체를 형성할 수 있는 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 상기 안티센스는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있고, mRNA의 번역을 차단 또는 저해하며, mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 안티센스는 바람직하게는 본 발명의 nc886 유전자의 폴리뉴클레오티드에 상보적인 안티센스 올리고머가 될 수 있다. 상기 안티센스는 통상적인 방법으로 개체에 투여함으로써 발암 유전자의 발현을 예방 또는 억제시키는 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 안티센스 올리고디옥시뉴클레오티드를 폴리-L-라이신 유도체와 정전기적 인력에 의해 혼합시키고, 상기 혼합체를 개체의 정맥에 투여하는 방법(J.S. kim et al., J controlled Release 53, 175-182, 1998)이 사용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하여, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약물 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다. 특히, 본 발명에서 난소암 환자의 예후가 불량하다는 것은 난소암세포의 전이가 발생하고(실시예 3, [도 12]), 난소암에 대한 항암제에 내성이 존재하며, 난소암 환자가 사망할 수 있음을 의미한다(실시예 9, [도 34] 및 [도 35]).

본 발명의 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 난소암으로 진단받은 환자의 병의 경과(병의 진행, 개선, 난소암의 재발, 종양 성장, 약물 저항성)를 미리 짐작하는 것을 의미한다.

본 발명의 용어 "유전자의 발현 수준을 측정하는 제제"란 본 발명의 바이오마커 유전자의 발현 수준을 확인하기 위하여 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 종래 기술에서는 암의 예후와 관련하여 TGF-β 경로가 관련되어 있음을 확인하고 있을 뿐, nc886 유전자와의 관련성에 대하여는 개시된 바 없다. 특히, 난소암의 전이성 내지 약물 내성과 관련하여 nc886 와의 관련성에 대하여는 아직까지 연구된 바가 없다.

본 발명에 따른 nc886 유전자는 난소암, 특히 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형에서 TGF-β에 의해 유도되고 miRNA 경로를 억제하므로, 이를 이용하여 난소암을 예방 또는 치료할 수 있으며, 이의 발현 수준 측정을 통해 난소암을 진단 또는 이의 예후를 예측할 수 있는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 nc886 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 nc886 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암 진단용 조성물을 제공한다.

난소암 세포주, 특히 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암 세포주는 nc886 유전자의 발현량이 높으며, 상기 nc886 유전자의 발현량이 높은 경우 난소암 환자의 예후가 나쁜 것으로 예측할 수 있다.

상기 iM/섬유증(integrated mesenchymal/fibrosis; iM/fibrosis) 아형의 난소암은 장액성 난소암에 해당하면서 중간엽 아형과 관련된 miRNA들을 강하게 발현하는 난소암이자(선행문헌 12), miR-200a와 부정적(negatively)으로 관련된 난소암을 의미한다(선행문헌 13).

상기 nc886 유전자의 발현을 억제하는 물질은 nc886 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA일 수 있으나 바람직하게는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드인 것이 바람직하다. 그 서열은 3‘-UAGAGACACGACCCCAAGCU-5’일 수 있으며, nc886 유전자의 서열은 서열번호 1의 서열과 같다.

또한, 본 발명은 i) 난소암 환자에서 생물학적 시료를 수득하는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 수득한 시료의 nc886 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및

iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 nc886의 발현 수준에 따라 상기 단계 i)의 난소암 환자를 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 난소암 환자에서 수득한 “생물학적 시료"란 난소암 환자의 난소 유래 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 바람직하게는 난소암 종양 조직인 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 단계 iii)에서 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 것은 nc886의 발현에 따라 발현수준이 변동되는 유전자들의 발현패턴을 기준으로 분류할 수 있다. 본 발명에서 확인한 총 1024개의 유전자의 발현패턴을 이용할 수 있으나, 더 명확하게는 다음 118개의 유전자의 발현패턴을 분석하여 분류 기준으로 활용할 수 있다; ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 의 118개 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 FRMD6, TAGLN, SNAI2, CALD1, CTGF 및 TPM1 유전자 모두의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 118개의 유전자 모두의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 정보제공방법은 iv) 상기 단계 iii)의 분류 결과 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 난소암은 iM/섬유증 아형의 난소암인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것이 바람직하나 난소암을 치료하는 효과가 있는 항암제라면 한정되지 않는다.

본 발명은 또한, i) A2780_vector, SKOV3_vector, OSE80PC_nc886-kd, SKOV3_nc886, OSE80PC_control-kd, A2780_nc886 및 SKOV3_TGF-β 세포주에서 유전자 발현 데이터를 얻는 단계;

ii) 상기 단계 i)에서 얻은 데이터를 분석하여 패턴을 수득하는 단계;

iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 패턴을 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘으로 통합하여 분류기(classifier)를 형성하는 단계; 및

iv) 상기 단계 iii)에서 형성된 분류기에 난소암 환자의 유전자 발현 데이터를 적용하여 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;

를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.

상기 A2780_vector, SKOV3_vector 및 OSE80PC_nc886-kd 세포주는 nc886의 발현량이 낮은 세포주들이며, SKOV3_nc886, OSE80PC_control-kd, A2780_nc886 및 SKOV3_TGF-β 세포주는 nc886의 발현량이 높은 세포주들이다(도 17). 이들에서 발현하는 유전자들의 패턴을 분석하여 nc886의 발현량이 높은지 여부를 판단하는데에 기초가 될 수 있는 데이터들을 수득한다. 유전자 발현 데이터는 Affymetrix 마이크로 어레이 플랫폼(U133 v2.0)을 사용하여 생성할 수 있으나, 해당 기술분야에서 유전자 발현 데이터를 생성하는데에 통상적으로 사용되는 수단이라면 사용될 수 있다. 생성된 유전자 발현 데이터는 BRB-ArrayTools를 이용하여 분석할 수 있으나, 해당 기술분야에서 유전자 발현 데이터를 생성하는데에 통상적으로 사용되는 수단이라면 사용될 수 있다.

그 후, 상기 유전자들의 패턴을 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘으로 통합하여 nc886의 발현량이 높은지 여부를 판단하는데에 기준이 되는 분류기(classifier)을 형성할 수 있다. 상기 BCCP 알고리즘은 시료가 특정 하위그룹에 속하는지 여부를 판단할 수 있으며, 3회 실험에 대해 p<0.05, fold change>1.3 이다. 상기 BCCP 알고리즘 외에도 해당 기술분야에서 유전자들의 패턴을 분석하는데에 통상적으로 사용되는 수단이라면 사용될 수 있다.

상기 분류기를 이용하는 경우, 특정 난소암 환자의 nc886의 발현정도 및 더 나아가 그 환자의 예후를 예측할 수 있다(실시예 9).

본 발명의 상기 단계 iv)에서 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 것은 nc886의 발현에 따라 발현수준이 변동되는 유전자들의 발현패턴을 기준으로 분류할 수 있다. 본 발명에서 확인한 총 1024개의 유전자의 발현패턴을 이용할 수 있으나, 더 명확하게는 다음 118개의 유전자의 발현패턴을 분석하여 분류 기준으로 활용할 수 있다; ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 의 118개 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 FRMD6, TAGLN, SNAI2, CALD1, CTGF 및 TPM1 유전자 모두의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 상기 118개의 유전자 모두의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 상기 정보제공방법은, v) 상기 단계 iv)에서 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 난소암세포의 전이 발생, 항암제에 대한 내성 존재 및 난소암 환자의 사망을 예측하여 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것이 바람직하나 난소암을 치료하는 효과가 있는 항암제라면 한정되지 않는다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

<1-1> 세포주, 항체 및 기타 시약

본 발명에서 사용된 난소 세포주는 하기 [표 1]에 기재된 바와 같다. nc886을 안정하게 발현하는 SKOV3- 및 A2780- 유래 세포주를 다음과 같이 준비하였다: 간단하게, 세포를 nc886 발현 플라스미드(표 3)로 형질 감염시키고 항생제로 처리한 뒤(플라스미드에 따라 퓨로마이신(puromycin) 또는 G418), 단일 콜로니를 분리하고 노던 혼성화(Northern hybridization)로 nc886 발현을 확인하였다. 하기 [표 2]은 본 발명에서 제작 및 사용된 안정한 세포주들을 나타내며, [표 3] 및 [표 4]는 상기 [표 2]의 세포주들의 제작에 사용된 플라스미드의 정보를 나타낸다.

TGF-β(R & D Systems, Minneapolis, MN)를 처리하는 경우에는, 96 시간 동안 10 ng/㎖ 처리 하였다. 구체적으로, 달리 명시되지 않는 한 96 시간 동안 배양 배지를 교체함으로써 신선한 TGF-β를 매일 보충했다. 본 발명에 사용된 항체와 시약의 출처는 달리 명시되지 않는 한 선행문헌 16과 동일하다.

환자 표본

제일 병원과 여성 건강 관리 센터에서 악성 난소암 환자 25 명을 대상으로 검체 채취를 시행 하였다. 이 연구에서 사용된 조직 샘플은 조직의 수집/사용을 허가하는 모든 환자와 Cheil General Hospital & Women 's Healthcare Center (CGH-IRB-2011-68)의 승인을 받았다. 외과적 병기 결정은 국제 부인과 산부인과 학회(FIGO) 지침에 따라 수행되었다. 100 밀리그램의 환자 조직을 1 ㎖의 TRIzol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 첨가하고, Automill machine(Tokken, Chiba, Japan)을 사용하여 균질화시켜 제조사의 지침에 따라 전체 RNA를 준비했다. RNA 농도 및 순도는 qRT-PCR 전에 NanoDrop ND-1000(NanoDrop, Wilmington, DE)을 사용하여 측정하였다.

메틸화 분석

파이로시퀀싱(Pyisequencing)은 선행문헌 26에 기술된 대로 수행되었다. EpiTPYER 분석을 위해 2 ㎍의 게놈 DNA를 EpiTect Plus Bisulfite Kit을 사용하여 제조사의 지침(Qiagen, Leipzig, Germany)에 따라 중아황산염(bisulfite)을 처리 하였다. PCR 프라이머는 EpiDesigner(Sequenom, http://www.epidesigner.com)를 사용하여 디자인하였으며 서열 정보는 하기 [표 4]에 요약되어있다. EpiTPYER의 PCR 조건은 다음과 같다; 94 ℃에서 15 분(초기 변성); 94 ℃에서 20 초, 56 ~ 62 ℃에서 30 초, 72 ℃에서 60 초(증폭)의 45 사이클; 72 ℃에서 3 분간 (최종 연장). EpiTYPER은 EpiTYPER Reagent와 SpectroCHIP Set(Agena Bioscience, San Diego, CA)를 사용하여 수행되었으며, EpiTYPERTM ver 1.2(Agena Bioscience)를 사용하여 데이터를 분석하고 gplots 패키지(R 2.9. 1)를 사용하여 히트맵(heat map)을 제작하였다.

RNA 및 mRNA 배열의 측정/분석

총/핵/세포질 RNA의 분리, 노던 혼성화 및 qRT-PCR은 상기 [표 4]에 나와있는 프라이머를 사용하여 선행문헌 16에서 설명한대로 수행 하였다. 노던 블랏의 각 밴드는 AlphaView 소프트웨어 2.0.1.1(Alpha Innotech, San Jose, CA)로 정량화되었다. miRNA는 TaqMan® microRNA assay (Applied Biosystems, Waltham, MA)로 측정되었다. 모든 분석은 달리 명시되어 있지 않고 Student's t-test가 그 중요성을 평가하기 위해 적용된 경우를 제외하고는 3 회 수행하였다. 0.05 미만의 p 값을 갖는 결과는 유의한 차이가 있는 것으로 간주되었다. 차이가 명백한 일부 도면에서는 p 값이 표시되지 않았다.

mRNA 분석은 TotalPrep ™ RNA 증폭 키트 및 HumanHT-12 v4.0 Expression BeadChip 키트(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 수행했다. 쌍(pairwise) 샘플의 배열 fc 값에 대한 산점도(scatter plots)에서 피어슨의 r 값으로 상관의 정도가 표시되었으며, 선형 회귀 모델의 중요성은 R 소프트웨어(버전 2.6.1)를 사용하여 F-통계에 기초한 p-값에 의해 평가되었다.

플라스미드 DNA, RNA 및 형질 감염

이 연구에서의 플라스미드 DNA는 상기 [표 3]에 요약되어있다. nc886 발현 플라스미드 및 루시퍼라제 센서 플라스미드를 제조하기 위해, 게놈 DNA로부터 PCR 증폭된 DNA 단편을 지시된 벡터에 삽입하였다. PCR은 상기 [표 4]에 나열된 프라이머를 사용하여 amfiFusion High Fidelity PCR 마스터 믹스(GenDepot, Barker, TX)로 수행 하였다.

siDicer와 siPKR은 Invitrogen의 Stealth RNAi ™ siRNA이다. siRNA 서열은 요청시 이용 가능하다. siRNA를 그림 범례에 표시된 바와 같이 다양한 시간 동안 40 nM으로 형질 감염시켰다. nc886-kd 실험에서 본 연구에서 "anti-nc886"과 "anti-control"로 지정된 nc886 표적화 및 비 표적화 대조군 안티 올리고의 서열은 각각 3‘-UAGAGACACGACCCCAAGCU-5’ 및 3’-CCGACCGAAATCGAGUCGCC-5’이다. 안티 올리고는 100 nM에서 형질 감염시켰다. ST Pharm(Siheung, Korea)의 맞춤형 RNA 이중 가닥인 miRNA 모방체(mimic)를 10 nM에서 24 시간 동안 형질 감염시켰다. 작은 RNA(siRNA, anti-oligos 및 miRNA 모방물)를 Lipofectamine ™ RNAiMAX 시약(Invitrogen)으로 형질 감염시켰다. 플라스미드 DNA (단독 또는 작은 RNA와의 조합)를 형질감염 시켰을 때 Lipofectamine ™ 2000 시약 (Invitrogen)을 사용했다.

세포 부착 분석

인간 중피(mesothelial) 세포주(American Type Culture Collection, Manassas, VA)의 MeT5A 세포를 평평한 96-웰 플레이트(웰당 10⁶ 세포)에 도말하고 밤새 부착시켜 중피층을 형성시켰다. 실험 조작(예 : nc886 및 TGF-β 치료의 이소성 발현) 후 난소 세포를 트립신 처리로 분리하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척한 후 37 ℃에서 45 분 동안 10 μM CellTrakerTM (Invitrogen)으로 프로빙했다. CellTraker^TM-라벨 세포는 0.1 % 소태아 혈청(FBS)와 RPMI 1640 매체로 씻어 free dye를 제거하고 중피층 맨 위에 도말(10⁵ 세포/well) 되었다. 파종 직후, 각 웰의 형광을 오메가(BMG Labtech, Ortenberg, Germany)가 판독하여 중피층에 부착하기 위한 시작 시간을 나타내었다. 지시된 시간점(60 및 120 분)에서 부드러운 세척 및 흡인에 의해 제거된 후, 부착성 세포를 정량화하기 위해 Scion Image Software (Scion Corp., Frederick, MD)를 사용하여 각 웰의 형광을 이미지화하고 픽셀 단위로 측정하였다.

세포 이동 및 침입 분석

세포 이동 분석은 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone; PVP)이 없는 폴리카보네이트 필터(구멍 크기 8-㎛)가 있는 Boyden 챔버에서 수행되었다. 필터를 PBS로 완전히 세척하고 사용 직전에 건조시켰다. 세포 침투 분석을 위해 동일한 Boyden 챔버를 사용했지만 1㎍/㎖ 농도의 마트리겔(Matrigel)로 미리 코팅된 폴리 카보네이트 필터를 사용했다. 세포를 트립신 처리하고 1 % FBS를 함유하는 RPMI 1640에 재현탁하고, 24 시간 또는 36 시간 동안 TGF-β(5ng/㎖)의 존재 또는 부재 하에 상부 챔버에 첨가하였다. 5 % FBS를 함유하는 동일한 RPMI 1640 배지를 바닥 챔버에 첨가하였다. 막의 하부 표면으로 이동된(또는 마트리겔을 통해 침입한) 세포를 10 분 동안 메탄올로 고정시키고 0.05 % 크리스탈 바이올렛으로 30 분 동안 염색시켰다. 면봉을 사용하여 상부 챔버로부터 잔류 세포를 제거한 후, 필터의 하부에 있는 세포를 뒤집힌 현미경(inverted microscope)으로 계수하였다. 모든 실험은 3 회로 행해졌고 필터당 최소 5 개 필드를 계산했다.

약물 내성

세포를 표시된 적정 농도로 파클리탁셀(paclitaxel; A.G. Scientific, San Diego, CA)으로 처리 하였다. 처리 후 2 일째에, 세포 생존력을 MTT 분석으로 측정하였다. 세포막 외부에 대한 포스파티딜 세린의 노출을 측정하는 아넥신 V(annexin V) 및 프로피디움아이오다이드(propidiumiodide; PI)의 이중 염색에 의해 세포 사멸 퍼센트를 측정하고, 세포사멸 동안 세포막 완전성은 배제하였다. 이는 Annexin-V FITC Apoptosis Detection Kit(BioBud, 성남, 한국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 염색된 세포는 FACS cater-plus flow cytometer로 분석하였다.

상호 작용하는 단백질을 확인하기 위한 S100 분획의 준비와 nc886의 풀다운(pull-down)

OSE80PC 세포를 15cm 배양 디쉬(dish)에서 배양하고 약 10⁹ 개의 세포를 30개의 디쉬에서 수거하였다. biotin-16-UTP(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)를 사용하여 MEGAscript® T7 transcription kit(Ambion, Waltham, MA)로 Biotinylated 합성 nc886을 만들었다. 대조군으로서, tRNA 서열 (5'-gaagcgggugcucuuauuu-3')을 갖는 바이오티닐화 올리고리보뉴클레오티드(biotinylated oligoribonucleotide; GE Dharmacon, Lafayette, CO)를 합성하여 병행하여 사용하였다. 스트렙타비딘 자기 비즈(Streptavidin magnetic beads)는 New England Biolabs(Ipswich, MA)로부터 구입 하였다. nc886-구슬에 바인딩하기 전에, S100 분획을 해동하고, 실온 (RT)에서 2 시간 동안 배양하고, 초-원심 분리 (Beckman TLA 100.3 로터에서 15 분 동안 40,000 rpm으로 40,000 rpm) 하였다. 상등액 ("clear S100 fraction")은 nc886 또는 tRNA 단편을 포함하는 실험용 비드와 함께 배양하기 전에 4 ℃에서 30 분간 비어있는 비드로 사전 배양 하였다.

In vitro Dicer 처리 분석

부분적으로 정제된 Dicer의 원료로서, 293T 세포를 FLAG-Dicer를 발현하는 플라스미드([표 3]에서 "pcDNA3.1-FLAG-Dicer(WT)")로 형질 감염시켰다. 약 10⁷ 개의 세포를 1 ㎖ 완충액 D [20 mM HEPES-KOH (pH 7.4), 100 mM KCl, 0.2 mM EDTA, 5 % 글리세롤, 0.2 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF), 0.5 mM DTT] freeze-and-thaw 및 FLAG-Dicer는 Anti-FLAG® M2 자기 구슬(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 풀다운하여 정제했다. 정제된 Dicer-FLAG-비드를 200㎕의 완충액 D에 재현탁시키고, 슬러리를 분량으로 동결시켰다. miRNA 전구체, nc886 및 vtRNA1-1(ncRNA는 nc886과 유사하지만 nc886과는 다르다)은 MEGAscript® T7 전사 키트로 합성했다.

Dicer 처리 분석의 10 ㎕ 반응 혼합물은 5 ㎕의 FLAG-Dicer 비드 슬러리, 50 ng의 miRNA 전구체(및 경쟁자로서의 nc886 또는 vtRNA1-1의 숫자로 표시된 양), 6 mM MgCl₂, 0.7 mM ATP, 30 mM 크레아틴 인산염, 20 ng/㎕의 크레아틴 키나아제가 포함되어 있다. 적정량의 FLAG-Dicer 비드 슬러리가 사용되었을 때, 동일한 용해 및 풀다운 과정을 통해 형질감염되지 않은 293T 세포로부터 정제된 대조 슬러리를 병렬로 첨가하여 슬러리의 총 부피를 5㎕로 조정하였다. 혼합물을 37 ℃에서 60 분 동안 인큐베이션 하였다. 배양 중에, 슬러리를 반응 혼합물에 10 분마다 재현 탁 하였다. 10 ㎕의 RNA 겔-로딩 완충액(95 % 포름 아미드, 18 mM EDTA, 0.025 %의 나트륨 도데실설페이트)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 반응 생성물을 15 % 변성 폴리 아크릴아미드겔에서 분리하고 각각의 전구체에 대한 프로브(표 4)를 사용하여 노던 혼성화 하였다.

nc886 -Dicer 결합 분석

결합 분석은 0.001 % Nonidet P-40, 3.2 mM Ribonucleoside-Vanadyl Complex (New England Biolabs) 및 0.24 unit/㎕ RNase Inhibitor (New England Biolabs)를 포함하고 ATP, 크레아틴 포스페이트 및 크레아틴 키나아제는 제외된 in vitro Dicer 공정 분석의 반응 혼합물에서 4 ℃에서 10 분 동안 수행되었다. 완충액 D 로 5회 세척한 후, 반응을 75 ℃에서 5 분 동안 가열함으로써 결합된 RNA를 RNase-free H₂O로 용출시켰다. 용리된 RNA는 상기 [표 4]에 열거된 프라이머를 사용하여 nc886 및 vtRNA1-1의 qRT-PCR을 실시하였다.

게놈 및 임상 데이터 분석

유전자 발현 및 임상 데이터는 National Center for Biotechnology Information (NCBI) Gene Expression Omnibus(GEO) 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 입수 할 수 있다. 난소암 환자(GSE9891, n = 285)의 유전자 발현 데이터를 사용하여 nc886 의 임상적 관련성을 시험하였다. 유전자 발현 데이터는 Affymetrix 마이크로 어레이 플랫폼(U133 v2.0)을 사용하여 생성 하였다. 모든 데이터는 robust multi-array 평균법을 사용하여 표준화되었다. 모든 환자는 세포 감소 수술과 백금 기반 화학 요법을 시행 받았다. BRB-ArrayTools는 주로 통계적으로 유전자 발현 데이터를 분석하는데 사용되었으며 다른 모든 통계 분석은 R 언어 환경에서 수행되었다(http://www.r-project.org). 클러스터 분석은 Cluster and Treeview 55를 사용하여 수행되었다. 유전자 발현 시그니처를 기반으로 예측 모델을 개발 및 검증하고 예측 정확도를 추정하는 것은 다음과 같이 수행되었다: 세포주로부터 수득한 118개 유전자의 발현 패턴(훈련 세트; training set)은 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘에 따라 분류기(classifier)를 형성하기 위해 결합되었다. 이 알고리즘은 특정 표본이 하위 집단에 속할 확률을 추정한다. 이 훈련 세트의 계산 오류율은 분류 중 Leave-One-Out-Cross-Validation(LOOCV)에 의해 추정되었으며, 분류기를 난소암 환자의 유전자 발현 데이터(테스트 세트; test set)에 직접 적용했다. 환자의 예후를 예측하기 위해 Kaplan-Meier 플롯 및 로그 순위 테스트를 사용했다. 보조 화학 요법에 대한 내성 예측을 위한 SOH 신호의 유용성을 평가하기 위해, 우리는 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선 분석을 사용했다. ROC 곡선의 경우 곡선 아래의 면적(AUC)을 계산했으며, 0.5(정보가 없는 예측 마커의 경우)에서 1(완벽한 예측 마커의 경우)의 범위를 가진다. 부트스트랩 방법을 사용하여 AUC의 신뢰 구간(CI)을 계산했다. 0.05 미만의 p 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었으며, 모든 검사는 양측(two-tailed)이었다.

메틸화 특이성-고해상도 용융(MS- HRM )

중아황산염(Bisulfite) 처리 및 MS-HRM에 대한 PCR 반응은 EpiTPYER 분석에 설명 된대로 수행되었다. PCR 프라이머는 상기 [표 4]에 나열되어 있으며 엠플리콘(amplicons)은 nt -424 내지 +558 범위에서 설정되었다(-424~-254, -294~-141, -162~-15, -40~+68, +45~+207, +230~+317, +293~+443 및 +469~+558). LightCycler® 480 Instrument II에서 MS-HRM의 멜팅 곡선(melting curves)을 얻었고 GeneScanning 소프트웨어(Roche, Basel, Switzerland)를 사용하여 분석했다.

Chromatin 면역 침전( ChIP ) 분석

ChIP는 ChIP Assay Kit(EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. 간략하게, 포름 알데히드(최종 농도 1 %)-고정 세포를 수확하고 용해시켰다. 염색질을 초음파 처리하여 300-500 개의 뉴클레오타이드 DNA 단편을 얻은 다음 항 SMAD4 항체(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX의 sc-73599)를 사용하여 4 ℃에서 24시간 동안 면역 침전시켰다. 항체-염색질 복합체를 연어 정자 DNA-단백질 G-아가로오스 비드로 잡아 당겼다. 가교 결합을 역전시킨 후, DNA(면역 침전 및 투입)를 Fragment DNA 정제 키트(Intron Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하여 정제한 다음, [표 4]의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시켰다.

정위 이식( Orthotopic implantation)

BALB/c 흉선 누드 마우스(Orient Bio, 성남, 한국)를 사용 하였다. 모든 쥐는 20-25g의 체중을 가진 암컷으로 통상적인 실험실 조건하에 음식과 물을 자유롭게 사용할 수 있게 보관했다. 각 마우스(총 20 마리, 각 세포주에 대해 n = 10)의 복강 내로 5×10⁶ 세포(PBS 100㎕)를 접종하여 난소 세포("SKOV3_vector" 및 "SKOV3_nc886")의 전이를 유도 하였다. 접종 후 5 주째부터 마우스의 1/2을 TGF-β (체중 kg 당 1 ㎍)로 처리하고, 나머지 1/2은 복막 주사를 통해 비히클 PBS로 처리 하였다. 처리는 매주 3 회(월요일, 수요일, 금요일)에 이루어졌다. 접종 후 8 주째에 마우스를 희생시켜 해부하고, 개별적인 종양 결절의 수와 위치를 확인하고 기록했다.

루시퍼라제 분석

루시퍼라제 분석은 Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI)을 사용하여 수행되었다. OSE80PC 세포(96-웰 플레이트)를 0.5ng의 지시된 센서 플라스미드(표 3) 및 웰 당 miRNA 모방 또는 대조 모방 RNA와 조합한 5ng의 pRL-SV40으로 형질감염 하였다. 형질감염 24 시간 후, 제조사의 지시에 따라 세포를 루시퍼라제 분석을 위해 수확 하였다. 루시퍼라제 값은 선행문헌 1에서 기술된 대로 표준화되고 플롯되었다.

질량 분광 광도계

샘플 준비 및 나노 LC-MS / MS 분석 : 스트렙타비딘 풀다운 및 후속 세척 단계 후, 세척된 비드를 30㎕의 1X NUPAGE® LDS 샘플 완충액(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 끓여서 SDS-PAGE(NuPAGE 10 % Bis-Tris 겔, Invitrogen)에 주입하였다. 용출된 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루 얼룩으로 시각화하고 분자 크기에 따라 6 개의 겔 조각으로 절단 하였다. 각각의 겔 조각은 탈 염색되었으며 트립신(T9600, GenDepot, Barker, TX)을 사용하여 in-gel 소화시켰다. 트립신 펩타이드를 10 ㎕의 로딩 용액(0.1 % 포름산을 함유하는 5 % 메탄올)에 재현탁하고, LTQ Orbitrap Elite ™ 질량 분석기(Thermo Fisher Scientific)에 커플링된 나노 LC 1000 시스템(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)으로 nanoflow LC-MS/MS 분석에 주입하였다. 상기 펩티드를 2cm × 100㎛ 크기의 프리 컬럼(pre-column)인 Reprosil-Pur Basic C18 (1.9㎛, Dr. Maisch GmbH, Germany)에 로딩하였다. 프리 컬럼은 0.1 % 포름산/물에서 평형화된 Reprosil-Pur Basic C18이 충진 된 50 mm × 150 ㎛의 분석 컬럼과 직렬로 스위칭되었다. 펩타이드는 600 nl/min의 유속에서 4-26 % 아세토니트릴/0.1% 포름산의 75 분 불연속 그라디언트를 사용하여 용리되었다. 용출된 펩타이드를 데이터 의존적 획득 모드로 작동되는 LTQ Orbitrap Elite 질량 분석기에 직접 전기 분무하여 상위 50 개의 가장 강한 이온의 분열 스펙트럼을 획득하였다.

데이터베이스 검색 및 데이터 검증 : 얻어진 MS/MS 스펙트럼을 Proteome Discoverer 1.3 인터페이스(Thermo Fisher Scientific)에서 Mascot 알고리즘 (Mascot 2.3, Matrix Science)을 사용하여 target-decoy human Refseq 데이터베이스에 대해 검색했다. 전구체 질량 내성은 20ppm 이내로 제한되었으며 단편 질량 허용치는 0.5 달톤이었고 최대 2 회의 누락 절단을 허용하였다. 산화, 단백질 N-말단 아세틸화 및 파괴의 동적 변형이 허용되었다. 마스코트 결과 파일에서 확인된 펩타이드는 5 % FDR(false discover rate)로 검증되었으며 수동 검증 대상이다. 회수 된 펩타이드 수를 사용하여 샘플의 상이한 조건 사이의 상대적인 양을 비교하기 위해 단백질 존재량을 계산하였다.

nc886 발현은 TGF -β에 의해 유도된다.

난소암 세포주(표 1)들의 nc886 발현량을 확인하고자, nc886은 노던혼성화 후 정량화 하였으며, TGFBI은 qRT-PCR로 측정하여 primary OSE에 대한 상대적인 값으로 나타냈다. nc886 발현은 A2780, SKOV3, OVCA433, OVCA432, IGROV-1 및 BG-1에서 침묵된 반면, nec886 수준은 OSE80PC, MPSC1, HeyA8 및 OVCA5에서 난소 표면 상피 세포보다 높았다(도 1). nc886의 발현이 침묵된 이유는 CpG DNA 과메틸화 때문이었으며, 이는 SKOV3 및 A2780 세포에 nc886 발현을 회복시키는 DNA 탈메틸화를 초래하는 후성적 변형인자인 5-Aza-2'deoxycytidine(AzadC)을 처리하고 세포 배양하여 확인되었다(도 2).

난소암 환자 표본에서 nc886과 TGFBI의 발현을 조사한 결과 유의한 양의 상관관계를 보였다(Pearson's r value = +0.5903; 도 3). nc886과 TGFBI가 TGF-β에 의해 동시에 조절되는지 여부를 확인하고자, SKOV3 세포에 TGF-β를 처리하였다. 그 결과, nc886과 TGFBI가 유의적으로 증가되었으며, SMAD5 발현도 증가하긴 하였으나 그 정도가 약했다(도 4). 또한, TGF-β에 의한 nc886의 유도는 DNA 메틸 전이 효소(DNA methyl-transferase; DNMT1)의 이소성 발현에 의해 무효화되었다(도 4). 이는 SKOV3 세포에 10 ng/㎖의 TGF-β를 처리한 후 48 시간 뒤에 DNMT1 발현 플라스미드(및 벡터 대조군)를 형질 감염시키고, 24 시간 후에 세포를 수확한 후 nc886 발현량을 qRT-PCR로 측정함으로써 확인하였다.

TGF-β에 의한 nc886의 유도가 저메틸화의 후성적 메커니즘을 통해 일어나는 것을 확인하고자 하였다. 첫째, 중아황산염(bisulfite) 처리 genomic DNA 에서 여러 PCR 세그먼트에 메틸화 민감성 고해상도 용해(MS-HRM) 분석을 수행하여 1000nt 영역을 조사했다. TGF-β 처리는 AzadC 처리와 유사하게 융해 양상을 저메틸화 DNA의 것과 유사하게 바꾸었다(nt -424 ~ -254, 모든 nt 번호는 nc886 전 사체의 5 '말단에서 +1). 두 번째, EpiTYPER 분석에 의해 -165 ~ + 493nt 영역의 개별 CpG 사이트를 조사했다. TGF-β 및 AzadC을 96시간 동안 처리하는 것은 측정 가능한 모든 CpG 부위의 저메틸화를 유도했다([도 5] 상단의 어두운 수직 막대). 하기 [표 5]는 EpiTYPER 분석에서 CpG 구역의 메틸화값([도 5]의 히트맵의 미가공 값(raw data))을 나타낸다. 이들 데이터는 SKOV3 세포에 AzadC 또는 TGF-β를 96시간동안 처리한 후, nc886 프로모터 영역에서 3 개의 CpG 사이트의 메틸화 정도를 측정한 피로시퀀싱 결과에 의해 확인되었다.

CpG sites*	SKOV3
	untreat	TGF -β	AzadC
-127 & -120	0.89	0.57	0.52
-113 & -109	0.91	0.58	0.53
-85 & -79	0.95	0.57	0.50
-61	0.91	0.64	0.59
-46	1.00	0.74	0.61
-15	0.76	0.47	0.38
-1 & +5	0.88	0.52	0.42
+72	0.94	0.69	0.64
+79 & +81	0.92	0.69	0.61
+253 & +257	0.96	0.64	0.69
+359 & +361	0.99	0.55	0.73
+368	0.96	0.69	0.74
+380	0.96	0.71	0.68
+418	0.94	0.62	0.57
+467	0.97	0.43	0.51

small interfering RNA(siRNA)을 이용하여 SMAD4 TF를 녹다운 시키는 경우, TGF-β에 의한 nc886 유도를 손상시키지 않았으며, 염색질 면역 침전(ChIP) 실험에서, TGF-β는 nc886 게놈 영역에서 SMAD4 결합을 유도하지 않았다. 또한, 그 유도가 게놈 복사 수의 변화 때문이 아니라는 것을 확인했다. 결론적으로, 본 발명자들은 nc886이 후성기전을 통해 TGF-β에 의해 유도된 ncRNA임을 확인하였다.

nc886은 세포 표현형에서 TGF -β를 모방한다.

TGF-β 경로에서 nc886의 기능적 중요성을 시험하기 위해, nc886을 안정적으로 발현하는 SKOV3 및 A2780 유래의 난소암 세포주를 생성시켰다. 안정한 세포 클론의 표현형이 우연이 아닌지 확인하기 위해, 우리는 2 개의 다른 nc886 발현 플라스미드(표 4)를 형질 감염시켜 다양한 안정 세포주를 만들었다. 이소성 nc886 발현 수준은 primary OSE 세포 또는 OSE80PC 세포의 내인성 발현 수준보다 높지 않으며 TGF-β-유도와 유사(도 6)하므로 안정한 세포 클론의 표현형은 인공적인 결과가 아님을 확인하였다.

TGF-β는 난소암 전이능을 향상시키기 때문에 TGF-β가 유도하는 ncRNA인 nc886의 역할을 조사했다. SKOV3와 A2780 세포에서의 nc886의 이소성 발현은 TGF-β 처리와 유사하게 중피세포와 이동 및 침윤([도 7] 내지 [도 9])에 대한 부착을 촉진시켰다. 시험관 시험법의 데이터는 생체 내 실험을 통해 뒷받침되었다. SKOV3_vector 또는 SKOV3_nc886 세포를 BALB/c 흉선 누드 마우스의 복강 내로 접종하고, TGF-β 또는 인산 완충 식염수를 복강 내 주사를 통한 비히클 대조군으로서 처리 하였다. 결과적으로, nc886이 발현되고 TGF-β가 처리되었을 때 SKOV3 세포가 먼 장기로 전이되었음을 확인하였다(도 12).

추가적으로, TGF-β 경로는 다각적인 효과를 나타낼 수 있기 때문에 nc886에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(anti-oligo; "anti-nc886"또는 "nc886-kd") 뿐만 아니라 컨트롤 anti-oligo("anti-control" 또는 "control-kd")를 포함하여 녹다운(kd) 실험을 수행하여 nc886의 역할 부분을 평가하고자 하였다. 다만, nc886은 단백질 키나제 R(PKR)의 억제제이므로 nc886-kd시 PKR가 활성화되어 결국 세포를 사멸하게 하였다. 따라서, SKOV3_nc886 세포의 nc886-kd에 앞서 siRNA를 transfection하여 PKR을 억제했다. 이는 대조군 siRNA와 비교하여 세포 증식 및 이동에 차이를 나타내지 않았다(데이터는 나타내지 않음). SKOV3 세포주에 TGF-β를 96 시간동안 처리, siPKR로 24 시간 동안 형질감염 및 18 시간 동안 nc886 kd로 형질 감염시키는 경우 SKOV3 세포의 이동은 TGF-β 처리에 의해 자극되었으며, 이 자극 효과는 nc886-kd에 의해 거의 무효화된 반면, 비히클 처리했을 때, nc886-kd는 세포 이동에 영향을 미치지 않았음을 확인하였다(도 10). 이것은 항-nc886이 비특이적 부작용을 나타내지 않는다는 것을 확인했다. 이 모든 데이터는 nc886이 TGF-β에 의해 유발된 난소암 전이에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다.

파클리탁셀(Paclitaxel)은 난소암 환자를 위한 최전선의 화학 요법제로 사용되어왔다. 따라서, MTT 분석을 수행하여 파클리탁셀 치료시 nc886 및/또는 TGF-β가 세포 생존 능력에 미치는 영향을 시험하고자 하였다. 파클리탁셀의 세포 독성은 nc886 발현 또는 TGF-β 처리에 의해 유의하게 완화되었다(도 11). SKOV3_nc886 세포를 TGF-β로 처리 하였을 때, TGF-β가 없는 SKOV3_vector(IC50 = 0.048 μM)에 필적하는 세포 독성 효과를 유도하기 위해 파클리탁셀 농도가 거의 100 배 높은 파클리탁셀(IC50 = 3.972 μM)이 필요 하였다. 상기 MTT 데이터는 annexin V-FITC 염색 분석으로 입증되었다. 파클리탁셀 치료로 아넥신 V-포지티브(아폽토시스) 세포가 풍부 해졌다. 각각의 IC50 농도에서 파클리탁셀을 처리하였을 때, 4 개의 실험 세트(nc886 및/또는 TGF-β) 사이에서 세포 자멸 세포의 분획이 유사하였다. 파클리탁셀이 없는 경우, nc886 및/또는 TGF-β는 MTT 값이나 기저 수준의 세포 자멸사에서 두드러진 차이를 이끌어 냈다. 요약하면, 파클리탁셀은 난소암 세포의 세포 사멸을 유도하지만, nc886/TGF-β는 파클리탁셀에 내성을 부여한다.

nc886은 유전자 발현의 TGF -β 매개 재프로그램화를 모방한다.

nc886이 TGF-β를 매개로 하는 유전자 발현 재현을 모방하는지 여부를 확인하기 위해, mRNA 마이크로 어레이에 의한 전역 유전자 발현을 측정했다. 우리는 p 값을 계산하기 위해 3 개 샘플로부터 마이크로 어레이를 실행하고, p <0.05 인 것으로 간주된 유전자를 유의성 있게 평가하였고, 발현값의 배수 변화(fc)에 의해 이들 유전자를 추가로 선택하였다. SKOV3 세포에서 TGF-β 처리에 의해 변형된 1196 개의 유전자를 확인 하였다(fc cutoff = 0.5). nc886 발현에 대해 동일한 분석 결과 380 개의 유전자가 변형되었다("SKOV3_vector"에 비해 "SKOV3_nc886"). 이 두 유전자 세트의 교차점은 nc886 표적 유전자의 대다수(380 개 중 273 개)가 TGF-β 표적 유전자(도 13)이기도 하다는 것을 보여주었다. nc886 발현과 TGF-β 처리 사이의 상관관계를 조사하기 위해 두 세트에서 p 값이 0.05 미만인 5221 개의 유전자를 선택하고 fc 절단 없이 이들 모두를 플로팅했다. 이들 세트간에 강한 양의 상관관계가 있었다(Pearson's r value = +0.7478 and p <2.2e-16; 도 14). nc886은 SKOV3 세포에서 TGF-β와 유사한 유전자 발현 패턴을 유도하였으며, 이 유사성은 [도 7] 내지 [도 9]에 나타난 종양 표현형의 비유를 설명한다.

nc886 의존 유전자 발현 시그니처를 확인하기 위해, 불멸화 OSE80PC 세포를 nc886 표적 안티 올리고("anti-nc886") 또는 비 표적 안티 올리고("anti-control") 100 nM으로 형질 감염시켰다. 세포들은 핵/세포질 분획을 위해 형질감염 후 48시간 후에 수확하였다. OSE80PC 세포에서 nc886-kd와 A2780 세포에서 nc886 발현으로 2 개의 실험 세트를 추가 하였다. 4 개의 데이터 세트("SKOV3_TGF-β", "SKOV3_nc886", "A2780_nc886" 및 "OSE80PC_nc886-kd")를 가지고, 유전자 발현 상관관계가 있는지 쌍 비교를 수행했다. "SKOV3_nc886" 과 "OSE80PC_nc886-kd" 모두에서 유의적으로(p <0.05) 변경된 2636 개의 유전자를 선택하고, 모든 2636 개의 유전자 (fc 컷오프가 없음)를 플롯하고, 통계적으로 유의한 역 상관관계를 관찰했다(Pearson's r 값 = -0.3123 및 p <2.2e-16; 도 16). 마찬가지로, "OSE80PC_nc886-kd"의 유전자 발현은 "SKOV3_TGF-β"또는 "A2780_nc886"의 것과 역상관관계가 있으며, "A2780_nc886"과 "SKOV3_TGF-β"또는 "SKOV3_nc886"의 양의 상관관계가 있는 것을 확인하였다.

또한 모든 실험 세트의 감독되지 않은 계층적 클러스터링을 수행했다. 우리는 적어도 하나의 실험에서 중간값에서 발현값이 발산(1024x108) 한 1024 개의 유전자를 선택했다. 1024 유전자의 히트맵(heat map)은 nc886 수준에 따라 2 개의 그룹으로 3 개의 nc886-low 샘플 대 4 개의 nc886-high 샘플로 명백하게 나뉘었다(도 17 왼쪽). 추후 임상 데이터 분석에서 나중에 사용될 nc886 발현의 대리 지표가 될 수 있는 nc886 시그너처 유전자의 더 작은 하위 집합을 확인하고자 했다. 이를 위해 nc886-low 및 nc886-high 샘플의 클러스터링을 보여주는 heat map에서 118 개 유전자(최소 3 회 실험에서 fc> 1.3)를 선택하고 표본 간의 발현 패턴을 나타내었다(도 17 오른쪽). 이 118 개의 유전자 중 qRT-PCR 검증을 위해 TGF-β 처리로 가장 증가된 유전자 6 개(FRMD6, TAGLN, SNAI2, CALD1, CTGF, TPM1)를 선택하였다. 그들의 발현은 TGF-β 또는 nc886에 의해 유도 되었으나 nc886-kd에 의해 감소되었다(도 18). 따라서, 세포 nc886은 유전자 발현의 TGF-β-매개 재프로그램화를 모방할 수 있음을 확인하였다.

난소암에서 유전자 발현의 nc886 조절 기작은 PKR 경로를 통한 것이 아니다.

nc886이 유전자 발현 양상을 변화시킨 분자 기작을 밝히기 위해 분자 데이터베이스(MSigDB : http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/)에 대한 우리의 배열 데이터를 분석함으로써 시작했다. 예를 들어 Biocarta 경로 분석의 경우 선험적으로 정의된 217 개의 집합이 있다. 217 세트의 각각은 주어진 Biocarta 경로에 수십 개의 유전자를 포함한다. 상기 경로 집합에서 유전자의 발현이 전반적으로 상승했는지 또는 감소했는지를 나타내는 Z 점수를 계산했다(각각 양수 값과 음수 값). 217 개의 Biocarta pathway Z-score를 "SKOV3_TGF-β"와 "SKOV3_nc886"에서 결정 및 플롯하여 강한 양의 상관관계를 관찰했으며, 그 결과 "OSE80PC_nc886-kd"와 "SKOV3_TGF-β"간에는 음의 상관관계가 나타났다(도 19).

217 Biocarta 경로 중 nc886이 NF-κB의 활성화 인자인 PKR의 억제제이고 TGF-β가 NF-κB를 억제하는 것으로 나타났기 때문에, NF-κB 경로를 확인하고자 하였다. 실제로 분석에서 NF-κB와 관련 경로([도 19]의 4 개의 빨간색 막대)는 TGF-β 처리 SKOV3 세포에서 가장 억제된 경로로 평가되었다. 따라서, 그럴듯한 메커니즘은 TGF-β에 의해 유도된 nc886이 PKR 및 결과적으로 NF-κB의 활성을 억제한다는 것이다. 그러나 nc886은 NF-κB 및 관련 경로에 유의한 영향을 미치지 않았다. 이 4 가지 경로 중 어느 것도 nc886-kd 또는 발현에 유의한 Z 점수(> +3 또는 <-3)가 나타나지 않았다. "OSE80PC_nc886-kd"의 경우, PKR은 실제로 phospho-PKR (PKR의 활성 형태)의 형태로 활성화 되었으며, 그 기질인 eIF2α의 인산화를 초래했다. 그러나 NF-κB는 활성화시키지 않았으므로 PKR/NF-κB 연결이 OSE80PC 세포에서는 관계없음을 암시한다. 또한 난소암 세포주의 PKR 발현 데이터의 경우, phospho-PKR 밴드(nc886이 감소되거나 침묵된 곳)는 OSE80PC 세포(nc886 발현이 높았던 곳)의 기본 발현보다 강하지 않았다. 마찬가지로, phospho-eIF2α 밴드는 어떤 샘플에서도 보이지 않았다. 이들 모든 데이터는 PKR 활성화가 자연 성장하는 난소암 세포에서 nc886 이외의 세포성 PKR 억제제에 의해 차단되었고 난소암 전이에서의 nc886의 역할이 PKR 활성화에 기인할 수 없음을 의미한다.

nc886은 miRNA 경로를 억제한다.

nc886은 세포질에 독점적으로 국한되어 있으므로(도 15) TF 활동 및 염색질 개장과 같은 핵 사건의 직접적인 역할은 거의 없을 것이다. 따라서 nc886이 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하고자 하였다.

MSigDB에서 다른 유전자 세트를 조사하는 동안 miRNA 표적 유전자 세트(이하 "MIRs")에서 흥미로운 패턴을 발견했다. 221 개의 MIR 컬렉션에서 각 세트에는 miRNA 시드 시퀀스의 대상 사이트가 있는 유전자가 들어 있다. Biocarta 경로의 경우와 마찬가지로, 주어진 MIR 세트에서 유전자의 전체 발현은 Z 점수를 산출했다. 양성(또는 음성) MIR Z 점수는 표적 유전자가 풍부하거나(또는 고갈됨) 따라서 해당 miRNA의 활성/수준이 낮거나 높다는 것을 나타낸다. 서로 다른 miRNA가 동일한 시드 시퀀스를 가질 수 있기 때문에 MIR 세트 수는 miRNA 수보다 적다.

그 결과, nc886과 TGF-β가 전반적인 MIR 패턴에 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 각 실험쌍에서 MIR Z 점수를 계산하고, 가장 낮은 값에서 가장 높은 값으로 221 값을 정렬하고 데이터를 그림으로 그렸다(도 20). "OSE80PC_nc886-kd"의 경우, Z-점수 분포는 x-intercept 가 190 위 MIR 세트와 함께 아래로 이동되었다. 이것은 189 명의 MIR이 고갈되었지만 31 명의 MIR 만 풍부해 졌음을 나타낸다. 즉, 대다수 miRNA의 활성/수치는 nc886-kd에서 상승했다. 반면에, TGF-β를 처리(그리고 nc886-high)하는 경우 27 및 193 개의 MIR이 고갈되고 농축되었다. 비교를 위해, TF 표적 유전자 모음(MSigDB에서 "TFT"라고 함)에 대해 동일한 분석을 수행했다. 각각 615 개의 TFT 세트가 있으며, 각각은 TF의 표적 유전자를 가지고 있다. 같은 방식으로 615 개의 TFT를 플로팅했다. 일부 TFT는 풍부하고 다른 TFT는 고갈되었다. MIR의 분포가 편향되어있는 것과는 대조적으로 전반적인 순위 분포가 상대적으로 균형을 이뤘다. 양성값에 대한 MIRs의 경향은 SKOV3 및 A2780에서 nc886의 이소성 발현에서도 나타났다(데이터는 나타내지 않음); 그러나, 크기는 TGF-β 처리에서보다 낮았다. 이는 세포주가 안정되어 있고 MIR에 대한 nc886의 직접 효과가 장기간의 배양 과정에서 확산되었기 때문으로 추측하였다. 따라서 추가 분석에서 nc886-kd와 TGF-β 처리에 더 중점을 두었다. 종합적으로, nc886 수준은 MIR과 양성 반응을 보였으며, 이는 nc886이 miRNA 경로를 저해한다는 것을 의미한다.

nc886-kd 및 TGF-β의 MIR Z- 점수는 산점도에 표시된다. 비교를 위해, TFT Z-점수는 동일한 방식으로 플로팅 되었다. MIR 산포도에서는 대부분의 데이터 포인트가 두 번째 사분면에 국한되어 MIR이 일반적으로 감소하고 nc886-kd 및 TGF-β만큼 증가하는 것을 보여준다. 중요한 것은 nc886-kd와 TGF-β 사이에는 강력한 음성 상관 관계(Pearson's r = -0.5927 <-0.5이고 "강한 상관관계"를 나타냄)가 있다는 것이다. 동일한 분석에서 TFT는 또한 통계적으로 유의미한(p=2.783e-10)하지만 약한 부 상관관계를 나타냈다(Pearson's r = -0.2509는 -0.3 ~ -0.1 사이이고 "약한 상관관계"를 나타냄). 4 개의 실험 세트("SKOV3_TGF-β", "SKOV3_nc886", "A2780_nc886"및 "OSE80PC_nc886-kd")로부터 쌍으로 비교할 때, MIR 상관관계는 TFT 상관관계보다 강했다. "SKOV3_TGF-β"와 "SKOV3_nc886" 사이 및 "SKOV3_nc886"과 "OSE80PC_nc886-kd" 사이의 산점도는 각각 양 및 음의 상관관계를 보였고 이는 TFT보다 높은 Pearson의 r 값을 보였다.

TGF-β/nc886에 의해 가장 영향을 받는 miRNA를 확인하기 위해 MIR 프로파일을 조사했다. 4 개의 실험 세트에서 Z 점수의 합에 따라 MIR을 분류했다. 최상위 MIR 중 암과 관련된 miRNA(miRbase, http://www.mirbase.org/를 기반으로) 중에서 풍부하게 복제된 miRNA를 선별하였으며, 최종적으로 5 개의 miRNA(miR-124-3p, -183- 5p, -203a-3p, -200c-3p 및 -19b-3p)를 선택하였으며, 이들은 난소암 세포 운동성을 억제하는 것으로 나타났다. 상기 5개의 miRNA 중에서 3 개의 성숙 miRNA(miR-124-3p, -200c-3p 및 -203a-3p)의 발현 수준을 miR-Taqman PCR assay를 이용하여 측정하였다. 이들 모두는 nc886-kd에 의해 증가되었지만, MIR 프로파일과 일치하여 TGF-β 처리 또는 nc886 안정 세포주에서 감소하였다(도 22). 성숙한 miRNA의 증가/감소는 1 차/전구체 miRNA가 상대적으로 영향을 받지 않기 때문에 1 차 miRNA의 전사에 기인할 수 없다.

miRNA의 기능은 표적 mRNA의 발현을 억제하는 것이므로 난소암에서 nc886/TGF-β 경로에서 miRNA 표적 유전자를 검색했다(도 23). 초기에 nc886-kd와 TGF-β 치료 모두에서 유의하게(p <0.05) 변화된 1552 개의 배열 프로브를 고려하였고 nc886-kd 및 TGF-β 모두에서 감소한 477 개의 프로브를 선택했다. miRNA가 표적 mRNA에 미치는 영향은 대개 완만하기 때문에 fc cutoff를 적용하지 않았다. miRNA 표적 후보자 인 397 개의 mRNA 유전자가 ncRNA 및 주석이 없는 유전자와 중복된 프로브에 대한 프로브를 제거하면 397 개의 mRNA 유전자가 생성된다. 우리는 MIR 유전자가 우리가 관심있는 상위 5 개의 miRNA(miR-124-3p, -183-5p, -203a-3p, -200c-3p 및 19b-3p; [도 21] 참조)를 설정할 때, 예상되는 표적 유전자들이 상기 397 개의 유전자에서 상당히 농축된 것을 확인하였다. 예를 들어, 552 개의 유전자가 miR-124-3p의 MIR 세트(MSigDB에서 miR-124a로 지정됨)에 나열되어 있으며 이는 인간 게놈에서 19,313 개의 단백질 코딩 유전자 중 ~ 2.8 %로 계산된다. 이 MIR 세트에 대해 397 개의 유전자를 분석했을 때, miR-124-3p가 표적으로 하는 유전자는 25 개(6.3 %; 농축 p 값 <0.001)였다. 이 농축은 다른 모든 4 개의 miRNA에서 나타났으며 nc886-kd/TGF-β가 miRNA 경로를 변조하여 유전자 발현 패턴에 영향을 미친다는 가설을 뒷받침한다.

예상 miRNA 표적을 더 조사하기 위해 하나 이상의 miRNA에 의해 표적화된 유전자를 선택했다. 이는 단일 유전자를 억제하는 여러 개의 miRNA가 협동적 또는 단순한 가중치 작용을 통해 단일 miRNA보다 분명히 더 억제되기 때문이다. 그 결과, 40 개 이상의 miRNA가 13 개의 유전자를 표적으로 한다는 것을 확인하였으며, 그들 중 일부는 난소암과 관련이 있는 것으로 알려져 있었다(도 24). 그 중 CNN3, PDCD6, PRKCA 및 ZEB2을 추가 검사 대상으로 선정하였다. qRT-PCR 측정은 그들의 발현이 배열 데이터와 일관되게 nc886-kd 만큼 감소되고 TGF-β(도 24)에 의해 증가됨을 확인했다. miRNA에 의해 억제되었는지 여부를 테스트하기 위해 miRNA-mimic (miR-124-3p, -183-5p, -203a-3p, -200c-3p 및 -19b-3p의 혼합물)을 OSE80PC 세포 (nc886- 높고 그러므로 miRNAs는 낮다). PRKCA를 제외한 모든 3 개의 유전자의 수준은 miRNA 모방에 의해 감소되었다(도 29). 다음으로, CNN3, PDCD6 및 ZEB2가 이들 유전자의 3'-비 번역 영역(UTR)을 갖는 센서 플라스미드로 루시퍼라제 분석을 수행함으로써 직접 표적인지 여부를 확인하였다(도 29). 3 개의 모든 센서 플라스미드는 miRNA 모방에 반응하여 직접 표적 유전자임을 나타냈다(도 29).

그러나 nc886이 수백 개의 miRNA 중 주요 부분을 조절하고, 각 miRNA가 수백 개의 표적에 약간의 영향을 미친다는 사실을 고려하면 nc886은 전체 miRNA 활동을 억제하는 것으로 판단된다.

nc886은 Dicer와 상호 작용하여 miRNA의 성숙을 억제한다.

표적 DNA 또는 RNA를 인식하여 유전자 발현을 조절하는 대부분의 조절 ncRNA와 달리, nc886은 nc886/PKR 사례에서 볼 수 있듯이 단백질과 상호 작용하고 그 활성을 조절함으로써 작용하는 것으로 보인다. 따라서 난소암에서 nc886의 표적 단백질을 확인하고자 하였다. 이를 위해 우리는 in vitro biotinylated nc886을 이용하여 OSE80PC 세포의 용해성 세포질 추출물(S100 분획)에서 nc886과 상호 작용하는 단백질을 검색했다. 질량 분석기 분석은 EIF2AK2(일명 PKR), ACTG2, KRT28, ADAR, PKM, DHX9, HARS2, ILF3, KRT13, DICER1, TAGLN 및 STAU1(질량 분광 분석 점수> 10, [도 25])을 포함하는 여러 단백질들을 분석하였다. nc886이 MIR에 미치는 영향과 함께 Dicer는 전구체 miRNA를 성숙한 miRNA로 변환하는 다중 도메인 효소이기 때문에 이를 확인하고자 하였다(도 25). Dicer-nc886 상호 작용은 FLAG-tagged Dicer의 면역 침전(IP)에 의해 검증되었다. nc886은 FLAG-Dicer IP 복합체에는 존재하지만 음성 대조군에는 존재하지 않는다([도 25]의 WT(야생형) 및 FLAG와 비교함). 상호 작용의 특이성은 nc886에 대한 paralog ncRNA 인 vtRNA1-1과 비교하여 더욱 확증되었다. vtRNA1-1은 길이(99 nt 대 101 nt) 및 서열(6 개 이상의 연속 일치하는 뉴클레오타이드가 계산되었을 때 38 동일 nts)이 nc886과 유사하다. 그럼에도 불구하고 이러한 ncRNA는 Dicer와 다르게 결합한다. 야생형 및 돌연변이 Dicer("pcDNA3.1-FLAG-Dicer-" 시리즈) 또는 pcDNA3.1-FLAG 벡터는 293T 세포로 형질감염시켰다. FLAG-IP 후, 마이너 부분(minor portion)의 비드를 SDS-PAGE 겔 로딩 완충액에 재현탁하고 FLAG 웨스턴 블롯에 의해 검출된 결합 단백질을 용리시키기 위해 2 분 동안 가열하였다. 나머지 주요 부분(major portion)은 2^{- ΔCt} 값으로부터 % 입력 RNA를 계산하는 결합 분석에 사용되었다. 그 결과, nc886은 FLAG-Dicer IP 복합체에 vtRNA1-1보다 유의하게 높은 수준으로 존재했다([도 26]의 WT). nc886의 역할을 평가할 때, vtRNA1-1은 세포 내 존재량, 세포질 내 위치, Pol Ⅲ에 의한 전사와 같은 다른 특징을 공유하기 때문에 가장 적절한 통제가 필요하다. 그러나 vtRNA1-1은 종양의 표현형이나 miRNA 표적 유전자의 발현에는 의미가 없었고(데이터는 표시되지 않음), 이는 nc886과 대조적이다. 이는 nc886과 vtRNA1-1에 각각 Dicer가 결합하여 능숙하고 불완전하기 때문인 것으로 추측하였다.

nc886-Dicer 상호 작용은 절사 돌연변이를 시험하여 입증되었다(도 25). Pre-miRNA에 대한 Dicer 상호 작용의 메커니즘은 많은 문헌에서 집중적으로 연구되어왔다. PAZ(PIWI-AGO-ZWILLE) 도메인은 pre-miRNA의 말단을 인식하고 RNase Ⅲ 촉매 도메인([도 25]의 "RIIIDa"및 "RIIIDb")에서 그 위치를 결정짓는 중요한 역할을 한다. ATPase / helicase 도메인([도 25]의 "Helicase")은 pre-miRNA의 루프와 상호 작용하며 일부 pre-miRNA의 처리를 용이하게 한다. pre-miRNA 결합에서 DUF283 (알려지지 않은 기능의 도메인)과 이중 가닥 RNA 결합 도메인([도 25]의 "dsRBD")의 역할은 덜 명확하다. FLAG-IP 데이터에서 nc886 상호 작용은 헬리케이즈 도메인 (WT 및 ΔDUF 비교)이 없는 경우 감소하고 PAZ 도메인이 삭제되면 더 감소한다(ΔDUF 및 ΔPAZ 비교). ΔPAZ에서 nc886 신호는 배경 수준(FLAG) 이상 이었지만 vtRNA1-1 신호와 구별 할 수 없었다. 그래서, 헬리케이즈 및 PAZ 도메인이 nc886의 특이적 인식에 기여하는 것으로 나타났다.

nc886-Dicer 상호 작용이 nc886이 저/고일 때 성숙한 miRNA 수준이 증가/감소한다는 사실에 기반하여 손상된 miRNA 프로세싱을 유도했다고 가정하고(도 22), miRNA processing assays로 이 가설을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 경쟁자(비 표지된 nc886 또는 vtRNA1-1)를 표시된 양 만큼 가공 반응에 첨가하였다. 처리되지 않은 pre-miRNA 밴드뿐만 아니라 처리된 성숙한 miRNA 밴드를 정량화하여 하단에 표시되는 가공의 %를[= 성숙 miRNA/(성숙한 miRNA + pre-miRNA)] 계산했다. 그 결과, miR-124-1 및 -200c의 전구체는 FLAG 정제된 Dicer에 의해 성숙한 miRNA로 효율적으로 가공되었다. 중요한 것은 nc886이 vtRNA1-1과 비교하여 프로세싱 분석에 첨가될 때 miRNA 성숙을 효율적으로 억제한다는 것이다(도 27). 이 데이터는 바인딩 데이터(도 26)와 잘 일치하므로 nc886이 Dicer에 결합하는 능력과 그 결과 진정한 miRNA 전구체로부터 Dicer를 적정 할 수 있는 가능성이 높다. 주목할 만하게, nc886는 결합하였을 뿐만 아니라 Dicer에 의해 분해되었다(도 27). Dicer에 의한 nc886의 분해는 또한 우리의 실험에 의해 Dicer의 이소성 발현 및 kd가 nc886의 감소된 발현 수준 및 증가된 발현 수준을 각각 초래한다는 것을 보여주듯이 난소암 세포에서 일어났다(도 28). 이러한 데이터는 miRNA뿐만 아니라 nc886의 세포 내 수준을 제어하는 중요한 피드백 메커니즘이 있음을 암시한다.

nc886의 분해는 진짜 miRNA 프로세싱과 구별되었다. Dicer는 진정한 pre-miRNA의 성숙한 miRNA 크기(22 nts)의 단일 불연속 밴드와 달리 nc886을 25-80 nts의 넓은 범위의 다중 밴드로 분해한다(도 27). nc886은 전체 세포 RNA에서 검출 가능한 성숙 miR-886과 일치하여 이 분석에서 성숙한 miRNA를 간신히 생산했다. nc886 분해의 정도는 pre-miR-200c 처리의 양보다 정량적으로 적다(도 27). Canonical pre-miRNAs는 2 nt 3'-overhang 인 말단 구조를 가진 거의 완벽한 duplex의 줄기를 가지고 있다. 이 영역은 절단 부위를 촉매 코어에 정확하게 위치시키는 PAZ 도메인에 의해 인식된다. nc886은 덜 효율적인 와블(wobble) 절단을 설명하는 그러한 구조적 특징이 결여되어있다. nc886이 진짜 pre-miRNA보다 약한 기질이었음에도 불구하고 nc886이 세포 내에 매우 풍부(10⁵ copies/cell)하기 때문에 nc886이 Dicer와 경쟁 할 수 있을 것으로 기대한다. nc886은 Dicer와 물리적으로 상호 작용하고, pseudo-substrate로 작용하며, miRNA 전구체로부터 멀리 적정함으로써 miRNA 경로를 저해한다.

nc886의 표현형은 Dicer 억제에 기인한다.

다음으로 TGF-β/nc886 경로에서 Dicer 억제의 기능적 중요성을 평가했다. SKOV3_벡터 세포주를 96 시간 동안 TGF-β로 처리하고, pcDNA3.1-FLAG-Dicer(WT)로 24 시간 동안 형질 감염시킨 다음 분석하였다. Dicer kd는 TGF-β 및 nc886이 수행 한 것과 유사하게 성숙 miRNA 수준을 감소시키고, 세포 부착을 향상시켰다(도 30). 더 중요한 것은, Dicer의 이소성 발현은 TGF-β 또는 nc886에 의해 자극 된 세포 이동을 약화시켰다(도 31). 세포 이동에 대한 Dicer의 억제 효과는 PARP 수준이 동일하고 Dicer의 이소성 발현이 SKOV3_vector를 억제하지 않았기 때문에 비특이적 독성 효과가 아니었다. 이것은 Dicer 억제가 세포 전이능을 촉진하는데 TGF-β/nc886의 역할에서 중요한 사건임을 분명히 증명했다.

nc886은 난소암 환자에서 화학 요법 내성(내 화학성)과 불량한 예후와 관련있다 .

본 발명자들은 nc886의 임상적 관련성을 조사하고자 했다. nc886에 대해 매우 특이적인 유전자 발현 시그니처(118개 유전자의 nc886 시그니처, 도 17)를 확인 하였다. 난소암 환자(GSE9891, n = 285)의 집단 유전자 발현 데이터에 상기 시그니처를 적용하기 전에, 이용 가능한 RNA로 수집한 다른 작은 집단(제일 병원의 25 명)에서 이것을 검증하였다. 이를 위해 상기 118 개의 유전자 중 3 개의 유전자 (FRMD6, TAGLN 및 TPM1)를 선택하고 GSE9891 집단의 118 유전자 시그니쳐와 상관 관계가 있음을 확인했다(도 32). 상기 3 가지 유전자(FRMD6, TAGLN, TPM1)가 선택된 이유는 다음과 같다; 첫째, nc886이 miRNA 경로를 억제하여 miRNA 표적 유전자를 증가시키는 우리의 모델에서 예상되는 방향("nc886_kd"이 감소하고 "nc886_exp"또는 "TGF-β"가 증가됨)으로 변경되었다. 둘째, 이들은 nc886과 TGF-β(4 개의 실험 쌍에서 접힘 변화를 요약했을 때 8 위, 9 위, 17 위)에 의해 가장 많이 규제된 유전자들 중 하나였다. 셋째, 그들의 표현은 qRT-PCR에 의해 확인되었다. 그런 다음 제일 병원 집단(n=25)에서 qRT-PCR로 측정하여 nc886과 이들 3 가지 유전자를 직접 비교하고 강한 양의 상관관계를 확인했다([도 32], 3 가지 Pearson's r 값> + 0.5). 이 데이터는 118 유전자 시그니처가 nc886에 대한 좋은 프록시 측정을 나타내므로 우리는 난소암 환자(GSE9891 집단, [도 33])의 발현 데이터와 교차 비교하기 위해 이 방법을 사용했다. 이 환자들을 nc886 신호에 따라 층화시켰을 때, 높은 nc886 발현 환자의 전체 생존율과 무 재발 생존율은 낮은 nc886 환자보다 유의하게 낮았다(로그 순위 테스트에 의해 p<0.001, [도 34]). 보조 화학 요법 치료 정보가 이용 가능하고 nc886이 약물 내성을 촉진했기 때문에(도 11) nc886과 내화학성의 연관성을 테스트한 결과 대다수의 내화학성 환자(18 명 중 15 명 또는 83 % nc886-high 아형으로 분류되었다(p=0.008, [도 35]). 또한 nc886은 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 분석에서 항암 화학 요법에 대한 내성을 매우 예측할 수 있었으며(AUC : 70.2 %, p = 0.002, [도 35]), nc886이 치료 후 난소암 환자의 임상 결과를 지시할 수 있었다. 또한 하기 [표 6]에서 나타나는 바와 같이, 단변량 및 다변량 Cox 회귀 분석에서 nc886 아형이 전반적인 생존과 유의한 관련이 있었으며 병기 및 잔여 질환과 같은 예후적 임상변수와는 무관한 것으로 나타났다. 요약하면, 임상 데이터는 우리의 세포 배양 데이터와 잘 일치하며([도 11] 및 [도 35]), 새로운 TGF-β 표적 유전자 및 miRNA 조절 인자인 nc886이 난소암의 주요 종양유발인자가 될 수 있으며, 미래의 화학 요법의 표적이 될 수 있음을 종합적으로 나타낸다.

<110> NATIONAL CANCER CENTER University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Method of providing information for predicting ovarian cancer prognostication using nc886 genome <130> 1064419 <150> KR 10/2017/0144330 <151> 2017-10-31 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 150 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nc886 <400> 1 agtcgcacac tcctacccgg gtcggagtta gctcaagcgg ttacctcctc atgccggact 60 ttctatctgt ccatctctgt gctggggttc gagacccgcg ggtgcttact gaccctttta 120 tgcaataaat tcggtataat ctgtcactct 150

Claims (13)

1. nc886 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 올리고 뉴클레오타이드를 포함하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 난소암은 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암인 것을 특징으로 하는 난소암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
   
3. nc886 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암 진단용 조성물.
   
4. i) 난소암 환자에서 생물학적 시료를 수득하는 단계;
   ii) 상기 단계 i)에서 수득한 시료의 nc886 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
   iii) 상기 단계 ii)에서 확인한 nc886의 발현 수준에 따라 상기 단계 i)의 난소암 환자를 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;
   를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 단계 iii)의 분류는 ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현패턴을 기준으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
6. 제4항에 있어서, iv) 상기 단계 iii)의 분류 결과 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계;
   를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
7. 제4항에 있어서, 상기 난소암은 iM/섬유증(iM/fibrosis) 아형의 난소암인 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 예후가 불량하다는 것은 암세포의 전이 발생, 항암제 에 대한 내성 존재 및 환자의 사망을 의미하는 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
9. 제8항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
   
10. i) A2780_vector, SKOV3_vector, OSE80PC_nc886-kd, SKOV3_nc886, OSE80PC_control-kd, A2780_nc886 및 SKOV3_TGF-β 세포주에서 유전자 발현 데이터를 얻는 단계;
    ii) 상기 단계 i)에서 얻은 데이터를 분석하여 패턴을 수득하는 단계;
    iii) 상기 단계 ii)에서 수득한 패턴을 BCCP(Bayesian compound covariate predictor) 알고리즘으로 통합하여 분류기(classifier)를 형성하는 단계; 및
    iv) 상기 단계 iii)에서 형성된 분류기에 난소암 환자의 유전자 발현 데이터를 적용하여 nc886 고발현군 또는 nc886 저발현군으로 분류하는 단계;
    를 포함하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 유전자는 ADAP2, ADM, ADM2, AHR, AK2P2, ALPP, ALS2CR14, ALS2CR4, ANXA2, ASS1, BCYRN1, C5orf13, C6orf170, C9orf130, CALD1, CCBE1, CCDC125, CD68, CDKN1A, CENTA1, CEP27, CTGF, CYCSL1, CYR61, DDIT4, DENR, DHRS2, DOPEY2, DTWD2, EIF2AK4, ENO2, FAM153B, FAM40B, FAM72D, FAM73A, FLJ21986, FRMD6, FSTL1, G0S2, GDF15, GNAI1, GPT2, HCFC1R1, HSCB, IER5L, IGFBP5, IL20RB, JAK1, KLHL28, LAMA5, LEP, MARCKS, MOAP1, NLRP8, NR4A2, NUBPL, PALLD, PCDHB9, PCK2, PDE4C, PIP5K2B, PLA2G2D, PNPT1, PPP1R10, PRO1853, PTPLA, PTPLAD2, RAB32, RASSF6, RAXL1, RBM3, RBM47, RHBDL2, RN5S9, RNU11, RNU1-3, RNU1-5, RNU1A3, RNU1F1, RNU1G2, RUNDC2C, SDHALP1, SEL1L3, SEMA3B, SLC3A2, SLC4A5, SLC5A8, SNAI2, SNORD3A, SNORD3C, SNORD3D, SPARC, SSTR2, SYAP1, TAF9L, TAGLN, TAP1, TAX1BP3, TGFB1I1, THBS1, TIPARP, TMEM106A, TMEM191A, TMEM47, TNFSF14, TPM1, TRIB1, TRIB3, TRIM6, TUBB6, UBE2L6, UGCG, USP49, VPS41, ZNF223, ZNF682, ZNF773 및 ZNF786 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
    
12. 제10항에 있어서, v) 상기 단계 iv)에서 nc886 고발현군으로 분류되는 경우 난소암세포의 전이 발생, 항암제에 대한 내성 존재 및 난소암 환자의 사망을 예측하여 예후가 불량할 것으로 판단하는 단계;
    를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
    
13. 제12항에 있어서, 상기 항암제는 파클리탁셀(paclitaxel)인 것을 특징으로 하는 난소암 환자의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
    
    

Images