KR100998365B1 - 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 1개 이상의 치료 효능이 있는 변형핵산(N)과 풍부한 구아노신(G)이 포함된 신규 올리고뉴클레오티드 변형체를 합성하고, 상기 올리고뉴클레오티드 변형체가 암 세포의 세포사멸 활성을 가짐을 확인함으로써 신규 올리고뉴클레오티드 변형체 및, 상기 변형체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체{Novel guanosine rich modified oligonucleotides and antiproliferative activity thereof}
본 발명은 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체, 및 상기 변형체 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
근래의 의학적 발전에도 불구하고 암은 여전히 전 세계에 걸쳐서 가장 중요한 사망원인에 속하며, 노령화에 따라 암환자도 매년 기하급수적으로 상승하고 있다.
일반적으로 항암제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
1980년대 이후 자동화된 DNA 합성기가 개발되었고, 세포 내 mRNA를 타겟으로 하는 안티센스, siRNA, 리보자임과 단백질을 타겟으로 하는 압타머, CpG, 디코이 핵산등 올리고데옥시누클레오타이드를 치료제로 개발하기 위한 연구가 활발해졌다[Gleave et al., Nat Rev Cancer. 2005 468-479 ; Castanotto et al., Nature 2008 426-433 ; Sullenger et al., Nature 2002 252-258 ; Kaur et al,. Expert Opin Investig Drugs. 2008 43-60 ; Jurk M et al., BioDrugs. 2007 387-401 ; Tomita et al., Clin Exp Nephrol. 2007 7-17].
구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드는 광범위한 암세포에 대하여 세포성장저해 효과를 가진다고 알려져 있으며, 암세포에 처리할 경우 세포내의 특정한 단백질, 예를 들어 eEF1A, JNK, Ki-ras, Nucleolin, stat3, telomerase, topoisomerase 단백질 등과 같은 세포 성장과 사멸에 중요한 단백질과 결합하여 세포주기를 조절하는 역할을 하며, 이러한 단백질은 정상 세포보다 암 세포에 과발현되어 있는 것으로 알려져 있다[Christopher R. Ireson et, al. Molecular cancer therapy 2006 2957-2962 ; Naijie Jing et, al. Cancer Research 2004 6603??6609 ; Christophe Marchand Et, al. The journal of Biological Chemistry 2002 8906??8911].
이러한 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오타이드는 시토신과 삼중의 수소결합 외에도 특별한 구조적인 특징을 가지고 있다. 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드는 분자내 결합 또는 분자간 결합을 통하여 4가닥의 구조를 가질 수 있다. 일반적인 아데노신과 티아민, 구아노신과 시티딘과의 수소결합을 통한 이중나선구조를 형성하는 대신 4개의 구아노신이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsten) 형태의 수소결합을 이루어서 G-쿼드로플렉스(Quadruplex)를 형성하고 이것이 2개 이상 연속적으로 구성되어 사중 나선구조(tetrad helical structure)를 가지게 된다. 일반적으로 올리고뉴클레오티드가 혈액 내 안정성 및 세포투과율이 매우 낮아 약물로서 개발하는 어려움이 있었으나, 이러한 G-쿼드로플렉스를 이루는 올리고뉴클레오티드는 그의 구조적인 특징으로 인하여 안정한 구조를 이루고 있어 비교적 높은 혈액안정성 및 세포투과도를 가지는 것으로 알려져 있다. [Julian Leon Huppert, Chemical Society Reviews 2008, 37, 1375??1384;Paula J. Bates Et, al.Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164 ; Christopher R. Ireson et, al. Molecular cancer therapy 2006 2957-2962].
미국특허 제 7312082호에서 언급한 것처럼 G-쿼드로플렉스(Quadruplex)의 안정성은 일가 양이온, 인터킬레이팅 시약, 올리고뉴클레오티드의 농도 등에 영향을 받게 된다. (Haiyan Qi et, al. Cancer Res 2006 11808-11816, Anna Arola et, al. Current Topics in Medicinal Chemistry 2008 1405-1415)
이러한 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 미국특허 제7314926, 미국 특허 공개 제2007-105805호에서와 같이 암세포 표면에 많이 발현되어 있는 특정한 단백질과 결합 후 엔도사이토시스로 암세포로 침투 후 세포사멸에 관련된 단백질에 결합하여 세포성장을 저해하는 것으로 알려져 있으며, 세포독성 효과(cytotoxic effect) 보다 세포성장 정지 효과(cytostatic effect)로 인하여 세포사멸을 유도하는 것으로 보고되어 있다[Paula J. Bates Et, al. The journal of Biological Chemistry 1999 26369??26377 ; Bruna et al,. FEBS journal 2006 1350-1361].
또한, G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 암세포의 성장을 저해시키는 효과 이외에도 미국 특허 제5567604호에서는 항바이러스, 미국특허 제6994959호에서는 면역조절작용, 미국 특허 공개 제2007-105805호에서는 헌팅턴 질환에 치료 효과가 있는 것으로 발표되어 생체 내에서 여러 가지 기능 및 조절작용을 하는 것으로 알려졌다[Cheryl A. Stoddart et, al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998 2113-2115 ; Michael Skogen et, al. BMC Neuroscience, 2006 7:65].
이처럼 G-쿼드로플렉스 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드의 다양한 질환에 대한 효과로 인해 많은 연구자들이 이에 대한 연구를 진행하고 있으며, 현재 항암제로서 임상이 진행되고 있다[Paula J. Bates Et, al.Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164].
임상 약물인 AS-1411은 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드로서 암세포에 과발현되어 있는 뉴클레오린(nucleolin)과 결합하여 우수한 세포성장 저해 효과를 주는 것으로 보고되었다. 또한, 생체 내에서 정상세포에 미치는 영향을 최소화 할 수 있고 약제 내성을 가지는 암 세포종에서도 복합적으로 사멸율을 증대시킬 수 있는 것으로 보고 있으며 항암제의 새로운 약물로 기대되고 있다[Christopher R. Ireson et. al. Mol Cancer Ther. 2006 Dec;5(12):2957-62].
그러나, G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 주로 세포성장 저해 효과로 인한 세포사멸을 유도해야 하므로 세포사멸율이 비교적 높지 않아 4일에서 7일 정도 수액 주사를 통하여 일정시간 이상 지속적인 처리가 필요하다. 따라서, 필요 이상의 약물을 장시간 투여해야 하는 문제점이 있으며, 강한 독성의 화학요법제와 병용 투여해야 하는 어려움이 있다[Paula J. Bates Et, al.Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164 ; Christopher R. Ireson et, al. Molecular cancer therapy 2006 2957-2962].
이에, 본 발명자들은 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 세포사멸 효과를 주는 치료용 변형핵산을 도입하여 세포사멸 효과를 증대하고자 하였다.
대표적인 치료용 변형핵산은 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU)을 들 수 있다. 5-FU은 1950년대 말에 항대사물질 계열의 항암제로 개발되었으며, 티미딜레이트 합성효소(thymidylate synthase)를 차단하여 항암 효과를 나타낸다[Piedo et al. J Clin Oncol 1988, 1953-1664]. 또한, 5-플루오로데옥시우리딘(5-flurorodeoxyuridine, 5-FdU), 5-플루오로데옥시시티딘(5-flurorodeoxycytidine, 5-FdC), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine)과 같은 5-플루오로피리미딘(5-fluoropyrimidine) 계열의 뉴클레오시드(nucleoside) 형태의 전구약물(prodrug)들이 광범위하게 대장, 유방, 두경부 등의 암 치료 목적으로 40년 이상 사용되어지고, 현재 임상적으로 이용하고 있다[Thomas et al. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1998 887-895 ; Heidelberger et al. Nature 1957 179:663??666 ; Longley et al., Nat Rev Cancer 2003 330??338 ; Beumer et al., Cancer Chemother Pharmacol 2008 363-368 ; Song et al., Clinical cancer research. 1997, 901-909].
이러한 5-플루오로데옥시우리딘(5-flurorodeoxyuridine), 5-플루오로데옥시시티딘(5-flurorodeoxycytidine), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine) 뉴클레오시드가 올리고뉴클레오티드에 포함되도록 하는 포스포라미다이트(phosphoramidite) 제제가 합성되어져 고정상 DNA 합성기에서 치료적 뉴클레오시드가 포함된 올리고뉴클레오티드의 합성이 가능해졌다[Gmeiner et al., J. Org. Chem. 1994, 5779-5783 ; Schmidit et al., Nucleic Acids Research, 1992, 2421-2426 ; Stolarski et al., Biochemistry 1992, 31, 7027-7042].
이러한 치료적 뉴클레오시드가 포함된 올리고뉴클레오티드는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 등에 의해서 분해되면서 5-FdU나 5-FdC가 유리되고 여러 가지 효소들이 관여하여 5-FdUMP와 같은 최종 활성형이 생성되어 세포사멸을 유도하며, 같은 농도의 5-FdU 보다 세포독성이 강력할 뿐 아니라 약제내성이 있는 암종에서도 효능이 있는 것으로 알려졌다[Gmeiner et al., Nucl. Nuct. 1995 243-253]. 미국 특허 제 5457187호에서는 5-플루오로우라실이 포함된 호모 폴리-FdU 올리고뉴클레오티드, 미국특허 제5614505호에서는 FdU로 구성된 올리고뉴클레오티드가 세포독성을 가짐에 대하여 보고된 바 있다. 그러나 이러한 5-플루오로우라실이 포함된 호모 폴리-FdU 올리고 뉴클레오티드는 G-쿼드로플렉스를 형성하지 아니하여 혈액안정성 및 세포투과성이 현저히 떨어지는 등 전체적인 구조 및 약효의 작용면에서 약물로서 개발하기에는 문제가 있다.
이에, 본 발명자들은 세포성장 정지 효과(cytostatic effect)를 가지는 구아노신이 풍부하여 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 세포독성 효과(cytotoxic effect)로 세포사멸을 유도하는 1개 이상의 치료용 변형핵산을 도입하여 혈액안정성 및 세포투과성을 증대함과 동시에 좀 더 효과적으로 암세포의 성장을 억제하고 사멸에 이르게 하고자 하였으며, 이러한 구조의 신규한 올리고뉴클레오티드를 합성하여 세포독성을 비교해 본 결과 임상약물보다 암세포 사멸 효과가 획기적으로 증대되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 1개 이상의 치료 효능이 있는 변형핵산과 풍부한 구아노신이 포함된 신규 올리고뉴클레오티드 변형체를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 변형체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하여 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체에 관한 것이다.
Figure 112010034987118-pat00001
Figure 112010034987118-pat00002
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R3은 수소, 할로겐, C1 -10의 알킬기, C1 -10의 할로알킬기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 할로알케닐기이며, 단, R1, R2는 동시에 하이드록시가 아니다.
또한 본 발명은, 'GxHyNz'서열[여기서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, H는 구아노신이 아닌 핵산, N은 우리딘 또는 시티딘 유래의 치료적 효능을 가지는 변형핵산이며, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 30의 정수, y는 0 내지 30의 정수, z는 1 내지 30의 정수이고, 단, x,y,z를 합한 전체의 값은 60을 넘지 않는다.]로 표시되는 올리고뉴클레오티드 변형체를 그 특징으로 한다;
또한, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 변형체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물을 또 다른 특징으로 한다.
본 발명에 따른 1개 이상의 치료 효능이 있는 변형핵산과 구아노신이 포함되어 G-쿼드로플렉스를 형성할 수 있는 신규한 올리고뉴클레오티드 변형체는 신규 구조의 화합물로서, 우수한 세포사멸 활성을 가지므로 암 예방 및 치료제로서 활용될 수 있다.
도 1은 대표적인 구아노신 또는 구아노신 유도체를 나타낸 것이다.
도 2는 올리고뉴클레오티드의 세포성장 저해된 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 올리고뉴클레오티드의 IC50 수치 및 세포의 형태를 촬영한 사진이다.
도 4은 올리고뉴클레오티드의 K562 AML(급성백혈병)세포에 대한 세포사멸효과(Cell growth % , in 1uM )를 비교한 그래프이다.
도 5은 올리고뉴클레오티드의 MV-4-11 AML(급성백혈병)세포에 대한 세포사멸효과(Cell growth % , in 2uM )를 비교한 그래프이다.
도 6은 양성대조군인 APT-4001 올리고뉴클레오티드의 G-쿼드로플렉스 구조를 확인하기 위하여 원편광이색성(CD, circular dichroism) 분광 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 1에서 제조된 APT-2054 올리고뉴클레오티드의 G-쿼드로플렉스 구조를 확인하기 위하여 원편광이색성 분광 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 실시예 1에서 제조된 APT-2073 올리고뉴클레오티드의 G-쿼드로플렉스 구조를 확인하기 위하여 원편광이색성 분광 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 구아노신이 풍부하여 G-쿼드로플렉스(G-quardruplex) 형성하는 올리고뉴클레오티드에 세포독성을 가지는 변형핵산이 포함되도록 제조된 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 G-쿼드로플렉스(G-quardruplex)는 구아노신(G)으로 대표적으로 언급되어지는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상[도 1 참조] 등이 풍부하여 특정 서열의 경우 4개의 구아노신이 한 평면에 위치하여 후그스텐(hoogsten) 형태의 수소결합을 이루어서 사중 나선구조를 가지게 되는 올리고뉴클레오티드를 말하며, 여기에 치료적 효과를 가지는 변형핵산을 도입하도록 합성된다.
구아노신이 풍부하여 G-쿼드로플렉스(G-quardruplex) 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 암세포에 좀 더 선택적으로 결합하고 세포 내에서 여러 기작을 통하여 암세포의 성장을 저해한다는 것이 알려졌다.
이러한 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드에 변형핵산을 한 개 이상 포함시켜 암세포 내로 전달 후 G-쿼드로플렉스 자체의 세포 성장 저해 효과 외에 뉴크레아제(Nuclease)에 의하여 분해될 경우 치료 효과를 갖는 변형핵산이 직접적으로 세포 성장을 저해시켜 복합적으로 암세포가 사멸하게 되었다. G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 단독적으로 사용 시에는 세포 성장 저지 효과만 있기 때문에 세포 사멸율이 비교적 높지 않을 뿐 아니라 일정시간 이상 지속적인 처리가 필요하다. 하지만, 본원발명에서는 치료 효과를 갖는 변형핵산이 포함되면 세포사멸 효과가 직접적으로 증대되어 세포사멸율이 급격히 증가될 수 있음을 확인하였다.
치료 효능을 가지는 변형핵산으로는 당(Sugar)이나 베이스(Base)를 변형시킨 아데노신, 구아노신, 티미딘, 시티딘, 우리딘 등을 의미한다.
구체적인 양태로서 본 발명에서 사용된 우리딘 또는 시티딘 유래 치료용 변형핵산(N)은 다음 화학식 1의 우리딘 또는 화학식 2의 시티딘과 같은 피리미딘 계열의 뉴클레오티드가 바람직하며, 상기 뉴클레오티드를 통상적인 방법[Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach 1991 et al. IRL Press: Oxford]으로 포스포라미다이트 형태로 만들거나, 뉴클레오티드 포스포라미다이트를 글렌리서치(glenresearch)사, 베리(Berry and Associates)사, 오키노스(Okeanos Tech)사, 켐젠(Chemgene)사, 프롤리고(Proligo)사 등에서 구입하고, 기존에 보고된 방법으로 DNA 합성기를 이용한 고정상 합성법을 통하여 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드에 포함되도록 생산 가능하다.
[화학식 1]
Figure 112010034987118-pat00003

[화학식 2]
Figure 112010034987118-pat00004
상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R3은 수소, 할로겐, C1 -10의 알킬기, C1-10의 할로알킬기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 할로알케닐기이며, 단, R1, R2는 동시에 하이드록시가 아니다.
더욱 바람직하기로는 상기 우리딘 또는 시티딘 유래 변형핵산(N)이 5-플루오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine), 5-플루오로데옥시시티딘(5-fluorodeoxycytidine), 5-플루오로시티딘(5-fluorocytidine), 5-아이오도데옥시우리딘(5-iododeoxyuridine), 5-아이오도우리딘(5-iodouridine), 5-아이오도데옥시시티딘(5-iododeoxycytidine), 5-아이오도시티딘(5-iododeoxycytidine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside/Ara-C), 2′,2′-다이플루오로데옥시시티딘(Gemcitabine), 카페시타빈(Capecitabine) 및 브로모비닐-데옥시우리딘(bromovinyl-deoxyuridine) 등이 적합하며, 상기 변형핵산이 포스포라미다이트 형태로 만들어진 것을 사용하여 고정상 합성기를 통하여 통상적인 방법으로 올리고뉴클레오티드 변형체를 제조할 수 있다.
즉, 상기 변형핵산 포스포라미다이트를 무수아세토나이트릴에 녹여서 DNA 합성기에 장착하여 합성하고, 글렌리서치(glenresearch) 사에서 제공하는 지침서 및 미국특허 제 5457187호와 제 5614505호를 참고하여 통상적인 합성 및 정제방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드 변형체를 합성한다. 구체적인 한 예로서, 합성된 올리고뉴클레오티드 변형체의 구조는 다음 화학식 3과 같다.
Figure 112010034987118-pat00005
또한, 상기와 같이 변형핵산을 이용하여 합성 가능한 올리고뉴클레오티드 변형체의 대표적인 서열은 기존에 치료를 목적으로 보고된 올리고뉴클레오티드 서열[Paula J. Bates et. al. The journal of Biological Chemistry 1999 26369??26377, Cheryl A Stoddart et, al. Antimicrobial agents and chemotherapy 1998 2113-2115, Virna Dapic et. al.Biochemistry 2002 3676-3685, Naijie Jing et al. Biochemistry 2002, 41, 5397-5403, Naijie Jing et. al. Cancer research 2004 6603-6609, Haiyan Qi et. al. Cancer research 2006 11808-11816, YunTeng et al. Cancer Research 200710491-10500, Bruna Scaggiante et al. FEBS Journal 2006 1350??1361, Julie E. Reed et. al. Journal of the American Chemical Society 2006 5992-5993, Jeffrey S. Bishop et al. The Journal of Biological Chemistry 1999 5698??5703, Christophe Marchand et al. The Journal of Biological Chemistry 2002 8906??8911, Jun-ichiro Suzuki et al. Journal of virology 2002 3015??3022, Virna Dapic et al. Nucleic Acids Research, 2003 2097-2107, Amber Goodchild et. al. Nucleic acid research 2007 4562-4572, 미국특허 제 6323185, 미국특허 제 7314926, 미국특허 제 6994959, 미국특허 제 7157436, 미국특허 제 7199228] 또는 G-쿼드러플렉스를 형성하면서 생리적 활성을 나타내는 다양한 서열들에 대하여, 적어도 한 개 이상 치료적 효능이 있는 변형핵산으로 치환하여 도입함으로써 완성될 수 있다. 예를 들면, 세포 성장 저해 활성을 나타내는 것으로 알려진 TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG 또는 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG 로 표시되는 서열의 경우 적어도 한 개 이상 치료적 효능이 있는 변형핵산, 예를들면 5-FdU(이하 'F'로 명기) 또는 2′,2′-다이플루오로데옥시시티딘(Gemcitabine, 이하 'Z' 로 명기)를 치환하여 도입함으로써 다양한 신규 올리고뉴클레오타이드 변형체를 완성할 수 있다. 구체적인 예를 들면, FFFGGFGGFGGFGGFFGFGGFGGFGGFGG, FFFGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, GGFGGFGGFGGFFGFGGFGGFGGFGG, GGFGGFGGFGGFFFFGGFGGFGGFGG, GGFGGFGGFGGTTGTGGFGGFGGFGG, GGFGGFGGTGGTTGTGGTGGFGGFGG, GGFGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGFG, GGTGGTGGTGGFFFFGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGFFGFGGTGGTGGTGG, GGZGGZGGZGGZZGZGGZGGZGGZGG, GGTGGTGGTGGTTZTGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTZZTGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTZGTGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTTGZGGTGGTGGTGG, GGTGGTGGTGGTZGZGGTGGTGGTGG, GGZGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGZGG, GGTGGZGGTGGTTGTGGTGGZGGTGG 등으로 적절한 위치에 변형핵산을 치환하여 도입함으로써 다양하게 신규 올리고뉴클레오티드로 완성할 수 있으며, 이들은 우수한 세포사멸 효과를 보이는 것으로 확인되었다. 따라서 기존에 치료를 목적으로 보고된 올리고뉴클레오티드 서열 또는 G-쿼드러플렉스를 형성하면서 생리활성을 갖는 올리고 뉴클레오타이드의 서열에 본 발명의 변형핵산을 치환하여 도입함으로써 신규한 뉴클레오티드 변형체를 완성할 수 있다. 신규 뉴클레오티드의 서열 및 변형핵산의 치환 위치는 G-쿼드러플렉스를 형성하는 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등에 영향을 줄 수 있다. 따라서 신규 뉴클레오티드의 서열 및 변형핵산의 치환 위치는 G-쿼드러플렉스를 형성하는 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등에 따라 결정될 수 있으며, 본 발명에 의해 완성된 뉴클레오티드 변형체의 유용성은 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등의 결정요인에 따라 나타나는 생리적 활성 효과에 따라 결정될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 적용 가능한 신규 올리고뉴클레오티드 변형체의 서열은 다음과 같다.
본 발명은 'GxHyNz'서열[여기서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, H는 구아노신이 아닌 핵산, N은 우리딘 또는 시티딘 유래의 치료적 효능을 가지는 변형핵산이며, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 30의 정수, y는 0 내지 30의 정수, z는 1 내지 30의 정수이고, 단, x,y,z를 합한 전체의 값은 60을 넘지 않는다.]로 표시되는 올리고뉴클레오티드 변형체를 그 특징으로 한다.
상기 치료적 효능을 가지는 변형핵산(N)은 하기 화학식 4 또는 화학식 5로 표시되는 화합물로 올리고뉴클레오티드 변형체 내에 존재하게 된다.
Figure 112010034987118-pat00006
Figure 112010034987118-pat00007
상기 화학식 4 또는 화학식 5에서, R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R3은 수소, 할로겐, C1 -10의 알킬기, C1 -10의 할로알킬기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 할로알케닐기이고, 단, R1, R2는 동시에 하이드록시가 아니며, X는 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이고, Y는 수소 또는 다른 핵산 중 포스페이트 잔기의 인 원자이다.
상기 H는 아데노신, 시티딘, 우리딘 또는 티미딘이 더욱 바람직하며, 상기 x,y,z를 합한 전체의 값은 5 ~ 60, 더욱 바람직하게는 14 ~ 26 범위에 있는 것이 좋다.
상기에서, G는 구아노신으로, 바람직하기로는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신, D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상일 수 있으며, N은 시티딘 또는 우리딘 유래의 변형핵산으로서, 바람직하기로는 5-플루오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine), 5-플루오로데옥시시티딘(5-fluorodeoxycytidine), 5-플루오로시티딘(5-fluorocytidine), 5-아이오도데옥시우리딘(5-iododeoxyuridine), 5-아이오도우리딘(5-iodouridine), 5-아이오도데옥시시티딘(5-iododeoxycytidine), 5-아이오도시티딘(5-iododeoxycytidine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside/Ara-C), 2′,2′-다이플루오로데옥시시티딘(Gemcitabine), 카페시타빈(Capecitabine) 및 브로모비닐-데옥시우리딘(bromovinyl-deoxyuridine) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상일 수 있으며, 이와 유사한 구조를 가지는 변형핵산을 포함할 수 있다.
기존의 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드 함유 치료제의 경우 전신독성, 약제 내성 등의 부작용을 나타날 수 있으며 많은 암세포가 이러한 치료용 뉴클레오시드 항암제에 내성을 획득하여 다른 약제를 선택해야 하는 경우도 발생한다. 이러한 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드가 암세포에 좀 더 선택성을 가지는 G-쿼드로플렉스 올리고뉴클레오티드에 포함될 경우 생체 내에서 정상세포에 미치는 영향을 최소화할 수 있으며, 또한 약제내성을 가지는 암세포종에서도 복합적으로 사멸율을 증대시킬 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 변형체는 G-쿼드로플렉스 구조를 형성하고 있는 기존에 보고된 올리고뉴클레오티드와 같이, 원편광이색성(CD, circular dichroism) 분광 분석시 240 nm 근처에서 최소 피크를 가지며 260 ~ 270 nm 근처에서 최대 피크를 나타내다. 이러한 특징적인 결과는 본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형체가 G-쿼드로플렉스 구조를 형성하고 있음을 뒷받침하며, 여러 문헌(M. Lu, Q. Guo, N.R.Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455;P. Balagurumoorthy, S.K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry. 2002, 41, 3676)에 관련 내용이 보고되어 있다.
이러한 G-쿼드로플렉스(Quadruplex) 구조는 포타슘이온(K+) 등이 존재할 경우 더욱 안정한 형태를 이루어서 혈액 내에서와 같은 일반적인 생리조건에서도 상당히 오랫동안 안정한 구조를 가지게 된다. 따라서, 본 발명에서는 일정농도(30 ~ 70 mM)의 KCl 용액 등을 이용하여 치료 효과를 가지는 변형핵산이 포함된 G-쿼드로플렉스 올리고뉴클레오티드를 안정화시킨 후 사용된다.
본 발명에 따른 신규 올리고뉴클레오티드 변형체는 기존의 치료 효과를 가지는 뉴클레오시드 함유 치료제에 비해 월등히 향상된 암세포의 세포사멸 효과를 나타내었다.
따라서, 본 발명은 상기 올리고뉴클레오티드 변형체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 및 치료용 조성물을 포함한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어, 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 있다. 적합한 금속염으로서, 나트륨염, 칼륨염 등과 같은 알칼리 금속염; 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등과 같은 알칼리 토금속염; 알루미늄염 등이 있다. 유기 염기와의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 있다. 무기산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 있다. 유기산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 있다.
염기성 아미노산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 알기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 있다. 산성 아미노산과의 염의 적합한 예로서, 예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 있다. 특히, 바람직한 염으로는, 화합물이 그 내에 산성 관능기를 가지는 경우, 알칼리 금속염 (예컨대, 나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염 (예컨대, 칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등) 등과 같은 무기염, 및 암모늄염과 같은 유기 염이 있으며, 화합물이 그 내에 염기성 관능기를 가지는 경우, 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과 같은 무기산과의 염, 아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산 등과 같은 유기산과의 염이 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형체를 포함한 암 예방 및 치료용 조성물은 유효성분 외에 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 주사제의 경우에는 보존제, 등장화제, 무통화제, 가용화제, 완충제, 및 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 경구 투여 시에는 가용화제, 결합제, 부형제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 붕해제, 활택제 및 향료 등을 사용할 수 있고, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제 및 보존제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 제형은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 또한, 조성물의 제형은 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있으며 경구 투여 시에는 정제, 엘릭서, 캡슐, 서스펜션, 트로키, 웨이퍼 및 시럽 등의 형태로 제조할 수 있으며 현탁액, 정제, 환약, 캡슐 및 서방형 제제 등으로 제형화할 수 있다.
한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 미정질 셀룰로즈, 자일리톨, 에리스리톨, 메틸 셀룰오스, 폴리비닐피롤리돈, 전분, 아카시아, 알지네이트, 젤라틴, 락토즈, 덱스트로오스, 수크오스, 프로필히드록시벤, 조에이트, 셀룰로오스, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 마그네슘 스테아레이트 탈크, 솔비톨, 만니톨, 말티톨, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 또는 광물유 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 유효성분의 투여 경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 정맥내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 국소 투여, 비내 투여, 피내 투여 등이 될 수 있으며, 이것에만 제한되지는 않는다. 그러나 경구 투여 시, 올리고뉴클레오티드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 위나 장관에서의 분해 및 흡수가 용이하도록 제조되어야 하며, 바람직하게는 주사제 형태 및 비강 내로의 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 유효성분의 경우, 1 ∼ 1000 mg/kg 이고, 바람직하게는 3 ∼ 100 ㎎/㎏이며, 하루 1 ∼ 3회 투여 또는 일정 기간 동안 지속적(infusion) 투여할 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 신규한 올리고뉴클레오티드 변형체의 합성
DNA 합성은 일반적인 DNA 고정상 합성기를 이용하여 1μmole 스케일로 합성을 실시하였다. 합성에 사용되는 포스포라미다이트는 글렌리서치(Glen research) 사에서 구입한 데옥시구아노신, 티미딘, 데옥시시티딘, 5-플루오로-데옥시우리딘, 아라씨, 티엠피-5-플루오로-데옥시우리딘 포스포라미다이트를 건조한 아세토나이트릴을 이용하여 0.067M 농도로 녹여 폴리진(Polygene)사의 DNA 고정상합성기에 장착한다. 다음 표 1 에 제시된 서열에 따라 합성이 되며, 일반적으로 3′→ 5′ 방향으로 진행되는데, 첫 뉴클레오티드의 3' 수산기를 수지에 붙여 놓고, 한 염기가 첨가되는 동안 크게 4 단계의 화학반응 즉, 5′-말단의 탈트리틸반응(detritylation), 새로운 염기의 부가반응(coupling), 부가반응이 되지 않은 DNA 사슬의 캡핑(capping) 반응, 인산기의 산화반응(oxidation)을 반복하였다. 반응이 종결되면 보호기를 제거하고, 합성된 CPG 레진을 암모니아수에 넣고 55 ℃에서 5시간동안 방치 후 암마니아수를 건조하여 흰색 파우더를 얻었다. 워터스(Waters) 음이온 교환 HPLC 칼럼을 이용하여 HPLC 시스템에서 1M NaCl 용액을 5~70%로 증가하여 정제를 실시하였다. 메인피크를 수집하고 여기에 100% 에탄올을 넣어 올리고뉴클리오티드를 침전시켜 건조하였다. 결과적으로 HPLC를 이용한 측정 결과 순도 85% 이상의 올리고뉴클레오티드를 얻었으며, ESI-LC-MS (Q-TRAP 2000 ESI-MS)를 이용하여 분자량을 측정하여 합성 성공유무를 파악하였다.
다음 표 1의 서열 이외에 기존에 치료를 목적으로 보고된 올리고뉴클레오티드 서열 또는 G-쿼드러플렉스를 형성하면서 생리적 활성을 나타내는 다양한 서열에 대해 상기와 동일한 방법으로 올리고뉴클레오티드 변형체를 제조할 수 있다.
화합물번호 N G H 서열 LC/MS
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(서열번호 1) 		9220.77
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(서열번호 3) 		9523.16
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(서열번호 18)		 6326.08
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(서열번호 24)		 6343.1
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(서열번호 27)		 8284.3
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APT-2066 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTGGTNNTGGTGGTGGTGG
(서열번호 29)		 8289.3
APT-2067 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTGGTNGTGGTGGTGGTGG
(서열번호 43)		 8293.3
APT-2068 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTGGTTGNGGTGGTGGTGG
(서열번호 31)		 8293.3
APT-2069 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTGGTNGNGGTGGTGGTGG
(서열번호 44)		 8314.3
APT-2070 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG
(서열번호 45)		 8314.3
APT-2071 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGNGGTGGTTGTGGTGGNGGTGG
(서열번호 46)		 8314.3
APT-2072 2',2'-다이플루오로데옥시시티딘 2'-데옥시구아노신 티미딘 GGTGGTGGTTNTGGTGGTGGN
(서열번호 47)		 6668.3
APT-4001
(Positive control)		 　- 2'-데옥시구아노신 티미딘 TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG
(서열번호 48) 		9185.01
APT-4002
(Nagative control)		 　- - 티미딘, 2'-데옥시시티딘　 TTTCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTCC
(서열번호 49) 		8504.5
실시예 2: 신규한 올리고뉴클레오티드 변형체 제제의 제조
각각의 올리고뉴클레오티드를 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에 희석하여 최종 농도가 100 μM이 되도록 만들었다. 희석된 용액을 94 ℃에서 5분간 방치한 후 얼음에 튜브를 방치하였다. 2M KCl 용액을 첨가하여 최종 농도가 50mM 의 KCl 용액이 되도록 한 다음 3 시간 동안 60 ℃에서 방치한 후 상온까지 천천히 낮추었다. 각각의 올리고뉴클레오티드를 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) 용액에 희석하여 10 μM 농도가 되도록 만든 후 94 ℃에서 5분간 방치한 후 얼음에 튜브를 방치한 용액과 2M KCl 용액을 첨가하여 최종 농도가 50mM 의 KCl 용액이 되도록 한 다음 3 시간 동안 60 ℃에서 방치한 후 상온까지 천천히 낮춘 용액을 사용하였다.
실험예 1: 암세포에서의 세포사멸율 측정
실험 전날 96 웰 플레이트에 ㎖당 103 ~ 104개의 전립선 암세포인 PC-3 세포주가 현탁되어 있는 배양액 190 ㎕를 접종한 다음, 다음날 상기 실시예 1에서 제조한 올리고뉴클레오티드 용액 10 ㎕를 첨가한 후 6일 동안 배양하였다. 접종 6일 후에 일반적인 XTT 방법으로 세포사멸을 측정하였다[JBC 1999, 26369 참고].
APT-2001, APT-2002 및 APT-2003에 대한 세포사멸율 측정 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 양성 대조군인 APT-4001과 음성 대조군인 APT-4002 보다 본 발명의 신규 올리고뉴클레오티드 변형체인 APT-2001, APT-2002 및 APT-2003의 IC50 또는 IC90 가 3~10배 정도 탁월한 세포사멸 효과를 확인하였다[도 2].
또한, 양성대조군인 APT-4001에 비해 APT-2001, APT-2002 및 APT-2003이 훨씬 적은 양에서도 세포사멸 효과를 확인할 수 있었다[도 3].
그리고, 본 발명에 따라 합성한 많은 신규 올리고뉴클레오타이드에서도 우수한 세포사멸 효과를 확인할 수 있었고, PC3, MCF7, HCT116, A549, A498, K562, MV-4-11 등의 다양한 암세포주에 대해서 탁월한 세포사멸 효과를 확인함으로써 광범위한 항암활성을 가짐을 확인하였다. 특히, 약물저항성 세포주인 MCF7-DX 에 대해서도 우수한 항암활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 상기 세포사멸 효과를 확인한 결과를 하기 표 2 내지 7에 나타내었다. 또한 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 K562, MV-4-11 AML(급성백혈병) 세포에 대한 세포사멸효과를 확인하여 도 4 및 5에 각각 나타내었다.
PC3 전립선암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 0.7
APT-2002 2.6
APT-2003 1.5
APT-2013 0.09
APT-2020 0.16
APT-2022 0.11
APT-2023 0.26
APT-2031 >10
APT-2032 >10
APT-2033 >10
APT-2034 >10
APT-2035 0.035
APT-2036 9.9
APT-2054 <0.3
APT-2059 0.015
APT-2060 0.04
APT-2061 0.041
APT-2063 0.022
APT-2064 0.016
APT-2066 0.034
APT-2070 0.024
APT-2072 0.012
APT-4001 4.3~7.4
APT-4002 >50
MCF7-DX 유방암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 0.2
APT-2002 0.6
APT-2013 0.66
APT-2020 0.89
APT-2022 0.79
APT-2023 1.86
APT-2031 1.5
APT-2032 3.6
APT-2033 3.3
APT-2034 1.2
APT-2035 0.007
APT-2036 0.2
APT-2040 >1.0
APT-2042 0.5
APT-2043 0.6
APT-2044 >1.0
APT-2054 <0.3
APT-2059 0.004
APT-2060 0.023
APT-2061 0.022
APT-2063 0.008
APT-2064 0.008
APT-2066 0.01
APT-2067 0.024
APT-2068 0.023
APT-2069 0.01
APT-2070 0.013
APT-2071 0.015
APT-4001 >30
APT-4002 >50
MCF7 유방암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 2.1
APT-2002 8.9
APT-4001 7.3
APT-4002 NA
HCT116 대장암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 0.4
APT-2002 2.1
APT-4001 >30
APT-4002 >50
A549 비소세포암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 0.9
APT-2002 5.2
APT-4001 3.7
APT-4002 >50
A498 신장암세포
서열 번호 IC50 (μM)
APT-2001 <0.1
APT-2002 <0.1
APT-4001 1.9
APT-4002 >50
실험예 2: G-쿼드로플렉스 형성 확인 실험
상기 실시예 1에서 제조한 올리고뉴클레오티드의 G-쿼드로플렉스 구조 형성을 측정하기 위하여 CD(Circular dichroism) 분석 기술을 사용하였다.
상기 실시예 1에서 제조한 올리고뉴클레오티드 용액을 1 uM이 되도록 포타슘 포스페이트 버퍼에 희석하여 냉동 보관하였다. 각 올리고뉴클레오티드를 100 uM이 되도록 10mM 포타슘 포스페이트 버퍼에 희석하여 2ml의 용액을 만든 후 원편광이색성(CD, circular dichroism) 분석에 이용하였다. CD 스펙트라는 JARSCO J-810 spectropolarimeter를 이용하였고, 20 ℃에서 100nm/min scan speed, 0.5s response time, 2nm band width, 1cm path length 로 320 nm 내지 220nm 파장까지 살펴보았다.
그 결과, 264 nm 에서 최대 피크를 보여주었고 G-쿼드로플렉스를 형성하는 것으로 알려진 대조물질(APT-4001)과 동일한 CD 스펙트럼을 보임을 확인하였다. 즉, 이러한 결과는 G-쿼드로플렉스를 형성하는 것임이 문헌(M. Lu, Q. Guo, N.R.Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455;P. Balagurumoorthy, S.K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061 ; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry. 2002, 41, 3676)에 보고되어 있는 바, 본 발명의 올리고뉴클레오티드 변형체는 G-쿼드로플렉스를 형성함을 확인할 수 있었다 [도 6 ~ 8].
실험예 3: 독성시험
본 발명의 유효성분에 대하여 독성실험을 다음과 같이 수행하였다.
APT-2001, APT-2002 및 APT-2003 각각을 디메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide, DMSO)에 용해하고 물로 희석한 후 이를 마우스(군당 10마리)에 각각 1 g/㎏을 투여한 다음 7일간 관찰하였으나 사망하는 쥐는 없었다.
제조예 1: 주사액제의 제조
APT-2001 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.
APT-2001 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.
상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.
유효성분 1 g
염화나트륨 0.6 g
아스코르빈산 0.1 g
증류수 적량
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Claims (10)

  1. 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물을 포함하여 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
    [화학식 1]
    Figure 112010034987118-pat00008


    [화학식 2]
    Figure 112010034987118-pat00009

    상기 화학식 1 또는 화학식 2에서, R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R3은 수소, 할로겐, C1 -10의 알킬기, C1-10의 할로알킬기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 할로알케닐기이며, 단, R1, R2는 동시에 하이드록시가 아니다.
  2. 제 1 항에 있어서, 5-플루오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine), 5-플루오로데옥시시티딘(5-fluorodeoxycytidine), 5-플루오로시티딘(5-fluorocytidine), 5-아이오도데옥시우리딘(5-iododeoxyuridine), 5-아이오도우리딘(5-iodouridine), 5-아이오도데옥시시티딘(5-iododeoxycytidine), 5-아이오도시티딘(5-iododeoxycytidine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside/Ara-C), 2′,2′-다이플루오로데옥시시티딘(2′,2′-Difluorodeoycytidine/Gemcitabine), 카페시타빈(Capecitabine) 및 브로모비닐-데옥시우리딘(bromovinyl-deoxyuridine) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  3. 'GxHyNz'서열[여기서, G는 구아노신 또는 구아노신 유도체, H는 구아노신이 아닌 핵산, N은 우리딘 또는 시티딘 유래의 치료적 효능을 가지는 변형핵산이고, G, H, N은 순열에 의해서 무작위로 배열되며, x는 1 내지 30의 정수, y는 0 내지 30의 정수, z는 1 내지 30의 정수이고, 단, x,y,z를 합한 전체의 값은 60을 넘지 않는다.]로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 구아노신 또는 구아노신 유도체는 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 변형핵산(N)은 하기 화학식 4 또는 화학식 5로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체;
    [화학식 4]
    Figure 112010057507425-pat00010

    [화학식 5]
    Figure 112010057507425-pat00011

    상기 화학식 4 또는 화학식 5에서, R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고, R3은 수소, 할로겐, C1-10의 알킬기, C1-10의 할로알킬기, C2-10의 알케닐기, C2-10의 할로알케닐기이고, 단, R1, R2는 동시에 하이드록시가 아니며, X는 수소 또는 상기 G, H, N 중에서 선택된 핵산에 포함되는 포스페이트 잔기의 인 원자이고, Y는 수소 또는 상기 G, H, N 중에서 선택된 핵산에 포함되는 포스페이트 잔기의 인 원자이다.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 변형핵산(N)은 5-플루오로데옥시우리딘(5-fluorodeoxyuridine), 5-플루오로우리딘(5-fluorouridine), 5-플루오로데옥시시티딘(5-fluorodeoxycytidine), 5-플루오로시티딘(5-fluorocytidine), 5-아이오도데옥시우리딘(5-iododeoxyuridine), 5-아이오도우리딘(5-iodouridine), 5-아이오도데옥시시티딘(5-iododeoxycytidine), 5-아이오도시티딘(5-iododeoxycytidine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine arabinoside/Ara-C), 2′,2′-다이플루오로데옥시시티딘(2',2'-Difluorodeoycytidine/Gemcitabine), 카페시타빈(Capecitabine) 및 브로모비닐-데옥시우리딘(bromovinyl-deoxyuridine) 중에서 선택된 1종 또는 2종 이상인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  7. 제 3 항에 있어서, x+y+z 값이 14 ~ 26인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  8. 제 3 항에 있어서, 서열번호 1 내지 47 로 표시되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  9. 제 3 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 변형체는 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 변형체.
  10. 제 3 항 내지 제 8 항 중에서 선택된 어느 한 항의 올리고뉴클레오티드 변형체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 암 예방 및 치료용 조성물.
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