JP5841938B2

JP5841938B2 - 治療効能のある変形核酸及びグアノシンを含有するオリゴヌクレオチド変形体

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Publication number: JP5841938B2
Application number: JP2012518491A
Authority: JP
Inventors: スージンリー; スンフワンムーン
Original assignee: アプタバイオセラピュティックスインコーポレイテッド
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2016-01-13
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Description

本発明は、治療効能のある変形核酸及びグアノシンを含有するオリゴヌクレオチド変形体、及び前記変形体又はその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含有する癌予防及び治療用組成物に関する。

近来の医学的発展にもかかわらず、癌は全世界にわたって最も重要な死亡原因であり、老齢化するにつれて癌患者も毎年幾何級数的に増加しつつある。
通常、抗癌剤として用いている物質は相当な毒性を持っており、癌細胞のみ選択的に除去できないため、癌が発生した後、その治療だけでなく、癌の発生を予防するための毒性が少なく、効果的な抗癌剤の開発が切実に求められている。

１９８０年代以後、自動化したＤＮＡ合成機が開発され、細胞内ｍＲＮＡをターゲットにするアンチセンス、ｓｉＲＮＡと、リボザイム及びタンパク質をターゲットにするアプタマー、ＣｐＧ、デコイ核酸などのオリゴデオキシヌクレオチドを治療剤として開発するための研究が盛んであった［Gleave et al., Nat Rev Cancer. 2005 468-479; Castanotto et al., Nature 2008 426-433; Sullenger et al., Nature 2002 252-258; Kaur et al., Expert Opin Investig Drugs. 2008 43-60; Jurk M et al., BioDrugs. 2007 387-401; Tomita et al., Clin Exp Nephrol. 2007 7-17］。

グアノシンに富んだオリゴヌクレオチドは、広範囲な癌細胞に対して細胞成長阻害効果を有すると知られており、癌細胞に処理する場合、細胞内の特定のタンパク質、例えばｅＥＦ１Ａ、ＪＮＫ、Ｋｉ−ｒａｓ、ヌクレオリン（Ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）、ｓｔａｔ３、テロメラーゼ（ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ）、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ）タンパク質などの細胞の成長と死滅に重要なタンパク質と結合して細胞周期を調節する役割をし、このようなタンパク質は、正常細胞よりも癌細胞に過剰発現すると知られている［Christopher R. Ireson et al., Molecular cancer therapy 2006 2957-2962; Naijie Jing et al., Cancer Research 2004 6603-6609; Christophe Marchand et al., The journal of Biological Chemistry 2002 8906-8911］。

このようなグアノシンに富んだオリゴヌクレオチドは、シトシンとの三重の水素結合以外にも特別な構造的な特徴を持っている。グアノシンに富んだオリゴヌクレオチドは、分子内結合又は分子間結合により４本の構造を有することになる。一般的なアデノシンとチアミン、グアノシンとシチジンの水素結合による二重螺旋構造を形成する代わりに、４つのグアノシンが１平面に位置してフーグステン（ｈｏｏｇｓｔｅｎ）型の水素結合を形成してグアニン四重鎖（Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）を形成し、これが２つ以上連続して構成されて四重螺旋構造（ｔｅｔｒａｄｈｅｌｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を有する。通常、オリゴヌクレオチドは、血液内の安定性及び細胞透過率が非常に低いため、薬品として開発し難かったが、このようなグアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、その構造的な特徴により安定した構造が得られ、比較的高い血液安定性及び細胞透過度を有すると知られている［Julian Leon Huppert, Chemical Society Reviews 2008, 37, 1375-1384; Paula J. Bates et al., Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164; Christopher R. Ireson et al., Molecular cancer therapy 2006 2957-2962］。

米国特許第７３１２０８２号に記載したように、グアニン四重鎖（Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）の安定性は、１価の陽イオン、インターキレート剤、オリゴヌクレオチドの濃度などから影響を受ける［Haiyan Qi et al., Cancer Res 2006 11808-11816, Anna Arola et al., Current Topics in Medicinal Chemistry 2008 1405-1415］。
このようなグアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、米国特許第７３１４９２６、米国特許公開第２００７−１０５８０５号に記載したように、癌細胞の表面にたくさん発現している特定のタンパク質と結合した後、エンドサイトーシスにより癌細胞に浸透し、細胞死滅に関連したタンパク質と結合して細胞成長を阻害すると知られており、細胞毒性効果（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔ）よりも細胞成長静止効果（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃｅｆｆｅｃｔ）により細胞死滅を誘導すると報告されている［Paula J. Bates et al., The journal of Biological Chemistry 1999 26369-26377; Bruna et al., FEBS journal 2006 1350-1361］。

また、グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、癌細胞の成長を阻害する効果以外にも米国特許第５５６７６０４号では抗ウイルス、米国特許第６９９４９５９号では免疫調節作用、米国特許公開第２００７−１０５８０５号ではハンチントン病に治療効果があると発表され、生体内で様々な機能及び調節作用をすることが分かった［ Cheryl A. Stoddart et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998 2113-2115; Michael Skogen et al., BMC Neuroscience, 2006 7:65］。
このようにグアニン四重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドが多様な疾患に対して効果的であるため、研究者らがこれに対する研究を行い、現在、抗癌剤として臨床試験中である［Paula J. Bates et al., Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164］。
臨床薬品のＡＳ−１４１１は、グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドとして癌細胞に過剰発現しているヌクレオリン（ｎｕｃｌｅｏｌｉｎ）と結合することにより、優れた細胞成長阻害効果があると報告された。また、生体内で正常細胞に及ぼす影響を最小化し、薬剤耐性を有する癌細胞腫に対しても複合的に死滅率を増大させると判断されるため、新しい抗癌剤として期待されている［Christopher R. Ireson et al., Mol Cancer Ther. 2006 Dec;5(12) :2957-62］。

しかし、グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、主に細胞成長阻害効果による細胞死滅を誘導しなければならず、細胞死滅率が比較的高くないため、４日から７日ほどリンゲル注射による一定時間以上の持続的な処理が必要である。従って、必要以上の薬品を長時間投与するという問題があり、強い毒性の化学療法剤と併用して投与するという問題がある［Paula J. Bates et al., Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164; Christopher R. Ireson et al., Molecular cancer therapy 2006 2957-2962］。

そのため、本発明者らはグアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドに細胞死滅効果を与える治療用変形核酸を導入して細胞死滅効果を増大しようとした。
代表的な治療用変形核酸は５−フルオロウラシル（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ、５−ＦＵ）が挙げられる。５−ＦＵは、１９５０年代末に代謝拮抗物質系の抗癌剤として開発され、チミジル酸生成酵素（ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ）を遮断して抗癌効果を現した［Piedo et al., J Clin Oncol 1988, 1953-1664］。また、５−フルオロデオキシウリジン（５−ｆｌｕｒｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ、５−ＦｄＵ）、５−フルオロデオキシシチジン（５−ｆｌｕｒｏｒｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ、５−ＦｄＣ）、５−フルオロウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）のような５−フルオロピリミジン（５−ｆｌｕｏｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）系のヌクレオシド（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）形態のプロドラッグ（ｐｒｏｄｒｕｇ）が広範囲に大腸、乳房、頭頸部などに対して癌治療を目的として４０年以上使用され、現在臨床で用いられている［Thomas et al., Clin Exp Pharmacol Physiol. 1998 887-895; Heidelberger et al., Nature 1957 179:663-666; Longley et al., Nat Rev Cancer 2003 330-338; Beumer et al., Cancer Chemother Pharmacol 2008 363-368; Song et al., Clinical cancer research. 1997, 901-909］。
このような５−フルオロデオキシウリジン（５−ｆｌｕｒｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−フルオロデオキシシチジン（５−ｆｌｕｒｏｒｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−フルオロウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）ヌクレオシドがオリゴヌクレオチドに含まれるようにするホスホラミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）製剤が合成され、固相ＤＮＡ合成機で治療的ヌクレオシドが含まれたオリゴヌクレオチドの合成が可能になった［Gmeiner et al., J. Org. Chem. 1994, 5779-5783; Schmidit et al., Nucleic Acids Research, 1992, 2421-2426; Stolarski et al., Biochemistry 1992, 31, 7027-7042］。

このような治療的ヌクレオシドが含まれたオリゴヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼ（ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などにより分解されて５−ＦｄＵや５−ＦｄＣが遊離し、様々な酵素が関与して５−ＦｄＵＭＰのような最終活性型が生成されて細胞死滅を誘導し、同じ濃度の５−ＦｄＵよりも細胞毒性が強く、かつ薬剤耐性を有する癌腫に対しても効能があることが分かった［Gmeiner et al., Nucl. Nuct. 1995 243-253］。米国特許第５４５７１８７号では５−フルオロウラシルが含まれたホモポリ−ＦｄＵオリゴヌクレオチド、米国特許第５６１４５０５号ではＦｄＵで構成されたオリゴヌクレオチドが細胞毒性を有すると報告されたことがある。しかし、このような５−フルオロウラシルが含まれたホモポリ−ＦｄＵオリゴヌクレオチドは、グアニン四重鎖を形成せず、血液安定性及び細胞透過性が顕著に劣るなど、全体的な構造及び薬効の作用面において薬品として開発し難い。

本発明者らは、細胞成長静止効果（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃｅｆｆｅｃｔ）を有するグアノシンに富み、グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドに、細胞毒性効果（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔ）により細胞死滅を誘導する１つ以上の治療用変形核酸を導入することにより、血液安定性及び細胞透過性を増大させると共に、効果的に癌細胞の成長を抑制して死滅させることを目的とし、このような構造の新規なオリゴヌクレオチドを合成して細胞毒性を比較してみた結果、臨床薬品よりも癌細胞の死滅効果が画期的に増大したことを確認し、本発明を完成した。
従って、本発明は、１つ以上の治療効能のある変形核酸と豊富なグアノシンが含まれた新規なオリゴヌクレオチド変形体を提供することにその目的がある。
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド変形体又はその薬学的に許容可能な塩を有効性分として含有する癌予防及び治療用組成物を提供することに他の目的がある。

下記式（１）又は式（２）で表される化合物を含んでグアニン四重鎖（Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）構造を形成することを特徴とするオリゴヌクレオチド変形体に関する。

（式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン又はヒドロキシ基であり、Ｒ₂は水素、ハロゲン又はヒドロキシ基であり、Ｒ₃は水素、ハロゲン、Ｃ_1-10のアルキル基、Ｃ_1-10のハロアルキル基、Ｃ_2-10のアルケニル基、Ｃ_2-10のハロアルケニル基であり、ただし、Ｒ₁、Ｒ₂は同時にヒドロキシとなることはない。）

また、本発明は、「ＧｘＨｙＮｚ」配列で表されるオリゴヌクレオチド変形体をその特徴とする。（配列において、Ｇはグアノシン又はグアノシン誘導体、Ｈはグアノシンでない核酸、Ｎはウリジン又はシチジン由来の治療的効能を有する変形核酸であり、Ｇ、Ｈ、Ｎは順列により無作為に配列され、ｘは１〜３０の整数、ｙは０〜３０の整数、ｚは１〜３０の整数であり、ただし、ｘ、ｙ、ｚの和は６０を超えない。）
また、本発明は、前記オリゴヌクレオチド変形体又はその薬学的に許容可能な塩を有効性分として含有する癌予防及び治療用組成物を他の特徴とする。

本発明による１つ以上の治療効能のある変形核酸及びグアノシンが含まれてグアニン四重鎖を形成する新規なオリゴヌクレオチド変形体は新規構造の化合物であって、優れた細胞死滅活性を有するため、癌予防及び治療剤として活用可能である。

代表的なグアノシン又はグアノシン誘導体を示す図である。オリゴヌクレオチドの細胞成長阻害の程度を示す図である。オリゴヌクレオチドのＩＣ₅₀数値及び細胞の形態を撮影した写真である。オリゴヌクレオチドのＫ５６２ＡＭＬ（急性白血病）細胞に対する細胞死滅効果（１μＭにおける細胞成長％）を比較したグラフである。オリゴヌクレオチドのＭＶ−４−１１ＡＭＬ（急性白血病）細胞に対する細胞死滅効果（２μＭμＭにおける細胞成長％）を比較したグラフである。陽性対照群のＡＰＴ−４００１オリゴヌクレオチドのグアニン四重鎖構造を確認するために円偏光二色性（ＣＤ、ｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分光分析した結果を示すグラフである。実施例１により製造されたＡＰＴ−２０５４オリゴヌクレオチドのグアニン四重鎖構造を確認するために円偏光二色性分光分析した結果を示すグラフである。

このような本発明を詳細に説明する。
本発明は、グアノシンに富み、グアニン四重鎖（Ｇ−ｑｕａｒｄｒｕｐｌｅｘ）を形成するオリゴヌクレオチドが細胞毒性を有する変形核酸を含むように製造したオリゴヌクレオチドに関する。
本発明に用いられるグアニン四重鎖（Ｇ−ｑｕａｒｄｒｕｐｌｅｘ）は、グアノシン（Ｇ）として代表的に言及される２’−デオキシグアノシン（２−ｄｅｏｘｙ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’−フルオロ−グアノシン（２’−Ｆ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）−グアノシン、Ｄ−デオキシグアノシン、及びＤ−グアノシンから選択された１種又は２種以上（図１参照）などに富み、特定配列の場合、４つのグアノシンが１平面に位置してフーグステン（ｈｏｏｇｓｔｅｎ）型の水素結合を形成して四重螺旋構造を有するオリゴヌクレオチドをいい、これに治療的効果を有する変形核酸を導入するように合成される。
グアノシンに富み、グアニン四重鎖（Ｇ−ｑｕａｒｄｒｕｐｌｅｘ）構造を形成するオリゴヌクレオチドは、癌細胞に選択的に結合し、細胞内で様々な機序により癌細胞の成長を阻害すると知らされている。

このようなグアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドに変形核酸を１つ以上含んで癌細胞内に伝達した後、グアニン四重鎖が有する細胞成長阻害効果以外に、ヌクレアーゼ（Ｎｕｃｌｅａｓｅ）により分解される場合、治療効果を有する変形核酸が直接的に細胞成長を阻害して複合的に癌細胞が死滅するようになる。グアニン四重鎖を形成するオリゴヌクレオチドは、単独使用する場合は細胞成長阻害効果しかないため、細胞死滅率が比較的高くなく、かつ一定時間以上の持続的な処理が必要である。しかし、本発明では治療効果を有する変形核酸が含まれることにより、細胞死滅効果が直接的に増大して細胞死滅率が急激に増加する可能性があることを確認した。

治療効能を有する変形核酸としては、糖（Ｓｕｇａｒ）や塩基（Ｂａｓｅ）を変形させたアデノシン、グアノシン、チミジン、シチジン、ウリジンなどが挙げられる。
具体的に、本発明に用いられるウリジン又はシチジン由来の治療用変形核酸（Ｎ）は、次の式（１）のウリジン又は式（２）のシチジンのようなピリミジン系のヌクレオチドが好ましく、前記ヌクレオチドを通常の方法［Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach 1991 Fritz Eckstein et al., IRL Press: Oxford］によりホスホラミダイト形態に製造してもよく、ヌクレオチドホスホラミダイトを、グレンリサーチ（ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ）社、ベリー・アンド・アソシエイツ（ＢｅｒｒｙａｎｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）社、オキノス（ＯｋｅａｎｏｓＴｅｃｈ）社、ケムジーンズ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）社、プロリゴ（Ｐｒｏｌｉｇｏ）社などから購入して既知の方法によりＤＮＡ合成機を用いた固相合成法によりグアノシンに富んだオリゴヌクレオチドに含まれるように生産してもよい。

さらに好ましくは、前記ウリジン又はシチジン由来の変形核酸（Ｎ）として、５−フルオロデオキシウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−フルオロウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−フルオロデオキシシチジン（５−ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−フルオロシチジン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−ヨードデオキシウリジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ヨードウリジン（５−ｉｏｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ヨードデオキシシチジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−ヨードシチジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ／Ａｒａ−Ｃ）、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、及びブロモビニル−デオキシウリジン（ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌ−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）などが挙げられ、前記変形核酸がホスホラミダイト形態に製造されたものをもって固相合成機により通常の方法でオリゴヌクレオチド変形体を製造することができる。

すなわち、前記変形核酸ホスホラミダイトを無水アセトニトリルに溶かしてＤＮＡ合成機に投入して合成し、グレンリサーチ（ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ）社から提供された指針書及び米国特許第５４５７１８７号と第５６１４５０５号を参考にして通常の合成及び精製方法を用いてオリゴヌクレオチド変形体を合成する。具体的な一例として、合成されたオリゴヌクレオチド変形体の構造は次の式（３）の通りである。

また、上記のように変形核酸を用いて合成可能なオリゴヌクレオチド変形体の代表的な配列は、既に治療を目的に報告されたオリゴヌクレオチド配列［Paula J. Bates et al., The journal of Biological Chemistry 1999 26369-6377, Cheryl A Stoddart et al., Antimicrobial agents and chemotherapy 1998 2113-2115, Virna Dapic et al., Biochemistry 2002 3676-3685, Naijie Jing et al., Biochemistry 2002, 41, 5397-5403, Naijie Jing et al., Cancer research 2004 6603-6609, Haiyan Qi et al., Cancer research 2006 11808-11816, Yun Teng et al., Cancer Research 2007 10491-10500, Bruna Scaggiante et al., FEBS Journal 2006 1350-1361, Julie E. Reed et al., Journal of the American Chemical Society 2006 5992-5993, Jeffrey S. Bishop et al., The Journal of Biological Chemistry 1999 5698-5703, Christophe Marchand et al., The Journal of Biological Chemistry 2002 8906-8911, Jun-ichiro Suzuki et al., Journal of virology 2002 3015-3022, Virna Dapic et al., Nucleic Acids Research, 2003 2097-2107、Amber Goodchild et al., Nucleic acid research 2007 4562-4572、米国特許第６３２３１８５、米国特許第７３１４９２６、米国特許第６９９４９５９、米国特許第７１５７４３６、米国特許第７１９９２２８］又はグアニン四重鎖を形成して生理的活性を有する多様な配列に対して、少なくとも１つ以上の治療的効能のある変形核酸に置換して導入することで完成される。例えば、細胞成長阻害活性を有するＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ又はＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧで表される配列は、少なくとも１つ以上の治療的効能がある変形核酸、例えば５−ＦｄＵ（以下、「Ｆ」）又は２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、以下、「Ｚ」）を置換して導入することにより、様々な新規なオリゴヌクレオチド変形体を完成することができる。具体的には、ＦＦＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＦＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧ、ＦＦＦＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＦＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧ、ＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＦＦＦＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧ、ＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧＴＴＧＴＧＧＦＧＧＦＧＧＦＧＧ、ＧＧＦＧＧＦＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＦＧＧＦＧＧ、ＧＧＦＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＦＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＦＦＦＦＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＦＦＧＦＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＺＧＧＺＧＧＺＧＧＺＺＧＺＧＧＺＧＧＺＧＧＺＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＺＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＺＺＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＺＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＺＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＺＧＺＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ、ＧＧＺＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＺＧＧ、ＧＧＴＧＧＺＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＺＧＧＴＧＧなどであり、適切な位置に変形核酸を置換して導入することにより、様々な新規なオリゴヌクレオチドとして完成でき、これらは優れた細胞死滅効果を奏すると確認された。従って、既に治療を目的に報告されたオリゴヌクレオチドの配列又はグアニン四重鎖を形成して生理活性を有するオリゴヌクレオチドの配列に本発明の変形核酸を置換して導入することにより、新規なヌクレオチド変形体を完成することができる。新規なヌクレオチドの配列及び変形核酸の置換位置は、グアニン四重鎖を形成する標的タンパク質に対する結合力又は特異性などに影響を与えることがある。従って、新規なヌクレオチドの配列及び変形核酸の置換位置は、グアニン四重鎖を形成する標的タンパク質に対する結合力又は特異性などに応じて決定され、本発明により完成されたヌクレオチド変形体の有用性は標的タンパク質に対する結合力又は特異性などの決定要因による生理的活性効果に応じて決定される。

上記のような方法を用いて適用可能な新規なオリゴヌクレオチド変形体の配列は次の通りである。
本発明は、「ＧｘＨｙＮｚ」配列で表されるオリゴヌクレオチド変形体をその特徴とする。（配列において、Ｇはグアノシン又はグアノシン誘導体、Ｈはグアノシンでない核酸、Ｎはウリジン又はシチジン由来の治療的効能を有する変形核酸であり、Ｇ、Ｈ、Ｎは順列により無作為に配列され、ｘは１〜３０の整数、ｙは０〜３０の整数、ｚは１〜３０の整数であり、ただし、ｘ、ｙ、ｚの和は６０を超えない。）

前記治療的効能を有する変形核酸（Ｎ）は、下記式（４）又は式（５）で表される化合物であって、オリゴヌクレオチド変形体内に存在する。

（式中、Ｒ₁は水素、ハロゲン又はヒドロキシ基であり、Ｒ₂は水素、ハロゲン又はヒドロキシ基であり、Ｒ₃は水素、ハロゲン、Ｃ_1-10のアルキル基、Ｃ_1-10のハロアルキル基、Ｃ_2-10のアルケニル基、Ｃ_2-10のハロアルケニル基であり、ただし、Ｒ₁、Ｒ₂は同時にヒドロキシとなることはなく、Ｘ及びＹはそれぞれ水素又は隣接核酸のリン酸残基のリン原子である。）

前記Ｈは、アデノシン、シチジン、ウリジン又はチミジンがさらに好ましく、前記ｘ、ｙ、ｚの和は５〜６０、さらに好ましくは１４〜２６の範囲にあることが良い。
前記Ｇはグアノシンであり、好ましくは２’−デオキシグアノシン（２−ｄｅｏｘｙ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、グアノシン（ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’−Ｏ−メチル−グアノシン（２’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、２’−フルオロ−グアノシン（２’−Ｆ−ｇｕａｎｏｓｉｎｅ）、ＬＮＡ（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ）−グアノシン、Ｄ−デオキシグアノシン、Ｄ−グアノシンから選択された１種又は２種以上であり、Ｎはシチジン又はウリジン由来の変形核酸であって、好ましくは５−フルオロデオキシウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−フルオロウリジン（５−ｆｌｕｏｒｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−フルオロデオキシシチジン（５−ｆｌｕｏｒｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−フルオロシチジン（５−ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−ヨードデオキシウリジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ヨードウリジン（５−ｉｏｄｏｕｒｉｄｉｎｅ）、５−ヨードデオキシシチジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、５−ヨードシチジン（５−ｉｏｄｏｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ）、シトシンアラビノシド（Ｃｙｔｏｓｉｎｅａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ／Ａｒａ−Ｃ）、２’，２’−ジフルオロデオキシシチジン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、カペシタビン（Ｃａｐｅｃｉｔａｂｉｎｅ）、及びブロモビニル−デオキシウリジン（ｂｒｏｍｏｖｉｎｙｌ−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ）から選択された１種又は２種以上であり、これと類似の構造を有する変形核酸を含んでもよい。

従来の治療効果を有するヌクレオシド含有治療剤は、全身毒性、薬剤耐性などの副作用があり、多くの癌細胞がこのような治療用ヌクレオシド抗癌剤に耐性を有する場合が多いため、他の薬剤を選択しなければならない場合も発生する。このような治療効果を有するヌクレオシドが癌細胞に選択性を有するグアニン四重鎖オリゴヌクレオチドに含まれる場合、生体内で正常細胞に及ぼす影響を最小化することができ、また、薬剤耐性を有する癌細胞腫に対しても複合的に死滅率を増大させることができる。

前記オリゴヌクレオチド変形体は、グアニン四重鎖構造を形成する既に報告されたオリゴヌクレオチドのように、円偏光二色性（ＣＤ、ｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分光分析時、２４０ｎｍ近くで最小ピークを持ち、２６０〜２７０ｎｍ近くで最大ピークを持つ。このような特徴的な結果は、本発明のオリゴヌクレオチド変形体がグアニン四重鎖構造を形成することを裏づけ、様々な文献（M. Lu、 Q. Guo, N. R. Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455; P. Balagurumoorthy, S. K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry. 2002, 41, 3676）に関連内容が報告されている。

このようなグアニン四重鎖（Ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ）構造はカリウムイオン（Ｋ＋）などが存在する場合、さらに安定した形態を形成して血液内のような一般的な生理条件でも非常に長期間にわたって安定した構造を有する。従って、本発明では一定濃度（３０〜７０ｍＭ）のＫＣｌ溶液などを用いて治療効果を有する変形核酸が含まれたグアニン四重鎖オリゴヌクレオチドを安定化させて使用する。
本発明による新規なオリゴヌクレオチド変形体は、既存の治療効果を有するヌクレオシド含有治療剤に比べて、著しく向上した癌細胞の細胞死滅効果を有する。

従って、本発明は、前記オリゴヌクレオチド変形体又はその薬剤学的に許容可能な塩を有効性分として含む癌予防及び治療用組成物を含む。前記薬学的に許容可能な塩は、例えば、金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性又は酸性アミノ酸との塩などがある。好ましい金属塩として、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩と、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩などのアルカリ土類金属塩と、アルミニウム塩などがある。好ましい有機塩基との塩として、例えば、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、２，６−ルチジン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、シクロヘキシルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンなどとの塩がある。好ましい無機酸との塩として、例えば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などとの塩がある。
好ましい有機酸との塩として、例えば、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などとの塩がある。

好ましい塩基性アミノ酸との塩として、例えば、アルギニン、リシン、オルニチンなどとの塩がある。好ましい酸性アミノ酸との塩として、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸などとの塩がある。特に好ましい塩としては、化合物が酸性官能基を有する場合であれば、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩など）、アルカリ土類金属塩（例えば、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩など）などのような無機塩、及びアンモニウム塩のような有機塩があり、化合物が塩基性官能基を有する場合であれば、塩酸、臭化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸などのような無機酸との塩、酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸などのような有機酸との塩がある。

本発明のオリゴヌクレオチド変形体を含む癌予防及び治療用組成物は、有効性分以外に薬剤学的に許容可能な担体を含むことができる。前記薬剤学的に許容される担体は、注射剤の場合には保存剤、等張化剤、無痛化剤、乳化剤、緩衝剤、及び安定化剤などを混合して用いられ、経口投与時には乳化剤、結合剤、賦形剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素崩壊剤、滑沢剤、及び香料などが用いられ、局所投与時には基剤、賦形剤、潤滑剤、及び保存剤などが用いられる。
本発明の組成物の剤形は、薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造される。また、組成物の剤形は注射剤の場合は単位投薬アンプル又は多数回投薬形態に製造し、経口投与時には錠剤、エリキシル剤、カプセル、懸濁液、トローチ、ウエハー、及びシロップなどの形態に製造し、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、及び徐放性製剤などに剤形化することができる。

一方、製剤化に適する担体、賦形剤、及び希釈剤としては、微晶質セルロース、キシリトール、エリスリトール、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、ラクトース、デキストロース、スクロース、ヒドロキシ安息香酸プロピル、セルロース、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ステアリン酸マグネシウム、ソルビトール、マンニトール、マルチトール、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、又は鉱物油などが用いられる。

本発明で「投与」とは、適切な方法で患者に対して所定の物質を導入することを意味し、前記有効性分の投与経路は薬品が目的組織に到達する限り、如何なる一般的な経路により投与してもよい。静脈内投与、皮下投与、経口投与、筋肉内投与、腹腔内投与、肺内投与、及び直腸内投与、局所投与、鼻内投与、皮内投与などが挙げられるが、これに制限されることはない。しかし、経口投与する時、オリゴヌクレオチドは消化されるため、経口用組成物は胃や腸での分解及び吸収が容易なものとして製造し、好ましくは注射剤の形態及び鼻腔内への投与が挙げられる。

本発明による有効性分の製剤内の含有量は、体内の活性成分の吸収度、不活化率、排泄速度、使用者の年齢、性別及び状態などに応じて適切に選択することができる。本発明の有効性分は、１〜１０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは３〜１００ｍｇ／ｋｇであり、１日１〜３回投与又は一定期間の間、点滴（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）投与することができる。
以下、本発明は、次の実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明がこれに限定されることはない。

実施例１：新規なオリゴヌクレオチド変形体の合成
ＤＮＡ合成は、一般的なＤＮＡ固相合成機を用いて１μｍｏｌｅスケールの合成を実施した。合成に用いられるホスホラミダイトは、グレンリサーチ（Ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ）社のデオキシグアノシン、チミジン、デオキシシチジン、５−フルオロ−デオキシウリジン、Ａｒａ−Ｃ、ＴＭＰ−５−フルオロ−デオキシウリジンホスホラミダイトを乾燥したアセトニトリルを用いて０．０６７Ｍ濃度に溶かし、ポリジーン（Ｐｏｌｙｇｅｎｅ）社のＤＮＡ固相合成機に装着する。次の表１に提示された配列により合成が行われ、一般的に３’→５’方向に進行するが、最初のヌクレオチドの３’水酸基を樹脂に付着し、１つの塩基が添加される間、大きく４段階の化学反応、すなわち、５’−末端の脱トリチル反応（ｄｅｔｒｉｔｙｌａｔｉｏｎ）、新たな塩基の付加反応（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、付加反応しないＤＮＡ鎖のキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）反応、リン酸基の酸化反応（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）を繰り返し行った。反応が終了すると、保護装置を除去し、合成されたＣＰＧレジンをアンモニア水に入れて５５℃で５時間放置し、アンモニア水を乾燥して白色パウダーを得た。ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）の陰イオン交換ＨＰＬＣコラムを用いてＨＰＬＣシステムで１ＭＮａＣｌ溶液を５〜７０％に増加して精製を実施した。メインピークを収集し、これに１００％エタノールを入れてオリゴヌクレオチドを沈殿させて乾燥した。ＨＰＬＣを用いた測定結果、純度８５％以上のオリゴヌクレオチドが得られ、ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳ（Ｑ−ＴＲＡＰ２０００ＥＳＩ−ＭＳ）を用いて分子量を測定して合成が成功したか否かを把握した。
次の表１の配列以外に、既に治療を目的に報告されたオリゴヌクレオチド配列又はグアニン四重鎖を形成して生理的活性を有する様々な配列に対して上述した方法によりオリゴヌクレオチド変形体を製造することができる。

実施例２：新規なオリゴヌクレオチド変形体製剤の製造
それぞれのオリゴヌクレオチドを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に希釈して最終濃度を１００μＭにした。希釈した溶液を９４℃で５分間放置し、氷にチューブを放置した。２ＭＫＣｌ溶液を添加して最終濃度を５０ｍＭのＫＣｌ溶液にした後、３時間の間６０℃で放置し、室温までゆっくり冷やした。それぞれのオリゴヌクレオチドを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）溶液に希釈して１０μＭ濃度にした後、９４℃で５分間放置し、氷にチューブを放置した溶液と２ＭＫＣｌ溶液を添加して最終濃度を５０ｍＭのＫＣｌ溶液にした後、３時間の間６０℃で放置し、室温までゆっくり冷やした。

実験例１：癌細胞での細胞死滅率の測定
実験前日、９６ウェルプレートに１ｍｌ当たり１０３〜１０４個の前立腺癌細胞のＰＣ−３細胞株が懸濁されている培養液１９０μｌを接種した後、翌日、前記実施例１により製造されたオリゴヌクレオチド溶液１０μｌを添加して６日間培養した。接種６日後、一般的なＸＴＴ方法で細胞死滅を測定した［ＪＢＣ１９９９、２６３６９参考］。
ＡＰＴ−２００１、ＡＰＴ−２００２、及びＡＰＴ−２００３に対する細胞死滅率の測定結果、図２に示すように、陽性対照群のＡＰＴ−４００１と陰性対照群のＡＰＴ−４００２よりも本発明の新規なオリゴヌクレオチド変形体のＡＰＴ−２００１、ＡＰＴ−２００２、及びＡＰＴ−２００３のＩＣ₅₀又はＩＣ₉₀が３〜１０倍程度優れた細胞死滅効果を確認した（図２）。

また、陽性対照群のＡＰＴ−４００１に比べてＡＰＴ−２００１、ＡＰＴ−２００２、及びＡＰＴ−２００３が少量であったが、細胞死滅効果が優れたことを確認することができた（図３）。

本発明により合成した多くの新規なオリゴヌクレオチドにおいても、優れた細胞死滅効果を確認でき、ＰＣ３、ＭＣＦ７、ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、Ａ４９８、Ｋ５６２、ＭＶ−４−１１などの様々な癌細胞株に対して優れた細胞死滅効果を確認し、それによって広範囲な抗癌活性を有することを確認した。特に、薬品抵抗性細胞株のＭＣＦ７−ＤＸに対しても優れた抗癌活性を有することを確認することができた。前記細胞死滅効果を確認した結果を下記表２〜７に示す。また、本発明のオリゴヌクレオチドのＫ５６２、ＭＶ−４−１１ＡＭＬ（急性白血病）細胞に対する細胞死滅効果を確認し、図４及び５にそれぞれ示した。

実験例２：グアニン四重鎖形成の確認実験
前記実施例１により製造されたオリゴヌクレオチドのグアニン四重鎖構造の形成を測定するために、ＣＤ（Ｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析技術を用いた。
前記実施例１により製造されたオリゴヌクレオチド溶液を１μＭにするために、リン酸カリウム緩衝剤に希釈して冷凍保管した。各オリゴヌクレオチドを１００μＭにするために、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤に希釈して２ｍｌの溶液を製造した後、円偏光二色性（ＣＤ、ｃｉｒｃｕｌａｒｄｉｃｈｒｏｉｓｍ）分析に用いた。ＣＤスペクトルはＪＡＲＳＣＯＪ−８１０分光偏光計（ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｅｒ）を用い、２０℃で１００ｎｍ／ｍｉｎ走査速度（ｓｃａｎｓｐｅｅｄ）、０．５ｓ反応時間（ｒｅｓｐｏｎｓｅｔｉｍｅ）、２ｎｍ帯域幅（ｂａｎｄｗｉｄｔｈ）、１ｃｍ経路長（ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ）をもって３２０ｎｍ〜２２０ｎｍ波長まで観察した。
その結果、２６４ｎｍで最大ピークを示しており、グアニン四重鎖を形成すると知られた対照物質（ＡＰＴ−４００１）と同じＣＤスペクトルを有することを確認した。すなわち、このような結果は、グアニン四重鎖を形成することが文献（M. Lu, Q. Guo, N. R. Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455; P. Balagurumoorthy, S. K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry. 2002, 41, 3676）に報告されており、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、グアニン四重鎖を形成することを確認することができた（図６〜７）。

実験例３：毒性試験
本発明の有効性分に対して毒性実験を次の通り行った。
ＡＰＴ−２００１、ＡＰＴ−２００２、及びＡＰＴ−２００３をそれぞれジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ、ＤＭＳＯ）に溶解して水で希釈し、これをマウス（１群当たり１０匹）にそれぞれ１ｇ／ｋｇを投与し、７日間観察したが、死亡したマウスはいなかった。

製造例１：注射液剤の製造
ＡＰＴ−２００１１０ｍｇを含有する注射液剤は次のような方法で製造した。
ＡＰＴ−２００１１ｇ、塩化ナトリウム０．６ｇ、及びアスコルビン酸０．１ｇを蒸溜水に溶解して１００ｍｌを作った。この溶液を容器に入れて２０℃で３０分間加熱して滅菌させた。
前記注射液剤の構成成分は次の通りである。
有効性分１ｇ
塩化ナトリウム０．６ｇ
アスコルビン酸０．１ｇ
蒸溜水適量

Claims

ヌクレオチド配列「ＧｘＨｙＮｚ」で表される、グアニン四重鎖構造を有するオリゴヌクレオチド変形体であって、配列番号１〜４７のいずれかで表されることを特徴とするオリゴヌクレオチド変形体。
請求項１に記載のオリゴヌクレオチド変形体又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有することを特徴とする癌予防又は治療用医薬組成物。