ES2598555T3

ES2598555T3 - Nuevos oligonucleótidos modificados ricos en guanosina y actividad antiproliferativa de los mismos

Info

Publication number: ES2598555T3
Application number: ES10794335.9T
Authority: ES
Inventors: Soo Jin Lee; Sung Hwan Moon
Original assignee: APTABIO THERAPEUTICS Inc
Current assignee: APTABIO THERAPEUTICS Inc
Priority date: 2009-06-29
Filing date: 2010-06-29
Publication date: 2017-01-27
Anticipated expiration: 2030-06-29
Also published as: KR100998365B1; EP2448952A2; WO2011002200A2; US20120202981A1; EP2448952A4; JP2012532123A; US9056886B2; EP2448952B1; WO2011002200A3; JP5841938B2

Abstract

Un oligonucleótido modificado indicado por la secuencia nucleotídica 'GxHyNz', en donde G es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-O-metilguanosina, 2'-F-guanosina, LNA (ácido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina y D-guanosina; H es un ácido nucleico exclusivo de guanosina; N es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 5-fluorodesoxicitidina, 5-fluorocitidina, 5- yododesoxicitidina, 5-yodocitidina, arabinósido de citosina/Ara-C, 2',2'-difluorodesoxicitidina/gemcitabina y capecitabina, en donde G, H, N se distribuyen al azar; x es un entero de 1 a 30, y es un entero de 0 a 30, z es un entero de 1 a 30, en donde la suma de (x + y + z) no es mayor que 60, en donde el oligonucleótido modificado se selecciona de las SEQ ID n.os 1, 2, 3, 4, 6, 7, 13, 18, 23, 24, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47.

Description

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DESCRIPCION

Nuevos oligonucleotidos modificados ricos en guanosina y actividad antiproliferativa de los mismos Campo de la tecnica

La presente invencion se refiere a un oligonucleotido modificado que comprende al menos una molecula de guanosina y acido nucleico modificado con eficacias terapeuticas segun esta definido en las reivindicaciones adjuntas. La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para prevenir o tratar el cancer que comprende el acido nucleico modificado o su sal farmaceuticamente aceptable como un ingrediente activo.

Antecedentes de la tecnica

Incluso con el reciente y rapido progreso de la tecnologfa y tratamiento medicos, el cancer todavfa esta considerada una de las enfermedades mas mortales del mundo. Ademas, la tendencia global de envejecimiento de la sociedad simplemente acelera el incremento anual del numero de pacientes con cancer. En general, los agentes contra el cancer son extremadamente toxicos y no son capaces de retirar selectivamente las celulas cancerosas. Asf pues, se lleva necesitando desde hace mucho el desarrollo de un agente contra el cancer que sea muy eficaz, pero que sea menos toxico.

Desde el desarrollo de la smtesis automatizada de ADN en los anos ochenta del siglo XX, la investigacion en el campo medico se ha dirigido mas activamente al desarrollo de agentes terapeuticos mediante el uso de siRNA y antisentidos que actuan selectivamente sobre ARNm intracelular, aptameros, CpG y cebos que actuan selectivamente sobre ribozimas y protemas, etc. [Gleave et al., Nat Rev Cancer. 2005, 468-479; Castanotto et al., Nature 2008, 426-433; Sullenger et al., Nature, 20O2, 252-258; Kaur et al., Expert. Opin. Investig. Drugs. 2008, 43-60; Jurk M et al., BioDrugs. 2007, 387-401; Tomita et al., Clin Exp. Nephrol. 2007, 7-17].

Se sabe que los oligonucleotidos ricos en guanosina tienen actividad inhibidora del crecimiento frente a un amplio espectro de celulas cancerosas. Cuando las celulas cancerosas se tratan con oligonucleotidos ricos en guanosina, se fijan a protemas concretas en las celulas, por ejemplo, eEFIA, JNK, Ki-ras, nucleolina, stat3, telomerasa, topoisomerasa, que estan asociadas muy estrechamente al crecimiento y muerte celulares, y que regulan el ciclo celular. Se sabe que estas protemas se expresan a mayor nivel en las celulas cancerosas que en celulas normales [Christopher R. Ireson et al., Molecular Cancer Therapy 2006, 2957-2962; Naijie Jing et al., Cancer Research, 2004, 6603-6609; Christophe Marchand et al., The journal of Biological Chemistry, 2002, 8906-8911].

Estos oligonucleotidos ricos en guanosina tienen una estructura especial que incluye tres puentes de hidrogeno con la citosina. Pueden tener una estructura tetracatenaria gracias a fijaciones intramoleculares o intermoleculares. En vez de formar una estructura de doble helice mediante puentes de hidrogeno entre la adenosina y la timidina, y la guanosina y la citidina, cuatro moleculas de guanosina quedan localizadas en el mismo plano para formar puentes de hidrogeno de tipo Hoogsten, gracias a lo cual se forma un cuarteto de G. Este cuarteto de G se repite al menos una vez y forma una estructura tetrahelicoidal.

En general, los oligonucleotidos no se han visto favorecidos en el desarrollo de nuevos farmacos debido a su poca estabilidad en la sangre y a su poca permeabilidad celular. Sin embargo, se sabe que los oligonucleotidos con la estructura de cuartetos de G tienen una estructura estable, y una estabilidad en la sangre y permeabilidad celular relativamente altas [Julian Leon Huppert, Chemical Society Reviews 2008, 37, 1375-1384; Paula J. Bates et al., Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164; Christopher R. Ireson et al., Molecular Cancer Therapy 2006, 2957-2962]. La patente de los EE. UU. n.° 7.312.082 ensena que la estabilidad del cuarteto de G depende de los cationes monovalentes, de los agentes intercalantes y de la concentracion de oligonucleotidos o similares (Haiyan Qi et al., Cancer Res. 2006, 118808-11816, Anna Arola et al., Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008, 1405-1415).

La patente de los EE. UU. n.° 7.314.926 y la publicacion de la solicitud de la patente de los EE. UU. n.° 2007-105805 describen que a los cuartetos de G se fijan determinadas protemas, las cuales se expresan en la superficie de las celulas cancerosas, entran en las celulas cancerosas por endocitosis y se fijan a protemas que intervienen en la apoptosis celular, por medio de lo cual se inhibe el crecimiento de las celulas cancerosas. Se sabe que la apoptosis celular esta inducida por el efecto citostatico en lugar de por el efecto citotoxico [Paula J. Bates et al. The Journal of Biological Chemistry 1999, 26369-26377; Bruna et al., FEBS 2006, 1350-1361].

Ademas de su efecto inhibidor sobre el crecimiento de las celulas cancerosas, tambien se conocen otros efectos de los oligonucleotidos que forman cuartetos de G. Por ejemplo, la patente de los EE. UU. n.° 5.567.604 describe un efecto antivmco; la patente de los EE. UU. n.° 6.994.959 describe el efecto sobre la regulacion inmunitaria; y la publicacion de la solicitud de la patente de los EE. UU. n.° 2007-105805 describe su funcion para el tratamiento de la enfermedad de Huntington, lo que sugiere que estan asociadas a diversas funciones biologicas y regulaciones del organismo [Cheryl A. Stoddart et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998, 2113-2115; Michael Skogen et al. BMC Neuroscience, 2006, 7:65]. Muchas lmeas de investigacion se han centrado en utilizar oligonucleotidos que forman cuartetos de G para el tratamiento de diversas enfermedades y, recientemente, se ha realizado un estudio clmico para comprobar su posible uso como agente contra el cancer [Paula J. Bates et al., Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164].

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El AS-1411, un farmaco clmico desarrollado como resultado de las investigaciones, es un oligonucleotido que forma cuartetos de G, el cual se fija a la nucleolina que se sobreexpresa en celulas cancerosas, con lo que ejerce una actividad inhibidora excelente contra el crecimiento de las celulas cancerosas. Ademas, consigue reducir de forma considerable su influencia sobre las celulas normales del organismo a la vez que incrementa su accion apoptosica celular contra las celulas cancerosas, con lo que se espera, por lo tanto, que pueda llegar a convertirse en un nuevo farmaco contra el cancer [Christopher R. Ireson et al., Mol Cancer Ther. Diciembre de 2006; 5(12): 2957-62]. Los oligonucleotidos formadores de cuartetos de G inducen la apoptosis celular mediante la inhibicion del crecimiento celular. No obstante, existe la desventaja con los oligonucleotidos que forman cuartetos de G de que es esencial proporcionarle a un paciente una inyeccion de Ringer al dfa durante un periodo de 4 a 7 dfas debido a que su citotoxicidad es relativamente baja, y tambien hay una carga por la necesidad de la administracion combinatoria de un quimioterapico que es muy toxico [Paula J. Bates et al. Experimental and Molecular Pathology (2009) 151-164; Christopher R. Ireson et al., Molecular Cancer Therapy, 2006, 2957-2962].

Para solucionar los problemas anteriores, los inventores de la presente invencion han hecho esfuerzos por mejorar el efecto apoptosico celular de los oligonucleotidos formadores de cuartetos de G mediante la introduccion de un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz que tiene efectos apoptosicos sobre los oligonucleotidos formadores de cuartetos de G.

Un ejemplo representativo de acidos nucleicos modificados y terapeuticamente eficaces es el 5-fluorouracilo (5-FU). El 5-FU se desarrollo primero a finales de los anos cincuenta como un agente antineoplasico y antimetabolico. Se sabe que su actividad contra el cancer se ejerce mediante el bloqueo de la timidilato sintasa [Piedo et al., J. Clin. Oncol. 1988, 1953-1664]. Ademas, los profarmacos en forma de un nucleosido de 5-fluoropirimidina, tal como la 5- fluorodesoxiuridina (5-FdU), la 5-fluorodesoxicitidina (5-FdC) y la 5-fluorouridina se ha utilizado para el tratamiento del cancer colorrectal, el cancer de mama y el cancer de cabeza y cuello durante mas de 4 decadas, y se estan estudiando en un ensayo clmico [Thomas et al. Clin Exp. Pharmacol. Physiol. 1998, 887-895; Heidelberger et al. Nature 1957 179: 663-666; Longley et al., Nat. Rev. Cancer 2003, 330-338; Beumer et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 2008, 363-368; Song et al. Clinical Cancer Researh, 1997, 901-909]. Ya que se saben sintetizar las preparaciones de fosforamidita, que comprenden en los oligonucleotidos estas 5-fluorodesoxiuridina, 5- fluorodesoxicitidina o nucleosido de 5-fluorouridina, fue posible sintetizar en un sintetizador de ADN en fase solida los oligonucleotidos que contienen los nucleosidos terapeuticos [Gmeiner et al., J. Org. Chem. 1994, 5779-5783; Schmidt et al., Nucleic Acids Research, 1992, 2421-2426; Stolarski et al., Biochemistry 1992, 31, 7027-7042].

Estos oligonucleotidos que contienen los nucleosidos terapeuticos liberan la 5-FdU y la 5-FdC durante la degradacion enzimatica por la accion de las exonucleasas, y se acaban asociando a diferentes clases de enzimas para convertirse en 5-FdUMP como una forma completamente activada, gracias a lo cual se induce la apoptosis celular. Asf pues, se sabe que los oligonucleotidos obtenidos son mas citotoxicos que el 5-FdU a la misma concentracion y tambien son mas eficaces desde el punto de vista terapeutico a la hora de tratar las celulas cancerosas resistentes a los farmacos [Gmeiner et al., Nucl. Nuct. 1995, 243-253].

En la patente de los EE. UU. n.° 5.457.187 se describe la citotoxicidad de un oligonucleotido de homo-poli-FdU que contiene 5-fluorouracilo, y la patente de los EE. UU. n.° 5.614.505 describe la citotoxicidad de los oligonucleotidos que comprenden FdU. Sin embargo, estos oligonucleotidos que contienen 5-fluorouracilo no forman cuartetos de G, tienen muy poca estabilidad en la sangre y son poco permeables para la celula, con lo que no resultan idoneos para que sean desarrollados como farmaco con respecto a su estructura y eficacia farmaceutica.

Compendio de la invencion

Casos a resolver

Los inventores de la presente invencion, en un intento por solucionar los problemas descritos mas arriba asociados a la tecnica anterior, descubrieron que al introducir al menos un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz, que es capaz de inducir la apoptosis celular debido al efecto citotoxico, en los oligonucleotidos, que forman un cuarteto de G debido a la presencia de muchas guanosinas con efecto citotoxico, la estabilidad en la sangre y la permeabilidad celular del oligonucleotido se considero que habfan mejorado considerablemente, mientras que el crecimiento de las celulas cancerosas resulto inhibido con mas eficacia, lo que al final condujo a la apoptosis. Tras la comparacion del efecto citotoxico de los oligonucleotidos mencionados mas arriba sintetizados del mismo, se confirmo que su efecto citotoxico contra las celulas cancerosas era superior al de un farmaco clmico.

Asf pues, la presente invencion se refiere a un nuevo oligonucleotido modificado y rico en guanosinas que contiene un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz tal y como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ademas, la presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para prevenir y tratar el cancer que comprende como ingrediente activo el oligonucleotido modificado anteriormente mencionado o su sal farmaceuticamente aceptable.

Solucion tecnica

La presente invencion se refiere a un oligonucleotido modificado que se indica mediante una secuencia de

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nucleotidos 'GxHyNz', en donde la G se selecciona del grupo que consiste en 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-0- metilguanosina, 2'-F-guanosina, LNA (acido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina y D-guanosina; H es un acido nucleico exclusivo de guanosina; N es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 5- fluorodesoxicitidina, 5-fluorocitidina, 5-yododesoxicitidina, 5-yodocitidina, arabinosido de citosina/Ara-C, 2',2'- difluorodesoxicitidina/gemcitabina y capecitabina, en donde G, H y N se distribuyen al azar; x es un entero de 1 a 30, y es un entero de 0 a 30, z es un entero de 1 a 30, en donde la suma de (x + y + z) no es mayor de 60, en donde el oligonucleotido modificado se selecciona de las SEQ ID n.os 1, 2, 3, 4, 6, 7, 13, 18, 23, 24, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47.

Ademas, la presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para prevenir y tratar el cancer, que comprende como un ingrediente activo el oligonucleotido modificado mencionado mas arriba o su sal farmaceuticamente aceptable.

Efecto de la invencion

El oligonucleotido modificado de la presente invencion es un compuesto con una nueva estructura qmmica que comprende al menos un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz, y guanosina capaz de formar una estructura de cuarteto de G. Tiene una excelente actividad apoptosica celular y, asf pues, es idonea como agente terapeutico para prevenir y tratar el cancer.

Breve descripcion de los dibujos

Lo anterior y otras peculiaridades de la presente invencion se describiran a continuacion en detalle con referencia a determinadas realizaciones de ejemplo, las cuales se ilustraran con los dibujos acompanantes que se ofrecen a continuacion unicamente a modo de ilustracion y, asf pues, no son limitantes de la presente invencion, y en donde:

En la figura 1 se muestra una guanosina o sus derivados;

En la figura 2 se muestra el nivel de la inhibicion del crecimiento celular debida a diferentes oligonucleotidos modificados, sin estar conformes a la invencion;

En la figura 3 se muestran imagenes de la CI50 de los oligonucleotidos modificados sin estar conformes a la invencion y su morfologfa celular;

La figura 4 es una grafica que compara la actividad de apoptosis celular de diferentes oligonucleotidos modificados frente a las celulas de LMC (leucemia mielogena cronica) K562 (porcentaje de crecimiento celular, en 1 jM);

La figura 5 es una grafica que compara la actividad de apoptosis celular de diferentes oligonucleotidos modificados frente a las las celulas de lMa (leucemia mielogena aguda) MV-4-11 (porcentaje de crecimiento celular, en 2 jM);

En la figura 6 se presenta una grafica que muestra el resultado del analisis de dicrofsmo circular (DC) para confirmar la presencia de la estructura de cuarteto de G en el oligonucleotido APT-4001, un control positivo;

En la figura 7 se presenta un grafico que muestra el resultado del analisis de dicrofsmo circular (DC) para confirmar la presencia de la estructura de cuarteto de G en el oligonucleotido APT-2054 preparado en el ejemplo 1; y

En la figura 8 se presenta un grafico que muestra el resultado del analisis de dicrofsmo circular (DC) para confirmar la presencia de la estructura de cuarteto de G en el oligonucleotido APT-2073 preparado en el ejemplo 1.

Mejor modo de realizar la invencion

La presente invencion se describe con mas detalle segun se presenta aqu en virtud de esto.

Se describe en la presente memoria un oligonucleotido preparado de tal manera que un nucleotido rico en guanosinas, que es capaz de formar una estructura de cuarteto de G, se introduce con un acido nucleico modificado para conferirle citotoxicidad.

El cuarteto de G utilizado en la presente invencion es rico en al menos una guanosina (G) representativa seleccionada del grupo que consiste en 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-0-metilguanosina, 2'-F-guanosina, LNA (acido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina y D-guanosina (figura 1). En un oligonucleotido con cuarteto de G, las cuatro moleculas de guanosina estan localizadas en el mismo plano para formar puentes de hidrogeno de tipo Hoogsten, gracias a lo cual se forma una estructura helicoidal cuadruple, y a este oligonucleotido se le introduce en la presente invencion un acido nucleico modificado con eficacia terapeutica.

El oligonucleotido rico en guanosinas que forma una estructura de cuarteto de G se sabe que se fija selectivamente a las celulas cancerosas y tambien que inhibe el crecimiento de las celulas cancerosas por diferentes mecanismos. Cuando el oligonucleotido que forma la estructura de cuarteto de G se introduce con al menos un acido nucleico modificado y a continuacion se transporta al interior de las celulas cancerosas, el efecto inhibidor del crecimiento celular debido a la propia estructura de cuarteto de G y el efecto inhibidor directo del crecimiento celular debido al

acido nucleico modificado, al que se da un efecto terapeutico cuando queda degradado por la accion de una nucleasa, trabajan juntos para finalmente conducir a la muerte de las celulas cancerosas. El oligonucleotido que forma la estructura de cuarteto de G por sf solo unicamente puede ejercer el efecto inhibidor del crecimiento celular y, asf pues, no tiene un efecto apoptosico celular alto, por lo que requiere un tratamiento largo y continuo durante un 5 periodo de tiempo determinado. Sin embargo, la adicion de un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz en el oligonucleotido que forma la estructura de cuarteto de G de la presente invencion confirmo que se hada mejorado considerablemente el efecto apoptosico, gracias a lo cual se incrementa considerablemente la tasa de apoptosis celular.

En general, los ejemplos de acidos nucleicos terapeuticamente eficaces son adenosina, guanosina, timidina, citidina 10 y uridina, en donde su azucar o su base esta modificada. Mas espedficamente, los acidos nucleicos modificados derivados de la uridina o de la citidina utilizados en la presente invencion son los nucleosidos de tipo pirimidina, tal como la citidina de la formula 2 que viene a continuacion. Estos nucleosidos se pueden convertir en fosforamidita mediante el uso de un metodo convencional [Oligonucleotidos and Analogues: A Practical Approach, 1991, Fritz Eckstein et al. IRL Press: Oxford]; o la fosforamidita nucleotidica se puede comprar a las casas comerciales (p. ej., 15 Glenresearch, Berry and Associates, Okeanos Tech, Chemgene, Proligo) y, a continuacion, se puede introducir en un oligonucleotido rico en guanosina mediante la smtesis en fase solida con un sintetizador de ADN de acuerdo con un metodo conocido.

imagen1

En la formula 1 o 2 anteriores, R1 es un hidrogeno, un halogeno o un grupo hidroxilo, R2 es un hidrogeno, un 20 halogeno o un grupo hidroxilo, R3 es un hidrogeno, un halogeno, alquilo(C-Mo), haloalquilo(C-Mo), alquenilo(C2-1o), haloalquenilo(C2-1o), en donde R1 y R2 no son un grupo hidroxilo al mismo tiempo.

Los acidos nucleicos modificados de mas arriba derivados de la citidina (N) de acuerdo con la invencion son 5- fluorodesoxicitidina, 5-fluorocitidina, 5-yododesoxicitidina, 5-yodocitidina, arabinosido de citosina/Ara-C, 2',2'- difluorodesoxicitidina/gemcitabina y capecitabina. Los acidos nucleicos modificados anteriores se convierten primero 25 en la forma de fosforamidita y a continuacion se preparan en un oligonucleotido modificado a traves de la smtesis en fase solida con un sintetizador de ADN de acuerdo con un metodo conocido. Es decir, el oligonucleotido modificado se sintetiza por disolucion de la fosforamidita del acido nucleico modificado anterior en acetonitrilo anhidro y cargandolo en un sintetizador de ADN de acuerdo con el protocolo proporcionado por Glenresearch Corporation o la smtesis y metodos de purificacion convencionales descritos en las patentes de los EE. UU. n.os 5.457.187 y 30 5.614.505. Un ejemplo de un oligonucleotido modificado sintetizado asf (sin estar conforme a la invencion) se muestra a continuacion en la formula 3.

imagen2

Ademas, los ejemplos de las secuencias de oligonucleotidos modificados que se pueden sintetizar con el uso de acidos nucleicos modificados, con respecto a las secuencias oligonucleotfdicas ya descritas con el proposito del tratamiento terapeutico [Paula J. Bates et al., The Journal of Biological Chemistry 1999, 26369-26377, Cheryl A 5 Stoddart et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998, 2113-2115, Virna Dapic et al. Biochemistry 2002, 3676-3685, Naijie Jing et al., Biochemistry 2002, 41, 5397-5403, Naijie Jing et al., Cancer Research 2004, 66036609, Haiyan Qi et al., Cancer Resarch 2006, 11808-11816, YunTeng et al. Cancer Research 2007, 10491-10500, Bruna Scaggiante et al., FEBS Journal 2006, 1350-1361, Julie E. Reed et al., Journal of the American Chemical Society, 2006, 5992-5993, Jeffrey S. Bishop et al., The Journal of Biological Chemistry 1999, 5698-5703, Christophe 10 Marchand et al., The Journal of Biological Chemistry 2002, 8906-8911, Jun-ichiro Suzuki et al., Journal of Virology 2002, 3015-3022, Virna Dapic et al., Nucleic Acids Research, 2003, 2097-2107, Amber Goodchild et al. Nucleic Acid Research 2007, 4562-4572, patentes de los EE. UU. n.os 6.323.185, 7.314.926, 6.994.959, 7.157.436 y 7.199.228] o a diferentes secuencias oligonucleotfdicas con la estructura de cuarteto en G que muestran actividades fisiologicas, al introducir al menos un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz. Por ejemplo, en el caso de las 15 secuencias oligonucleotfdicas que se sabe que muestran actividad de inhibition del crecimiento celular, tales como

se pueden

sintetizar en general diferentes oligonucleotidos modificados mediante la introduction de al menos un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz, por ejemplo, 5-FdU ('F' de aquf en adelante) o 2',2'- difluorodesoxicitidina/gemcitabina (Gemcitabina, 'Z' de aquf en adelante). Mas especfficamente, mediante la 20 introduccion de un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz en una position idonea de cualquiera de los oligonucleotidos que tienen las secuencias anteriores, que incluyen

TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG 0 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG

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FFFGGFGGFGGFGGFFGFGGFGGFGGFGG,

GGFGGFGGFGGFFGFGGFGGFGGFGG,

GGFGGFGGFGGTTGTGGFGGFGGFGG,

GGFGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGFG,

GGTGGTGGTGGFFGFGGTGGTGGTGG,

GGTGGTGGTGGTT2TGGTGGTGGTGG,

GGTGGTGGTGGTZGTGGTGGTGGTGG,

FFFGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG, GGFGGFGGFGGFFFFGGFGGFGGFGG, GGFGGFGGTGGTTGTGGTGGFGGFGG, GGTGGTGGTGGFFFFGGTGGTGGTGG, GGZGGZGGZGGZZGZGGZGGZGGZGG, GGTGGTGGTGGTZZTGGTGGTGGTGG F GGTGGTGGTGGTTGZGGTGGTGGTGG,

GGTGGTGGTGGTZGZGGTGGTGGTGG. GGZGGTGG'GGTTG'GGTGGTGGZGG. y

i ' , se pueden sintetizar diferentes nucleotidos modificados. Tambien se ha

demostrado que estas secuencias tienen una excelente actividad apoptosica celular.

Se pueden obtener nuevos oligonucleotidos modificados mediante la introduction de un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz en una position idonea de cualquiera de los oligonucleotidos que se describieron para el proposito del tratamiento terapeutico o de los oligonucleotidos con estructura de cuarteto de G que tienen actividades fisiologicas.

Las secuencias de los nuevos oligonucleotidos modificados y la posicion para la introduccion de los acidos nucleicos modificados podrian influir en la afinidad o en la especificidad para actuar selectivamente sobre regiones con cuartetos de G que tienen proteinas. Por lo tanto, las secuencias de los nuevos oligonucleotidos y la posicion para introducir acidos nucleicos modificados se podrian determinar mediante la afinidad o la especificidad para actuar selectivamente sobre regiones con cuartetos de G que tienen proteinas. Los oligonucleotidos modificados de acuerdo con la presente invention se podrian determinar mediante actividades fisiologicas que se muestran mediante factores decisivos, tales como la afinidad de fijacion o la especificidad para actuar selectivamente sobre regiones con cuartetos de G que tienen proteinas.

Las secuencias de los nuevos oligonucleotidos modificados por el metodo anterior son tal y como se presenta a continuacion.

En la presente memoria se describe una secuencia oligonucleotidica llamada 'GxHyNz', en donde G se selecciona del grupo que consiste en 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-0-metilguanosina, 2'-F-guanosina, LNA (acido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina y D-guanosina; H es un acido nucleico exclusivo de la guanosina; N es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 5-fluorodesoxicitidina, 5-fluorocitidina, 5-yododesoxicitidina, 5- yodocitidina, arabinosido de citosina/Ara-C, 2',2'-difluorodesoxicitidina/gemcitabina y capecitabina, en donde G, H, N se distribuyen aleatoriamente; x es un entero de 1 a 30, y es un entero de 0 a 30, z es un entero de 1 a 30, en donde la suma de (x + y + z) no es mayor de 60.

El acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz anterior (N) esta representado por la formula 5 y reside en los oligonucleotidos modificados.

imagen3

En la formula 5 anterior, R1 es un hidrogeno, un halogeno o un grupo hidroxilo, R2 es un hidrogeno, un halogeno o un grupo hidroxilo, R3 es un hidrogeno, un halogeno, alquilo(C1-10), haloalquilo(C1-10), alquenilo(C2-10), haloalquenilo(C2-10), en donde R1 y R2 no son un grupo hidroxilo al mismo tiempo, X e Y son respectivamente un hidrogeno, o un atomo de fosforo en el grupo fosfato del acido nucleico adjunto.

La H anterior es mas preferiblemente adenosina, citidina, uridina o timidina, en donde la suma de (x + y + z) no es mayor de 60, preferiblemente esta en el intervalo de 5 a 60, lo mas preferiblemente de 14 a 26.

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15

20

25

30

35

40

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50

55

Los agentes convencionales que comprenden un nucleosido terapeuticamente eficaz se sabe que a menudo provocan efectos secundarios, tales como la toxicidad sistemica y la resistencia a farmacos. Ademas, se sabe que muchas celulas cancerosas son resistentes a estos agentes contra el cancer que contienen un nucleosido terapeuticamente eficaz, lo que requiere la seleccion de otras clases de farmacos en su lugar. En el caso de que estos nucleosidos terapeuticamente eficaces esten contenidos en un oligonucleotido con una estructura de cuarteto de G, que tiende a actuar mas selectivamente sobre las celulas cancerosas, disminuira al mmimo su influencia sobre las celulas normales del organismo, y tambien incrementara su tasa de apoptosis celular contra los canceres farmacorresistentes.

El oligonucleotido modificado que se menciona mas arriba, como es el caso del oligonucleotido con estructura de cuarteto de G, ha mostrado un pico mmimo a aproximadamente 240 nm, y el pico maximo a aproximadamente 260270 nm segun el analisis por dicrcnsmo circular (DC). Estos rasgos caractensticos respaldan que el oligonucleotido modificado de la presente invencion tiene la estructura de cuarteto de G, y se ha descrito informacion relevante (M. Lu, Q. Guo, N. R. Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455; P. Balagurumoorthy, S. K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061; Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry, 2002, 41, 3676).

La estructura de cuarteto de G se vuelve mas estable en presencia de iones de potasio (K+). Conserva una estructura estable en una condicion fisiologica dada, tal como en la sangre, durante un periodo relativamente largo de tiempo. Por lo tanto, en la presente invencion, el oligonucleotido con estructura de cuarteto de G que comprende un acido nucleico modificado y terapeuticamente eficaz se estabiliza antes de usarlo al tratarlo con una solucion de KCl (30-70 mM). El nuevo oligonucleotido modificado de acuerdo con la presente invencion mostro que tiene un efecto apoptosico superior sobre las celulas cancerosas que el farmaco clmico.

La presente invencion tambien se refiere a una composicion farmaceutica para prevenir y tratar el cancer que comprende el oligonucleotido modificado de mas arriba, o su sal farmaceuticamente aceptable, como un ingrediente activo.

Los ejemplos de la sal farmaceuticamente aceptable incluyen un sal de metal, una sal con una base organica, una sal con un acido inorganico, una sal con un acido organico, una sal con un aminoacido acido o basico, o similares.

Los ejemplos de la sal de metal idonea incluyen una sal de metal alcalino, tal como sal de sodio y sal de potasio; sal de un metal alcalinoterreo, tal como sal de calcio, sal de magnesio y sal de bario; sal de aluminio, o similares.

Los ejemplos de la sal idonea con una base organica incluyen una sal con trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, 2,6-lutidina, etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, ciclohexilamina, diciclohexilamina, N,N- dibenciletilenamina, o similares.

Los ejemplos de la sal idonea con un acido inorganico incluyen una sal con acido clorhndrico, acido bromhndrico, acido nftrico, acido sulfurico, acido fosforico o similares.

Los ejemplos de la sal idonea con un acido organico incluyen una sal con acido formico, acido acetico, acido trifluoroacetico, acido ftalico, acido fumarico, acido oxalico, acido tartarico, acido maleico, acido cftrico, acido succmico, acido metanosulfonico, acido bencenosulfonico, acido p-toluenosulfonico, o similares.

Los ejemplos de la sal idonea con aminoacido basico incluyen una sal con arginina, lisina, ornitina o similares.

Los ejemplos de la sal idonea con aminoacido acido incluyen una sal con acido aspartico, acido glutamico o similares.

En particular, los ejemplos de sales preferidas, en el caso de que un compuesto tenga un grupo funcional acido en el compuesto, son las sales inorganicas tales como las sales de metales alcalinos (p. ej., sales de sodio, sal de potasio, etc.) y las sales de metales alcalinoterreos (p. ej., sal de calcio, sal de magnesio, sal de bario, etc.) y la sal de amonio, tal como las sales organicas; y en el caso de que un compuesto tenga un grupo funcional basico en el compuesto son una sal con un acido inorganico (p. ej., acido clorhndrico, acido bromhndrico, acido nftrico, acido sulfurico, acido fosforico, etc.) y una sal con una sal organica (p. ej., acido acetico, acido ftalico, acido fumarico, acido oxalico, acido tartarico, acido maleico, acido cftrico, acido succmico, acido metanosulfonico, acido p- toluenosulfonico, etc.).

La composicion farmaceutica para prevenir y tratar el cancer que comprende el oligonucleotido modificado mas arriba podna comprender un vehnculo farmaceuticamente aceptable, ademas de un ingrediente activo. Los ejemplos de vehnculo farmaceuticamente aceptable, en el caso de una inyeccion, son un conservante, un agente isotonico, un anestesico, un solubilizante, un tamponante, etc., o una mezcla de los mismos; en el caso de una administracion oral son un solubilizante, un aglutinante, un diluyente, un disgregante, un estabilizante, un agente de suspension, un decolorante, un lubricante, aromatizante, etc.; y en el caso de una administracion local estan una base, un diluyente, un lubricante, un conservante, etc.

La preparacion de la composicion farmaceutica de la presente invencion se puede formular en diferentes tipos al

5

10

15

20

25

30

35

40

45

mezclarla con un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Ademas, se puede preparar en forma de una ampolla de dosis unitaria o una forma de dosis multiple en el caso de una inyeccion; se puede preparar en forma de un comprimido, un elixir, una capsula, suspension, trocisco, oblea, jarabe en el caso de una administracion oral; y otras formas, que incluyen una suspension, un comprimido, una pfldora, una capsula y una preparacion de liberacion prolongada, o similares.

Ejemplos de vehmulos, excipientes y diluyentes idoneos para las preparaciones farmaceuticas incluyen celulosa microcristalina, xilitol, eritritol, metilcelulosa, polivinilpirrolidona, almidon, goma arabiga, alginato, gelatina, lactosa, dextrosa, sacarosa, propilhidroxibenzoato, celulosa, agua, metilhidroxibenzoato, estearato de magnesio, talco, sorbitol, manitol, maltitol, fosfato de calcio, silicato de calcio, aceite mineral, o similar.

En la presente invencion, «administracion» se refiere a la introduccion de una determinada sustancia en un paciente por cualquier via adecuada. La via de administracion de un ingrediente activo no esta limitada, sino que se puede aplicar cualquier via de administracion con tal de que pueda servir para hacer llegar una determinada sustancia farmacologica a un tejido diana, por ejemplo, administracion intravenosa, administracion subcutanea, administracion oral, administracion intramuscular, administracion intraperitoneal, administracion intrapulmonar, administracion rectal, administracion local, administracion intranasal, administracion intradermica, pero no esta limitado a estas. Sin embargo, ya que los oligonucleotidos son digeridos cuando se administran por via oral, la composicion farmaceutica para la administracion oral se debe preparar de tal modo que pueda descomponerse y absorberse en el tubo digestivo. Preferiblemente, se podna administrar por inyeccion o a traves de una via internasal.

El contenido del ingrediente activo de las preparaciones farmaceuticas de la presente invencion se puede seleccionar idoneamente segun la capacidad de absorcion del ingrediente activo, relacion de inactivacion, tasa de excrecion, edad de un usuario, sexo y estado de salud, etc. En la presente invencion, el contenido del ingrediente activo es de 1 a 1000 mg/kg, preferiblemente de 100 mg/kg y se podna administrar de 1 a 3 veces al dfa, o se podna administrar continuamente por infusion durante un periodo de tiempo determinado.

La presente invencion se describe a continuacion, pero no se debe interpretar que limita el alcance de la presente invencion segun se define mediante las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplos

Ejemplo 1: Smtesis de los oligonucleotidos modificados

Los nuevos oligonucleotidos modificados se sintetizaron con un sintetizador de ADN (Polygene, Inc.) en una escala de 1 |jM con una qrnmica estandar de fosforamiditas en fase solida. En Glen Research Corporation se adquirieron la desoxiguanosina, la timidina, la desoxicitidina, la 5-fluorodesoxiuridina (sin estar conforme a la invencion), el Ara-C y la fosforamidita de TMP-5-fluorodesoxiuridina, y a continuacion se disolvieron en acetonitrilo seco a una concentracion de 0,067 M, y se cargaron en el sintetizador de ADN en fase solida.

El ADN se sintetizo en la direccion 3'^5' para preparar los oligonucleotidos cuya secuencia se muestra en la tabla 1 que viene a continuacion. Con el 3'-OH del primer nucleotido adherido a la resina, una reaccion qrnmica de cuatro etapas que comprende la destritilacion del extremo 5', el acoplamiento de una nueva base, la proteccion de la cadena de ADN sin conjugar, y la oxidacion del grupo fosfato se repitio mientras que se anadfa una base. Tras finalizar la reaccion, se retiro el protector. Asf pues, la resina de CPG sintetizada se anadio a una solucion de amonio y se dejo a 55 °C durante 5 horas. A continuacion, la solucion de amonio se seco para finalmente obtener un producto en forma de polvo blanco. El resultante se purifico con una columna de HPLC de intercambio de cationes de Waters, en donde la concentracion de NaCl a 1 M se incremento al 5-70%. A continuacion, se recogieron los picos principales y se les anadio etanol al 100% para precipitar los oligonucleotidos, que se secaron despues. Asf pues, los oligonucleotidos obtenidos se analizaron por HPLC y se encontro que teman una pureza de mas del 85%. Su masa molecular se midio por ESI-LC-MS (ESI-MS Q-TRAP 2000) para determinar el exito de la smtesis.

Los oligonucleotidos modificados se pueden sintetizar mediante el metodo anterior con las secuencias oligonucleotidicas que ya se describieron con el proposito del tratamiento terapeutico o diferentes secuencias que muestran actividades fisiologicas que forman una estructura de cuarteto de G, ademas de las secuencias mostradas en la tabla 1 que viene a continuacion.

Tabla 1

Comp. n.°: N G H Secuencia lc/ms

APT-2001*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina - NNNGGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNG GNGG (SEQ. ID. NO. 1) 9232.53

APT-2001B: 5-F-desoxicitidina 2-desoxi- guanosina NNNGGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNG GNGG (SEQ. ID. NO. 1) 9220.77

APT-2002*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

NNNGGTG GTGGTGGTTGTGGTGGTGG TGG (SEQ. ID. NO. 2)

9196.89

APT-2002B

5-F-desoxicitidina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

NNNGGTG GTGGTGGTTGTGGTGGTGG TGG (SEQ. ID. NO. 2)

9193.95

APT-2003*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG NNNG (SEQ. ID. NO. 3)

9526.1

APT-2003B

Arabinosido de citosina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG NNNG (SEQ. ID. NO. 3)

9517.16

APT-2003C

5-F-desoxicitidina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG NNNG (SEQ. ID. NO. 3)

9523.16

APT-2004*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

imagen4

8308.1

APT-2005*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

imagen5

8287

APT-2007*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

GGGNNNNGGGNNNNGGGNNNNGGG

(SEQ. ID. NO. 6)

7586.6

APT-2008*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

GGNGGNNNNGGNGG

(SEQ. ID. NO. 7)

4420.7

APT-2009*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

GGNGGNGGNGG

(SEQ. ID. NO. 8)

3496.2

APT-2010*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

GGNNNNGG

(SEQ. ID. NO. 9)

2487

APT-2011*

5-yodo-

desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

NNNGGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNG GNGG (SEQ. ID. NO. 1)

10799.4

APT-2012

Arabinosido de citosina

2-desoxi-

guanosina

NNNGGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNG GNGG (SEQ. ID. NO. 1)

9468.76

APT-2013*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

NNNGGNGGNGGNGGTTGTGGNGGNG GNGG (SEQ. ID. NO. 10)

9220.7

APT-2014*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

NNNGGTGGTGGTGGNNGNGGTGGTGG TGG (SEQ. ID. NO. 11)

9208.8

APT-2015*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

Timidina

GGNGGNGGNGGTTTTGGNGGNGGNG

G

(SEQ. ID. NO. 12)

8271.2

APT-2015B*

5-F-desoxiuridina

2-desoxi-

guanosina

2'-

desoxicitidina

GGNGGNGGNGGCCCCGGNGGNGGNG

G

(SEQ ID NO. 13)

8211.08

APT-2015C: Arabinosido de citosina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGNGGNGGCCCCGGNGGNGGNG G (SEQ ID NO. 13) 8193.10

APT-2016*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGNNNNGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 14) 8263.2

APT-2017*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGNGGNGGNNNNGGTGGTGGTG G (SEQ ID NO. 15) 8275.1

APT-2018*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGNNNNGGNGGNGGNG G (SEQ ID NO. 16) 8275.1

APT-2019*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGNGGTTTTGGNGGNGG (SEQ ID NO. 17) 6338

APT-2019B: Arabinosido de citosina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGNNNNGGTGGTGG (SEQ ID NO. 18) 6326.08

APT-2020*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGNNNNGGTGGTGG (SEQ ID NO. 18) 6338

APT-2021*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina G'GNCG TTTGgNGG (SEQ ID NO. 19) 4404.8

APT-2022*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GC~GCKNK\GCTGG (SEQ ID NO. 20) 4412.8

APT-2023*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina (SEQ ID NO. 21) 3492.2

APT-2024*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina (SEQ ID NO. 22) 2479.6

APT-2025: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina GGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNGGNG G (SEQ ID NO. 4) 8461.2

APT-2026: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGGNNNNGGGNNNNGGGNNNNGGG (SEQ ID NO. 6) 7790.7

APT-2027: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina uGGGGNNN\GGNGG (SEQ ID NO. 7) 4522.8

APT-2028: Arabinosido de citosina 2-desoxi- guanosina GGNGGNGGNGGNNGNGGNGGNGGNG G (SEQ ID NO. 4) 8281.2

APT-2030: Arabinosido de citosina 2-desoxi- guanosina - uGGGGNNN\GGNGG (SEQ ID NO. 7) 4402.8

APT-2031*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 23) 6326

APT-2032*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 24) 6324.1

APT-2033*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTTTNGGTGGTGG (SEQ ID NO. 25) 6324.1

APT-2034*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTNNNGGTGGTGG (SEQ ID NO. 26) 6328

APT-2035: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTTNTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 24) 6343.1

APT-2037*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina |GGTGGTGGTGGNNGNGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 27) 8284.3

APT-2038*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- Timidina GGTGGTGGTGGTNNNGGTGGTGGTGG 8259.3


: guanosina (SEQ ID NO. 28)

APT-2039*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTNNTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 29) 8255.3

APT-2040*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTTNTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 30) 8251.3

APT-2041*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTTGNGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 31) 8276.3

APT-2042*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGNGGNGGTTGTGGNGGNGGNG G (SEQ ID NO. 32) 8296.3

APT-2043*: 5-F-desoxiuridina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGNGGTGGTTGTGGTGGNGGNG G (SEQ ID NO. 33) 8288.3

APT-2044: 5-F-desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGNGG (SEQ ID NO. 34) 8280.3

APT-2050: 2,,2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina NNGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGT GG (SEQ ID NO. 35) 8922.7

APT-2051: 2,,2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina NGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTG G (SEQ ID n.° 36) 8597.5

APT-2054: 2,,2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTTNTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 30) 8268

APT-2059: 2,,2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTNNTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 23) 6364.1

APT-2060: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGNTGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 37) 6368.1

APT-2061: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTNGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 38) 6368.1

APT-2062: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTTG NGGTGGTGG (SEQ ID NO. 39) 6368.1

APT-2063: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTNGNGGTGGTGG (SEQ ID NO. 40) 6389.1

APT-2064: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGTGGTTGTGGTGGNGG (SEQ ID NO. 41) 6389.1

APT-2065: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGNGGTTGTGGNGGTGG (SEQ ID NO. 42) 6389.1

APT-2066: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTNNTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 29) 8289.3

APT-2067: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTN GTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 43) 8293.3

APT-2068: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTTGNGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 31) 8293.3

APT-2069: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGTGGTGGTNGNGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 44) 8314.3

APT-2070: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGNGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO. 45) 8314.3

APT-2071: 2',2'-difluoro- desoxicitidina 2-desoxi- guanosina Timidina GGTGGNGGTGGTTGTGGTGGNGGTGG (SEQ ID NO. 46) 8314.3

APT-2072: 2',2'-difluoro- 2-desoxi- Timidina GGTGGTGGTTNTGGTGGTGGN 6668.3

5

10

15

20

25

: desoxicitidina guanosina (SEQ ID NO. 47)

APT-4001* (Control posit.): ' 2-desoxi- guanosina Timidina TTTGGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGT GG (SEQ. ID. NO. 48) 9185.01

APT-4002* (Control negat.): Timidina, 2'- desoxicitidina TTTCCTCCTCCTCCTTCTCCTCCTCCTC C(SEQ. ID NO. 49) 8504.5

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invencion.

Ejemplo 2: Smtesis de oligonucleotidos modificados

Cada oligonucleotido se diluyo en Tris-HCl a 10 mM (pH 7,4) para dar una concentracion final de 100 pM. La solucion diluida se coloco a 94 °C durante 5 minutos y a continuacion se coloco rapidamente en hielo y se dejo en el durante 5 minutos. Al resultante se le anadio KCl a 2 M para dar una concentracion final de 50 mM, se dejo a 60 °C durante 3 horas y despues se enfrio lentamente a temperature ambiente.

Ejemplo experimental 1: medicion de la apoptosis celular en las celulas cancerosas

Un dfa antes del experimento, en cada uno de los pocillos de una placa de 96 pocillos se inocularon 190 pl del cultivo, en donde la lmea de celulas PC-3 (celulas de cancer de prostata) estaba suspendida a una concentracion de 103-104/ml. Al dfa siguiente, se anadieron 10 pl de la solucion de oligonucleotido preparada en el ejemplo 1 y se cultivo durante seis dfas. Seis dfas despues de la inoculacion, la tasa de la apoptosis celular se midio por medio del metodo XTT [JSC 1999, 26369].

Como resultado, se confirmo que la tasa de apoptosis celular de APT-2001, APT-2002 y APT-2003 (que no son conforme a la invencion) era de 3 a 10 veces mas alta que la de APT-4001 (control positivo) y APT-4002 (control negativo) segun se midio en terminos de CI50 o CI90 (figura 2). Ademas, APT-2001, APT-2002 y APT-2003, incluso en una cantidad mas pequena que la de APT-4001 (control positivo), mostraron una actividad apoptosica celular superior (figura 3). Ademas, se observo que otros oligonucleotidos nuevos que se prepararon teman una excelente actividad apoptosica celular. De hecho, mostraron una excelente actividad apoptosica celular sobre diferentes lmeas de celulas cancerosas, entre ellas PC3, MCF7, HCT116, A549, A498, K562, MV-4-11, etc, lo que confirma que tienen un amplio espectro de actividad contra el cancer. En particular, tambien mostraron una excelente actividad contra el cancer contra MCF7-DX, una lmea de celulas resistente a los farmacos. La actividad apoptosica celular mencionada mas arriba se muestra en las tablas 2 a 7. Ademas, tambien se verifico la actividad apoptosica celular de los oligonucleotidos sobre celulas de LMC (leucemia mielogena cronica) K562 y LMA (leucemia aguda) MV-4-11. Los resultados se muestran en las figuras 4 y 5, respectivamente.

Tabla 2: PC3 (celulas de cancer de prostata)

SEQ ID n.°: CI50 (pM)

APT-2001*: 0,7

APT-2002*: 2,6

APT-2003*: 1,5

APT-2013*: 0,09

APT-2020*: 0,16

APT-2022*: 0,11

APT-2023*: 0,26

APT-2031*: > 10

APT-2032*: > 10

APT-2033*: > 10

APT-2034*: > 10

APT-2035: 0,035

APT-2054: < 0,3

APT-2059: 0,015

APT-2060: 0,04

APT-2061: 0,041

APT-2063: 0,022

APT-2064: 0,016

APT-2066: 0,034

APT-2070: 0,024

APT-2072: 0,012

APT-4001*: 4,3-7,4

APT-4002*: > 50

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invencion.

Tabla 3: MCF7-DX (celulas de cancer de mama)

SEQ ID n.°: CMpM)

APT-2001*: 0,2

APT-2002*: 0,6

APT-2013*: 0,66

APT-2020*: 0,89

APT-2022*: 0,79

APT-2023*: 1,86

APT-2031*: 1,5

APT-2032*: 3,6

APT-2033*: 3,3

APT-2034*: 1,2

APT-2035: 0,007

APT-2040*: > 1,0

APT-2042*: 0,5

APT-2043*: 0,6

APT-2044: > 1,0

APT-2054: < 0,3

APT-2059: 0,004

APT-2060: 0,023

APT-2061: 0,022

APT-2063: 0,008

APT-2064: 0,008

APT-2066: 0,01

APT-2067: 0,024

APT-2068: 0,023

APT-2069: 0,01

APT-2070: 0,013

APT-2071: 0,015

APT-4001*: > 30

APT-4002*: > 50

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invencion.

Tabla 4: MCF7 (celulas de cancer de mama)

SEQ ID n.°: CI50 (pM)

APT-2001*: 2,1

APT-2002*: 8,9

APT-4001*: 7,3

APT-4002*: NA

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invention.

5 Tabla 5: HCT116 (celulas de cancer colorrectal)

SEQ ID n.°: CI50 (pM)

APT-2001*: 0,4

APT-2002*: 2,1

APT-4001*: > 30

APT-4002*: > 50

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invention.

Tabla 6: A549 (celulas de carcinoma no microtitico)

SEQ ID n.°: CI50 (pM)

APT-2001*: 0,9

APT-2002*: 5,2

APT-4001*: 3,7

APT-4002*: > 50

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invencion.

10

Tabla 7: A498 (celulas de cancer de rinon)

SEQ ID n.°: CI50 (pM)

APT-2001*: <0,1

APT-2002*: <0,1

APT-4001*: 1,9

APT-4002*: > 50

* Senala los oligonucleotidos que no son conforme a la invencion.

Ejemplo experimental 2: confirmation de la formation del cuarteto de G

15 La formation de la estructura de cuarteto de G en los oligonucleotidos preparados en el ejemplo 1 de mas arriba se examino mediante el analisis por DC (dicrofsmo circular). Las soluciones de oligonucleotidos preparadas en el ejemplo 1 se diluyeron correspondientemente en el tampon de fosfato de potasio a 10 mM para dar una concentration final de 1 nM y se conservaron en un congelador. Cada oligonucleotido se diluyo en el tampon de fosfato de potasio a 10 mM para dar una concentration final de 100 pM para obtener una solution de 2 ml, y se

20 analizo mediante el analisis por DC (dicrofsmo circular). Se observaron los espectros de DC con el espectropolanmetro JARSCO J-810 a 20 °C en el margen de 320 nm a 220 nm, con una velocidad de escaneado de 100 nm/min, un tiempo de respuesta de 0,5 s, un ancho de banda de 2 nm y una longitud de paso de 1 cm.

Como resultado, se demostro que habfa un pico maximo a 264 nm y tambien se confirmo que mostraba el mismo espectro de DC que APT-4001, un control positivo que se sabe que forma la estructura de cuarteto de G.

De lo anterior, se confirmo que los oligonucleotidos modificados forman la estructura de cuarteto de G, como se describe en la tecnica relacionada sobre la formacion de la estructura de cuarteto de G (M. Lu, Q. Guo, N. R. 5 Kallenback, Biochemistry, 1992, 31, 2455; P. Balagurumoorthy, S. K. Brahmachari, Nucleic Acids Res., 1992, 20, 4061; Proc. Natl. Acad. Sci USA. 91, 1994, 7658-7662; Biochemistry. 1997, 36, 12498; Biochemistry. 2002, 41, 3676) [figuras 6 a 8].

Ejemplo experimental 3: prueba de toxicidad

La prueba de toxicidad se realizo como se describe a continuacion.

10 Cada uno de APT-2001, APT-2002 y APT-2003 (ninguno es conforme a la invencion) se disolvieron en dimetilsulfoxido (DMSO), se diluyeron con agua y a continuacion se administraron a ratones (10 ratones/grupo) en la cantidad de 1 g/kg. Los ratones se vigilaron durante los siguientes 7 dfas y se confirmo que todos los ratones sobrevivieron.

Ejemplo de preparacion 1: preparacion del lfquido de inyeccion

15 El lfquido de inyeccion que contiene 10 mg de APT-2001 se preparo como se describe a continuacion.

Se disolvieron en agua destilada 1 g de APT-2001 (no es conforme a la invencion), 0,6 g de cloruro de sodio y 0,1 g de acido ascorbico hasta dar un volumen final de 100 ml. La mezcla se anadio en un vial y se esterilizo por calentamiento a 20 °C durante 30 minutos.

(Formulacion del lfquido para inyeccion)

20 Ingrediente activo Cloruro de sodio Acido ascorbico Agua destilada

1 g

0,6 g 0,1 g

Cantidad adecuada

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un oligonucleotido modificado indicado por la secuencia nucleotfdica 'GxHyNz', en donde G es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 2-desoxiguanosina, guanosina, 2'-0-metilguanosina, 2'-F-guanosina, LNA (acido nucleico bloqueado)-guanosina, D-desoxiguanosina y D-guanosina; H es un acido nucleico exclusivo de

5 guanosina; N es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en 5-fluorodesoxicitidina, 5-fluorocitidina, 5- yododesoxicitidina, 5-yodocitidina, arabinosido de citosina/Ara-C, 2',2'-difluorodesoxicitidina/gemcitabina y capecitabina, en donde G, H, N se distribuyen al azar; x es un entero de 1 a 30, y es un entero de 0 a 30, z es un entero de 1 a 30, en donde la suma de (x + y + z) no es mayor que 60, en donde el oligonucleotido modificado se selecciona de las SEQ ID n.os 1, 2, 3, 4, 6, 7, 13, 18, 23, 24, 29, 30, 31, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 10 46, 47.
2. El oligonucleotido modificado de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde H es adenosina, citidina, uridina o timidina, y en donde la suma de (x + y + z) esta en el intervalo de 14 a 26, en donde el oligonucleotido modificado se selecciona de las SEQ ID n.os6, 7, 13, 18, 23, 24, 29, 30, 31, 34, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47.
3. Una composicion farmaceutica o su sal farmaceuticamente aceptable, que comprende como ingrediente 15 activo el oligonucleotido modificado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para prevenir o

tratar el cancer.