ES2340807T3 - Oligonucleotidos sinteticos utiles terapeuticamente. - Google Patents

Oligonucleotidos sinteticos utiles terapeuticamente. Download PDF

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Mario C. Filion
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Abstract

Una composición que comprende una secuencia aislada de nucleótidos fosfodiéster sintéticos 3''-OH, 5''-OH de la SEQ ID NO: 45:gggagg y que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

Oligonucleótidos sintéticos útiles terapéuticamente.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con una composición de oligonucleótidos para tratar el cáncer.
Antecedentes de la invención
El cáncer es una acumulación neta aberrante de células atípicas, que pueden resultar de un exceso de proliferación, una insuficiencia de muerte celular, o una combinación de las dos.
La proliferación es la culminación de una progresión de la célula durante el ciclo celular dando por resultado la división de una célula en dos células. Las 5 fases principales del ciclo celular son G_{0}, G_{1}, S, G_{2} y M. Durante la fase G_{0}, las células son inactivas. La mayoría de las células en el cuerpo, en cualquier momento, están en esta etapa. Durante la fase G_{1}, las células, que responden a las señales de división, producen el ARN y las proteínas necesarias para la síntesis del ADN. Durante la fase-S (SE, fase-S temprana; SM, fase-S media; y SL, fase-S tardía) las células replican su ADN. Durante la fase G_{2}, las proteínas se elaboran en la preparación para la división celular. Durante la fase (M) mitótica, la célula se divide en dos células hijas. Las alteraciones en la progresión del ciclo celular ocurre en todos los cánceres y puede resultar de la sobre expresión de los genes, la mutación de los genes reguladores, o abrogación del punto de inspección de daño del ADN (Hochhauser D. Anti-El cáncer Chemotherapeutic Agents 8:903, 1997).
Diferente de las células cancerosas, la mayoría de las células normales no pueden proliferar indefinidamente debido a un proceso llamado senectud celular. La senectud celular es una respuesta de muerte celular programada que conduce a la detención del crecimiento de células (Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995). La lesión del ADN, la exposición de células cancerosas del colon, pecho y ovarios en los inhibidores de toposiomerasa y exposición de células cancerosas nasofaríngeas al cisplatino se reportan para prevenir la proliferación de estas células por inducción de la senectud (Wang et al. El cáncer Res. 58:5019, 1998; Poele et al. Br. J. El cáncer 80:9, 1999).
Los oligonucleótidos sintéticos son secuencias polianiónicas que se internan en las células (Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994). Se reporta que los oligonucleótidos sintéticos se unen selectivamente a los ácidos nucleicos (Wagner, R. Nature: 372:333, 1994), a las proteínas celulares específicas (Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999) y a las proteínas nucleares específicas, para inhibir la proliferación de células cancerosas (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998).
Las secuencias sintéticas de 27 bases que contienen guanina (G) y cantidades variables de timina (T) (oligonucleótido GTn), en donde n es \geq1 o \leq7 y en donde el número de bases es \geq20 (Scaggiante et al. Eur. J. Biochem. 252:207, 1998), se reportan para inhibir el crecimiento del líneas de células cancerosas por el enlace específico de la secuencia a una proteína nuclear de 45 kDa, mientras el GTn, en donde el número de bases es \leq20, se reporta que es inactivo contra las líneas de células cancerosas (Morassutti et al. Nucleosides y Nucleotides 18:1711, 1999). Se reportan dos oligonucleótidos GT-ricos sintéticos de 15 y 29 bases con modificaciones aminoalquil 3', para formar G-cuartetos que se unen a la nucleolina y para inhibir la proliferación de líneas de células cancerosas (Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999). La TTAGGG-fosforotioato sintética de 6 bases, que tiene una secuencia idéntica a aquella de la secuencia repetida del telómero de mamífero, se describe para inhibir la proliferación de células de linfoma de Burkitt in vitro e in vivo (Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:189, 1997). Sin embargo, se describe que la TTAGGG-fosfodiester sintética de 6 bases, no tiene actividad anti-telomerasa (US Patent No: 5, 643,890).
La muerte celular se lleva a cabo por mediadores-inmunes que promueven la apoptosis, y por inductores de apoptosis que directamente inician las rutas que conducen a la muerte celular (Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997). La apoptosis es un proceso activo de muerte celular caracterizado por cambios morfológicos distintivos que incluye condensación de cromatina nuclear, contracción celular, desintegración nuclear, vesiculación de la membrana plasmática, y la formación de cuerpos apóptoticos unidos a la membrana (Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). Una característica típica molecular de la apoptosis es la degradación del ADN nuclear de las células en fragmentos de longitud oligonucleosomal como el resultado de la activación de las endonucleasas endógenas (Wyllie A. Nature 284:555, 1980).
Las caspasas (proteasas cisteina-aspartil-específicas) se han implicado como enzimas claves en la ejecución de la etapa tardía de la apoptosis. La familia caspasa consiste de al menos catorce proteasas aspartil cisteina relacionadas. Todas las caspasas contienen un motivo de sitio pentapéptido activo conservado QACXG (donde X es R, Q o G) (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997). Un número de caspasas se sintetizan como proenzimas inactivas que son activadas continuando con la división en los sitios de división específicos de la caspasa (Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997) o como enzimas inactivas que requieren de la asociación con moléculas reguladoras para la activación (Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999).
Además de su papel en la apoptosis, las caspasas se involucran en la activación y proliferación de los linfocitos B y T, en la maduración de la citoquina durante la inflamación, en la diferenciación de las células madre durante la eritropoyesis y en el desarrollo de fibras de lentes (Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000). Con respecto a los linfocitos B y T, la caspasa 3 se procesa durante la activación de los linfocitos B y de CD4 (+), CD8 (+), CD45RA (+) y CD45RO (+) subconjuntos de los linfocitos T (Alam et al. J. Exp. Med. 190:1879, 1999). Por otra parte, la estimulación de los linfocitos T por mitógenos y por la interleuquina-2 se asocia con la activación de la ruta de la caspasa y con la división de PARP (Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998). Con respecto a las citoquinas, la actividad de la caspasa 3 es necesaria para la liberación de IL-2 por los linfocitos T activados (Posmantur et al. Exp. Cell Res. 244:302, 1998) y para el proceso y maduración de la interleuquina-16 citoquina pro-inflamatoria (Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 1998). Con respecto a la eritropoyesis, la activación de la caspasa se involucra en la regulación de la eritropoyesis y se ha mostrado que modula GATA-1, una proteína reguladora nuclear crucial para la maduración de los precursores eritroides (De Maria, et al. Nature 401:489, 1999).
La citólisis es la destrucción completa o parcial de una célula y se media por el sistema inmune. Los macrófagos y monocitos activados producen moléculas bioáctivas que incluyen, pero no limitan a las citoquinas. Las citoquinas, incluyen, pero no limitan a, interleuquina (IL)-1, IL-1beta, IL-6, IL-10, IL-12, y TNF-alfa.
IL-1beta reduce la sensibilidad de la célula de la médula ósea a los fármacos citoreductivos, a la radiación y a la depuración de la célula del tumor in vitro con fármacos en transplante de médula ósea autólogo (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
IL-6 induce la diferenciación de la célula B, estimula la secreción de IgG (Taga et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987), induce la diferenciación de la célula T citotóxica (Lee et al. Vaccine 17:490, 1999), promueve la maduración del megacariocito (Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8953, 1989) y funcionan ambos como un factor anti-proliferativo (Mori et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993: Novick et al. Cytokine 4:6, 1992) y como un factor pro-proliferativo (Okamoto et al. Cancer Res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer Res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2: 1417, 1996) para las células cancerosas.
IL-10 mejora la efectividad de las vacunas en modelos de tumor murina (Kauffman et al. J. Immunother. 22: 489, 1999) y favorece la expresión de respuesta autoreactiva de la célula T anti-cáncer (Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995).
IL-12, sola y en combinación con otras citoquinas, promueve la maduración de los leucocitos e induce la secreción del interferón-gama. Se describe que IL-12 tiene actividad anti-cáncer (Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 19977 que incluye, pero no limita a, la activación de linfocitos-T citolíticos específicos, activación de las células destructoras naturales (NK) e inducción de las proteínas anti-angiogénicas IP-10 y MiG.
TNF-alfa causa necrosis de los tumores sólidos (Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991), sensibiliza las células cancerosas a la apoptosis inducida por la irradiación gama (Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999) y protege las células precursor de la médula ósea de los efectos de agentes antineoplásticos (Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
Sin embargo, la mayoría de las terapias anti-cáncer previas al oficio, están dirigidas a la inducción de la detención del ciclo celular, inhibición de la proliferación, inducción de la apoptosis o estimulación del sistema inmune, han probado ser menos que adecuadas para las aplicaciones clínicas. Muchas de estas terapias son ineficientes o tóxicas, tienen significantes efectos secundarios adversos, dan lugar al desarrollo de la resistencia de medicamentos o inmuno sensibilización, y se debilitan para el receptor.
Por consiguiente, existe una continua necesidad de composiciones novedosas y métodos que inducen la detención del ciclo celular en las células cancerosas, inhiben la proliferación de células cancerosas, activan las caspasas en las células cancerosas, inducen la apoptosis en las células cancerosas y estimulan la producción de la citoquina por las células del sistema inmune.
Resumen de la invención
La presente invención cumple a cabalidad esta necesidad proporcionando una composición y método que comprende un oligonucleótido sintético 3'-OH, 5'-OH de la SEQ ID NO: 45: gggagg y en donde la secuencia induce una respuesta seleccionada del grupo que consiste de la inducción de la detención del ciclo celular, la inhibición de proliferación, activación de caspasas y la inducción de apoptosis en las células cancerosas y la producción de citoquinas por las células del sistema inmune. Una composición que comprende la secuencia SEQ ID NO: 45 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra a un animal, que incluye un humano, que tiene cáncer en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en el animal. La inesperada y sorprendente habilidad de la secuencia para inducir la detención del ciclo celular, inhibe la proliferación, activa las caspasas e induce la apoptosis y en las células cancerosas y de estimular la producción de la citoquina por direccionamiento de las células del sistema inmune una necesidad no lograda experimentada durante un tiempo en los oficios médicos y proporciona un beneficio importante para los animales, incluyendo humanos.
Por consiguiente, un propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método efectivo para tratar una enfermedad en un animal, incluyendo un humano.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método efectivo para tratar el cáncer.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la senectud en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la detención del ciclo celular en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la detención del ciclo celular en las células cancerosas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que inhibe la proliferación de células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que inhibe la proliferación de células cancerosas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de Fas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de TNFR1.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de p53/p21.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de p21/waf-1/CIP.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de p15^{ink4B}.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de p16^{ink4}.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de la caspasa 3.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes del receptor TGF-beta 1.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de la dependencia hormonal.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que induce la apoptosis en las células cancerosas independientes de la resistencia de medicamentos.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que activa las caspasas en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que activa las caspasas en las células cancerosas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para tratar una enfermedad autoinmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para tratar una enfermedad linfoproliferativa.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para tratar una infección.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para tratar una inflamación.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para modular la activación de la célula T- o B-.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para modular la maduración de la célula madre.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para modular la eritropoyesis.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método para modular la transcripción de los factores en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que potencia el efecto de otros agentes terapéuticos en las células.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que potencia el efecto de agentes quimioterapéuticos en las células cancerosas.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que potencia el efecto antineoplástico de la radiación.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula la producción de la citoquina por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula producción de IL-1beta por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula la producción de IL-6 por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula la producción de IL-10 por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula la producción de IL-12 por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición y un método que estimula la producción de TNF-\alpha por las células del sistema inmune.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición que es simple de preparar.
Otro propósito de la presente invención es proporcionar una composición que es tóxica en forma mínima al receptor.
Estos y otros objetivos, características y ventajas de la presente invención serán aparentes después de una revisión de la siguiente descripción detallada de la modalidad revelada y las reivindicaciones anexas.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1. Fluorescencia [Fluo-3-AM] de células humanas de leucemia T Jurkat incubadas con 0 \mug/ml y 100 \mug/ml de la base 6 GT SEQ ID NO: 25 (comparación).
Fig. 2. Activación de la Caspasa 3 en células humanas de leucemia T Jurkat incubadas sin 0 \mug/ml y 100 \mug/ml de GT SEQ ID NOs: 66, 67, 81, 82 y 83 medida citométricamente (A) y colorimétricamente (B) (comparación).
Fig. 3. Activación de la caspasa en células humanas de leucemia T Jurkat. (A) Activación de la Caspasa 3 en las células incubadas con 0 \mug/ml y 100 \mug/ml de la base 6 GT SEQ ID NO: 25; (B) activación (a) de la Caspasa 7 y contenido de PARP (b) en las células incubadas con 0 \mug/ml y 100 \mug/ml de la base 6 GT SEQ ID NO: 25. (comparación).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona una composición que comprende una 3'-OH, 5'OH secuencia sintética nucleótido fosfodiéster de la SEQ ID NO: 45: gggagg
en donde la secuencia induce una respuesta seleccionada del grupo que consiste de la inducción de la detención del ciclo celular, la inhibición de proliferación, activación de las caspasas y la inducción de la apoptosis en las células cancerosas y la producción de citoquinas por las células del sistema inmune. Una composición que comprende la secuencia SEQ ID NO: 45 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se administra a un animal, incluyendo un humano, que tiene cáncer en una cantidad efectiva para tratar el cáncer en un animal, incluyendo un humano. La inesperada y sorprendente habilidad de la secuencia para inducir la detención del ciclo celular, inhibir la proliferación, inducir la apoptosis y activar las caspasas en las células cancerosas y estimular la producción de la citoquina por direccionamiento de las células del sistema inmune una necesidad no lograda experimentada durante un tiempo en los oficios médicos y proporciona un beneficio importante para los animales, incluyendo humanos.
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Según se utiliza aquí la palabra "secuencia" se refiere a un oligonucleótido sintético 3'-OH, 5'-OH de 2 a 20 bases que comprende las bases A, C, G y T.
Según se utiliza aquí, las abreviaciones "GT", "AG" "CG", "GG", "AGT" y "CGT" se refieren a las secuencias que comprenden las bases sintetizadas designadas en cualquier orden.
Según se utiliza aquí, la palabra "respuesta" se refiere a la inducción de la detención del ciclo celular, inhibición de proliferación, activación de caspasas e inducción de apoptosis, en las células cancerosas y a la estimulación de la producción de la citoquina por las células del sistema inmune.
Según se utiliza aquí, las frases "tratamiento terapéutico" y "cantidad efectiva a" se refieren a una cantidad de una secuencia efectiva para inducir la detención del ciclo celular, inhibir la proliferación, activar las caspasas e inducir la apoptosis en las células cancerosas y estimular la producción de la citoquina por las células del sistema inmune.
Según se utiliza aquí, las frases "modelo de tumor en suspensión" y "modelos de tumor sólido" se refieren a carcinomas o sarcomas primarios o secundarios.
Según se utiliza aquí, la frase "quimioterapéutico" es cualquier agente aprobado por una agencia reguladora de un país o un estado gubernamental o enumerado en la Farmacopea U.S u otras farmacopeas usualmente reconocidas para tratar el cáncer en un animal, incluyendo un humano.
Según se utiliza aquí, la palabra "antineoplástico" se refiere a la prevención del desarrollo, maduración, proliferación o dispersión de las células cancerosas.
Según se utiliza aquí, la palabra "potencializar" se refiere a un grado de sinergismo que es mayor que la actividad del aditivo de cada agente.
Según se utiliza aquí, la palabra "sinergismo" se refiere a la acción coordinada de dos o más agentes. La administración de una cantidad efectiva de la secuencia SEQ ID NO:45 de la presente invención a un animal, incluyendo un humano, es un tratamiento terapéutico que previene, trata o elimina una enfermedad que incluye, pero no limita a, cáncer, artritis reumatoide, desórdenes linfo-proliferativo y asma. Los cánceres incluyen, pero no limitan a, célula carcinoma escamosa, fibrosarcoma, carcinoma sarcoido, melanoma, cáncer mamario, cáncer pulmonar, cáncer colorectal, cáncer renal, osteosarcoma, melanoma cutáneo, carcinoma de célula basal, cáncer pancreático, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de ovarios, cáncer de próstata, leucemia, linfoma y metástasis derivados de estos.
La efectividad terapéutica de una secuencia se puede incrementar por métodos que incluyen, pero no limitan a, modificación química de la base, estructura de azúcar o fosfato, suplementar químicamente o amplificar biotecnológicamente las secuencias utilizando plásmidos bacterianos que contienen las secuencias apropiadas, formando complejos de las secuencias con vehículos biológicos o químicos o acoplando las secuencias a los ligandos o anticuerpos dirigidos al tipo de tejido o tipo de célula.
Las composiciones que contienen la secuencia SEQ ID NO: 45 y un vehículo farmacéuticamente aceptable se preparan llevando uniforme e íntimamente en asociación la secuencia y el vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen vehículos líquidos, vehículos sólidos o ambos. Los vehículos líquidos son vehículos acuosos, vehículos no acuosos o ambos e incluyen, pero no limitan a, suspensiones acuosas, emulsiones en aceite, emulsiones agua en aceite, emulsiones agua-en-aceite-en-agua, emulsiones de sitio-específico, emulsiones de larga-duración, emulsiones pegajosas, microemulsiones y nanoemulsiones. Los vehículos sólidos son vehículos biológicos, vehículos químicos o ambos e incluyen, pero no limitan a, sistemas de vector viral, partículas, micropartículas, nanopartículas, microesferas, nanoesferas, minibombas, extractos de pared celular bacteriana y polímeros naturales o sintéticos biodegradables o no-biodegradables que permiten la liberación sostenida de las secuencias. Los métodos utilizados para acomplejar una secuencia a un vehículo sólido incluyen, pero no limitan a, adsorción directa a la superficie del vehículo sólido; acoplamiento covalente a la superficie del vehículo sólido, tanto directamente como vía una fracción de enlace; y el acoplamiento covalente al polímero utilizado para hacer el vehículo sólido. Opcionalmente, una secuencia se puede estabilizar por la adición de polímeros no-iónicos o iónicos tales como polioxietilensorbitan monooleatos (Tweens) o ácido hialurónico.
Los vehículos acuosos preferidos incluyen, pero no limitan a, agua, solución salina y soluciones reguladoras farmacéuticamente aceptables. Los vehículos no-acuosos preferidos incluyen, pero no limitan a, un aceite mineral y un aceite neutral y mezclas de estos. Opcionalmente, los excipientes pueden ser incluidos independientemente del vehículo farmacéuticamente aceptable utilizado para presentar la secuencia a las células que responden. Estos excipientes incluyen, pero no limitan a, antioxidantes, soluciones reguladoras, y bacteriostáticos, y pueden incluir agentes de suspensión y agentes de espesamiento.
Secuencia SEQ ID NO: 45 puede ser administrada sola, o en combinación con otras modalidades terapéuticas que incluyen, pero no limitan a, agentes quimioterapéuticos, inmunoagentes terapéuticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirales o en combinación con terapia de radiación. Los agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no limitan a, anti-metabolitos, lesiones del ADN, desestabilización de microtúbulos, estabilización del microtúbulos, despolimerización de la actina, inhibición del crecimiento, inhibición de la topoisomerasa, inhibición de la HMG-CoA, inhibición de la purina, inhibición de la pirimidina, inhibición de la metaloproteinasa, inhibición de CDK, inhibición de angiogénesis y diferenciación de los agentes de mejora.
Las rutas de administración incluyen, pero no limitan a, oral, tópica, subcutánea, transdérmica, subdérmica, intra-muscular, intra-peritoneal, intra-vesical, intra-articular, intra-arterial, intra-venosa, intra-dérmica, intra-craneal, intralesional, intra-tumoral, intra-ocular, intra-pulmonar, intra-espinal, intra-prostática, colocación dentro de las cavidades del cuerpo, inhalación nasal, inhalación pulmonar, impresión en la piel y electrocorporación.
Dependiendo de la ruta de administración, el volumen por dosis es preferiblemente cerca de 0.001 a 100 ml por dosis, más preferiblemente cerca de 0.01 a 50 ml por dosis y la mayoría preferiblemente cerca de 0.1 a 30 ml por dosis. Preferiblemente, la cantidad de la secuencia administrada por dosis es de aproximadamente 0.001 a 100 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 a 10 mg/kg y la mayoría preferiblemente de aproximadamente 0.1 a 5 mg/kg. La secuencia SEQ ID NO: 45 o la secuencia plus un agente terapéutico se puede administrar en un tratamiento de dosis única, en tratamientos de dosis múltiples o en infusión continua en un horario y durante un periodo de tiempo apropiado a la enfermedad que se trata, la condición del receptor y la ruta de administración. Por otra parte, la secuencia se puede administrar antes, al mismo tiempo que, o después de la administración del agente terapéutico.
La secuencia SEQ ID NO: 45 en combinación con un agente quimioterapéutico se administra a un animal que tiene cáncer en una cantidad efectiva para potenciar el efecto anti-neoplástico del agente quimioterapéutico. Preferiblemente, la cantidad de agente terapéutico administrado por dosis es de aproximadamente 0.001 a 1000 mg/m^{2} o de aproximadamente 0.01 a 1000 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0.01 a 500 mg/m^{2} o de aproximadamente 0.01 a 500 mg/kg y la mayoría preferiblemente de aproximadamente 0.1 a 100 mg/m^{2} o de aproximadamente 0.1 a 100 mg/kg. La secuencia particular y el agente terapéutico particular administrado, la cantidad por dosis, el horario de dosis y la ruta de administración se debe decidir por el practicante utilizando métodos conocidos por aquellos de habilidad en el oficio y dependerá del tipo de cáncer, la severidad del cáncer, la localización del cáncer y otros factores clínicos tales como el tamaño, peso y condición física del receptor. Además, se pueden emplear ensayos in vitro opcionalmente para ayudar a identificar los rangos óptimos para la administración de la secuencia y para la administración de la secuencia más el agente terapéutico.
Aunque no quiere ser unido por la siguiente hipótesis, se piensa que la secuencia SEQ ID NO: 45 de la presente invención pertenece a una nueva familia de estructuras y que no funciona como ARN antisentido, ADN, ADN que forma una triple hélice, inhibidor de la telomerasa, activador de la transcripción o inhibidor de la transcripción.
Los siguientes ejemplos además servirán para ilustrar la presente invención sin, al mismo tiempo, sin embargo, constituir ninguna limitación de estos.
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Ejemplo 1 Preparación de la secuencias
Las secuencias fosfodiéster y fosforotioato se prepararon HUKABEL Scientific Ltd, (Montréal, Québec, Canada) utilizando el sistema de síntesis del ADN EXPEDITE^{TM} 8900 automatizado (PersSeptive Biosystems, Inc., Farminghan, MA) y Sigma-Genosys (Woodlands, TX) utilizando Abacus Segmented Synthesis Technology. A menos que se indique de otra manera, la secuencias utilizadas eran secuencias fosfodiéster. A menos que se indique de otra manera, inmediatamente previo al uso, la secuencias se dispersaron en agua desionizada esterilizada en autoclave o en una solución reguladora farmacéuticamente aceptable esterilizada en autoclave tal como, pero no limita a, solución salina.
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Ejemplo 2 Células y reactivos
Todas las líneas celulares se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) y se cultivaron en el medio recomendado por la ATCC. La tabla 1 muestra las líneas celulares, sus orígenes y sus propiedades.
TABLA 1
1
Las células se sembraron en microplacas de fondo plano de 6 (1 ml/pozo), 24 (0.5 ml/pozo) o 96 (0.1 ml/pozo) pozos y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO_{2}. A menos que se indique de otra manera, 2.5 X 10^{5} células/ml se incubaron con 0 \mug/ml (control) y 100 \mug/ml (tratado) de secuencias de 2 a 45 base que contienen A, C, G y T por 48 h.
Ejemplo 3 Medición de la proliferación celular
La proliferación celular se midió utilizando reducción de dimetiltiazol-difeniltetrazolio (MTT) (Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983). MTT se midió a una longitud de onda de 570 nm utilizando un lector espectrofotométrico multiplaca (ELX800, Bio-TEK Instruments Inc., Winooski, VT).
Ejemplo 4 Inhibición de la proliferación de célula T de leucemia humana Jurkat
Las células T de leucemia humana Jurkat son un modelo de célula neoplásica de suspensión humana resistentes a multifármaco atípico. Las células Jurkat se incuban con secuencias GT y CT de 27 bases (Tabla 2).
TABLA 2 (para comparación)
3
4 
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Como se muestra en la Tabla 2, la proliferación de célula T Jurist se inhibe por las secuencias GT probadas, pero no por la secuencia CT probada.
Las células T Jurkat se incuban con secuencias GT de 3, 6, 9, 12, 14, 15, 18, 21 y 24 bases (Tabla 3).
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TABLA 3 (para comparación)
5
6
Como se muestra en la Tabla 3, las secuencias GT de 3, 6, 9, 12, 14, 15 y 18 bases inhiben la proliferación de célula T Jurkat tan efectivamente como las secuencias GT de 21 y 24 bases.
Las células T Jurkat se incuban con secuencias GT, AG, CG, GG, AGT y CGT de 6 bases (Tabla 4)
TABLA 4
7
8
Como se muestra en la Tabla 4, las secuencias GT de 6 bases inhiben la proliferación de célula T Jurkat. La GT SEQ ID NO: 25 inhibe 60% de la proliferación y la AGT SEQ ID NO: 49 inhibe 45% de la proliferación. La comparación de la potencia relativa de la GT SEQ ID NO: 25 y AGT SEQ ID NO: 49 utilizando el Software PHARM/PCS-4 (Microcomputer Specialists, Philadelphia, PA) muestra que la potencia de la GT SEQ ID NO: 25 es 3.4 veces aquella de la AGT SEQ ID NO: 49. Se reporta que la AGT SEQ ID NO: 49-fosforotioato inhibe la actividad de telomerasa e induce apoptosis en células de linfoma Burkitt (Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144: 189, 997).
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Para determinar la actividad de telomerasa, los extractos de 2 x10^{5} células T Jurkat se ensayan utilizando el protocolo de amplificación de repetición telomérica PCR (TRAP) (Roche, Laval, Québec, Canadá). En concentraciones entre 1 y 100 \mug/ml, la GT SEQ ID NO: 25-fosfodiéster muestra entre 0 y 10% de actividad de anti-telomerasa, mientras que la AGT SEQ ID NO: 49-fosforotioato muestra entre 30 y 75% de actividad de anti-telomerasa. La GT SEQ ID NO: 25-fosforotioato y la GT SEQ ID NO: 49-fosfodiéster no muestran alguna actividad anti-telomerasa.
Las células T Jurkat se incuban con secuencias GT de 2, 3, 4, 5, 6 y 7 bases (Tabla 5).
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TABLA 5
9
10
Como se muestra en la Tabla 5, las secuencias GT de 2, 3, 4, 5, 6 y 7 base inhiben la proliferación de célula T Jurkat.
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Ejemplo 5 Inhibición de la proliferación de célula de leucemia promielocítica humana HL-60
Las células de leucemia promielocítica HL-60 son un modelo de tumor humano de suspensión mutado p53. Las células HL-60 se incuban con secuencias GT de 6 bases (Tabla 6).
TABLA 6
11
12
Como se muestra en la Tabla 6, las secuencias GT de 6 bases inhiben la proliferación de célula HL-60.
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Ejemplo 6 Inhibición de la proliferación de células humanas de cáncer de mama MCF-7
Las células humanas de cáncer de mama MCF-7 son un modelo de tumor sólido humano dependiente de estrógeno, de caspasa 3 negativa. Las células MCF-7 (5 x 10^{5} células/ml) se incuban con secuencias GT de 3 y 6 bases (Tabla 7).
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TABLA 7
13 
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Como se muestra en la Tabla 7, las secuencias GT de 6 y 7 bases inhiben la proliferación de célula MCF-7.
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Ejemplo 7 Inhibición de la proliferación de células humanas de cáncer de próstata PC-3
Las células de cáncer de próstata PC-3 son un modelo de tumor sólido humano independiente de andrógeno, mutado p53. Las células PC-3 (5 x 10^{5} células/ml) se incuban con secuencias GT de 3 y 6 bases (Tabla 8).
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TABLA 8
14
Como se muestra en la Tabla 8, las secuencias GT de 3 y 6 bases inhiben la proliferación de célula PC-3.
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Ejemplo 9 Inhibición de la proliferación de células humanas de cáncer de próstata LNCaP
Las células de cáncer de próstata LNCaP son un modelo de tumor sólido humano metastásico, independiente de andrógeno, de receptor TGF-beta 1 negativo, las células LNCaP (5 x 10^{5} células/ml) se incuban con secuencias GT de 6 bases (Tabla 9).
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TABLA 9
15
Como se muestra en la Tabla 9, las secuencias GT de 6 bases inhiben la proliferación de célula LNCaP.
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Ejemplo 9 Inhibición de la proliferación de célula de leucemia monocítica aguda humana THP-1
Las células de leucemia monocítica aguda THP-1 son un modelo de tumor de suspensión humano nulas p53. Las células THP-1 (1.6 X 10^{6} células/ml) se incuban con secuencias GT de 6 bases (Tabla 10).
TABLA 10
16
Como se muestra en la Tabla 10, las secuencias GT de 6 bases inhiben la proliferación de célula THP-1.
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Ejemplo 10 Inhibición de la proliferación de célula humana de cáncer de ovario OVCAR-3
Las células de cáncer de ovario OVCAR-3 son un modelo de tumor sólido humano metastásico, p21/waf-1/Cip eliminado, p53 mutado. Las células OVCAR-3 (5 x 10^{5} células/ml) se incuban con secuencias GT de 2, 6 y 18 bases y con una secuencia AGT de 6 bases (Tabla 11).
TABLA 11
17
Como se muestra en la Tabla 11, las secuencias GT de 2, 6 y 18 bases y una secuencia AGT de 6 bases inhiben la proliferación de de célula OVCAR-3.
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Ejemplo 11 Inhibición de la proliferación de célula humana de cáncer de ovario SK-OV-3
Las células de cáncer de ovario SK-OV-3 son un modelo de tumor sólido humano metastásico, p15ink4B eliminado, p16ink4 eliminado, p21/waf-1/Cip eliminado, p53 mutado. Las células SK-OV-3 (5 x 10^{3} células/ml) se incuban con secuencias GT de 2, 6 y 18 bases (Tabla 12).
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TABLA 12
19
Como se muestra en la Tabla 12, las secuencias GT de 2, 6 y 18 bases inhiben la proliferación de célula SK-OV-3.
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Ejemplo 12 Inhibición de la proliferación de células mediante secuencias de fosfodiéster y fosforotioato
Se ha reportado que la modificación de secuencias de fosfodiéster naturales mediante sustitución de un átomo de azufre por un átomo de oxígeno no puenteado en uno o más de los grupos fosfato incrementa la estabilidad de secuencias de oligonucleótido a endonucleasas en fluidos biológicos y células (Crooke et al. Anticancer Drugs 6: 609,1991).
Las células T de leucemia humana Jurkat (Tabla 13), células de cáncer de próstata humanas LNCaP (5 x 10^{5} células/ml) (Tabla 14) y células humanas de cáncer de mama MCF-7 (5 x10^{5} células/ml) (Tabla 15) se incuban con secuencias GT de 6 bases, que tienen ya sea oxígeno (fosfodiéster) o azufre (fosforotioato) como un átomo no puenteado en el grupo fosfato.
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TABLA 13
20
21 
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TABLA 14
22 
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TABLA 15
23 
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24
Como se muestra en las Tablas 13, 14 y 15, las secuencias GT-fosfodiéster de 6 bases inhiben la proliferación de células Jurkat T, LNCaP y MCF-7 más efectivamente que las secuencias GT-fosforotioato de 6 bases.
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Ejemplo 13 Inhibición de la proliferación de células mediante secuencias de fosfodiéster y fosforotioato mezcladas
Las células T de leucemia humana Jurkat (Tabla 16) y células humanas de cáncer de mama MCF-7 (5 x 10^{5} células/ml) (Tabla 17) se incuban con la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, en donde ya sea el oxígeno (fosfodiéster) o azufre (fosforotioato) es el átomo no puenteado en el grupo fosfato.
TABLA 16
25 
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26 
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TABLA 17
27
Como se muestra en las Tablas 16 y 17, la sustitución de un átomo de azufre por un átomo de oxígeno no puenteado en uno o más grupos fosfato de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases resulta en una disminución significativa en la inhibición de proliferacón de célula Jurkat T y MCF-7.
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Ejemplo 14 Inhibición de la proliferación de célula de cáncer de murino
Las células T de linfoma de murino EL-4 son un modelo de tumor de suspensión. Las células T de linfoma de murino EL-4 se incuban con secuencias GT de 6, 18, 27 y 33 bases y con una secuencia ACG de 15 bases (Tabla 18).
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TABLA 18
28
Como se muestra en la Tabla 18, las secuencias GT de 6, 18, 27 y 33 bases y una secuencia ACG de 15 bases no inhibe la proliferación de célula de murino EL-4.
Las células B de leucemia de murino A20 son un modelo de tumor de suspensión. Las células B de leucemia de murino A20 se incuban con secuencias GT de 6 bases (Tabla 19).
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TABLA 19
29
Como se muestra en la Tabla 19, las secuencias GT de 6 bases inhiben la proliferación de células de leucemia B de murino A20.
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Ejemplo 15 Inhibición de la proliferación de célula de cáncer de canino
Las células de osteosarcoma de canino D-17 y células de cáncer de glándula mamaria de canino CF-51 son modelos de tumor sólido. Las células de osteosarcoma de canino D-17 (5 x 10^{5} células/ml) (Tabla 20) y las células de cáncer de glándula mamaria de canino CF-51 (5 x 10^{5} células/ml) (Tabla 21) se incuban con secuencias GT de 6, 9, 17, 27 y 33 bases y con una secuencia ACG de 15 bases.
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TABLA 20
30 
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Como se muestra en las Tablas 20 y 21, las secuencias GT de 6, 9, 17, 27 y 33 bases y una secuencia ACG de 15 bases inhiben la proliferación de ambas células de canino D-17 y CF-51.
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Ejemplo 16 Inhibición de la proliferación de célula de cáncer
La inhibición de la proliferación de células de cáncer humanas, de murino y de canino mediante GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases se resume en la Tabla 22.
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TABLA 22
31 
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Como se muestra en la Tabla 22, las células de cáncer humanas son más sensibles que las células de cáncer de canino y células de cáncer de murino para la inhibición de la proliferación mediante GT SEQ ID NO: 25 6 bases.
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Ejemplo 17 Efecto sinérgico de dos secuencias GT de 6 bases en la inhibición de proliferación
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con concentraciones subóptimas (5.0 \mug/ml) de secuencias GT de 6 bases (Tabla 23).
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TABLA 23
33 
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Como se muestra en la Tabla 23, el uso simultáneo de dos secuencias GT de 6 bases tiene un efecto sinérgico en la inhibición de la proliferación de célula T Jurkat.
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Ejemplo 18 Potenciación del efecto antineoplásico de fármacos quimioterapéuticos
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con 1.0 \mug/ml de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases y de GT SEQ ID NO: 1 de 27 bases en la presencia de 0, 0.1, 1.0 o 10.0 \mug/ml de 5-fluorouracilo o cisplatina (Tabla 24). El 5-fluorouracilo es un antimetabolito que interfiere con la síntesis del ADN y ARN. La cisplatina es un agente de alquilación que reticula el ADN e inhibe los precursores de ADN.
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TABLA 24
35 
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Como se muestra en la Tabla 24, la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases y la GT SEQ ID NO: 1 de 27 bases potencian el efecto antineoplásico de .0.1 y 1.0 \mug/ml de 5-fluorouracilo en la proliferación de célula T Jurkat y Sla EQ ID NO: 25 GT potencia el efecto antineoplásico de 0.1 y 1.0 \mug/ml de cisplatina en la proliferación de célula T Jurkat.
Las células humanas de cáncer de mama MCF-7 (5 X 10^{5} células/ml) se incuban con 1.0 \mug/ml de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases y de GT SEQ ID NO: 1 de 27 bases en la presencia de 0, 0.1, 1.0 o 10.0 \mug/ml de 5-fluorouracilo o tamoxifen (Tabla 25). El tamoxifen es un antagonista de estrógeno.
TABLA 25
36
Como se muestra en la Tabla 25, la SEQ ID NO: 25 de 6 bases potencia el efecto antineoplásico de 0.1 \mug/ml de 5-flurouracilo y de 0.1 \mug/ml tamoxifen en la proliferación de célula MCF-7. La SEQ ID NO: 1 de veintisiete bases no potencia la actividad antineoplásica de 5-fluorouracilo o de tamoxifen en la proliferación de célula MCF-7.
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Ejemplo 19 Inhibición de la proliferación mediante repeticiones de SEQ ID NO: 25 GT de 6 bases
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con 1, 2, 3 y 4 repeticiones de GG(GT)_{1}GG(SEQ ID NO: 25) de 6 bases (Tabla 26).
TABLA 26
37
Como se muestra en la Tabla 26, la inhibición de la proliferación de célula T Jurkat es 60% con GT SEQ. ID NO: 25 de 6 bases y disminuye con GT SEQ ID NO: 69 de 12 bases, GT SEQ ID NO: 69 de 18 bases y GT SEQ ID NO: 70 de 24 bases. La temperatura de fusión (Tm) de la GT SEQ TD NO: 25 de 6 bases es 2.5ºC e incrementa a 56.8ºC con GT SEQ ID NO: 69, a 76.3ºC con GT SEQ ID NO: 69 y a 86.3ºC con GT SEQ ID NO: 70.
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Ejemplo 20 Inhibición de la proliferación Mediante secuencias derivadas de Bacillus Calmetteguerin (BCG)
Se reporta que las secuencias derivadas de BCG inhiben el crecimiento de tumor in vivo (Kataoka et al Jpn. J. Cancer Res. 83: 244, 1992). Adicionalmente, se reporta que el A-2 (SEQ ID NO: 72) y BCO A-4 (SEQ ID NO: 74), cuando se premezclan con células IMC y se inyectan en ratones CDF-1, inhiben el crecimiento de tumor IMC al 88% y 37% respectivamente.
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con secuencias de 45 bases derivadas de BCG (tabla 27).
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TABLA 27 (para comparación)
38 
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Como se muestra en la Tabla 27, las secuencias derivadas de BCG inhiben la proliferación de célula T Jurkat \leq 24%.
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Ejemplo 21 Inducción de detención del ciclo celular
Se determina la etapa de ciclo celular utilizando un equipo comercial CYCLETEST^{TM} PLUS DNA (Becton Dickinson). Brevemente, los núcleos de las células se obtienen al disolver la membrana celular en un detergente no iónico, eliminar el citoesqueleto de la célula y las proteínas naturales con tripsina, digerir el ARN celular con RNasa y estabilizar la cromatina nuclear con espermina. Se agrega yoduro de propicio a los núcleos celulares y se analiza su fluorescencia en un citómetro de flujo equipado con capacidad de discriminación de doblete electrónico (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, CA). La acumulación de células en fases G_{0}/G1, temprana S (SE), media S (SM), última S (SL) o fase G_{2}/M del ciclo celular se analiza utilizando software MODFIT LT (Verity Software House Inc., Topsham, MA).
Las células T de leucemia humana Jurkat (Tabla 28) y las células humanas de cáncer de mama MCF-7 (5 X 10^{5} células/ml) que crecen exponencialmente (Tabla 29) se incuban durante 24 h con secuencias de 2, 6, 15,18, 27 y 45 bases que contienen A, C, G y T. Las células se recolectan y se centrifugan y se determina la etapa de ciclo celular.
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TABLA 28
39
40 
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Como se muestra en la Tabla 28, en las células T Jurkat, las secuencias GT de 2, 6 y 27 bases inducen la detención en la fase SE del ciclo celular, las secuencias CG y AGT de 6 bases, GT de 18 bases y BCG A-1 de 45 bases inducen la detención en la fase SM del ciclo celular y una secuencia AG de 6 bases induce la detención en la fase G_{0}/G_{1} del ciclo celular.
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TABLA 29
41
Como se muestra en la Tabla 29, en las células MCF-7, secuencias GT de 2 y 6 bases inducen la detención en la fase SE del ciclo celular, una secuencia AGT de 6 bases y una secuencia GT de 18 bases inducen la detención en la fase SM del ciclo celular.
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Ejemplo 22 Inducción de la detención del ciclo celular mediante SEQ ID NO: 25 GT. SEQ ID NO: 79 AC y SEQ ID NO: 25 GT + SEQ ID NO: 79 AC
Las células T de leucemia de célula humana Jurkat (1 X 10^{6} células/ml) se incuban durante 24 h con GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases complementarias y la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases. GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC se hibridan al mezclar los oligonucleótidos (1: 1) y al calentar durante 10 minutos a 65ºC. Como controles, la GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC se calientan durante 10 minutos a 65ºC (Tabla 30).
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TABLA 30
42
Como se muestra en la Tabla 30, la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases induce la detención al fin de la fase SE del ciclo celular, mientras que la SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases complementaria no tiene efecto en el ciclo celular. La hibridación de la GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC neutraliza por la GT SEQ ID NO: 25 inducción de la detención del ciclo celular. Estos datos demuestran que son efectivos, las secuencias de la presente invención podrían ser monocatenarias.
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Ejemplo 23 Inducción de apoptosis
La redistribución de fosfatidilserina en la membrana de plasma y liberación de la proteína de matriz nuclear (NuMA) son características de las células que experimentan apoptosis (Martin et al. J. Exp. Med., 182: 1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15: 1042,1993).
La redistribución de la fosfatidilserina en la membrana de plasma durante la apoptosis se mide mediante citometría de flujo utilizando una anexina V conjugada con FITC (BD Pharmingen, San Diego, CA). La liberación de NuMA en el sobrenadante se determina utilizando un equipo ELISA comercial (Oncogen/Calbiochem, Cambridge, MA).
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con 50 \mum de secuencias GT de 3.4, 5, 6 y 7 bases, una secuencia ACGT de 5 bases, secuencias de AG, GG, AGT y CGT 6 bases y una secuencia GG de 7 bases. La Tabla 31 muestra el % de células en apoptosis (positivo para teñido con fosfatidil-serina/anexina V (PS/A-V)) y % de NuMA liberado de las células.
TABLA 31
43
Como se muestra en la Tabla 31, las secuencias GT, AG, CG y AGT de 3, 4, 5, y 6 bases inducen apoptosis de las células T Jurkat. Las secuencias ACGT de cinco bases y CGT y GG de 6 bases no inducen apoptosis de células T Jurkat.
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Ejemplo 24 Incremento en el calcio intracelular (Ca^{2+})_{i}
Se reporta que los incrementos en el calcio intracelular (Ca^{2+})_{i} están asociados con la inducción de apoptosis (Lam et al. Mol. Endocrinol. 7: 686, 1993). El (Ca^{2+})_{i} se sigue utilizando la prueba fluorescente Fluo-3-AM (Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., Eugene, OR). Un incremento en la fluorescencia Fluo-3-AM es indicativo de un incremento en (Ca^{2+})_{L}
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban durante 24 h con SEQ. NO: 25 GT de 6 bases. Las células se recolectan mediante centrifugación, se suspenden en PBS que contiene 1% de FBS y se cargan con 10 \mum de Fluo-3-AM durante 1 h a 37ºC. Se mide la fluorescencia celular a 488 am de excitación y 530 nm de emisión (detector FL1). Los datos se analizan en un FACSCALIBUR utilizando el programa CellQUEST (Becton Dickinson).
Como se muestra en la Figura 1, la incubación de las células T Jurkat con la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases origina un 88% de incremento en la fluorescencia celular, indicativo de un incremento en (Ca^{2+})_{i}.
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Ejemplo 25 Inducción de apoptosis
La apoptosis se puede iniciar mediante ligandos que unen a los receptores de superficie celular que incluyen, pero no se limitan a, Fas (CD95) y factor de necrosis de tumor (TNF). Ligando Fas que se une a Fas y TNF que se une al receptor TNF 1 iniciando la señalización intracelular que resulta en la activación de proteasas de aspartil cisteína (caspasas). Las caspasas inician la cascada proteolítica letal de ejecución de apoptosis asociada con fragmentación de ADN nuclear, liberación de proteínas de matriz nuclear (NuMA) y pérdida de contacto e sustrato celular.
Las células T de leucemia humana Jurkat (1 x 106/ml) se incuban con secuencias GT de 6 y 27 base (Tabla 32).
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TABLA 32
44 
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Como se muestra en la Tabla 32, el % de liberación de NuMA con la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases es mayor que el % de liberación NuMA con GT SEQ ID NOs: 1, 2, 3 y 4 de 27 bases.
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Ejemplo 26 Inducción de apoptosis por la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases y la SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases
Las células T de leucemia de célula humana Jurkat se incuban durante 24 h con GT SEQ ID NO: 25 6 bases, SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases complementaria, y GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + SEQ ID NO: 79 AC de 6 bases. La GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC se hibridan al mezclar las secuencias (1: 1) y calentar durante 10 minutos a 65ºC. como controles, la GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC se calientan durante 10 minutos a 65ºC (Tabla 33). Se evalúa la apoptosis como en el Ejemplo 23.
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TABLA 33
45 
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Como se muestra en la Tabla 33, la GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases induce apoptosis de células T Jurkat, mientras que la SEQ ID NO: 79 AC complementaria no tiene efecto en la apoptosis. Más aún, la hibridación de la GT SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 79 AC neutralizan la inducción de apoptosis por SEQ ID NO: 25 GT. Estos datos muestran que para ser efectivas, las secuencias de la presente invención deben ser monocatenarias.
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Ejemplo 27 Inhibición de proliferación, detención de ciclo celular y inducción de apoptosis mediante secuencias ricas en GT- y AC-derivadas de Mycobacterium phlei
Las células T de leucemia humana Jurkat se incuban con secuencias ricas en GT o AC derivadas del gen de Mycobacterium phlei (GenBank: Número de Acceso X99776). La inhibición de la proliferación se mide mediante la reducción de MTT como en el Ejemplo 3, la detención del ciclo celular se detecta mediante citometría de flujo utilizado yoduro de propicio como en el Ejemplo 21 y se evalúa la apoptosis mediante citometría de flujo utilizando anexina-V-FITC como en el Ejemplo 23.
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TABLA 34 (para comparación)
46
47 
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Como se muestra en la Tabla 34, las SEQ ID NOs: 81, 82 y 83, ricas en GT, inhiben la proliferación de, detención del ciclo celular inducido en y apoptosis de células T Jurkat inducidas, mientras que la SEQ ID NO: 15; rica en AC, no inhibe la proliferación de, induce detención del ciclo celular en o induce apoptosis de células T Jurkat.
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Ejemplo 28 Modulación de la activación caspasa mediante secuencias GT
Las caspasas reconocen las tres secuencias principales de sustratos de péptidos: 1) Tyr-Val-Ala-Asp (YVAD, caspasa-1, -4 y -5)(SEQ ID NO:84); 2) Asp-Glu-Val-Asp (DEVD, caspasa-2, -3 y -7) (SEQ ID NO:85); y, 3) Ile-(Leu)-Glu-X-Asp (I (L) EXD; caspasa-8 y -10) (SEQ ID NO:86) (Thornberry et al. J. Biol. Chem. 272:17907, 1997). El reconocimiento de secuencias en un objetivo de proteína resulta en una proteólisis específica y limitada del objetivo, en un primer ejemplo, la modulación de activación de caspasa 7 por caspasa 3 o, con un segundo ejemplo, la degradación de objetivos de proteína estructurales se incluyen, pero no se limitan, a láminas, como en un tercer ejemplo, la activación de enzimas incluyen, pero no se limitan a, PARP.
Construcciones de secuencia NH_{2}-XXXD-COO-GT se generan por conjugación química de una secuencia GT químicamente protegida o de una secuencia AC químicamente protegida para un péptido químicamente protegido seleccionado del grupo que consiste de NH_{2}-YVAD-COOH (SEQ ID NO:84), NH_{2}-DEVD-COOH (SEQ ID NO:85) y NH_{2}-IEGD-COOH(SEQ ID NO:87) utilizando un oligonucleótido sintetizado con un brazo separador amida 5'-C2 y técnicas de conjugación de carboheximida soluble en agua de amida-carboxilo estándar (Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sci. Appl. 706: 149, 1998). Los grupos amina reactivos y carboxilato reactivos se protegen luego de la conjugación.
Las construcciones de secuencia de péptido-GT (en adelante PGT) incluyen, pero no se limitan, NH2-YVAD-COO-GT; NH2-DEVD-COO-GT; y, NH2-I (L) EXD-COO-GT se dividen en la función carboxilato en la función entre la secuencia D y GT mediante enzimas que incluyen, pero no se limitan a, caspasas, encimas asociadas con metástasis de cáncer, colagenasa y metaloproteinasas. Tales resultados tal división resuelta en la liberación de la secuencia GT que activa caspasa desde el PGT. El incremento resultante en la actividad de caspasa intracelular puede, por ejemplo, mejorar el efecto terapéutico de agentes quimioterapéuticos en células neoplásicas resistentes a multifármacos o la respuesta inmunológica a estímulos antigénicos débiles.
Para determinar la activación de la caspasa, se lavan células de control y células tratadas, se fijan, se permeabilizan e incuban con un anticuerpo conjugado FITC que reconoce la forma activa de la caspasa (Pharmingen, San Diego, CA) utilizando las condiciones recomendadas por el fabricante. La fluorescencia asociada con la caspasa 3 activa se analiza mediante citometría de flujo en un FACSCALIBUR utilizando el programa CellQUEST (Becton Dickinson). Alternativamente, la activación de la caspasa, se determina colorimétricamente.
Utilizando un ensayo basado en la división de un péptido específico de caspasa conjugado con la molécula indicadora de color p-nitroanilida, que se puede cuantificar espectrofotométricamente en una longitud de onda de 405 NM.
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Ejemplo 29
(Para comparación)
Activación de caspasa 3 mediante la GT SEQ ID NOs: 66, 81, 82 y 83 y mediante la secuencia AGC SEQ ID NO: 67
Se incuban células de leucemia, las células T Jurkat durante 72 H con GT SEQ ID NO: 66 de 33 bases; GT SEQ ID NO: 81 de 11 bases (bases 1-11 de la GT SEQ ID NO: 66), GT SEQ ID NO: 82 de 11 bases (bases 12-22 de GT SEQ ID NO: 66), GT SEQ ID NO: 83 11 de base (bases 23-33 de GT SEQ ID NO: 66) y ACG SEQ ID NO: 67 de 15 bases. La caspasa 3 activa (17-22 kDa) se determina utilizando anticuerpo FITC conjugado (Clon: C92-605) como en el ejemplo 28.
Como se muestra en la figura 2 A, la GT SEQ ID NO: 66 de 33 bases y GT SEQ ID NOs: 81, 82 y 83 de 11 bases, cada una inducen procesamiento de procaspasa 3 inactiva para activar caspasa 3, mientras que la ACG SEQ ID NO: 67 de 15 bases no induce el procesamiento de una procaspasa 3 inactiva para activar la caspasa 3.
También se determina la activación de la caspasa 3 colorimétricamente como en el ejemplo 28. Como se muestra en la figura 2b, la actividad de la caspasa 3 en GT SEQ ID NO: 66 de 33 bases y GT SEQ ID NOs: 81, 82 y 83 de 11 bases, las células tratadas fueron 105%, 73%, 100% y 60% mayores que aquellas en las células de control, aunque en la ACG SEQ ID NO: 67 de 15 bases la activación de la caspasa 3 en células tratadas fue aproximadamente igual que en las células de control.
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Ejemplo 30 Activación de la actividad de la caspasa 3 por la GTSEQ ID NO: 25 de 6 bases
Se incuban células de leucemia, células T Jurkat durante 72 H con GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases. La activación de la caspasa 3 se determina colorimétricamente como en el ejemplo 28. Como se muestra en la figura 3ª, la activación de la caspasa 3 en GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, las células tratadas fueron 323% mayores que en las células de control.
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Ejemplo 31 Activación de división PARP y caspasa-7 por GT SEQ ID NO: 25
Se incuban células de leucemia, células T Jurkat durante 72 H con GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases. Las células se lavan 3x con PBS, se lisan con 10 mM de HEPES, pH 7.5 que contiene 5 mM MgCl_{2}, ditiotreitol, 1.5 nM de aprotilina, 10 mM, de leupeptina y 2.5 \mum de ortovanadato, y se determina el contenido de la proteína del lisato (Bradford J. Anal. Biochem.72: 248, 1976).
La división PARP y la caspasa 7 activada se detectan mediante análisis de inmunotransferencia Western blot. El lisato se mezcla con amortiguador Laemmli (Laemmli U. Nature 15: 680, 1970), se agita, y se calienta a 100ºC durante 4 min. Se agrega 50 \mug de cada línea y se separan las proteínas mediante electroforesis en un 10% (caspasa) o un 17% (PARP) geles de poliacrilamida geles de dodecilsulfatopoliacrilamida de sodio (SDS-PAGE) aun voltaje constante de 100V durante aproximadamente 1.5 H. las proteínas separadas se electrotransfieren sobre una membrana PVDF. Se monitorea la carga potencial al igual mediante teñido rojo ponceau mediante la membrana.
La membrana se bloquea durante la noche 4ºC con un amortiguador que contiene 1% de solución salina tris-amortiguada (2 mM Tris-HCl, 13.7 mM NaCl, pH 7.6, y 0.1% de monolaurato poletilenosorbitano (TWEEN 20) (TBST) +5% de leche descremada en polvo. La membrana se lava y se incuba durante un 1 h a RT con un anticuerpo monoclonal IgG anti-caspasa 7 (Pharmingen) (diluido 1: 1000 en TBST+1% BSA) o con un anticuerpo IgG anti-PARP monoclonal de ratón (diluido 1: 1000 en TBST+1%BSA) (Pharmingen). El IgG unido a la caspasa 7 o al PARP se detecta con IgG de anti ratón de oveja conjugado con peroxidasa de rábano (diluido 1:1000 in TBST+5% de leche descremada en polvo) (Pharmingen). Se desarrollan inmunotransferencias utilizando un sistema de detección quimioluminiscente mejorado (ECL, Amersham, Corp., Amersham, UK).)
Como se muestra en la figura 3B, la base 6 GT SEQ ID NO: 25, induce el procesamiento de las pro-caspasas 7 inactivas (30 kDa) para activar la caspasa 7 (19-20 kDa) y activar PARP a su producto de degradación de 85 kDa inactivo.
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Ejemplo 32 Amplificación de retroalimentación positiva de activación de caspasa
Se incuban células T de leucemia humana Jurkat durante 72 h con NH2-YV AD-CO-GG (GT) GG, NH2-DEVD-CO-GG (GT) GG, NH2-IEGD-COO-GG (GT) GG, NH2-YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC, NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC y NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC. Se determina la activación de la caspasa 3 y la caspasa 7.
NH2-YVAD-CO-GT, NH2-DEVD-CO-GT y NH2-IEGD-COO-GT cada una induce el procesamiento de la caspasa inactiva 3 para activar la caspasa 3 y de inactivar la caspasa 7 para activar la caspasa 7, aunque NH2-YVAD-CO-ACG, NH2-DVED-COACG y NH2-IEGD-CO-ACG no inducen el procesamiento de la pro-caspasa 3 inactiva para activar la caspasa 3 o de activar la caspasa 7 para activar la caspasa 7.
Aunque no se desea estar limitado por la siguiente hipótesis, se considera que la actividad de la caspasa basal dentro de las células que contienen caspasa media la liberación de las secuencias GT que activan la caspasa de las construcciones NH2-XXXD-COO-GT mediante proteólisis/hidrólisis. Esto resulta en la amplificación positiva de la actividad caspasa (niveles incrementados de caspasa 3 y caspasa 7) dentro de las células mediante las secuencias GT que activan la caspasa liberada.
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Ejemplo 33 Inducción de producción de citocina
A menos que se establezca otra cosa, se incuban 1 x 10^{6} células con 100 \mug/ml de cada una de las secuencias probadas durante 48 h a 37ªC en 5% de CO_{2}. La producción de citocinas IL-6, IL-10, IL-12, IL-1beta y TNF-alfa se determinan en pg/ml en 100 \mul de sobrenadante de cultivo utilizando el ELISA comercial adecuado (BioSource, camarillo, CA). El Elisa IL-12 mide tanto el complejo IL-12 p70 como la sub unidad p40 libre. Los resultados se expresan como el incremento en "veces" (x) la producción de citocinas mediante células tratadas comparadas con células de control.
Se incuban células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 con las secuencias GT base 2, 3,6, 9,12, 14, 15 y 18 se determina la producción IL-6 de citocina (Tabla 35).
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TABLA 35 (para comparación)
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Como se muestra en la Tabla 35, las secuencias GT de 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 y 18 bases incrementa la producción de células THP-1 de la citocina IL-6.
Las células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 se incuban con secuencias GT, AG, CG, GG, AGT y CGT de 6 bases y se determina la producción de las citocinas IL-12 y IL-6 (Tabla 36).
TABLA 36
50
51
Como se muestra en la Tabla 36, las secuencias GT, AG, CG, GG, AGT y CGT de 6 bases incrementan la producción de célula THP-1 de las citocinas IL-12 y IL-6.
La Tabla 37 resume la inducción de la síntesis de IL-12 y IL-6 mediante secuencias de 6 bases.
TABLA 37
52
Las secuencias derivadas de BCG A-3 (SEQ ID NO: 73), A-4 (SEQ ID NO: 74), A-6 (SEQ ID NO: 75), A-7 (SEQ ID NO: 76), M3 (SEQ ID NO: 77) y Alfa 1 (SEQ ID NO: 78) se reportan por activar las células NK in vivo (Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83: 244, 1992). Las células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 se incuban con secuencias derivadas de BCG de 45 bases y se determina la producción de las citocinas IL-12 y IL-6 (Tabla 38).
TABLA 38 (para comparación)
53 
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Como se muestra en la Tabla 38, secuencias derivadas de BCG d 45 bases incrementan minimamente la producción de células THP-1 de IL-12 y IL-6.
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Ejemplo 34 Inducción de producción de IL-12 mediante secuencias de fosfodiéster y fosforototioato
Las células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 se incuban con secuencias GT de 6 bases, que tienen ya sea un átomo de oxígeno (fosfodiéster) o un azufre (fosforotioato) como el átomo no puenteado en los grupos fosfatos y se determina producción de la citocina IL-12 (Tabla 39).
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TABLA 39
54
Como se muestra en la Tabla 39, la sustitución de un átomo de azufre (fosforotioato) por un átomo de oxígeno no puenteado (fosfodiéster) en los grupos fosfatos resulta en una disminución significativa en la producción de IL-12 en célula THP-1.
Las células de leucemia monocítica aguda humana THP-1 se incuban con GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, que tiene ya sea oxígeno (fosfodiéster) o un azufre (fosforotioato) como el átomo no puenteado en los grupos fosfatos y se determina la producción de la citocina IL-12 (Tabla 40).
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TABLA 40
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Como se muestra en la Tabla 40, la sustitución de un átomo de azufre (fosforotioato) por un átomo de oxígeno no puenteado (fosfodiéster) en GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases; resulta en una disminución significativa en producción de IL-12 de la célula THP-1.
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Ejemplo 35 Estimulación de síntesis de citocina en las células mononucleares de sangre periférica humana
Las células mononucleares de sangre periférica humana (aquí adelante, "PBMC") se aíslan de 7 humanos saludables mediante Ficoll-Hypaque (Amersham Pharmacia Biotech, Baie d'Urfée, Québec, Canadá) mediante centrifugación gradiente de densidad de sangre completa. Los PBMC se incuban con secuencias GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases y se determina la producción de las citocinas IL-1beta, IL-6, IL-10 y IL-12.
TABLA 41
56
57
Como se muestra en la Tabla 41, las secuencias GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases incrementan la producción de la célula PBMC humana de las citocinas IL-1beta, IL-6, IL-10 y IL-12.
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Ejemplo 36 Síntesis de citocina mediante células mononucleares de sangre periférica de chimpancé
Se aíslan los PBMC de 4 chimpancés saludables como en el Ejemplo 35. Los PBMC de chimpancé se incuban con secuencias de GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases y se determina la producción de las citocinas IL-10, IL-12 y TNF-alfa (Tabla 41).
TABLA 41
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59
Como se muestra en la Tabla 41, secuencias de GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases incrementan la producción de célula PBMC de chimpancé de las citocinas IL-10 y IL-12 y TNF-alfa.
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Ejemplo 37 Síntesis de citocina mediante células mononucleares de sangre periférica de mono rhesus
Se aíslan los PBMC de 4 monos rhesus saludables como en el Ejemplo 35. Los PBMC se incuban con secuencias GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases y se determina la producción de las citocinas IL-6, IL-12 y TNF-alfa (Tabla 42).
TABLA 42
60 
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Como se muestra en la Tabla 42, las secuencias GT, AGT, CGT, AG, CG y GG de 6 bases incrementan la producción de célula PBMC de mono rhesus de las citocinas IL-10, IL-12 y TNF-alfa.
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Ejemplo 38 Efecto de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + 5-fluorouracilo y de GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + tamoxifeno en tumores de mama en humano MCF-7
Se implantan células humanas de cáncer de mama MCF-7 subcutáneamente como xenoinjertos, en ratones hembra sin pelo BALB/c. los ratones se dividen en 6 grupos de 10 ratones. En el día 0, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, los ratones del grupo 3 reciben 5-fluorouracilo, los ratones del grupo 4 reciben tamoxifeno, los ratones del grupo 5 reciben GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + 5-fluorouracilo y los ratones del grupo 6 reciben GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases + tamoxifeno. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se determina la masa del tumor. Los ratones del grupo 1 tienen la mayor masa de tumor, los ratones de los grupos 2, 3 y 4 tienen menos masa de tumor que los ratones del grupo 1 y los ratones de los grupos 5 y 6 tienen menos masa de tumor que los ratones de los grupos 1, 2, 3 y 4.
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Ejemplo 39 Efecto de secuencias GT de 3 y 6 bases y secuencia BCG A-3 de 45 bases en tumores de cáncer de próstata humano LNCaP
Se implantan células de cáncer de próstata humano LNCaP subcutáneamente, como xenoinjertos en ratones machos sin pelo nu/nu. los ratones se dividen en 5 grupos de 10 ratones. En el día 0, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben SEQ ID NO: 8 de 3 bases, los ratones del grupo 3 reciben GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, los ratones del grupo 4 reciben AG SEQ ID NO: 45 de 6 bases y los ratones del grupo 5 reciben BCG A-3 SEQ ID NO: 69 de 45 bases. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se determina la masa del tumor. Los ratones del grupo 1 tienen la mayor masa de tumor, los ratones del grupo 5 tienen la menor masa de tumor que los ratones del grupo 1 y los ratones de los grupos 2, 3 y 4 tienen menos masa de tumor que los ratones de los grupos 1 y 5.
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Ejemplo 41 Efecto de bases 3, 6, 8 y 27 de secuencia en linfoma T de murinos L-4
Se implantan células de linfoma T de murinos L-4 en ratones C57/BL6. Los ratones se dividen en 6 grupos de 10 ratones. En el día 0, los ratones del grupo 1 reciben solución salina, los ratones del grupo 2 reciben base 3 SEQ ID NO: 8, los ratones del grupo 3 reciben GT SEQ ID NO: 25 de 6 bases, los ratones del grupo 4 reciben AG SEQ ID NO: 45 de 6 bases, los ratones del grupo 5 reciben GT SEQ ID NO: 18 de 18 bases y los ratones del grupo 6 reciben GT SEQ ID NO: 1 de 27 bases. Después de 4 semanas de tratamiento, se sacrifican los ratones y se determina la masa del tumor. Los ratones del grupo 1 tienen la mayor masa de tumor, los ratones del grupo 2, 3 ,4 ,5 y 6 tienen menos masa de tumor que los ratones del grupo 1.
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Ejemplo 42
Se mantienen estirpes celulares de cáncer de colon humano como cultivos celulares adherentes. Las células en la fase de crecimiento exponencial se tratan con GT, GA, GC o GG de 2-20 bases de secuencia en el rango de dosis de 0 \mug/ml a 100 \mul/ml durante 24-72 horas. Se inhibe la inhibición de la proliferación celular mediante reducción MTT, detención del ciclo celular mediante citometría de flujo y apoptosis por mediante unión Anexina V o liberación de nuMa. Las secuencias GT, GA, GC o GG inhiben la proliferación, inducen la detención del ciclo celular e inducen la apoptosis en las estirpes de las células de cáncer de colon.
Ratones SCID que llevan estirpes celulares de cáncer de colorectal humano subcutáneas se tratan con solución salina o con base 2-20 de las secuencias GT, GA, GC o GG, que tienen actividad antineoplásica contra estirpes celulares de cáncer colorectal humano in vitro. Los ratones tratados con base 2-20 de las secuencias GT, GA, GC o GG tienen actividad neoplásica contra estirpes de células neoplásicas colorectales humanas in vitro, que muestra una reducción significativa en la masa de tumor comparado con ratones tratados con solución salina.
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Referencias citadas en la descripción
Esta lista de referencias citadas por el aspirante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento de la Patente Europea. Aún cuando se ha tomado gran cuidado en recopilar las referencias, los errores u omisiones no se pueden excluir y la EPO desconoce toda responsabilidad en este respeto.
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\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> Phillip, Nigel
\hskip1cm
Filion, Mario 
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<120> Oligonucleótidos Sintéticos Útiles Terapéuticamente
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<130> 6857-21
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<150> 60/170,325
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<151> 1999-12-13
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<151> 2000-08-29
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<160> 87
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<170> PatentIn version 3.0
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<210> 1
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gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg 
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gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg 
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tctctctctc tctctctctc tctctct 
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tgt 
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gata 
\hfill
6 
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ccgtcc 
\hfill
6 
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tggttg 
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6 
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6 
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6 
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6 
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6 
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\hfill
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\hfill
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6 
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gt 
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tg 
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\hfill
4 
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ggtt 
\hfill
4 
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\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
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tgtg 
\hfill
4 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 5
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<213> Oligonucleótido Sintético
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\hfill
5 
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\hfill
5 
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Oligonucleótido Sintético
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\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Oligonucleótido Sintético
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gggtggg 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
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<213> Oligonucleótido Sintético
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tgggtgg 
\hfill
7 
\vskip1.000000\baselineskip
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7 
\vskip1.000000\baselineskip
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<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 67
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggggggtgg gggggtgggg gggtggg 
\hfill
27 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tgtgtg 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtgt 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tttgtt 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtggg 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggtgg 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgttt 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gccgagaagg tgcgcaacct gccggctggc cacggactga acgct 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
acgccgacgt cgtctgtggt ggggtgtcta ccgccaacgc gacgg 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgactacaac ggctgggata tcaacacccc ggcgttcgag tggta 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ccaccc 
\hfill
6 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cggta 
\hfill
5 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtgtgtttgg t 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggttttgttt g 
\hfill
11 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oligonucleótido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttgttttttt tg 
\hfill
12 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
63 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido Sintético
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> X = cualquier Aminoácido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Péptido Sintético
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
65

Claims (7)

1. Una composición que comprende una secuencia aislada de nucleótidos fosfodiéster sintéticos 3'-OH, 5'-OH de la SEQ ID NO: 45:gggagg y que además comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.
2. La composición de la reivindicación 1, que además comprende un agente quimioterapéutico.
3. La composición de las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de un antimetabolito, un agente alquilante y un antagonista hormonal.
4. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento para inducir una respuesta seleccionada del grupo que consiste de la inducción de la detención del ciclo celular, la inhibición de la proliferación, la activación de las caspasas y la inducción de la apoptosis en células cancerosas, y la producción de citoquinas por las células del sistema inmune, en donde las citoquinas se seleccionan del grupo que consiste de IL-1-beta, IL-6, IL-10, IL-12, y TNF-alfa.
5. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en la preparación de un medicamento para tratar el cáncer.
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de un carcinoma primario, un carcinoma secundario, un sarcoma primario y un sarcoma secundario.
7. El uso de la reivindicación 6, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste de leucemia, linfoma, cáncer de pecho, de próstata, colorectal, ovarios y de hueso.
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