KR100829646B1 - 치료상 유용한 합성 올리고뉴클레오타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 (GxTy)n, (TyGx)n, a(Gx Ty)n, a(TyGx)n, (GxTy) nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, a(TyGx)nb로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2 내지 20 염기 3′-OH, 5′-OH 합성 올리고뉴클레오타이드 (서열)를 포함하는 조성물 및 방법을 제공하며, 여기에서, x 및 y는 1 내지 7의 정수이고, n은 1 내지 12의 정수이며, a 및 b는 하나 이상의 As, Cs, Gs 또는 Ts이며, 서열은 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 생산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반응을 유도한다.
올리고뉴클레오타이드, 캐스페이즈, 아폽토시스

Description

치료상 유용한 합성 올리고뉴클레오타이드{THERAPEUTICALLY USEFUL SYNTHETIC OLIGONUCLEOTIDES}
본 발명은 암 치료용 올리고뉴클레오타이드 조성물에 관한 것이다.
암은 증식 과잉, 세포사의 불충분, 또는 이들 둘의 조합으로 생길 수 있는 부정형 세포의 비정상적인 최종적 축적이다.
증식은 1개 세포에서 2개 세포로의 분열로 귀결되는 세포 사이클을 통한 세포 진행과정의 정점이다. 세포 사이클의 5 가지 주요 상은 G0, G1, S, G2 및 M이다. G0기 동안, 세포는 휴지상태이다. 체내의 대부분의 세포는 임의의 한때는 이 단계에 있다. G1기 동안, 분열 시그널에 반응하는 세포는 RNA 및 DNA의 합성에 필요한 단백질을 생산한다. S기(SE, 초기 S기; SM, 중기 S기; 및 SL, 후기 S기) 동안, 세포는 자신의 DNA를 복제한다. G2기 동안, 단백질은 세포 분열 준비에 동화된다. 유사분열(M)기 동안, 세포는 두 개의 딸세포로 분열한다. 세포 사이클 진행상의 변질은 모든 암에서 일어나며 유전자의 과잉 발현, 조절 유전자의 돌연변이, 또는 DNA 손상 체크 포인트의 철폐에서 연유할 수 있다(Hochhauser D. Anti-Cancer Chemotherapeutic Agents 8:903, 1997).
암 세포와는 달리, 대부분의 정상 세포는 세포 노화로 불리는 과정에 기인하여 무한정으로 증식할 수가 없다. 세포 노화는 세포의 증식 저지를 초래하는 프로그램된 세포사 반응이다(Dimri et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:20, 1995). DNA 손상, 결장암, 유방암 및 난소암 세포의 토포이소머라제 억제제에의 노출 및 비인두 암 세포의 시스플라틴에의 노출이 노화 유도에 의한 이들 세포의 증식을 방지하는 것으로 보고되어 있다(Wang et al. Cancer Res. 58:5019, 1998; Poele et al. Br.J. Cancer 80:9, 1999).
합성 올리고뉴클레오타이드는 세포에서 내면화되는 폴리음이온 서열이다(Vlassov et al. Biochim. Biophys. Acta 1197:95, 1994). 핵산에(Wagner, R. Nature: 372:333, 1994), 특이적 세포 단백질에(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999) 및 특이적 핵 단백질에(Scaggiante et al. Eur.J.Biochem. 252:207, 1998) 선택적으로 결합하여 암 세포의 증식을 억제하는 합성 올리고뉴클레오타이드가 보고되었다.
구아닌(G)과 가변량의 티민(T)을 함유하는 합성 27 염기 서열(올리고뉴클레오타이드 GTn)(여기에서, n은 1 이상 또는 7 이하이며 염기의 수는 20 이상이다(Scaggiante et al. Eur.J.Biochem. 252:207, 1998))은 45 kDa 핵 단백질에 특이적으로 결합하는 서열에 의해 암 세포주의 증식을 억제하는 것으로 보고된 반면에, 염기수가 20 이하인 GTn은 암 세포주에 대해 불활성인 것으로 보고되었다(Morassutti et al. Nucleosides and Nucleotides 18:1711, 1999). 3′아미노알킬 변형을 갖는 15 및 29 염기의 두 합성 GT-풍부 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레올린에 결합하는 G-쿼텟을 형성하고 암 세포주의 증식을 억제하는 것으로 보고되어 있다(Bates et al. J. Biol. Chem. 274:26369, 1999). 포유류 텔로미어 반복 서열의 것과 동일한 서열을 갖는 합성 6 염기 TTAGGG-포스포로티오에이트는 버킷 림프종 세포의 시험관내 및 생체내 증식을 억제하는 것으로 보고되어 있다(Mata et al. Toxicol. Applied Pharmacol. 144:189, 1997). 그러나, 합성 6 염기 TTAGGG-포스포디에스테르는 항-텔로머라제 활성을 지니지 않은 것으로 보고되고 있다(US 특허 No. 5,643,890).
세포사는 아폽토시스를 촉진하는 면역-매개자에 의해, 및 세포사를 이끄는 경로를 직접 개시하는 아폽토시스 유도자에 의해 달성된다(Muzio et al. Cell 85:817, 1996; Levine, A. Cell 88:323, 1997). 아폽토시스는 핵 크로마틴의 응축, 세포 수축, 핵 붕괴, 원형질막 블레빙(blebbing), 및 막-결합 아폽토시스 소체의 형성을 포함하는 확연한 형태학적 변화를 특징으로 하는 능동적인 세포사 과정이다(Wyllie et al. Int. Rev. Cytol. 68:251, 1980). 아폽토시스의 분자적 특징은 내생성 엔도뉴클레아제의 활성화로 해서 세포 핵 DNA가 올리고뉴클레오솜-길이 단편으로 분해되는 현상이다(Wyllie A. Nature 284:555, 1980).
캐스페이즈(시스테인-아스파틸-특이성 프로테아제)가 아폽토시스의 후기 단계의 실행에서 주 효소로서 관여되었다. 캐스페이즈 계통은 적어도 14가지의 관련된 시스테인 아스파틸 프로테아제로 구성된다. 모든 캐스페이즈는 보존된 QACXG(여기에서, X는 R, Q 또는 G이다) 펜타펩타이드 활성-부위 모티프(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997)를 함유한다. 캐스페이즈의 수는 캐스페이즈 특이적 절단 부위에서 절단 후 활성화되는 불활성 전효소(proenzyme)로서(Cohen G. Biochim. Biophys. Acta 1366:139, 1997) 또는 활성화를 위한 조절 분자와의 회합을 요하는 불활성 효소로서(Stennicke et al. J. Biol. Chem. 274:8359, 1999) 합성된다.
캐스페이즈는 아폽토시스에서의 역할 뿐만 아니라, B 림프구와 T 림프구의 활성화와 증식에, 염증반응 동안 사 이토카인 성숙에, 적혈구 조혈 동안 선조세포의 분화에 및 수정체 섬유의 발생에 관여한다(Fadeel et al. Leukemia 14:1514, 2000). B 림프구와 T 림프구의 경우, 캐스페이즈 3은 B 림프구의 활성화 및 T 림프구의 CD4(+), CD8(+), CD45RA(+) 및 CD45RO(+) 서브세트의 활성화 동안에 프로세싱된다(Alam et al. J. Exp. Med. 190:1879, 1999). 더욱이, 유사분열물질에 의한 및 인터루킨-2에 의한 T 림프구의 자극은 캐스페이즈 경로의 활성화 및 PARP의 절단과 연관되어 있다(Wilheim et al. Eur. J. Immunol. 28:891, 1998). 사이토카인의 경우, 캐스페이즈 3 활성은 활성화된 T 림프구에 의한 IL-2의 방출에(Posmantur et al. Exp. Cell Res. 244:302, 1998) 및 프로(pro)-염증성 사이토카인 인터루킨-16의 프로세싱과 성숙에(Zhang et al. J. Biol. Chem. 273:1144, 1998) 필요하다. 적혈구 조혈의 경우, 캐스페이즈 활성화는 적혈구 조혈 조절에 관여하며 적혈구 전구체의 성숙에 중대한 핵 조절 단백질인 GATA-1을 조절하는 것으로 나타났다(De Maria, et al. Nature 401:489, 1999).
세포용해는 세포의 완전한 또는 부분적인 파괴이며 면역 시스템에 의해 매개된다. 활성화된 대식구와 단구는 사이토카인을 포함한(이에 한정되지 않음) 생물학 적 활성 분자를 생성한다. 사이토카인에는 인터루킨(IL)-1, IL-1 베타, IL-6, IL-10, 1L-12, 및 TNF-알파가 포함되며, 이에 한정되지 않는다.
IL-1 베타는 세포감소 약제, 방사선 및 자가 골수이식에서 약제로 퍼징되는 시험관내 종양 세포에 대한 골수 세포 감수성을 감소시킨다(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
IL-6는 B 세포 분화를 유도하고, IgG 분비를 자극하며(Taga et al. J. Exp. Med. 166:967, 1987), 세포독성 T 세포 분화를 유도하며(Lee et al. Vaccine 17:490, 1999), 거핵구 성숙을 촉진하며(Ishibashi et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8953, 1989) 암 세포에 대해 증식 억제 인자로서(Mori et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 257:609, 1999; Alexandroff et al. Biochem. Soc. Trans. 25:270, 1997; Takizawa et al. Cancer Res. 53:18, 1993: Novick et al. Cytokine 4:6, 1992) 및 프로-증식 인자로서(Okamoto et al., Cancer Res. 57:141, 1997; Okamoto et al. Int. J. Cancer 72:149, 1997; Chiu et al. Clin. Cancer Res. 2:215, 1996; Lu et al. Clin. Cancer Res. 2:1417, 1996) 모두 기능한다.
IL-10은 쥐 종양 모델에서 백신의 효율을 증진시키고(Kauffman et al. J. Immunother. 22:;489, 1999) 항암 자가반응성 T 세포 반응을 상향 조절한다(Alleva et al. Immunobiol. 192:155, 1995).
IL-12는 단독으로 및 다른 사이토카인과 함께, 백혈구의 성숙을 촉진하고 인터페론-감마의 분비를 유도한다. IL-12는 특정 세포용해성 T-림프구의 활성화, 내츄럴 킬러(NK) 세포의 활성화 및 항-맥관형성 단백질 IP-10 및 MiG의 유도를 포 함하여(이에 한정되지 않음), 항암 활성을 지니고 있는 것으로 보고되어 있다(Stine et al. Annals NY Academy of Science 795:420, 1996; Chen et al. Journal of Immunol. 159:351, 1997).
TNF-알파는 충실성 종양의 괴사를 초래하고(Porter et al. Trends in Biotech. 9:158, 1991), 암 세포를 감마선-유도 아폽토시스에 감작시키며(Kimura et al. Cancer Res. 59:1606, 1999) 안티네오플라스틱제의 효과로부터 골수 전구체 세포를 보호한다(Dalmau et al. Bone Marrow Transplant. 12:551, 1993).
그러나, 대부분의 종래 기술 항암요법은 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 아폽토시스 유도 또는 면역 시스템의 자극 어느 쪽을 지향하든 간에, 임상적인 적용으로는 덜 적당한 것으로 판명되었다. 이들 요법 중 다수는 비효율적이거나 독성을 띠고, 심각한 부작용이 있으며, 내약성 또는 면역감작의 발생을 초래하며, 수용자를 쇠약하게 만든다.
따라서, 암 세포에서 세포 사이클 저지를 유도하고, 암 세포의 증식을 억제하며, 암 세포에서 캐스페이즈를 활성화하며, 암 세포에서 아폽토시스를 유도하며 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하는 신규 조성물과 방법이 지속적으로 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 (GxTy)n, (TyGx)n, a(Gx Ty)n, a(TyGx)n, (GxTy) nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, a(TyGx)nb로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2 내지 20 염기 3′-OH, 5′-OH 합성 올리 고뉴클레오타이드(이하, "서열"로 약칭)를 포함하는 조성물 및 방법을 제공함으로써 이러한 요구조건을 충족시키며, 여기에서, x 및 y는 1 내지 7의 정수이고, n은 1 내지 12의 정수이며, a 및 b는 하나 이상의 As, Cs, Gs 또는 Ts이며, 서열은 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 생산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반응을 유도한다.
서열과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 암에 걸린, 인간을 포함한 동물에, 동물에서의 암 치료 유효량으로 투여한다. 세포 사이클 저지를 유도하고, 증식을 억제하며, 암 세포에서 캐스페이즈를 활성화하고 아폽토시스를 유도하며 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하는 서열의 예상치 못하고 놀라운 능력은 의학분야에서 오랫동안 통감해 온 완수하지 못했던 필요성을 어드레싱하며 인간을 포함한 동물에 중요한 혜택을 제공한다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간을 포함한 동물의 질병 치료에 효과적이 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 치료에 효과적인 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포의 노화를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에서 세포 사이클 저지를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포에서 세포 사이클 저지를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포 증식을 억제하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포의 증식을 억제하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Fas와 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TNFR1과 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 p53/p21과 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 p21/waf-1/CIP와 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 p15ink4B와 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 p16ink4와 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 캐스페이즈 3과 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 TGF-베타 1 수용체와 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 호르몬 의존성과 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 내약성과 무관한 암 세포에서 아폽토시스를 유도하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에서 캐스페이즈를 활성화하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포에서 캐스페이즈를 활성화하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자가면역 질환 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 림프증식성 질환 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감염증 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염증 치료를 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 T-세포 또는 B-세포 활성화를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 선조 세포 성숙을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 적혈구 조혈을 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에서 전사 인자를 조절하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에 미치는 다른 치료제의 효과를 강화하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암 세포에 미치는 화학요법제의 효과를 강화하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 방사선의 안티-네오플라스틱 효과를 강화하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 IL-1 베타 생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 IL-6 생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 IL-10 생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 IL-12 생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 면역 시스템의 세포에 의한 TNF-α생산을 자극하는 조성물 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 제조가 간편한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 수용자에게 최소한도로 유독한 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이들 목적과 다른 목적, 특징 및 이점은 개시된 양태의 상세한 설명과 첨부된 청구의 범위를 고찰한 후에 자명해질 것이다.
도 1. 0 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 6 염기 GT 서열번호 25와 배양시킨 Jurkat 인간 T 백혈병 세포의 형광[Fluo-3-AM].
도 2. 0 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 GT 서열번호 66, 67, 81, 82 및 83 없이 배양한 Jurkat 인간 T 세포 백혈병 세포에서 사이토메트리로(A) 및 측색법으로(B) 측정한 캐스페이즈 3 활성화.
도 3. Jurkat 인간 T 세포 백혈병 세포에서 캐스페이즈 활성화. (A) 0 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 6 염기 GT 서열번호 25와 배양한 세포에서 캐스페이즈 3 활성화; (B) 0 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 6 염기 GT 서열번호 25와 배양한 세포에서 캐스페이즈 7 활성화(a) 및 PARP 함량(b).
본 발명은 (GxTy)n, (TyGx)n, a(Gx Ty)n, a(TyGx)n, (GxTy) nb, (TyGx)nb, a(GxTy)nb, a(TyGx)nb로 이루어진 그룹 중에서 선택된 2 내지 20 염기 3′-OH, 5′-OH 합성 올리고뉴클레오타이드 (서열)를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서, x 및 y는 1 내지 7의 정수이고, n은 1 내지 12의 정수이며, a 및 b는 하나 이상의 As, Cs, Gs 또는 Ts이며, 서열은 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 생산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 반응을 유도한다.
서열과 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 암에 걸린, 인간을 포함한 동물에, 인간을 포함한 동물에서의 암 치료 유효량으로 투여한다. 세포 사이클 저지를 유도하고, 증식을 억제하며, 암 세포에서 아폽토시스를 유도하고 캐스페이즈를 활성화하며 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인 생산을 자극하는 서열의 예상치 못하고 놀라운 능력은 의학분야에서 오랫동안 통감해 온 완수하지 못했던 필요성을 어드레싱하며 인간을 포함한 동물에 중요한 혜택을 제공한다.
본원에서 사용된 "서열"이란 용어는 A, C, G 및 T 염기를 포함하는 2 내지 20 염기 3′-OH, 5′-OH 합성 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
본원에서 사용되는 약어 "GT", "AG", "CG", "GG", "AGT" 및 "CGT"는 임의 순서로 합성된 지정 염기를 포함하는 서열을 의미한다.
본원에서 사용되는 "반응"이란 용어는 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인 생산의 자극을 의미한다.
본원에서 사용되는 "치료적 처치" 및 "유효량"이란 어구는 세포 사이클 저지를 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인 생산의 자극을 의미한다.
본원에서 사용되는 "현탁 종양 모델" 및 "충실성 종양 모델"이란 어구는 1차 또는 2차 암종 또는 육종을 의미한다.
본원에서 사용되는 "화학요법제"란 인간을 포함한 동물에서의 암 치료를 위해, 국가 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나 U.S. 약전 또는 기타 일반적으로 인식된 약전에 수록되어 있는 제제이다.
본원에서 사용되는 "안티네오플라스틱"이란 용어는 암 세포의 발생, 성숙, 증식 또는 확산의 예방을 말한다.
본원에서 사용되는 "강화"란 용어는 각 제제의 부가 활성보다 큰 상승작용 정도를 말한다.
본원에서 사용되는 "상승작용"이란 용어는 둘 이상의 제제의 조화된 작용을 말한다.
인간을 포함한 동물에 유효량의 본 발명 서열의 투여는 암, 류머티스성 관절 염, 림프-증식성 질병 및 천식을 포함한(이에 한정되지 않음) 질환을 예방, 치료 또는 제거하는 치료적 처치이다. 암에는 편평상피세포 암종, 섬유육종, 육종성 암종, 흑색종, 유방암, 폐암, 직장암, 신장암, 골육종, 피하 흑색종, 기저세포 암종, 췌장암, 방광암, 뇌암, 난소암, 전립선암, 백혈병, 림프종 및 이로부터 유도된 전이가 포함되며 이에 한정되지 않는다.
서열의 치료 효율은 염기, 당 또는 포스페이트 백본을 화학적으로 변형시키거나, 적당한 서열을 함유하는 박테리아 플라스미드를 사용하여 서열을 화학적으로 보충하거나 생물공학적으로 증폭시키거나, 서열을 생물학적 또는 화학적 담체와 복합체를 형성시키거나 서열을 조직형 또는 세포형 지정 리간드 또는 항체와 커플링시키는 것을 포함한(이에 한정되지 않음) 방법에 의해 증가시킬 수 있다.
하나 이상의 서열 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 서열과 약학적으로 허용되는 담체를 균일하게 및 균질하게 회합시킴으로써 제조된다. 약학적으로 허용되는 담체로는 액체 담체, 고체 담체 또는 양자 모두가 포함된다. 액체 담체는 수성 담체, 비-수성 담체 또는 양자 모두이며, 수성 현탁액, 오일 에멀션, 오일 에멀션 중의 물, 수 에멀션 중의 유중수, 부위-특이성 에멀션, 장기-체류 에멀션, 점착성-에멀션, 마이크로에멀션 및 나노에멀션이 포함되며 이에 한정되지 않는다. 고체 담체는 생물학적 담체, 화학적 담체 또는 두 가지 모두이고 바이러스 벡터 시스템, 입자, 미립자, 나노파티클, 마이크로스피어, 나노스피어, 미니펌프, 박테리아 세포벽 추출액 및 서열의 지속적인 분비를 가능하게 하는 생분해성 또는 비-생분해성 천연 또는 합성 중합체를 포함하고, 이에 한정되지 않는다. 서열과 고 체 담체의 복합체를 형성하는 데 사용되는 방법으로는 고체 담체 표면에의 직접 흡착; 직접 또는 연결 잔기를 통한 고체 담체 표면에의 공유 커플링; 및 고체 담체를 제조하는 데 사용되는 중합체에의 공유 커플링이 포함되며, 이로 한정되지는 않는다. 임의로, 서열은 폴리옥시에틸렌솔비탄 모노올리에이트(Tweens) 또는 히알루론산과 같은 비-이온성 또는 이온성 중합체의 첨가에 의해 안정화될 수 있다.
바람직한 수성 담체로는 물, 식염수 및 약학적으로 허용되는 완충액이 포함되고, 이로 한정되지 않는다. 바람직한 비-수성 담체로는 광유 및 중성 오일과 이들의 혼합물이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다. 임의로, 부형제는 서열을 반응성 세포에 부여하는 데 사용되는 약학적으로 허용되는 담체와 상관없이 포함될 수 있다. 이러한 부형제로는 항산화제, 완충wp 및 세균 발육 저지제가 포함되고, 이로 한정되지 않으며, 현탁제 및 농후제를 포함할 수도 있다.
하나 이상의 서열이 단독으로, 또는 화학요법제, 면역요법제, 항균제, 항바이러스제가 포함되지만, 이로 한정되지는 않는 기타 치료 양식과 함께 또는 방사선 치료와 함께 투여될 수 있다. 화학요법제로는 항-대사산물, DNA 손상, 마이크로튜불 불안정화, 마이크로튜불 안정화, 액틴 해중합, 성장 억제, 토포이소머라제 억제, HMG-CoA 억제, 퓨린 억제, 피리미딘 억제, 메탈로프로테이나제 억제, CDK 억제, 맥관형성 억제 및 분화 증진제가 포함되고, 이로 한정되지는 않는다.
투여 경로로는 경구, 국소, 피하, 경피, 진피하, 근육내, 복막내, 방광내, 관절내, 동맥내, 정맥내, 피내, 두개내, 병소내, 종양내, 안내, 폐내, 척수강내, 전립선내, 체강 내 배치, 비 흡입, 폐 흡입, 피부에의 압인 및 일렉트로코포레이션 이 포함되고, 이로 한정되지는 않는다.
투여 경로에 따라, 투여량당 용적은 바람직하게는 투여량당 약 0.001 내지 100 ㎖, 더욱 바람직하게는 투여량당 약 0.01 내지 50 ㎖, 가장 바람직하게는 투여량당 약 0.1 내지 30 ㎖이다. 바람직하게는, 투여량당 투여되는 서열의 양은 약 0.001 내지 100 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 10 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 5 mg/kg이다. 서열 또는 서열과 치료제는 단일 투여 치료로, 복합 투여 치료로 투여되거나, 스케줄 대로 치료할 질환, 수용자 상태 및 투여 경로에 따라 적당한 시간에 걸쳐서 연속 주입될 수 있다. 더욱이, 서열은 치료제의 투여 전에, 투여와 동시에 또는 투여 후에 투여될 수 있다.
화학요법제와 함께 서열이 암에 걸린 동물에 화학요법제의 안티-네오플라스틱 효과 강화 유효량으로 투여된다. 바람직하게는, 투여량당 투여되는 치료제의 양은 약 0.001 내지 1000 mg/㎡ 또는 약 0.01 내지 1000 mg/kg, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 500 mg/㎡ 또는 약 0.01 내지 500 mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.1 내지 100 mg/㎡ 또는 약 0.1 내지 100 mg/kg이다. 투여되는 특정 서열 및 특정 치료제, 투여량당 양, 투여 스케줄 및 투여 경로는 주치의에 의해 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용하여 결정되어야 하고 암의 유형, 암의 심각성, 암의 위치 및 수용자의 사이즈, 체중 및 신체 상태와 같은 기타 임상적인 요인에 좌우될 것이다. 또한, 시험관내 분석은 임의로 서열 투여 및 서열과 치료제 투여의 최적의 범위를 확인하는 데 이용될 수 있다.
하기 가설에 구애되는 것을 원치 않지만, 본 발명의 서열은 신 부류의 구조 를 형성하고 이들이 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 삼중나선 형성 DNA, 텔로머라제 억제제, 전사 활성제 또는 전사 억제제로서의 기능을 하지는 않는다고 생각된다.
하기의 실시예는 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이지만, 동시에 이를 한정하지는 않는다. 이에 반하여, 본원의 설명을 정독한 후에 본 발명의 취지로부터 일탈하지 않으면서 당업자에게 제안될 수 있는 다양한 기타 양태, 수정 및 이의 등가물에 호소할 수 있음이 자명하다.
실시예 1
서열 제조
포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 서열이 EXPEDITETM 8900 자동 DNA 합성 시스템(미국 매사추세츠 파밍한 소재의 PersSeptive Biosystems, Inc.)을 사용하여 HUKABEL Scientific Ltd(캐나다 퀘벡 몬트리올 소재)에 의해, Abacus Segmented Synthesis Technology를 사용하여 Sigma-Genosys(미국 텍사스 우드랜드 소재)에 의해 제조된다. 달리 언급하지 않는 한, 사용되는 서열은 포스포디에스테르 서열이다. 달리 언급하지 않는 한, 사용 직전에, 서열을 오토클레이빙 탈이온수에 또는 식염수(이에 한정하지 않음)와 같은 약학적으로 허용되는 오토클레이빙 완충제에 분산시킨다.
실시예 2
세포 및 시약
모든 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, 미국 메릴랜드 록빌 소재)으로부터 입수되고 ATCC에 의해 권장되는 배지에서 배양된다. 표 1은 세포주, 이들의 기원 및 이들의 성질을 보여준다.
표 1
세포주
세포주 기원 성질
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 현탁 종양 모델 p53 null
MCF-7 인간 유방암 충실성 종양 모델; 비-전이성 캐스페이즈 3-음성; 에스트로겐-의존성
JURKAT 인간 T 세포 백혈병 현탁 종양 모델 p190-MRP 단백질과 관련있는 부정형 다중-내약성
PC-3 인간 전립선암 충실성 종양 모델; 전이성 돌연변이된 p53; 안드로겐-독립성(호르몬 저항성)
LNCaP 인간 전립선암 충실성 종양 모델; 전이성 TGF-베타 1 수용체-음성; 안드로겐-의존성
OVCAR-3 인간 난소암 충실성 종양 모델; 전이성 돌연변이된 p53; p21/waf-1/Cip-1 결실
SK-OV-3 인간 난소암 충실성 종양 모델; 전이성 결실된 p53; p21/waf-1/Cip 결실; p15ink4B, p16ink4 결실
HL-60 인간 전골수구성 백혈병 현탁 종양 모델 돌연변이된 p53
EL-4 쥐 T 림프종 현탁 종양 모델
A20 쥐 B 세포 백혈병 현탁 종양 모델
L-1210 쥐 백혈병 현탁 종양 모델
D-17 개 골육종 충실성 종양 모델
CF-51 개 유선암 충실성 종양 모델

세포를 6(1 ㎖/웰), 24(0.5 ㎖/웰) 또는 96(0.1 ㎖/웰) 웰 마이크로플레이트(편평한 바닥)에 시딩하고 5%의 CO2 대기 중 37℃에서 유지한다. 달리 언급하지 않는 한, 2.5 ×105 세포/㎖를 A, C, G 및 T를 함유하는 2 내지 45개의 염기 서열 0 ㎍/㎖(대조) 및 100 ㎍/㎖(처리)와 함께 48시간 동안 배양한다.
실시예 3
세포 증식의 측정
세포 증식을 디메틸티아졸-디페닐-테트라졸륨(MTT) 감소를 이용하여 측정한다(Mosman et al. J. Immunol. Methods 65:55, 1983). MTT를 멀티플레이트 분광광도계 판독기(미국 버먼트 위누스키 소재의 Bio-TEK Instruments Inc.의 ELX800)를 사용하여 570 nm의 파장에서 측정한다.
실시예 4
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제
Jurkat 인간 백혈병 T 세포는 부정형 다중-내약성 인간 현탁 종양 세포 모델이다. Jurkat 세포를 27 염기 GT 및 CT 서열과 함께 배양한다(표 2).
표 2
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00001
표 2에 나타나 있는 바와 같이, Jurkat T 세포 증식은 시험된 GT 서열에 의해서는 억제되었지만, 시험된 CT 서열에 의해서는 억제되지 않았다.
Jurkat T 세포를 3, 6, 9, 12, 14, 15, 18, 21 및 24 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 3).
표 3
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00002
표 3에 나타나 있는 바와 같이, 3, 6, 9, 12, 14, 15 및 18 염기 GT 서열은 21 및 24 염기 GT 서열만큼 효과적으로 Jurkat T 세포 증식을 억제한다.
Jurkat T 세포를 6 염기 GT, AG, CG, GG, AGT 및 CGT 서열과 함께 배양한다(표 4).
표 4
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00003
Figure 112002018381401-pct00004
표 4에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열은 Jurkat T 세포 증식을 억제한다. GT 서열번호 25는 증식을 60% 억제하고 AGT 서열번호 49는 증식을 45% 억제한다. PHARM/PCS-4 소프트웨어(미국 펜실베이니아 필라델피아 소재의 Microcomputer Specialists)를 사용하는 GT 서열번호 25와 AGT 서열번호 49의 상대 잠재력 비교는 GT 서열번호 25의 잠재력이 AGT 서열번호 49 잠재력의 3.4배임을 보여준다. AGT 서열번호 49-포스포로티오에이트는 텔로머라제 활성을 억제하고 Burkitt 림프종 세포에서의 아폽토시스를 유도하는 것으로 보고되었다(Mata et al. Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189, 1997).
텔로머라제 활성을 측정하기 위해, 2 ×105 Jurkat T 세포로부터의 추출액을 PCR-텔로머 반복 증폭 프로토콜(TRAP)을 이용하여 분석한다(캐나다 퀘벡 라발 소재의 Roche). 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도에서, GT 서열번호 25-포스포디에스테르는 0 내지 10%의 항-텔로머라제 활성을 보였고, 반면 AGT 서열번호 49-포스포로티오에이트는 30 내지 75%의 항-텔로머라제 활성을 보였다. GT 서열번호 25-포스포로티오에이트 또는 GT 서열번호 49-포스포디에스테르 모두 항-텔로머라제 활성을 보이지 않았다.
Jurkat T 세포를 2, 3, 4, 5, 6 및 7 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 5).









표 5
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00005
표 5에 나타나 있는 바와 같이, 2, 3, 4, 5, 6 및 7 염기 GT 서열은 Jurkat T 세포 증식을 억제한다.
실시예 5
HL-60 인간 전골수구성 백혈병 세포 증식의 억제
HL-60 전골수구성 백혈병 세포는 p53 돌연변이된 인간 현탁 종양 모델이다. HL-60 세포를 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 6).
표 6
HL-60 인간 전골수구성 백혈병 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00006
표 6에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열은 HL-60 세포 증식을 억제한다.
실시예 6
MCF-7 인간 유방암 세포 증식의 억제
MCF-7 인간 유방암 세포는 캐스페이즈 3 음성 에스트로겐-의존성 인간 충실성 종양 모델이다. MCF-7 세포(5 ×105 세포/㎖)를 3 및 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 7).
표 7
MCF-7 인간 유방암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00007
표 7에 나타나 있는 바와 같이, 6 및 7 염기 GT 서열은 MCF-7 세포 증식을 억제한다.
실시예 7
PC-3 인간 전립선암 세포 증식의 억제
PC-3 전립선암 세포는 p53 돌연변이되고 안드로겐-독립성인 인간 충실성 종양 모델이다. PC-3 세포(5 ×105 세포/㎖)를 3 및 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 8).



표 8
PC-3 인간 전립선암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00008
표 8에 나타나 있는 바와 같이, 3 및 6 염기 GT 서열은 PC-3 세포 증식을 억제한다.
실시예 8
LNCaP 인간 전립선암 세포 증식의 억제
LNCaP 전립선암 세포는 TGF-베타 1 수용체 음성 안드로겐-독립성 전이성 인간 충실성 종양 모델이다. LNCaP 세포(5 ×105 세포/㎖)를 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 9).



표 9
LNCaP 인간 전립선암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00009
표 9에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열은 LNCaP 세포 증식을 억제한다.
실시예 9
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포 증식의 억제
THP-1 급성 단구성 백혈병 세포는 p53 null 인간 현탁 종양 모델이다. THP-1 세포(1.6 ×106 세포/㎖)를 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 10).
표 10
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00010
표 10에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열은 THP-1 세포 증식을 억제 한다.
실시예 10
OVCAR-3 인간 난소암 세포 증식의 억제
OVCAR-3 난소암 세포는 p53 돌연변이되고 p21/waf-1/Cip 결실된 전이성 인간 충실성 종양 모델이다. OVCAR-3 세포(5 ×105 세포/㎖)를 2, 6 및 18 염기 GT 서열 및 6 염기 AGT 서열과 함께 배양한다(표 11).
표 11
OVCAR-3 인간 난소암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00011
표 11에 나타나 있는 바와 같이, 2, 6 및 18 염기 GT 서열과 6 염기 AGT 서열은 OVCAR-3 세포 증식을 억제한다.
실시예 11
SK-OV-3 인간 난소암 세포 증식의 억제
SK-OV-3 난소암 세포는 p53 돌연변이되고, p21/waf-1/Cip 결실되었으며, p15ink4B 결실되었으며, p16ink4 결실된 전이성 인간 충실성 종양 모델이다. SK-OV-3 세포(5 ×105 세포/㎖)를 2, 6 및 18 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 12).
표 12
SK-OV-3 인간 난소암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00012
표 12에 나타나 있는 바와 같이, 2, 6 및 18 염기 GT 서열은 SK-OV-3 세포 증식을 억제한다.
실시예 12
포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 서열에 의한 세포 증식의 억제
포스페이트 그룹 중 하나 이상에서 비-브리징 산소 원자를 황 원자로 치환시킴에 의한 천연 포스포디에스테르 서열의 변형체가 생물학적 유체 및 세포에서 엔도뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오타이드 서열의 안정성을 증가시키는 것으로 보고되었다(Crooke et al. Anticancer Drugs 6:609, 1991).
Jurkat 인간 백혈병 T 세포(표 13), LNCaP 인간 전립선암 세포(5 ×105 세포/㎖)(표 14) 및 MCF-7 인간 유방암 세포(5 ×105 세포/㎖)(표 15)를 포스페이트 그룹의 비-브리징 원자로서 산소(포스포디에스테르) 또는 황(포스포로티오에이트)을 가지는 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다.
표 13
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00013
표 14
LNCaP 인간 전립선암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00014





표 15
MCF-7 인간 유방암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00015
표 13, 14 및 15에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT-포스포디에스테르 서열은 Jurkat T, LNCaP 및 MCF-7 세포 증식을 6 염기 GT-포스포티오에이트 서열보다 더욱 효과적으로 억제한다.
실시예 13
혼합된 포스포디에스테르와 포스포로티오에이트 서열에 의한 세포 증식의 억제
Jurkat 인간 백혈병 T 세포(표 16) 및 MCF-7 인간 유방암 세포(5 ×105 세포/㎖)(표 17)를 산소(포스포디에스테르) 또는 황(포스포로티오에이트)이 포스페이트 그룹의 비-브리징 원자인 6 염기 GT 서열번호 25와 함께 배양한다.


표 16
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00016
*주: "o"는 포스페이트 그룹에서 산소 원자를 나타내고 "s"는 포스페이트 그룹에서 황 원자를 나타낸다.
표 17
MCF-7 인간 유방암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00017
*주: "o"는 포스페이트 그룹에서 산소 원자를 나타내고 "s"는 포스페이트 그룹에서 황 원자를 나타낸다.
표 16 및 17에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25의 하나 이상 의 포스페이트 그룹에서 비-브리징 원자를 황 원자로 치환하는 것은 Jurkat T 및 MCF-7 세포 증식 억제의 상당한 감소를 초래한다.
실시예 14
쥐 암 세포 증식의 억제
EL-4 쥐 림프종 T 세포는 현탁 종양 모델이다. EL-4 쥐 림프종 T 세포를 6, 18, 27 및 33 염기 GT 서열 및 15 염기 ACG 서열과 함께 배양한다(표 18).
표 18
EL-4 쥐 T 림프종 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00018
표 18에 나타나 있는 바와 같이, 6, 18, 27 및 33 염기 GT 서열 및 15 염기 ACG 서열은 EL-4 쥐 세포 증식을 억제하지 않았다.
A20 쥐 백혈병 B 세포는 현탁 종양 모델이다. A20 쥐 백혈병 B 세포를 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 19).
표 19
A20 쥐 B 백혈병 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00019
표 19에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열은 A20 쥐 B 백혈병 세포의 증식을 억제한다.
실시예 15
개 암 세포 증식의 억제
D-17 개 골육종 세포 및 CF-51 개 유선암 세포는 충실성 종양 모델이다. D-17 개 골육종 세포(5 ×105 세포/㎖)(표 20) 및 CF-51 개 유선암 세포(5 ×105 세포/㎖)(표 21)를 6, 9, 17, 27 및 33 염기 GT-서열 및 15 염기 ACG 서열과 함께 배양한다.



표 20
D-17 개 골육종 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00020
표 21
CF-51 개 유선암 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00021
표 20 및 21에 나타나 있는 바와 같이, 6, 9, 17, 27 및 33 염기 GT 서열 및 15 염기 ACG 서열은 D-17 및 CF-51 개 세포 증식을 모두 억제한다.
실시예 16
암 세포 증식의 억제
6 염기 GT 서열번호 25에 의한 인간, 쥐 및 개 암 세포의 증식 억제가 표 22에 요약되어 있다.
표 22
인간, 쥐 및 개 암 세포 증식의 억제율 %
세포 GG(GT)1GG(서열번호 25)
인간 Jurkat 60
인간 PC-3 38
인간 MCF-7 41
인간 HL-60 35
인간 OVCAR-3 14
인간 LNCaP 18
인간 SK-OV-3 12
인간 THP-1 15
쥐 EL-4 1
쥐 A20 11
쥐 L-1210 8
개 D17 18
개 CF-51 14
표 22에 나타나 있는 바와 같이, 인간 암 세포는 6 염기 GT 서열번호 25에 의한 증식의 억제에 개 암 세포 및 쥐 암 세포보다 더욱 민감하다.
실시예 17
증식의 억제에 미치는 두 6 염기 GT 서열의 상승작용 효과
Jurkat 인간 백혈병 T 세포를 최적 이하 농도(5.0 ㎍/㎖)의 6 염기 GT 서열과 함께 배양한다(표 23).





표 23
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00022
표 23에 나타나 있는 바와 같이, 두 6 염기 GT 서열의 동시 사용은 Jurkat T 세포 증식의 억제에 상승작용 효과를 미친다.
실시예 18
화학요법제의 안티네오플라스틱 효과의 증가
Jurkat 인간 백혈병 T 세포를 6 염기 GT 서열번호 25 및 27 염기 GT 서열번호 1 1.0 ㎍/㎖와 함께 5-플루오로우라실 또는 시스플라틴 0, 0.1, 1.0 또는 10.0 ㎍/㎖의 존재하에 배양한다(표 24). 5-플루오로우라실은 DNA 및 RNA 합성을 방해하는 항대사산물이다. 시스플라틴은 DNA를 가교결합시키고 DNA 전구체를 억제하는 알킬화제이다.
표 24
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
서열 억제율 %
5-플루오로우라실(㎍/㎖)
0.0 0.1 1.0 10.0
5-플루오로우라실 0 3 14 38
GG(GT)1GG-(6 염기) 서열번호 25, 1.0 ㎍/㎖ 0 10 21 40
(GT)13G-(27 염기) 서열번호 1, 1.0 ㎍/㎖ 3 15 25 41
시스플라틴(㎍/㎖)
0.0 0.1 1.0 10.0
시스플라틴 0 7 29 73
GG(GT)1GG-(6 염기) 서열번호 25, 1.0 ㎍/㎖ 0 14 38 76
(GT)13G-(27 염기) 서열번호 1, 1.0 ㎍/㎖ 3 18 35 76
표 24에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25 및 27 염기 GT 서열번호 1는 Jurkat T 세포 증식에 미치는 5-플루오로우라실 0.1 및 1.0 ㎍/㎖의 안티네오플라스틱 효과를 증가시키고 GT 서열번호 25는 Jurkat T 세포 증식에 미치는 시스플라틴 0.1 및 1.0 ㎍/㎖의 안티네오플라스틱 효과를 증가시킨다.
MCF-7 인간 유방암 세포(5 ×105 세포/㎖)를 6 염기 GT 서열번호 25 및 27 염기 GT 서열번호 1 1.0 ㎍/㎖와 함께 5-플루오로우라실 또는 타목시펜 0, 0.1, 1.0 또는 10.0 ㎍/㎖의 존재하에 배양한다(표 25). 타목시펜은 에스트로겐 길항제이다.


표 25
MCF-7 인간 유방암 세포 증식의 억제율 %
서열 억제율 %
5-플루오로우라실(㎍/㎖)
0.0 0.1 1.0 10.0
5-플루오로우라실 0 13 28 28
GG(GT)1GG-(6 염기) 서열번호 25, 1.0 ㎍/㎖ 6 24 36 33
(GT)13G-(27 염기) 서열번호 1, 1.0 ㎍/㎖ 8 24 35 33
타목시펜(㎍/㎖)
0.0 0.1 1.0 10.0
타목시펜 0 10 18 15
GG(GT)1GG-(6 염기) 서열번호 25, 1.0 ㎍/㎖ 6 21 24 31
(GT)13G-(27 염기) 서열번호 1, 1.0 ㎍/㎖ 8 19 24 20
표 25에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 서열번호 25는 MCF-7 세포 증식에 미치는 5-플루오로우라실 0.1 ㎍/㎖ 및 타목시펜 0.1 ㎍/㎖의 안티네오플라스틱 효과를 증가시킨다. 27 염기 서열번호 1은 MCF-7 세포 증식에 미치는 5-플루오로우라실 또는 타목시펜의 안티네오플라스틱 활성을 증가시키지 않았다.
실시예 19
6 염기 GT 서열번호 25의 반복에 의한 증식의 억제
Jurkat 인간 백혈병 T 세포를 6 염기 GG(GT)1GG(서열번호 25)의 1, 2, 3 및 4 반복체와 함께 배양한다(표 26).


표 26
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00023
표 26에 나타나 있는 바와 같이, Jurkat T 세포 증식의 억제율은 6 염기 GT 서열번호 25로는 60%이고 12 염기 GT 서열번호 68, 18 염기 GT 서열번호 69 및 24 염기 GT 서열번호 70으로 감소한다. 6 염기 GT 서열번호 25의 융점(Tm)은 2.5℃이고 GT 서열번호 68로는 56.8℃, GT 서열번호 69로는 76.3℃, GT 서열번호 70로는 86.3℃로 상승한다.
실시예 20
바실루스 칼메트-구에린(BCG) 유래 서열에 의한 증식의 억제
BCG 유래 서열이 생체내 종양 성장을 억제하는 것으로 보고되었다(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992). 또한, A-2(서열번호 72) 및 BCG A-4(서열번호 74)는 IMC 세포와 예비혼합되어 CDF-1 마우스에 주입되면, IMC 종양 성장을 각각 88% 및 37% 억제하는 것으로 보고되었다.
Jurkat 인간 백혈병 T 세포를 BCG로부터 유도되는 45 염기 서열과 함께 배양한다(표 27).
표 27
Jurkat 인간 백혈병 T 세포 증식의 억제율 %
Figure 112002018381401-pct00024
표 27에 나타나 있는 바와 같이, BCG 유래 서열은 Jurkat T 세포 증식을 ≤24%로 억제한다.
실시예 21
세포 사이클 저지의 유도
세포 사이클 단계는 CYCLETESTTM PLUS DNA 시판 키트(Becton Dickinson)를 사용하여 측정된다. 간단히, 세포로부터의 핵은 비이온 계면활성제에서 세포막을 용해하고, 세포골격 및 핵 단백질을 트립신으로 제거하고, RNase로 세포 RNA를 분해하고, 스퍼민으로 핵 크로마틴을 안정화함으로써 수득된다. 프로피듐 아이오다이드 가 세포핵에 첨가되고 이의 형광은 일렉트로닉 더블릿 식별능을 갖춘 플로우 사이토미터(FACSCalibur, Becton Dickinson, 미국 캘리포니아 새너제이 소재)에서 분석된다. 세포 주기의 G0/G1, 초기 S(SE), 중기 S(SM), 후기 S(SL) 또는 G2/M기에서 세포의 축적은 MODFIT LT 소프트웨어(Verity Software House Inc., Topsham, MA)를 사용하여 분석된다.
대수적으로 증식하는 Jurkat 인간 백혈병 T 세포(표 28) 및 MCF-7 인간 유방암 세포(5 X 105 세포/ml)(표 29)는 A, C, G 및 T를 함유한 2, 6, 15, 18, 27 및 45 염기 서열과 함께 24시간 동안 배양된다. 세포는 수집되고 원심분리되며 세포 사이클 단계가 측정된다.








표 28
Jurkat T 인간 백혈병 세포에서의 세포 사이클 저지의 유도
Figure 112002018381401-pct00025
표 28에 나타나 있는 바와 같이, Jurkat T 세포에서, 2, 6 및 27 염기 GT 서열은 세포 사이클의 SE기에서 저지를 유도하고, 6 염기 CG 및 AGT, 18 염기 GT 및 45 염기 BCG A-1 서열은 세포 사이클의 SM기에서 저지를 유도하며, 6 염기 AG 서열은 세포 사이클의 G0/G1기에서 저지를 유도하였다.
표 29
MCF-7 인간 유방암 세포에서의 세포 사이클 저지의 유도
Figure 112002018381401-pct00026
표 29에 나타나 있는 바와 같이, MCF-7 세포에서, 2 및 6 염기 GT 서열은 세포 사이클의 SE기에서 저지를 유도하였으며, 6 염기 AGT 서열 및 18 염기 GT 서열은 세포 사이클의 SM기에서 저지를 유도하였다.
실시예 22
GT 서열번호 25, AC 서열번호 79 및 GT 서열번호 25 + AC 서열번호 79에 의한 세포 사이클 저지의 유도
Jurkat 인간 세포 백혈병 T 세포 (1 X 106 세포/ml)는 6 염기 GT 서열번호 25, 상보적 6 염기 AC 서열번호 79 및 6 염기 GT 서열번호 25 + 6 염기 AC 서열번호 79와 24시간 동안 배양된다. GT 서열번호 25 및 AC 서열번호 79는 올리고뉴클레오타이드를 혼합하고(1:1) 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 하이브리드화된다. 대조군으로서, GT 서열번호 25 및 AC 서열번호 79가 65℃에서 10분 동안 가열된다(표 30).
표 30
Jurkat 인간 백혈병 T 세포에서의 세포 사이클 저지의 유도
Figure 112002018381401-pct00027
표 30에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25는 세포 사이클의 SE 말기에서 저지를 유도하였으며, 반면 상보적 6 염기 AC 서열번호 79는 세포 사이클에 아무런 영향도 미치지 않았다. GT 서열번호 25와 AC 서열번호 79의 하이브리드화는 GT 서열번호 25의 세포 사이클 저지의 유도를 중화시킨다. 이 데이터는 유효하기 위해서는, 본 발명의 서열이 일본쇄여야 함을 증명한다.
실시예 23
아폽토시스의 유도
원형질막 포스파티딜세린의 재분배 및 핵 매트릭스 단백질(NuMA)의 방출은 아폽토시스를 겪는 세포의 특징이다(Martin et al. J. Exp. Med., 182:1545, 1995; Miller et al. Biotechniques, 15:1042, 1993).
아폽토시스 동안에 원형질막에서의 포스파티딜세린의 재분배는 FITC-접합 아넥신 V(BD Pharmingen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 측정된다. 상층액으로의 NuMA 방출은 시판 ELISA 키트(Oncogen/Calbiochem, 미국 매사추세츠 캠브리지 소재)를 사용하여 측정된다.
Jurkat 인간 백혈병 T 세포는 50 μM의 3, 4, 5, 6 및 7 GT 염기 서열, 5 염 기 ACGT 서열, 6 염기 AG, GG, AGT 및 CGT 서열 및 7 염기 GG 서열과 배양된다. 표 31은 아폽토시스에서 세포의 %(포스파티딜-세린/아넥신 V 염색(PS/A-V)에 양성) 및 세포로 방출된 % NuMA를 보인다.
표 31
Jurkat T 세포 백혈병 세포에서 아폽토시스의 유도
Figure 112002018381401-pct00028
표 31에 나타나 있는 바와 같이, 3, 4, 5, 및 6 염기 GT, AG, CG 및 AGT 서열은 Jurkat T 세포의 아폽토시스를 유도하였다. 5 염기 ACGT 및 6 염기 CGT 및 GG 서열은 Jurkat T 세포에서 아폽토시스를 유도하지 않았다.
실시예 24
세포내 칼슘(Ca 2+ ) i 의 증가
세포내 칼슘(Ca2+)i의 증가는 아폽토시스 유도와 관련있는 것으로 보고 되었다(Lam et al. Mol. Endocrinol. 7:686, 1993). (Ca2+)i는 형광 탐침 Fluo-3-AM (Cell Permaant, Molecular Probes, Inc., 미국 오레건 유진 소재)을 사용하여 측정된다. Fluo-3-AM 형광의 증가는 (Ca2+)i 증가의 지표이다.
Jurkat 인간 백혈병 T 세포는 6 염기 GT 서열번호:25와 24시간 동안 배양된다. 세포는 원심분리시켜 수집되고, 1% FBS를 함유하는 PBS에 현탁되며 10 μM Fluo-3-AM과 37℃에서 1시간 동안 로딩된다. 세포 형광은 488 nm 여기 및 530 nm 발광(FL1 검출기)에서 측정되었다. 데이터는 CellQUEST(Becton Dickinson) 프로그램을 사용하여 FACSCALIBUR에서 분석된다.
도 1에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25와 Jurkat T 세포의 배양은 (Ca2+)i 증가의 지표인 세포 형광에서 88% 증가를 유발하였다.

실시예 25
아폽토시스의 유도
아폽토시스는 세포 표면 수용체에 결합하는 Fas(CD95) 및 종양 괴사 인자(TNF)를 포함하나 이에 제한되지 않는 리간드에 의해 개시될 수 있다. Fas 리간드와의 Fas-결합 및 TNF 수용체 1와의 TNF 결합은 시스테인 아스파틸 프로테아제(캐스페이즈)의 활성화를 초래하는 세포내 시그널링을 개시한다. 캐스페이즈는 핵 DNA-단편화, 핵 매트릭스 단백질(NuMA)의 방출 및 세포 기질 접촉의 상실과 관련된 아폽토시스 실행의 치사성 단백질분해 캐스케이드를 개시한다.
Jurkat 인간 백혈병 T 세포( 1 x 106/ml)는 6 및 27 GT 염기 서열(표 32)과 배양된다. NuMA는 실시예 23에서와 같이 측정된다.
표 32
Jurkat 인간 백혈병 T 세포로부터의 NuMA 방출 %
Figure 112002018381401-pct00029
표 32에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25의 NuMA 방출 %는 27 염기 GT 서열번호 1, 2, 3 및 4의 NuMA 방출 %보다 크다.
실시예 26
6 염기 서열번호 25 및 6 염기 AC 서열번호 79에 의한 아폽토시스 유도
Jurkat 인간 세포 백혈병 T 세포는 6 염기 GT 서열번호 25, 상보적 6 염기 AC 서열번호 79, 및 6 염기 GT 서열번호 25 + 6 염기 AC 서열번호 79와 함께 24시간 동안 배양된다. GT 서열번호 25 및 AC 서열번호 79은 서열을 혼합하고(1:1) 65℃에서 10분 동안 가열함으로써 하이브리드화된다. 대조군으로서, GT 서열번호 25 및 AC 서열번호 79를 65℃에서 10분 동안 가열한다(표 33). 아폽토시스는 실시예 23에서와 같이 평가되었다.
표 33
Jurkat 인간 백혈병 T 세포에서의 아폽토시스 유도
Figure 112002018381401-pct00030
표 33에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25는 Jurkat T 세포의 아폽토시스를 유도하였으며, 반면 상보적 AC 서열번호 79는 아폽토시스에 아무런 영향도 미치지 않았다. 또한, GT 서열번호 25와 AC 서열번호 79의 하이브리드화는 GT 서열번호 25의 아폽토시스 유도를 중화시켰다. 이들 데이터는 유효하기 위해서는, 본 발명의 서열이 일본쇄여야 함을 증명한다.
실시예 27
마이코박테리움 플레이(Mycobacterium phlei)로부터 유래한 GT-풍부 및 AC- 풍부 서열에 의한 증식 억제, 세포 사이클 저지 및 아폽토시스의 유도
Jurkat 인간 백혈병 T 세포는 마이코박테리움 플레이의 murA 유전자(GenBank: 접근 번호 X99776)로부터 유래한 GT-풍부 또는 AC-풍부 서열과 배양된다. 증식 억제는 실시예 3에서와 같이 MTT의 감소에 의해 측정되며, 세포 사이클 저지는 실시예 21에서와 같이 프로피듐 아이오다이드를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 검출되고 아폽토시스는 실시예 23에서와 같이 아넥신-V-FITC를 사용하여 플로우 사이토메트리에 의해 평가된다.
표 34
Jurkat 세포에서의 증식 억제, 세포 사이클 저지 및 아폽토시스 유도
Figure 112002018381401-pct00031
표 34에 나타나 있는 바와 같이, GT가 풍부한 서열번호 81, 82 및 83은 Jurkat T 세포의 증식을 억제하였고, 세포 사이클 저지를 유도하였으며 아폽토시스를 유도하였고, 반면 AC가 풍부한 서열번호 15는 Jurkat T 세포의 증식 억제, 세포 사이클 저지의 유도 또는 아폽토시스 유도를 하지 못했다.
실시예 28
GT 서열에 의한 캐스페이즈 활성화의 조절
캐스페이즈는 3 주요 펩타이드 기질 서열을 인식한다: 1) Try-Val-Ala-Asp(YVAD, 캐스페이즈-1, -4 및 -5)(서열번호 84); 2)Asp-Glu-Val-Asp(DEVD, 캐스페이즈-2, -3 및 -7)(서열번호 85); 및 3)Ile-(Leu)-Glu-X-Asp(I(L)EXD; 캐스페이즈-8 및 -10)(서열번호 86)(Thornberry et al. J. Biol. Chem. 272:17907, 1997). 단백질 표적내 서열 인식은 첫 번째 실시예에서, 캐스페이즈 3에 의한 캐스페이즈 7의 조절과 같은 표적의 한정되고 특이적인 단백질분해, 또는 두 번째 실시예에서, 라민을 포함하나 이에 한정되지 않는 구조 단백질 표적의 파괴, 또는 세 번째 실시예에서, PARP를 포함하나 이에 한정되지 않는 효소의 활성화를 초래한다.
NH2-XXXD-COO-GT 서열 작제물은 5'-C2 아미드 스페이서 아암 및 표준 아미드-카복실 수용성 카보헥시이미드 컨쥬게이션 기술로 합성된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, 화학적으로 보호된 GT 서열 또는 화학적으로 보호된 AC 서열을 NH2-YVAD-COOH(서열번호 84), NH2-DEVD-COOH(서열번호 85) 및 NH2-IEGD-COOH(서열번호 87)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 화학적으로 보호된 펩타이드에 컨쥬게이션시켜 생성될 수 있다(Guy et al. J. Chromatography. B. Biomed. Sci. Appl. 706:149, 1998). 반응성 카복실레이트 및 반응성 아민 그룹은 컨쥬게이션에 이어 탈보호화된다.
NH2-YVAD-COO-GT; NH2-DEVD-COO-GT; 및 NH2-I(L)EXD-COO-GT를 포함하여(이에 한정되지 않음) 펩타이드-GT(이하, PGT) 서열 작제물을 캐스페이즈, 암 전이-관련 효소, 콜라게나제 및 메탈로프로테이나제를 포함하나 이에 한정되지는 않는 효소에 의해 D 와 GT 서열 간의 카복실레이트 작용기에서 절단된다. 이러한 절단은 PGT로부터 캐스페이즈-활성화 GT 서열의 방출을 초래한다. 생성된 세포내 캐스페이즈 활성의 증가는, 예를 들면 여러 약물에 내성인 암 세포에서의 화학요법제의 치료 효과 또는 약한 항원 자극에 대한 면역 반응을 증진시킬 수 있다.
캐스페이즈 활성을 측정하기 위해, 대조군 및 처리군 세포는 세척되고, 고정되고, 투과되며 제조자에 의해 권장되는 조건을 사용하여 캐스페이즈의 활성형을 인식하는 FITC-접합 항체(Pharmingen, 미국 캘리포니아 샌디에고 소재)와 배양된다. 활성 캐스페이즈 3과 관련된 형광은 CellQUEST 프로그램을 사용하여 FACSCALIBUR(Becton Dickinson)에서 플로우 사이토메트리에 의해 분석된다. 대안적으로, 캐스페이즈 활성화는 색상 리포터 분자 p-니트로아닐라이드에 접합된 캐스페이즈-특이적 펩타이드의 절단에 기초한 분석을 이용하여 비색법으로 측정되며, 이는 405 nm의 파장에서 분광광도계로 정량될 수 있다.
실시예 29
GT 서열번호 66, 81, 82, 83 및 AGC 서열 서열번호 67에 의한 캐스페이즈 3의 활성화
Jurkat T 세포 백혈병 세포는 33 염기 GT 서열번호 66; 11 염기 GT 서열번호 81 (GT 서열번호 66의 염기 1-11), 11 염기 GT 서열번호 82 (GT 서열번호 66의 염기 12-22), 11 염기 GT 서열번호 83 (GT 서열번호 66의 염기 23-33) 및 15 염기 ACG 서열번호 67와 72시간 동안 배양된다. 활성 캐스페이즈 3(17-22 kDa)은 실시예 28에서와 같이 항체(Clone:C92-605)와 접합된 FITC를 사용하여 측정된다.
도 2a에서 보이는 바와 같이, 33 염기 GT 서열번호 66 및 11 염기 GT 서열번호 81, 82 및 83은 각각 비활성 프로-캐스페이즈 3에서 활성 캐스페이즈 3으로의 프로세싱을 유도하며, 반면 15 염기 ACG 서열번호 67은 비활성 프로-캐스페이즈 3에서 활성 캐스페이즈 3으로의 프로세싱을 유도하지 못한다.
캐스페이즈 3 활성화는 또한 실시예 28에서와 같이, 비색법으로 측정된다. 도 2b에서 보이는 바와 같이, 33 염기 GT 서열번호 66 및 11 염기 GT 서열번호 81, 82, 83 처리군 세포에서의 캐스페이즈 3 활성은 대조군 세포에서보다 큰 105%, 77%, 100% 및 60%이며, 반면 15 염기 ACG 서열번호 67 처리군 세포 캐스페이즈 3 활성화는 대조군 세포에서와 거의 동일하다.
실시예 30
6 염기 서열번호 25에 의한 캐스페이즈 3 활성의 활성화
Jurkat T 세포 백혈병 세포가 6 염기 GT 서열번호 25와 72시간 동안 배양된다. 캐스페이즈 3 활성화는 실시예 28에서와 같이 비색법으로 측정된다. 도 3a에 나타나 있는 바와 같이, GT 서열번호 25 처리군 세포에서의 캐스페이즈 3 활성화는 대조군 세포에서보다 큰 323%이다.
실시예 31
GT 서열번호 25에 의한 캐스페이즈-7 활성화 및 PARP 절단
Jurkat T 세포 백혈병 세포는 GT 서열번호 25와 72시간 동안 배양된다. 세포는 PBS로 3번 세척되고, 5 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨, 1.5 nM 아프로티닌, 10 mM 루페틴 및 2.5 ㎛ 나트륨 오르토바나데이트를 함유한 pH 7.5의 10 mM HEPES로 용해되며, 이어서 용해물의 단백질 함량이 측정된다(Bradford J. Anal. Biochem. 72:248, 1976).
활성화된 캐스페이즈 7 및 PARP 절단은 웨스턴 블롯 분석방법에 의해 검출된다. 용해물을 Laemmli 완충액(Laemmli U. Nature 15:680, 1970)과 혼합하며, 진탕하고, 100℃에서 4분 동안 가열한다. 단백질 50 ㎍이 각 레인에 첨가되고 단백질은 약 1.5시간 동안 일정한 100 V 전력에서, 10% (캐스페이즈) 또는 17% (PARP) 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동(SDS-PAGE)함으로써 분리된다. 분리된 단백질은 PVDF 막으로 일렉트로블롯팅된다. 동등한 단백질 로딩은 막의 퐁소 레드(Ponceau red) 염색을 통해 모니터링된다.
막은 1% 트리스-완충 식염수(2 mM 트리스-HCl, 13.7 mM NaCl, pH 7.6), 및 0.1% 폴리에틸렌솔비탄 모노라우레이트 (TWEEN 20)(TBST) + 5% 탈지 건조 분유를 함유하는 완충액으로 4℃에서 밤새 블로킹된다. 막은 세척된 후 (TBST + 1% BSA에서 1:1000으로 희석된)마우스 모노클로날 IgG 항-캐스페이즈 7 항체(Pharmingen) 또는 (TBST + 1% BSA에서 1:1000으로 희석된)마우스 모노클로날 IgG 항-PARP 항체(Pharmingen)와 1시간 동안 배양된다. 캐스페이즈 7 또는 PARP에 결합된 IgG는 호스래디쉬 퍼옥시다제와 접합된 (TBST + 5% 탈지 건조 분유에서 1:1000으로 희석된) 양의 항-마우스 IgG(Pharmingen)로 검출된다. 증진된 화학발광 검출 시스템(ECL, Amersham, Corp., Amersham, UK)을 사용하여 블롯이 나타난다.
도 3b에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25는 비활성 프로-캐스페이즈 7(30 kDa)에서 활성 캐스페이즈 7(19-20 kDa)으로 및 활성 PARP에서 이의 비활성 85 kDa 분해 산물로의 프로세싱을 유도하였다.
실시예 32
캐스페이즈 활성화의 양성 피드백 증폭
Jurkat 인간 백혈병 T 세포는 NH2-YVAD-CO-GG(GT)GG, NH2-DEVD-CO-GG(GT)GG, NH2-IEGD-COO-GG(GT)GG, NH2-YVAD-CO-AACCACAAGCCCAAC, NH2-DVED-CO-AACCACAAGCCCAAC 및 NH2-IEGD-CO-AACCACAAGCCCAAC와 72시간 동안 배양된다. 캐스페이즈 3 및 캐스페이즈 7 활성화가 측정된다.
NH2-YVAD-CO-GT, NH2-DEVD-CO-GT 및 NH2-IEGD-COO-GT는 각각 비활성 캐스페이즈 3에서 활성 캐스페이즈로 및 비활성 캐스페이즈 7에서 활성 캐스페이즈 7으로의 프로세싱을 유도하며, 반면 NH2-YVAD-CO-ACG, NH2-DVED-CO-ACG 및 NH2-IEGD-CO-ACG는 비활성 프로-캐스페이즈 3에서 활성 캐스페이즈 3으로 및 비활성 캐스페이즈 7에서 활성 캐스페이즈 7으로의 프로세싱을 유도하지 못한다.
비록 하기 가설에 구애됨을 원치 않지만, 캐스페이즈 함유 세포내의 기본 캐스페이즈 활성은 단백질분해/가수분해에 의해 NH2-XXXD-COO-GT 작제물로부터 캐스페이즈 활성화 GT 서열의 방출을 매개하는 것으로 생각된다. 이는 방출된 캐스페이즈-활성화 GT 서열에 의해 세포내에서 캐스페이즈 활성의 양성 증폭(캐스페이즈 3 및 캐스페이즈 7의 증가된 수준)을 초래한다.
실시예 33
사이토카인 생산의 유도
달리 언급하지 않는 이상, 5% CO2에서, 1 x 106 세포가 100 ㎍/ml의 실험된 각 서열과 37℃에서 48시간 동안 배양된다. 사이토카인 IL-6, IL-10, IL-12, 1L-1베타 및 TNF-알파의 생산은 적당한 시판 ELISA(BioSource, Camarillo CA)를 사용하여 100 ㎕의 배양 상층액에서 pg/ml 단위로 측정된다. IL-12 ELISA는 IL-12 p70 복합체 및 유리 p40 서브유닛 모두를 측정한다. 결과는 대조군 세포와 비교하여 처리 세포의 사이토카인 생산에 있어 증가의 "배(x)"로서 표현된다.
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포는 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 및 18 염기 GT 서열과 배양되며 사이토카인 IL-6의 생산이 측정되었다(표 35).
표 35
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00032
표 35에 나타나 있는 바와 같이, 2, 3, 6, 9, 12, 14, 15 및 18 염기 GT 서열은 사이토카인 IL-6의 THP-1 세포 생산을 증가시킨다.
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포는 6 염기 GT, AG, CG, GG, AGT 및 CGT 서열과 배양되며 사이토카인 IL-12 및 IL-6의 생산이 측정된다(표 36).
표 36
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00033
표 36에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT, AG, CG, GG, AGT 및 CGT 서열은 사이토카인 IL-12 및 IL-6의 THP-1 세포 생산을 증가시킨다.
표 37은 6 염기 서열에 의한 IL-12 및 IL-6 합성의 유도를 요약한 것이다.

표 37
6 염기 서열에 의한 IL-6 및 IL-12 합성 유도
Figure 112002018381401-pct00034
BCG 유래 서열 A-3(서열번호 73), A-4(서열번호 74), A-6(서열번호 75), A-7(서열번호 76), M3(서열번호 77) 및 알파 1(서열번호 78)은 생체내에서 NK 세포를 활성화시키는 것으로 보고되었다(Kataoka et al. Jpn. J. Cancer Res. 83:244, 1992). THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포가 45 염기 BCG 유래 서열과 배양되고 사이토카인 IL-12 및 IL-6의 생산이 측정되었다(표 38).








표 38
THP-1 인간 급성 단구성 백혈구 세포에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00035
표 38에 나타나 있는 바와 같이, 45 염기 BCG 유래 서열은 IL-12 및 IL-6의 THP-1 세포 생산을 극미량 증가시킨다.
실시예 34
포스포디에스테르 및 포스포로티오에이트 서열에 의한 IL-12 생산의 유도
THP-1 인간 급성 단구성 백혈구 세포가, 포스페이트 그룹 상에서 비-브리징 원자로서 산소(포스포디에스테르) 또는 황(포스포로티오에이트)을 가지는 6 염기 GT 서열과 배양되며, 사이토카인 IL-12의 생산이 측정된다(표 39).

표 39
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포에 의한 IL-12 생산
Figure 112002018381401-pct00036
표 39에 나타나 있는 바와 같이, 포스페이트 그룹 상의 비-브리징 산소 원자(포스포디에스테르)를 황 원자(포스포로티오에이트)로 치환하는 것은 IL-12의 THP-1 세포 생산에 있어 상당한 감소를 초래한다.
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포가, 포스페이트 그룹 상에서 비-브리징 원자로서 산소(포스포디에스테르) 또는 황(포스포로티오에이트)을 가지는 6 염기 GT 서열번호 25와 배양되며, 사이토카인 IL-12의 생산이 측정된다(표 40).





표 40
THP-1 인간 급성 단구성 백혈병 세포에 의한 IL-12 생산
Figure 112002018381401-pct00037
표 40에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT 서열번호 25에서 비-브리징 산소 원자(포스포디에스테르)를 황 원자(포스포로티오에이트)로 치환하는 것은 IL-12의 THP-1 세포 생산에 있어 현저한 감소를 초래한다.
실시예 35
인간 말초 혈액 단핵 세포의 사이토카인 합성의 자극
말초 혈액 단핵 세포(이하, "PBMC")는 7명의 건강한 인간으로부터 Ficoll-Hypaque(Amersham Pharmacia Biotech, 캐나다 퀘벡 바이 뒤르프 소재)에 의해 전혈을 밀도 구배 원심분리함으로써 분리된다. PBMC는 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열과 배양되며, 사이토카인 IL-1 베타, IL-6, IL-10 및 IL-12의 생산이 측정된다.
표 41
인간 PBMC에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00038
표 41에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열은 사이토카인 IL-1 베타, IL-6, IL-10 및 IL-12의 인간 PBMC 세포 생산을 증가시킨 다.
실시예 36
침팬지 말초 혈액 단핵 세포에 의한 사이토카인 합성
PBMC는 실시예 35에서와 같이 4마리의 건강한 침팬지로부터 분리된다. 침팬지 PBMC는 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열과 배양되며, 사이토카인 IL-10, IL-12 및 TNF-알파의 생산이 측정된다(표 41).











표 41
침팬지 PBMC에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00039
표 41에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열은 사이토카인 IL-10, IL-12 및 TNF-알파의 침팬지 PBMC 세포 생산을 증가시킨다.
실시예 37
붉은털 원숭이(rhesus monkey) 말초 혈액 단핵 세포에 의한 사이토카인 합성
실시예 35에서와 같이 4마리의 건강한 붉은털 원숭이로부터 PBMC가 분리된 다. PBMC는 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열과 배양되며, 사이토카인 IL-6, IL-12 및 TNF-알파의 생산이 측정된다(표 42).
표 42
붉은털 원숭이 PBMC에 의한 사이토카인 생산
Figure 112002018381401-pct00040
표 42에 나타나 있는 바와 같이, 6 염기 GT, AGT, CGT, AG, CG 및 GG 서열은 사이토카인 IL-10, IL-12 및 TNF-알파의 붉은털 원숭이 PBMC 세포 생산을 증가시킨다.
실시예 38
MCF-7 인간 유방암에 미치는 6 염기 GT 서열번호 25 + 5-플루오로우라실 및 6 염기 GT 서열번호 25 + 타목시펜의 6 염기 GT 서열번호 25의 효과
MCF-7 인간 유방암 세포는 암컷 누드 BALB/c 마우스에게 이종 이식편으로서 피하로 이식된다. 마우스는 10마리씩 6 그룹으로 나눈다. 0번째 날, 그룹 1 마우스는 생리식염수를 투여받고, 그룹 2 마우스는 6 염기 GT 서열번호 25를, 그룹 3 마우스는 5-플루오로아실을, 그룹 4 마우스는 타목시펜을, 그룹 5 마우스는 6 염기 GR 서열번호 25 + 5-플루오로아실 및 그룹 6 마우스는 6 염기 GT 서열번호 25 + 타목시펜을 투여받는다. 처리 4주 후에, 마우스는 희생되고 종양괴가 측정된다. 그룹 1 마우스는 가장 큰 종양괴를 가졌으며, 그룹 2, 3 및 4 마우스는 그룹 1 마우스보다는 작은 종양괴를 가지고 그룹 5 및 6 마우스는 그룹 1, 2, 3, 및 4 마우스보다는 작은 종양괴를 가진다.
실시예 39
LNCaP 인간 전립선암 종양에서의 3 및 6 염기 GT 서열 및 45 염기 BCG A-3 서열의 효과
LMCaP 인간 전립선 암 세포는 수컷 누드 nu/nu 마우스에게 이형 이식편으로서 피하로 이식된다. 마우스는 10마리씩 5 그룹으로 나뉜다. 0번째 날에, 그룹 1 마우스는 생리식염수를 투여받고, 그룹 2 마우스는 3 염기 서열번호 8을, 그룹 3 마우스는 6 염기 GT 서열번호 25를, 그룹 4 마우스는 6 염기 AG 서열번호 45 및 그룹 5 마우스는 45 염기 BCG A-3 서열번호 69를 투여받는다. 처리 4주 후에, 마우스는 희생되고 종양괴가 측정된다. 그룹 1 마우스는 가장 큰 종양괴를 가지며, 그룹 5 마우스는 그룹 1 마우스보다는 작은 종양괴를 가지고 그룹 2, 3 및 4 마우스는 그룹 1 및 5의 마우스보다는 작은 종양괴를 가진다.
실시예 41
EL-4 쥐 T 림프종에 대한 3, 6, 8 및 27 염기 서열의 효과
EL-4 쥐 T 림프종 세포는 C57/BL6 마우스로 이식된다. 마우스는 10마리씩 6 그룹으로 나눈다. 0번째 날에, 그룹 1 마우스는 생리식염수를 투여받고, 그룹 2 마우스는 3 염기 GT 서열번호 8을, 그룹 3 마우스는 6 염기 서열번호 25를, 그룹 4 마우스는 6 염기 AG 서열번호 45를, 그룹 5 마우스는 18 염기 GT 서열번호 18 및 그룹 6 마우스는 27 염기 GT 서열번호 1을 투여받는다. 처리 4주 후에, 마우스는 희생되고 종양괴가 측정된다. 그룹 1 마우스는 가장 큰 종양괴를 가지며, 그룹 2, 3, 4, 5 및 6 마우스는 그룹 1 마우스보다는 작은 종양괴를 가진다.
실시예 42
인간 결장암 세포주는 유착 세포 배양균으로서 유지된다. 대수증식기의 세포는 0 ㎍/ml 내지 100 ㎕/ml 투여 범위의 2-20 염기 GT, GA, GC 또는 GG 서열로 24-72시간 동안 처리된다. 세포 증식의 억제는 MTT 감소에 의해, 세포 사이클 저지는 플로우 사이토메트리에 의해 및 아폽토시스는 아넥신-V 결합 또는 NuMA 방출에 의해 측정된다. GT, GA, GC 및 GG 서열은 결장암 세포주에서 증식을 억제하며, 세포 사이클 저지를 유도하고 아폽토시스를 유도한다.
피하 인간 결장직장암 세포주를 지니는 SCID 마우스는 생리식염수로 또는 시험관내에서 인간 결장직장암 세포주에 대한 항암 활성을 가진 2-20 염기 GT, GA, GC 및 GG 서열로 처리된다. 시험관내에서 인간 결장직장암 세포주에 대한 항암 활성을 가지는 2-20 염기 GT, GA, GC 및 GG 서열로 처리된 마우스는 생리식염수로 처리된 마우스에 비해 종양괴가 현저히 줄었음을 보인다.
본 발명은 상세히 이의 특정 양태에 관하여 설명하기는 하였지만, 본 발명의 취지 및 범위의 일탈없이 다양한 변화와 변형이 일어날 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
<110> Phillip, Nigel Filion, Mario <120> Therapeutically Useful Synthetic Oligonucleotides <130> 6857-21 <150> 60/170,325 <151> 1999-12-13 <150> 60/228,925 <151> 2000-08-29 <160> 87 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 1 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg 27 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 2 gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg 27 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 3 gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 4 gggggggtgg gggggtgggg gggtggg 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 5 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgt 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 6 tctctctctc tctctctctc tctctct 27 <210> 7 <211> 3 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 7 tgt 3 <210> 8 <211> 3 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 8 gtg 3 <210> 9 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 9 tgtgtg 6 <210> 10 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 10 gtgtgt 6 <210> 11 <211> 9 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 11 tgtgtgtgt 9 <210> 12 <211> 9 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 12 gtgtgtgtg 9 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 13 tgtgtgtgtg tg 12 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 14 gtgtgtgtgt gt 12 <210> 15 <211> 14 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 15 tgtgtgtgtg tgtg 14 <210> 16 <211> 15 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 16 gtgtgtgtgt gtgtg 15 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 17 tgtgtgtgtg tgtgtgtg 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 18 gtgtgtgtgt gtgtgtgt 18 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 19 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg t 21 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 20 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt g 21 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 21 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtg 24 <210> 22 <211> 24 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 22 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgt 24 <210> 23 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 23 tttgtt 6 <210> 24 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 24 ggtggg 6 <210> 25 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 25 gggtgg 6 <210> 26 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 26 ttgttt 6 <210> 27 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 27 aagtaa 6 <210> 28 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 28 ccgtcc 6 <210> 29 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 29 tggttg 6 <210> 30 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 30 atgtat 6 <210> 31 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 31 aggtga 6 <210> 32 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 32 gagtga 6 <210> 33 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 33 gggtct 6 <210> 34 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 34 ccgtgg 6 <210> 35 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 35 gggtcc 6 <210> 36 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 36 ctgtct 6 <210> 37 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 37 tcgttc 6 <210> 38 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 38 cggtgc 6 <210> 39 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 39 ttgtgg 6 <210> 40 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 40 gggttt 6 <210> 41 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 41 ggttgg 6 <210> 42 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 42 ggaagg 6 <210> 43 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 43 ggccgg 6 <210> 44 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 44 gggggg 6 <210> 45 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 45 gggagg 6 <210> 46 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 46 gggcgg 6 <210> 47 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 47 ggaggg 6 <210> 48 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 48 gtgggg 6 <210> 49 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 49 ttaggg 6 <210> 50 <211> 2 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 50 gt 2 <210> 51 <211> 2 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 51 tg 2 <210> 52 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 52 gtgg 4 <210> 53 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 53 ttgt 4 <210> 54 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 54 gtgt 4 <210> 55 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 55 ttgg 4 <210> 56 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 56 ggtg 4 <210> 57 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 57 tgtt 4 <210> 58 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 58 ggtt 4 <210> 59 <211> 4 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 59 tgtg 4 <210> 60 <211> 5 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 60 ggtgg 5 <210> 61 <211> 5 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 61 gggtg 5 <210> 62 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 62 ggggtgg 7 <210> 63 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 63 gggtggg 7 <210> 64 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 64 tgggtgg 7 <210> 65 <211> 7 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 65 gggtggt 7 <210> 66 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 66 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtg 27 <210> 67 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 67 gggtgggtgg gtgggtgggt gggtggg 27 <210> 68 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 68 gggggtgggg gtgggggtgg gggtggg 27 <210> 69 <211> 27 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 69 gggggggtgg gggggtgggg gggtggg 27 <210> 70 <211> 6 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 70 tgtgtg 6 <210> 71 <211> 6 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<213> Synthetic Oligonucleotide <400> 82 ggttttgttt g 11 <210> 83 <211> 12 <212> DNA <213> Synthetic Oligonucleotide <400> 83 ttgttttttt tg 12 <210> 84 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic Peptide <400> 84 Tyr Val Ala Asp 1 <210> 85 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic Peptide <400> 85 Asp Glu Val Asp 1 <210> 86 <211> 5 <212> PRT <213> Synthetic Peptide <220> <221> SITE <222> (4) <223> X = Any Amino Acid <400> 86 Ile Leu Glu Xaa Cys 1 5 <210> 87 <211> 4 <212> PRT <213> Synthetic Peptide <400> 87 Ile Glu Gly Asp 1

Claims (44)

  1. 3'-OH, 5'-OH 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8-10, 25, 26, 41-43, 45 및 46으로 구성된 군으로부터 선택되는, 암 치료 또는 예방용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 8의 서열인 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 9의 서열인 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10의 서열인 조성물.
  5. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 25의 서열인 조성물.
  6. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 26의 서열인 조성물.
  7. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 41의 서열인 조성물.
  8. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 42의 서열인 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 43의 서열인 조성물.
  10. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 45의 서열인 조성물.
  11. 제 1 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 46의 서열인 조성물.
  12. 제 1 항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학요법제를 추가로 포함하는 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, 화학요법제가 항-대사산물, 알킬화제 및 호르몬 길항제로 구성된 군 중에서 선택되는 조성물.
  15. 서열번호 8-10, 25, 26, 41-43, 45 및 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 조성물을, 세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도, 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 생산으로 구성된 군 중에서 선택된 반응 유도 유효량으로 인간을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료 또는 예방 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 8의 서열인 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 9의 서열인 방법.
  18. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10의 서열인 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 25의 서열인 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 26의 서열인 방법.
  21. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 41의 서열인 방법.
  22. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 42의 서열인 방법.
  23. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 43의 서열인 방법.
  24. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 45의 서열인 방법.
  25. 제 15 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 46의 서열인 방법.
  26. 제 15 항에 있어서, 아폽토시스의 유도가 캐스페이즈 3과 관련없는 방법.
  27. 제 15 항에 있어서, 사이토카인이 IL-1-베타, IL-6, IL-10, IL-12, 및 TNF-알파로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  28. 제 15 항에 있어서, 암이 1차 암종, 2차 암종, 1차 육종 및 2차 육종으로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 암이 백혈병, 림프종, 유방암, 전립선암, 결장직장암, 난소암 및 골암으로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  30. 제 15 항에 있어서, 조성물이 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 방법.
  31. 제 15 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 화학요법제를 추가로 포함하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 화학요법제가 항-대사산물, 알킬화제 및 호르몬 길항제로 구성된 군 중에서 선택되는 방법.
  33. 서열번호 8-10, 25, 26, 41-43, 45 및 46으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드를 첨가하는 단계를 포함하는,
    세포 사이클 저지의 유도, 증식 억제, 암 세포에서 캐스페이즈의 활성화와 아폽토시스의 유도, 및 면역 시스템 세포에 의한 사이토카인의 생산으로 구성된 군 중에서 선택된 반응 유도용 약제의 제조 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 8의 서열인 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 9의 서열인 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 10의 서열인 방법.
  37. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 25의 서열인 방법.
  38. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 26의 서열인 방법.
  39. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 41의 서열인 방법.
  40. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 42의 서열인 방법.
  41. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 43의 서열인 방법.
  42. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 45의 서열인 방법.
  43. 제 33 항에 있어서, 합성 포스포디에스테르 뉴클레오타이드 서열이 서열번호 46의 서열인 방법.
  44. 제 33 항에 있어서, 약제가 인간 또는 동물의 암 치료용인 방법.
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