ES2543710T3 - Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U - Google Patents

Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U Download PDF

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Abstract

Una composición inmunoestimulante, que comprende: un oligómero de ARN aislado con una longitud de 5-40 nucleótidos que tiene una secuencia de bases que comprende al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U), en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG; y un lípido catiónico.

Description

Oligorribonucleótidos inmunoestimulantes que contienen G y U
Campo de la invención
La presente invención se refiere por lo general al campo de la inmunología y la estimulación inmune. De forma más particular, la presente invención se refiere a composiciones que contienen ácidos ribonucleicos inmunoestimulantes, homólogos de dichos ácidos ribonucleicos inmunoestimulantes, y procedimientos de tratamiento que usan dichas composiciones. Se cree que las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención son útiles para inducir la señalización a través del receptor 7 de tipo Toll (TLR7) y el receptor 8 de tipo Toll (TLR8).
Antecedentes de la invención
La respuesta inmune se divide conceptualmente en inmunidad innata e inmunidad adaptativa. Se cree que la inmunidad innata implica el reconocimiento de patrones moleculares asociados con agentes patógenos (PAMP) compartidos en común con ciertas clases de moléculas expresadas por microorganismos infecciosos o macromoléculas extrañas. Se cree que los PAMP se reconocen por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en ciertas células inmunes.
Los receptores de tipo toll (TLR) son una familia de polipéptidos altamente conservados que desempeñan un papel crítico en la inmunidad innata en mamíferos. En la actualidad, se han identificado diez miembros de la familia, denominados TLR1 -TLR10. Los dominios citoplasmáticos de los diversos TLR se caracterizan por un dominio receptor (TIR) de Toll-interleuquina 1 (IL-1). Medzhitov R y col. (1998) Mol Cell 2: 253-8. El reconocimiento de la invasión microbiana por los TLR desencadena la activación de una cascada de señalización que esta conservada de forma evolutiva en Drosophila y mamíferos. Se ha informado que la proteína MyD88 adaptadora que contiene el dominio TIR se asocia con los TLR y recluta la quinasa asociada al receptor IL-1 (IRAK) y el factor 6 asociado a receptores (TRAF6) de factor de necrosis tumoral (TNF) a los TLR. Se cree que la ruta de señalización dependiente de MyD88 conduce a la activación de factores de transcripción de NF-KB y proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) de quinasa c-Jun NH2 terminal (Jnk), etapas críticas en la activación inmune y la producción de citoquinas inflamatorias. Para una revisión, véase Aderem A y col. (2000) Nature 406: 782-87.
Aunque se ha informado de un número específico de ligandos de TLR, aún quedan por identificar ligandos para algunos TLR. Los ligandos para TLR2 incluyen peptidoglicanos y lipopéptidos. Yoshimura A y col. (1999) J Immunol
163: 1-5; Yoshimura A y col. (1999) J Immunol 163: 1-5; Aliprantis AO y col. (1999) Science 285: 736-9. Se ha informado que el ARN bicatenario derivado de virus (ARNds) y poli I:C, un análogo sintético del ARNds, son ligandos de TLR3. Alexopoulou L y col. (2001) Nature 413: 732-8. El lipopolisacárido (LPS) es un ligando para TLR4. Poltorak A y col. (1998) Science 282: 2085-8; Hoshino K y col. (1999) J Immunol 162: 3749-52. La flagelina bacteriana es un ligando para TLR5. Hayashi F y col. (2001) Nature 410: 1099-1103. Se ha informado que el peptidoglicano es obligándonos solamente para TLR2 sino también para TLR6. Ozinsky A y col. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97: 13766-71; Takeuchi O y col. (2001) Int Immunol 13: 933-40. Se ha informado que el ADN bacteriano (ADN CpG) es un ligando de TLR9. Hemmi H y col. (2000) Nature 408: 740-5; Bauer S y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 9237-42. Todos los ligandos de TLR enumerados anteriormente incluyen ligamentos naturales, es decir, ligandos de TLR encontrados en la naturaleza como moléculas expresadas por microorganismos infecciosos. Los ligandos naturales para TLR1, TLR7, TLR8 y TLR10 no se conocen, aunque recientemente se informó que ciertos compuestos sintéticos de bajo peso molecular, las imidazoquinolonas imiquimod (R-837) y resiquimod (R848), eran ligandos de TLR7. Hemmi H y col. (2002) Nat Immunol 3: 196-200.
Sumario de la invención
La presente invención se basa en parte en el nuevo descubrimiento por los inventores de ciertos ARN inmunoestimulantes y moléculas de de tipo ARN (en lo sucesivo en el presente documento, simplemente "ARN"). Los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en las composiciones inmunoestimulantes de la invención requieren una secuencia de bases que incluya al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U), en las que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG. La G puede ser una variante homólogo de G y/o el U puede ser independientemente una variante u homólogo de U. de forma sorprendente, las moléculas de ARN inmunoestimulante pueden ser monocatenarias o al menos parcialmente bicatenarias. También de forma sorprendente, las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención no requieren un motivo de CpG para ejercer su efecto inmunoestimulante. Sin que signifique que se queda ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante señalizan a través de una ruta dependiente de MyD88, probablemente a través de un TLR. También sin que signifique que se queda ligado por ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante interactúan con y señalizar a través de TLR8, TLR7, o algún otro TLR que aún está por identificar.
Los inventores también creen que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención son representativas de la clase de moléculas de ARN, encontradas en la naturaleza, que pueden inducir una respuesta inmune. Sin que signifique que se queda ligado a ninguna teoría o mecanismo en particular, los inventores creen que
la clase correspondiente de moléculas de ARN encontradas en la naturaleza está presente en el ARN ribosómico (ARNr), ARN de transferencia (ARNt), ARN mensajero (ARNm), y ARN viral (ARNv). A este respecto se debe observar que las moléculas de ARN inmunoestimulante de la presente invención tienen 5-40 nucleótidos de longitud. Tales moléculas de ARN cortas entran dentro del intervalo de los ARN mensajeros de longitud completa que se describe que son útiles en la transfección de células dendríticas para inducir una respuesta inmune a antígenos de cáncer. Véase, por ejemplo, Boczkowski D y col. (1996) J Exp Med 184: 465-72; Mitchell DA y col. (2000) Curr Opin Mol Ther 2: 176-81.
También se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención se pueden combinar de forma ventajosa con ciertos agentes que estimulan la estabilización del ARN, formación de grupos locales de las moléculas de ARN, y/o tráfico de las moléculas de RNA en el compartimento endosómico de las células. En particular, se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que ciertos lípidos y/o liposomas son útiles a este respecto. Por ejemplo, parece que ciertos lípidos catiónicos, incluyendo en particular metil-sulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)-propil]N,N,N-trimetilamonio (DOTAP), son especialmente ventajosos cuando se combinan con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención. Como otro ejemplo, la conjugación covalente de un resto de colesterilo con el ARN, por ejemplo en el extremo en la posición 3' del ARN, estimula el efecto inmunoestimulante del ARN, incluso en ausencia de lípido catiónico.
La invención proporciona composiciones de materia y procedimientos de tratamiento relacionados con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la invención. Las composiciones y procedimientos son útiles, entre otros, para activar las células inmunes in vivo, in vitro, y ex vivo; para tratar infecciones; para tratar cáncer; para preparar una composición farmacéutica; para identificar un receptor diana paral ARN inmunoestimulante; y para identificar sistemáticamente y para caracterizar compuestos inmunoestimulantes adicionales. Además, las composiciones de material y procedimientos de tratamiento relacionados con las moléculas de ARN inmunoestimulante usadas en la presente invención se pueden combinar de forma ventajosa con otras composiciones inmunoestimulantes de materia y procedimientos de tratamiento relacionados contables otras composiciones inmunoestimulantes de materia.
En un aspecto, la invención proporciona una composición inmunoestimulante que comprende un oligómero de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que tiene al menos un 60 % de guanina
(G) y uracilo (U) en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG, y un lípido catiónico. El oligómero de ARN puede ser de origen natural o natural. Un oligómero de ARN se puede derivar del ARN procariótico o se puede derivar del ARN eucariótico. Además, el oligómero de ARN de origen natural puede incluir una parte de un ARN ribosómico. Un oligómero de ARN de origen no natural puede incluir una molécula de ARN sintetizada fuera de una célula, por ejemplo, usando técnicas químicas conocidas por los expertos en la materia. En una realización, un oligómero de ARN puede incluir un derivado de un oligómero de ARN de origen natural.
Preferentemente, el oligómero de ARN aislado es un ARN rico en G y U como se define a continuación.
En una realización, el ARN inmunoestimulante que contiene G y U es una molécula de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que incluye una secuencia de bases como se proporciona con 5'-RURGY-3', en la que R representa purina, U representa uracilo, G representa guanina, e Y representa pirimidina. En una realización, el ARN inmunoestimulante que contiene G y U es una molécula de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que incluye una secuencia de bases como se proporciona con 5'-GUAGU-3', en la que A representa adenina. En una realización, el ARN inmunoestimulante que contiene G y U es una molécula de ARN aislada que incluye una secuencia de bases como se proporciona con 5'-GUAGUGU-3'.
En una realización, el ARN inmunoestimulante que contiene G y U es una molécula de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que incluye una secuencia de bases como se proporciona con 5'-GUUGB-3', en la que B representa U, G, o C.
En una realización, el ARN inmunoestimulante que contiene G y U es una molécula de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que incluye una secuencia de bases como se proporciona con 5-GUGUG-3'.
En otras realizaciones la molécula de ARN aislada puede contener múltiplos de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, combinaciones de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente, o combinaciones de cualquiera de las secuencias mencionadas anteriormente incluyendo múltiplos de cualquiera de las secuencias mencionas anteriormente. Los múltiplos y combinaciones se pueden unir directamente o se pueden unir indirectamente, es decir, a través de un nucleósido o secuencia intermedia. En una realización, el nucleósido de unión intermedia es G; en una realización, el nucleósido de unión intermedia es U.
En una realización, la secuencia de bases incluye 5'-GUGUUUAC-3'. En una realización, la secuencia de bases es 5'-GUGUUUAC-3'.
En otra realización, la secuencia de bases incluye 5'-GUAGGCAC-3'. En una realización, la secuencia de bases es 5'-GUAGGCAC-3'.
Además en otra realización la secuencia de bases incluye 5'-CUAGGCAC-3'. En una realización, la secuencia de bases es 5'-CUAGGCAC-3'.
Además en otra realización, la secuencia de bases incluye 5'-CUCGGCAC-3'. En una realización, la secuencia de bases es 5'-CUCGGCAC-3'.
En una realización, el oligómero tiene 5-12 nucleótidos de longitud, más preferentemente, el oligómero tiene 8-12 nucleótidos de longitud.
La secuencia de bases del oligómero de ARN puede ser al menos parcialmente autocomplementaria. En una realización, la extensión de la autocomplementariedad es de al menos un 50 por ciento. La extensión de la autocomplementariedad se puede extender y puede incluir un 100 por ciento. Por lo tanto, por ejemplo, la secuencia de bases del oligómero de ARN al menos parcialmente autocomplementario en diversas realizaciones puede tener una autocomplementariedad de al menos un 50 por ciento, al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos un 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, o un 100 por ciento. Los pares de bases complementarias incluyen guanina-citosina(G-C), adenina-uracilo (A-U), adenina-timina (A-T), y guanina-uracilo (G-U). El emparejamiento de bases "oscilante" de G-U, que es bastante común en el ARN ribosómico y en los retrovirus de ARN, es en cierto modo más débil que en el emparejamiento de bases de Watson-Crick tradicional entre G-C, A-T, o A-U. Una secuencia parcialmente autocomplementaria puede incluir una o más partes de secuencia autocomplementaria. En una secuencia de bases que implica una secuencia parcialmente autocomplementaria, el oligómero de ARN puede incluir una parte de autocomplementaria colocada en y que incluye cada extremo del oligómero.
En una realización de acuerdo con este aspecto de la invención, el oligómero es una pluralidad de oligómeros, es decir, una pluralidad de oligómeros de ARN cada uno con 6-40 nucleótidos de longitud que tienen una secuencia de bases que comprende al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U). La pluralidad de oligómeros puede incluir, pero no es necesario, secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí. Preferentemente, la pluralidad de oligómeros incluye un oligómero que tiene una primera secuencia de bases y un oligómero que tiene una segunda secuencia de bases, en los que la primera secuencia de bases y la segunda secuencia de bases son complementarias en al menos un 50 por ciento. Por lo tanto, por ejemplo las secuencias de bases al menos parcialmente complementarias pueden ser complementarias en al menos un 50 por ciento, al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos un 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, o un 100 por ciento. Como se ha descrito anteriormente, los pares de bases complementarias incluyen guanina-citosina (G-C), adenina-uracilo (A-U), adenina-timina (A-T), y guanina-uracilo (G-U). Las secuencias parcialmente complementarias pueden incluir una o más partes de secuencias complementarias, por ejemplo, las secuencias parcialmente complementarias pueden incluir una porción complementaria colocada en y que incluya al menos un extremo de los oligómeros.
En una realización, el oligómero es una pluralidad de oligómeros que incluyen oligómero que tiene una secuencia de bases que incluye 5'-GUGUUUAC-3' y un oligómero que tiene una secuencia de bases que incluye 5'-GUAGGCAC3'. En una realización, el oligómero es una pluralidad de oligómeros que incluyen oligómero que tiene una secuencia de bases 5'-GUGUUUAC-3' y un oligómero que tiene una secuencia de bases 5'-GUAGGCAC-3'.
Además, de acuerdo con este aspecto de la invención, en diversas realizaciones el oligómero incluye una unión de la estructura principal no natural, una base modificada, un azúcar modificado, o cualquier combinación de los mencionados anteriormente. La unión de la estructura principal no natural puede ser un enlace estabilizado , es decir un enlace que es una tirante resistentes frente a la degradación de ARNsa o nucleasa, en comparación con el enlace de fosfodiéster. En una realización, la unión no natural de la estructura principal es un enlace fosforotioato. El oligómero puede incluir una unión de la estructura principal no natural o una pluralidad de uniones de la estructura principal no naturales, cada una seleccionada independientemente del resto. La base modificada puede ser G y U, A, o C modificada, incluyendo la al menos una G y el al menos un U de la secuencia de bases de acuerdo con este aspecto de la invención. En algunas realizaciones, la base modificada se puede seleccionar entre 7desazaguanosina, 8-azaguanosina, 5-metiluracilo, y pseudouracilo. El oligómero puede incluir una base modificada o una pluralidad de bases modificadas, cada una sección a independientemente del resto. El azúcar modificado puede ser un azúcar metilado, arabinosa. El oligómero puede incluir un azúcar modificado o una pluralidad de azúcares modificados, cada uno seleccionado independientemente del resto.
En una realización, el lípido catiónico es metil-sulfato de N-[1-(2,3-dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP). Se cree que DOTAP transporta oligómero de ARN en células y realiza el tráfico de forma específica al compartimento endosómico, en el que puede liberar el oligómero de ARN de una forma dependiente del pH. Una vez que se encuentra en el compartimento endosómico, el ARN por interactuar con ciertas moléculas receptoras de tipo Toll intracelulares (TLR), que desencadenan las rutas de transducción de señales mediadas por TLR implicadas en la generación de una respuesta inmune. Otros agentes con propiedades similares que incluyen el tráfico al compartimento endosómico se pueden usar en lugar de o además de DOTAP.
En una realización, la composición inmunoestimulante incluye adicionalmente un antígeno. En una realización, el antígeno es un alérgeno. En una realización, el antígeno es un antígeno para el cáncer. En una realización, el antígeno es un antígeno microbiano.
También de acuerdo con este aspecto de la invención, en otra realización una composición inmunoestimulante de la invención comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los procedimientos para preparar la composición farmacéutica implican la colocación de una composición inmunoestimulante de la invención en contacto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por conveniencia, la composición farmacéutica se puede formular en una forma de dosificación unitaria.
En otro aspecto la invención proporciona un procedimiento de activación de una célula inmune in vitro. El procedimiento implica poner en contacto una célula inmune con una composición inmunoestimulante de la invención, que se ha descrito anteriormente, en una cantidad eficaz para inducir la activación de la célula inmune. La activación de la luna inmune implica la secreción de una citoquina por la célula inmune. La citoquina se puede seleccionar entre el grupo que consiste en interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 12 (IL-12), un interferón (IFN), y factor de necrosis tumoral (TNF). La activación de la célula puede incluir la secreción de una quimioquina tal como proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10). La activación de la celular inmune influye la expresión de una molécula coestimulante/auxiliar por la célula inmune que se puede seleccionar entre el grupo que consiste en moléculas de adhesión intercelular (Ias lCAM, por ejemplo, CD54), antígenos asociados a la función leucocitaria (los LFA, por ejemplo, CD58), los B7 (CD80, CD86), y CD40.
La activación de la célula inmune puede implicar la activación de una ruta de transducción de señales dependiente de MyD88. Se cree que MyD88 es una molécula adaptadora que interactúa con el dominio receptor de Toll/interleuquina-1 (TIR) de diversas moléculas receptoras de tipo Toll (TLR) y participa en las rutas de transducción de señales que por último dan como resultado la activación del factor kappa B nuclear (NF-KB). Por lo tanto, la ruta de transducción de señales dependiente de MyD88 se asocia con un TLR, más particularmente, cuando el TLR es TLR8 o el TLR es TLR 7.
La célula inmune puede ser una célula inmune humana o una célula dendrítica mieloide.
Como se desvela en el presente documento, la puesta en contacto se produce in vitro o in vivo.
También se desvela un procedimiento de tratamiento mediante la inducción de una respuesta inmune en un sujeto. El procedimiento de tratamiento de acuerdo con este aspecto de la invención implica la administración a un sujeto de una composición inmunoestimulante de la invención en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto. Se debe indicar que el procedimiento de tratamiento de acuerdo con este aspecto de la invención no implica la administración de un antígeno al sujeto. El sujeto puede ser un ser humano. En una realización, el sujeto padece o está en riesgo de padecer un cáncer. En una realización, el sujeto tiene o está en riesgo de tener una infección con un agente seleccionar entre el grupo que consiste en virus, bacterias, hongos, y parásitos. En una realización en particular, el sujeto tiene o está en riesgo de tener una infección vírica. También se debe indicar que el procedimiento de acuerdo con este aspecto de la invención se puede usar para tratar un sujeto con una capacidad suprimida para remontar una respuesta inmune eficaz o deseable. Por ejemplo, el sujeto puede tener un sistema inmune suprimido debido a una infección, un cáncer, una enfermedad aguda o crónica tal como insuficiencia renal o hepática, cirugía, y una exposición a un agente inmunosupresor tal como quimioterapia, radiación, ciertos fármacos,
o similares. En una realización, el sujeto tiene o está en riesgo de tener una alergia o asma. Tal sujeto se puede exponer a o estar en riesgo de exposición a un alérgeno que está asociado con una respuesta alérgica o asma en el sujeto.
También se desvela un procedimiento de tratamiento mediante la inducción de una respuesta inmune en un sujeto que implica la administración de un antígeno a un sujeto, y la administración al sujeto de una composición inmunoestimulante de la invención en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune al antígeno. Se debe indicar que el antígeno se puede administrar antes, después, o de forma simultánea con la composición inmunoestimulante de la invención. Además, tanto el antígeno como el compuesto inmunoestimulante se puede administrar sujeto más de una de.
En una realización de acuerdo con este aspecto de la descripción, el antígeno es un alérgeno. En una realización de acuerdo con este aspecto de la descripción, el antígeno es un antígeno para el cáncer. El antígeno para el cáncer puede ser un antígeno para el cáncer aislado del sujeto. En otra realización el antígeno es un antígeno microbiano. El antígeno microbiano puede ser un antígeno de un virus, una bacteria, un hongo, o un parásito.
La descripción proporciona adicionalmente, en otro aspecto adicional, un procedimiento de tratamiento mediante la inducción de la respuesta inmune en un sujeto que implica aislar células dendríticas de un sujeto, poner en contacto las células dendríticas ex vivo con una composición inmunoestimulante de la invención, poner en contacto las células dendríticas ex vivo con un antígeno, y administrar las células dendríticas puestas en contacto con el sujeto.
En una realización de acuerdo con este aspecto, el antígeno es un alérgeno. En una realización de acuerdo con este aspecto, el antígeno es un antígeno para el cáncer. El antígeno para el cáncer puede ser un antígeno para el cáncer aislado del sujeto. En otra realización el antígeno es un antígeno microbiano. El antígeno microbiano puede ser un antígeno de un virus, una bacteria, un hongo, o un parásito.
Una respuesta inmune que surge de la estimulación de un TLR se puede modificar, potenciar o amplificar mediante la estimulación de otro TLR, y el efecto inmunoestimulante combinado puede ser sinérgico. Por ejemplo, se informa
que TLR9 responde al ADN bacteriano y, de forma más general, ADN CpG. Una respuesta inmune que surge de TLR9 poniendo en contacto su ligando natural (o cualquier ligando de TLR9) se puede modificar, potencial amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR7 con un ligando de TLR7, o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR8 con un ligando de TLR8, o ambos. Del mismo modo, una respuesta inmune que surge de TLR7 poniendo en contacto un ligando de TLR7 se puede modificar, potenciar o amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR8 con un ligando de TLR8, o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR9 con ADN CpG (o cualquier ligando de TLR9 adecuado), o ambos. Además como otro ejemplo, una respuesta inmune que surge de TLR8 poniendo en contacto un ligando de TLR8 se puede modificar, potenciar o amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR 7 con un ligando de TLR7, o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR9 con ADN CpG (o cualquier ligando de TLR9 adecuado),o ambos.
La presente descripción se basa en parte en el nuevo descubrimiento de los inventores de lo que se cree que son ligandos naturales para TLR7 y TLR8. Aunque se han descrito ligandos de origen natural derivados de microbios para ciertos TLR, anteriormente no se han descrito ligan dos naturales para TLR7 y TLR8. Ciertas moléculas pequeñas sintéticas, compuestos de imidazoquinolina, se han descrito como ligandos para TLR7, pero tales compuestos se van a distinguir de los ligandos naturales de la presente invención. Hemmi H y col. (2002) Nat Immunol 3: 196-200.
Los ligandos naturales aislados de TLR7 y TLR8 son útiles como composiciones que pueden inducir, potenciar, y complementar una respuesta inmune. Los ligandos naturales de TLR7 y TLR8 son útiles para la preparación de nuevas composiciones que pueden inducir, potenciar, y complementar una respuesta inmune. Además, los ligandos naturales de TLR7 y TLR8 son útiles para inducir de forma selectiva la señalización mediada por TLR7 y TLR8 y para inducir de forma selectiva respuestas inmunes mediadas por TLR7 y TLR8. Además, los ligandos naturales de TLR7 y TLR8 son útiles en el diseño y la realización de ensayos de identificación sistemática para la identificación y selección de compuestos inmunoestimulantes.
La presente descripción también se basa en parte en el nuevo descubrimiento de que los neutrófilos humanos expresan TLR8 fuertemente. Esta observación es importante porque los neutrófilos son muy a menudo las primeras células para involucrar agentes patógenos infecciosos y por lo tanto para iniciar respuestas. Se cree que los neutrófilos activados segregan quimioquinas y citoquinas, que a su vez son fundamentales en el reclutamiento de células dendríticas. Las células dendríticas que expresan TLR9 atraídas al sitio de los neutrófilos activados allí se llegan a activar, amplificando de este modo la respuesta inmune.
La presente descripción también se basa en parte en la observación de la expresión diferencial de diversos TLR, incluyendo TLR7, TLR8, y TLR9, en diversas células del sistema inmune. Esta segregación puede ser de significancia en particular en seres humanos con respecto a TLR 7, TLR8, y TLR9. La respuesta inmune que surge de la estimulación de uno cualquiera de estos TLR se puede potencial o amplificar mediante la estimulación de otro TLR, y el efecto inmunoestimulante combinado puede ser sinérgico. Por ejemplo, se informa que TLR9 responde al ADN bacteriano y, de forma más general, ADN CpG. Una respuesta inmune que surge de TLR9 poniendo en contacto su ligando natural (o cualquier ligando de TLR9) se puede potenciar o amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR7 con su ligando natural (o cualquier ligando de TLR7 adecuado), o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR8 con su ligando natural (o cualquier ligando de TLR8 adecuado), o ambos. Del mismo modo, una respuesta inmune que surge de TLR7 poniendo en contacto su ligando natural (o cualquier ligando de TLR7) se puede potenciar o amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR8 con su ligando natural (o cualquier ligando de TLR8 adecuado), o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR9 con ADN CpG (o cualquier ligando de TLR9 adecuado), o ambos. Como otro ejemplo adicional, una respuesta inmune que surge de TLR8 poniendo en contacto su ligando natural (o cualquier ligando de TLR8) se puede potenciar o amplificar también poniendo en contacto de forma selectiva TLR7 con su ligando natural (o cualquier ligando de TLR7 adecuado), o también poniendo en contacto de forma selectiva TLR9 con ADN CpG (o cualquier ligando de TLR9 adecuado), o ambos.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que incluye una cantidad eficaz de un ligando para TLR8 para inducir la señalización de TLR8 y una cantidad eficaz de un ligando para un segundo TLR seleccionar entre el grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR9 y TLR10 para inducir la señalización mediante el segundo TLR. Preferentemente, el segundo TLR es TLR3 o TLR7, más preferentemente el segundo TLR es TLR9. En una realización, ligando para TLR8 y el ligando para el segundo TLR están unidos. La composición también puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En el presente documento también se desvela una composición que incluye una cantidad eficaz de un ligando para TLR7 para inducir la señalización de TLR7 y una cantidad típica de un ligando para un segundo TLR seleccionado entre el grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR8, TLR9, y TLR10 para inducir la señalización mediante el segundo TLR. El segundo TLR es TLR3 o TLR8 o TLR9. El ligando para ligando de TLR7 o para el segundo TLR están unidos. La composición también puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición que incluye un conjugado de ADN:ARN, en la que el ADN del conjugado incluye un motivo de CpG eficaz para estimular la señalización de TLR9 y en la que el ARN del conjugado incluye ARN eficaz para estimular la señalización mediante TLR3, TLR7, TLR8, o cualquier
combinación de los mismos. En una realización, el conjugado incluye una estructura principal de ADN:ARN. En una realización, la estructura principal quimérica incluye un sitio de escisión entre el ADN y el ARN. En una realización, el conjugado incluye un heterodúplex de ADN:ARN bicatenario. La composición puede incluir adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención proporciona un procedimiento de tratamiento mediante la estimulación de la señalización de TLR8 implica poner en contacto TLR8 con un ARN aislado en una cantidad eficaz de una composición inmunoestimulante de acuerdo con la presente invención como se describe en el presente documento.
Además en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para estimular la señalización de TLR8 que implica poner en contacto TLR8 con una mezcla de nucleósidos que consisten básicamente en G y U en una relación entre 1 G:50 U y 10 G:1 U, en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR8. Los nucleósidos son ribonucleósidos o comprenden una mezcla de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos. La G también puede ser un derivado de guanosina seleccionado entre el grupo que consiste en: 8-bromoguanosina, 8-oxoguanosina, 8mercaptoguanosina, 7-alil-8-oxoguanosina, complejo de ribonucleósido de guanosina y vanadilo, inosina, y nebularina.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR8. El procedimiento implica poner en contacto TLR8 con una mezcla de complejos de ribonucleósido de vanadilo. En una realización, la mezcla comprende complejos de guanosina ribonucleósido de vanadilo.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR8. El procedimiento implica poner en contacto TLR8 con un oligonucleótido rico en G y U aislado que comprende la secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en: UUGUGG, UGGUUG, GUGUGU, y GGGUUU, en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR8. El oligonucleótido puede ser un oligorribonucleótido puede tener 7-50 bases de longitud, por ejemplo, 12-24 bases de longitud. El oligonucleótido puede tener la secuencia 5'-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3' (SEC ID Nº: 1).
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR8 que implica poner en contacto TLR8 con una molécula de ácido nucleico al menos parcialmente bicatenario que comprende al menos un par de bases G-U, en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR8.
Además en otro aspecto, la invención proporcionó procedimiento de tratamiento mediante el complemento de una respuesta inmune mediada por TLR8 que implica poner en contacto TLR8 con una cantidad eficaz de una composición inmunoestimulante de acuerdo con la presente invención para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8, y poner en contacto un TLR distinto de TLR8 con una cantidad eficaz de un ligando para el TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un procedimiento e tratamiento mediante el complemento de una respuesta inmune mediada por TLR8 en un sujeto. El procedimiento de tratamiento de acuerdo con este aspecto implica la administración a un sujeto con necesidad de una respuesta inmune una cantidad eficaz de una composición inmunoestimulante de acuerdo con la presente invención para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8, y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un ligando para un TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8. En una realización, el TLR distinto de TLR8 es TLR9. En una realización, ligando para TLR9 es un ácido nucleico CpG. El ácido nucleico de CpG puede tener una estructura principal estabilizada. El ligando para TLR8 y el ligando para TLR9 puede ser un conjugado, y el conjugado puede comprender un heterodúplex de ADN:ARN bicatenario. Como alternativa, el conjugado puede comprender una estructura principal quimérica de ADN:ARN, que puede comprender un sitio de escisión entre el ADN y el ARN.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con un ribonucleósido de guanosina aislado en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR7. El ribonucleósido de guanosina puede ser un derivado de ribonucleósido de guanosina seleccionado entre el grupo que consiste en: 8-bromoguanosina, 8-oxoguanosina, 8-mercaptoguanosina, 7-alil-8oxoguanosina, complejo de ribonucleósido de guanosina y vanadilo, inosina, y nebularina, preferentemente, el derivado de ribonucleósido de guanosina es la 8-oxoguanosina. El nucleósido guanosina puede ser un ribonucleósido. El nucleósido guanosina puede comprender una mezcla de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con un ácido nucleico aislado que comprende una guanosina terminal oxidada o halogenada en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR7. La guanosina oxidada o halogenada es la 8-oxoguanosina.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con un ARN aislado en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR7. El ARN puede ser ARN bicatenario. El ARN puede ser ARN ribosómico. El ARN puede ser ARN de transferencia. El ARN puede ser ARN mensajero. El ARN puede ser ARN viral. El ARN puede ser ARN rico en G. el ARN puede ser parte de un heterodúplex de ADN:ARN. El ARN puede consistir básicamente en el ribonucleósido de guanosina.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con una mezcla de núcleos y los que consiste básicamente en G y U en una proporción entre 1 G:50 U y 10 G:1 U, en una cantidad eficaz para estimular la señalización de TLR7.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para estimular la señalización de TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con una mezcla de complejos de ribonucleósido de vanadilo. La mezcla puede comprender complejos de de ribonucleósido de guanosina y vanadilo.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para complementar una respuesta inmune mediada por TLR7 que implica poner en contacto TLR7 con una cantidad eficaz de un ligando de TLR7 para inducir una respuesta inmune mediada por TLR7, y poner en contacto un TLR distinto de TLR7 con una cantidad eficaz de un ligando para el TLR distinto de TLR7 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR7.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para complementar una respuesta inmune mediada por TLR7 en un sujeto que implica administrar a un sujeto con necesidad de una respuesta inmune una cantidad eficaz de un ligando de TLR7 para inducir una respuesta inmune mediada por TLR7, y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un ligando para un TLR distinto de TLR7 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR7. El TLR distinto de TLR7 puede ser TLR9. El ligando para TLR9 puede ser un ácido nucleico CpG. El ácido nucleico de CpG puede tener una estructura principal estabilizada. El ligando para TLR7 y el ligando para TLR9 puede ser un conjugado. El conjugado puede comprender un heterodúplex de ADN:ARN bicatenario. El conjugado puede comprender una estructura principal de ADN:ARN quimérica. La estructura principal quimérica puede comprender un sitio de escisión entre el ADN y el ARN.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para identificar sistemáticamente compuestos inmunoestimulantes candidatos que implica medir una señal de referencia mediada por TLR8 como respuesta a una referencia de ARN, medir una señal de ensayo mediada por TLR8 como respuesta a un compuesto inmunoestimulante candidato, y comparar la señal de ensayo mediada por TLR8 con la señal de referencia mediada por TLR8.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para identificar sistemáticamente compuestos inmunoestimulantes candidatos, que comprende medir una señal de referencia mediada por TLR8 como respuesta a una referencia de imidazoquinolina, medir una señal de ensayo mediada por TLR8 como respuesta a un compuesto inmunoestimulante candidato, y comparar la señal de ensayo mediada por TLR8 con la señal de referencia mediada por TLR8.
En el presente documento también se desvela un procedimiento para identificar sistemáticamente compuestos inmunoestimulantes candidatos que implica medir una señal de referencia mediada por TLR7 como respuesta a una referencia de imidazoquinolina, medir una señal de ensayo mediada por TLR7 como respuesta a un compuesto inmunoestimulante candidato, y comparar la señal de ensayo mediada por TLR7 con la señal de referencia mediada por TLR7.
La imidazoquinolina puede ser resiquimod (R-848).
La imidazoquinolina puede ser imiquimod (R-837).
En el presente documento también se desvela un procedimiento para identificar sistemáticamente compuestos inmunoestimulantes candidatos que implica medir una señal de referencia mediada por TLR7 como respuesta a una referencia de 7-alil-8-oxoguanosina, medir una señal de ensayo mediada por TLR7 como respuesta a un compuesto inmunoestimulante candidato, y comparar la señal de ensayo mediada por TLR7 con la señal de referencia mediada por TLR7.
Cada una de las limitaciones de la invención puede incluir diversas realizaciones de la invención. Por lo tanto, se anticipa que cada una de las imitaciones de la invención implica uno cualquiera de los elementos o combinaciones de elementos se pueden incluir en cada aspecto de invención.
Breve descripción de las figuras
La FIG. 1 es un gráfico de barras que representa la secreción de IL-12 p40 por células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) como respuesta a ciertos estímulos que incluyen oligonucleótidos de ARN seleccionados que contienen G y U con o sin DOTAP ("con Liposomas" y "sin Liposomas", respectivamente), tal como se mide con ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas específico (ELISA). La letra minúscula “s” que aparece en las secuencias de bases se refiere a enlace de fosforotioato.
La FIG. 2 es un gráfico de barras que representa secreción de TNF-α por PBMC humanas como respuesta a ciertos estímulos que incluyen oligonucleótidos de ARN seleccionados que contienen G y U con o sin DOTAP ("con Liposomas" y “sin Liposomas”, respectivamente), tal como se mide con ELISA específico.
La FIG. 3 es un gráfico de barras que representa la dependencia de la dosis de la secreción de IL-12 p40 por PBMC humanos como respuesta a diversas concentraciones de oligonucleótidos de ARN seleccionados que contienen G y U (con DOTAP), tal como se mide con ELISA específico.
La FIG. 4 es un gráfico de barras que representa la dependencia de la secuencia de la secreción de TNF-α por PBMC humanas como respuesta a diversos oligonucleótidos de ARN seleccionados con relación al oligonucleótido de ARN GUAGGCAC (con DOTAP), tal como se mide con ELISA específico.
La FIG. 5 es un gráfico de barras que representa el efecto de DOTAP en la secreción de IL-12 p40por PBMC humanas como respuesta a diversos estímulos, tal como se mide con ELISA específico.
La FIG. 6 es un cuarteto de gráficos de barras que representan la secreción de IL-12 p40 mediante diversos tipos de células macrófagas de murino como respuesta una diversidad de compuestos inmunoestimulantes de ensayo y de control, tal como se mide con ELISA específico. Panel A, macrófagos de tipo silvestre en presencia de IFN-γ; Panel B, macrófagos deficientes en MyD88 en presencia de IFN-γ; Panel C, línea celular de macrófagos J774; Panel D, línea celular de macrófagos RAW 264.7.
La FIG. 7 es un par de gráficos que representan la secreción de (A) TNF-α y (B) IL-12 p40 por PBMC humanas después de incubación con secuencias de ARN derivado de VIH-1, con y sin DOTAP. Círculos, 5'-GUAGUGUGUG3' (SEC ID Nº: 2); Triángulos, 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEC ID Nº: 3). Símbolos abiertos, sin DOTAP; símbolos cerrados, con DOTAP.
La FIG. 8 es un gráfico que representa la relación aparente entre los TLR.
La FIG. 9 representa dominios de unión de ácidos nucleicos en TLR7, TLR8, y TLR9.
La FIG. 10 es un gráfico de barras que representa la respuesta de PBMC humanas a factor de respuesta riguroso (SRF).
La FIG. 11 es un gráfico de barras que representa la respuesta de PBMC humanas a los complejos de ribonucleósido de vanadilo (RVC). X se refiere a resiquimod.
La FIG. 12 es una serie de tres gráficos de barras que representan la respuesta de TLR7 humano y TLR8 humano a ribonucleósidos individuales. X se refiere a resiquimod.
La FIG. 13 es una serie de tres gráficos de barras que representan la respuesta de TLR7 y TLR8 a mezclas de dos ribonucleósidos.
La FIG. 14 es un gráfico de barras que representa la respuesta de PBMC humanas a una mezcla de los ribonucleósidos G y U.
La FIG. 15 es un gráfico de barras que representa la respuesta de PBMC humanas a oligonucleótidos de ARN rico en G y U, pero no ADN.
La FIG. 16 es un gráfico de barras que representa la respuesta de PBMC humanas a ARN oxidado.
La FIG. 17 es una serie de tres gráficos de barras que representan respuestas de TLR7 y TLR8 humano al ribonucleósido de guanosina oxidado. X se refiere al resiquimod.
La FIG. 18 es un par de gráficos de barras que representan respuestas de TLR7 humano a ribonucleósidos guanosina modificados.
La FIG. 19 es una serie de imágenes de gel alineadas que representan la expresión diferencial de TLR1-TLR9 en células dendríticas CD123+ humanas (DC CD123+), DC CD11c+, y neutrófilos.
La FIG. 20 es una serie de tres gráficos que representan la capacidad de oligómeros de ARN que contienen G y U monocatenarios, cortos para inducir NF-KB en células HEK-293 transfectadas de forma estable con plásmido de expresión para TLR7 humano o TLR8 humano.
Descripción detallada de la invención
La invención se refiere en parte al descubrimiento por los inventores de una serie de ARN y moléculas de relacionadas con ARN que son eficaces como compuestos inmunoestimulantes. La identificación de los compuestos inmunoestimulantes aparece a través de un esfuerzo sistemático dirigido a la identificación de ligandos de origen natural para TLR7 y TLR8. Como resultado de este esfuerzo, en la actualidad se ha descubierto que el ADN y moléculas de tipo ARN que contienen guanina (G) y uracilo (U), incluyendo secuencias específicas que contienen G y U, son inmunoestimulante as y parece que actúan a través de una ruta dependiente de MyD88, que implica la implicación de TLR. De forma significativa, algunas de las secuencias de ARN aparecen en características estructurales altamente conservadas de de regiones sin traducir en la posición 5' de ARN viral que son importantes
para la replicación viral. Las secuencias de ARN inmunoestimulante identificadas también corresponden o corresponden de forma muy próxima con otros ARN, que incluyen los ARNt derivados de bacterias y levadura, así como ARNr derivado de bacterias y posiblemente de algunos eucariotas. De forma importante, el ARN inmunoestimulante de las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención incluye ARN monocatenario, además de ARN parcial o totalmente bicatenario, y su efecto se puede anular mediante tratamiento con RNasa. Cuando el ARN es al menos parcialmente bicatenario, en una realización puede incluir una estructura de tallo-lazo. Tal como se describe con más detalle a continuación, se ha descubierto de acuerdo con la invención que los ARN ricos en G y U monocatenarios con una longitud tan corta como 5 nucleótidos pueden estimular la producción por parte de células inmunes de grandes cantidades de un número de citoquinas y quimioquinas, incluyendo TNF-α, IL-6, IL-12, interferón de tipo 1 (por ejemplo, IFN-α), e IP-10.
En la actualidad, los inventores han descubierto de forma sorprendente que ciertas moléculas de ARN que contienen G y U y sus análogos, pero no sus homólogos de ADN, son inmunoestimulantes. De forma significativa, los oligorribonucleótidos que contienen G y U de las invenciones pueden ser básicamente más pequeños que los ARN mensajeros que previamente se describió que eran útiles en la preparación de vacunas de células dendríticas. Véase, por ejemplo, Boczkowski D y col. (1996) J Exp Med 184: 465-72; Mitchell DA y col. (2000) Curr Opin Mol Ther 2: 176-81. Aunque las moléculas de ARN que contienen G y U de la invención pueden ser sustitutos para ARN ribosómico y/o ARN viral como se encuentra en la naturaleza, tienen una longitud tan pequeña como de 5-40 nucleótidos. Como se describe adicionalmente en el presente documento, los oligorribonucleótidos que contienen G y U de la invención incluyen al menos un 60 % de G y U. De forma sorprendente, la eliminación de cualquiera de G o U de los oligorribonucleótidos que contienen G y U de la invención básicamente anula su efecto inmunoestimulante. La G y el U pueden ser adyacentes entre sí, o se pueden separar mediante nucleósidos o secuencia intermedia. También de forma significativa, las moléculas de ARN inmunoestimulante que contienen G y U usadas en la invención no requieren dinucleótido CpG.
En consecuencia, la invención proporciona una composición inmunoestimulante que comprende un oligómero de ARN aislado de 5-40 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que tienen al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U) en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG; y un lípido catiónico. Como se describirá con más detalle adicionalmente a continuación, el oligómero de ARN inmunoestimulante de 5-40 nucleótidos de longitud que tiene una secuencia de bases que tiene al menos un 60 % guanina (G) y uracilo (U) se formula de forma ventajosa de modo que el oligómero de ARN se estabiliza frente a la degradación, se concentra en
o sobre una partícula tal como un liposoma, Ibarra o se dirige para la administración al compartimento endosómico de las células. En una formulación, que se describen los ejemplos que siguen a continuación, el oligómero de ARN se combina de forma ventajosa con el lípido catiónico DOTAP, que se cree que ayuda en el tráfico de los oligorribonucleótidos que contienen G y U en el compartimento endosómico.
El oligómero de ARN puede ser de origen natural o no natural. El ARN como se produce en la naturaleza es un tipo de ácido nucleico que por lo general se refiere a un polímero lineal de ciertas unidades de ribonucleósido, formado cada ribonucleósido por una base de purina o pirimidina y un azúcar ribosa, unidas por enlaces fosfodiéster internucleósidos. A este respecto, "lineal" pretende describir la estructura primaria de la ARN. En general, el ARN puede ser monocatenario o bicatenario, incluyendo parcialmente bicatenario.
Como se usa en el presente documento, "nucleósido" se refiere un solo resto de azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unido a una base orgánica intercambiable, que es cualquiera de una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Como se describe en el presente documento, el nucleósido may puede ser un nucleósido de origen natural, un nucleósido modificado, o un nucleósido sintético (artificial).
Las expresiones "ácido nucleico" y "oligonucleótido" se usan indistintamente para hacer referencia a múltiples nucleótidos (es decir, moléculas que comprenden un azúcar (por ejemplo, ribosa o desoxirribosa) unido a un grupo fosfato y a una base orgánica intercambiable, que es cualquiera de una pirimidina sustituida (por ejemplo, citosina (C), timidina (T) o uracilo (U)) o una purina sustituida (por ejemplo, adenina (A) o guanina (G)). Como se usa en el presente documento, las expresiones se refieren a oligorribonucleótidos así como a oligodesoxirribonucleótidos. Las expresiones también incluirán polinucleósidos (es decir, un polinucleótido menos el fosfato) y cualquier otro polímero que contenga base orgánica. Las moléculas de ácido nucleico se pueden obtener de fuentes existentes de ácidos nucleicos (por ejemplo, genómicas o ADNc), pero son preferentemente sintéticas (por ejemplo, producidas por síntesis de ácidos nucleicos).
Las expresiones ácido nucleico y oligonucleótido también incluye nacidos nucleicos u oligonucleótidos constituciones
o modificaciones, tal como en las bases y/o azúcares. Por ejemplo, incluye nacidos nucleicos que tienen azúcares de estructura principal que se unen de forma covalente a grupos orgánicos de bajo peso molecular distintos de un grupo hidroxilo en la posición 3' y distintos de un grupo fosfato en la posición 5'. Los ácidos nucleicos modificados de este modo pueden incluir un grupo ribosa alquilado en la posición 2'-0-. Además, los ácidos nucleicos modificados pueden incluir azúcares tales como arabinosa en lugar de ribosa. Por lo tanto, los ácidos nucleicos pueden tener una composición de la estructura principal heterogénea que contiene de este modo cualquier posible combinación de unidades de polímero unidas en conjunto tal como ácidos nucleicos peptídicos (que tienen estructura principal de aminoácido con bases de ácido nucleico). En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos tienen una composición de
la estructura principal homogénea. Los ácidos nucleicos también incluyen purinas y pirimidinas sustituidas tales como bases modificadas con propino C-5. Wagner RW y col. (1996) Nat Biotechnol 14: 840-4. Purinas y pirimidinas incluyen, pero no se limitan a, adenina, citosina, guanina, timidina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, y otras nucleobases de origen natural y no natural, restos aromáticos sustituidos y sin sustituir. Los expertos en la materia conocen bien otras de tales modificaciones.
Una base de nucleósido natural se puede sustituir con una base de nucleósido modificado, en la que la base de nucleósido modificado se selecciona, por ejemplo, entre hipoxantina; dihidrouracilo; pseudouracilo; 2-tiouracilo; 4tiouracilo; 5-aminouracilo; 5-alquil (C1-C6)-uracilo; 5-alquenil (C2-C6)-uracilo; 5-alquinil (C2-C6)-uracilo; 5(hidroximetil)uracilo; 5-clorouracilo; 5-fluorouracilo; 5-bromouracilo; 5-hidroxicitosina; 5-alquil (C1-C6)-citosina; 5alquenil (C2-C6)-citosina; 5-alquinil (C2-C6)-citosina; 5-clorocitosina; 5-fluorocitosina; 5-bromocitosina; N2dimetilguanina; 2,4-diamino-purina; 8-azapurina (incluyendo, en particular, 8-azaguanina); una 7-desazapurina sustituida (incluyendo, en particular, 7-desazaguanina), incluyendo 7-desaza-purina sustituida en la posición 7 y/o 7desaza-purina sustituida en la posición 8; u otras modificaciones de una base de nucleósido natural. Esta lista pretende ser a modo de ejemplo y no se va a interpretar como limitante.
En particular, la al menos una base de guanina del oligorribonucleótido inmunoestimulante que contiene G y U puede ser una guanina sustituida o modificada tal como 7-desazaguanina; 8-azaguanina; 7-desaza-guanina sustituida en la posición 7 (tal como 7-desaza-7-alquinil (C2-C6)guanina); 7-desaza-guanina sustituida en la posición 8; hipoxantina; 2,6-diaminopurina; 2-aminopurina; purina; guanina sustituida en la posición 8 tal como 8hidroxiguanina; y 6-tioguanina. Esta lista pretende ser a modo de ejemplo y no se va a interpretar como limitante.
También en particular, la al menos una base de uracilo del oligorribonucleótido que contiene G y U puede ser un uracilo sustituido o modificado tal como pseudouracilo y 5-metiluracilo.
Para uso en la presente invención, los ácidos nucleicos de la invención se pueden sintetizar de novo usando cualquiera de un número de procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el procedimiento de fosforamidita de β-cianoetilo (Beaucage SL y col. (1981) Tetrahedron Lett 22: 1859); procedimiento de H-fosfonato nucleósido (Garegg y col. (1986) Tetrahedron Lett 27: 4051-4; Froehler y col. (1986) Nucl Acid Res 14: 5399-407; Garegg y col. (1986) Tetrahedron Lett 27: 4055-8; Gaffney y col. (1988) Tetrahedron Lett 29: 2619-22). Estas químicas se pueden realizar mediante una diversidad de sintetizadores de ácidos nucleicos automatizados disponibles en el mercado. Estos ácidos nucleicos se denominan ácidos nucleicos sintéticos. Como alternativa, se pueden producir dinucleótidos ricos en T y/o TG a gran escala en plásmidos, (véase Sambrook T y col., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor laboratory Press., New York, 1989) y se pueden separar en piezas más pequeñas o administrar completos. Se pueden preparar ácidos nucleicos a partir de secuencias de ácidos nucleicos existentes (por ejemplo, genómico o ADNc) usando técnicas conocidas, tales como las que usan enzimas de restricción, exonucleasas o endonucleasas. Los ácidos nucleicos preparados de esta manera se denominan ácidos nucleicos aislados. Un ácido nucleico aislado por lo general se refiere a un ácido nucleico que se separa de componentes con los que normalmente está asociado en la naturaleza. Como un ejemplo, un ácido nucleico aislado puede ser uno que se separa de una célula, de un núcleo, de mitocondria o de cromatina. La expresión "ácido nucleico" incluye ácido nucleico tanto sintético como aislado.
Para uso in vivo, los ácidos nucleicos opcionalmente pueden ser relativamente resistentes a la degradación (por ejemplo, están estabilizados). En algunas realizaciones solamente se pueden estabilizar opcionalmente partes específicas de los ácidos nucleicos. Una "molécula de ácido nucleico estabilizada" hará referencia a una molécula de ácido nucleico que es relativamente resistente a la degradación in vivo (por ejemplo, a través de una exo o endonucleasa). La estabilización puede ser función de la longitud o de la estructura secundaria. Los ácidos nucleicos que tienen una longitud de decenas a cientos de kbs son relativamente resistentes a la degradación in vivo. Para ácidos nucleicos más cortos, la estructura secundaria puede estabilizar y aumentar su efecto. Por ejemplo, si el extremo de la posición 3' de un ácido nucleico tiene autocomplementariedad con una región cadena arriba, de modo que se puede volver a pegar y formar una estructura de tallo lazo, entonces el ácido nucleico se estabiliza y por lo tanto presenta más actividad.
En ciertas realizaciones de acuerdo con este aspecto de la invención, la secuencia de bases del oligómero de ARN es al menos parcialmente autocomplementaria. Una secuencia autocomplementaria como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia de bases que, después de alineamiento adecuado, puede formar emparejamiento de bases intramolecular o, más habitualmente, intermolecular entre pares de bases oscilantes de G-C, A-U, y/o G-U. En una realización, el alcance de la autocomplementariedad es al menos de un 50 por ciento. Por ejemplo, un 8-mero que tiene una autocomplementariedad de al menos un 50 por ciento puede tener una secuencia capaz de formar 4, 5, 6, 7, o 8 pares de bases oscilantes de G-C, A-U, y/o G-U. Tales pares de bases pueden, pero no es necesario, implicar bases ubicadas en cualquier extremo del oligómero de ARN autocomplementario. Cuando la estabilización de ácidos nucleicos puede ser importante para los oligómeros de ARN, puede ser ventajoso "fijar" en conjunto uno o ambos extremos de un ácido nucleico bicatenario, mediante emparejamiento de bases o mediante cualquier otro medio adecuado. El grado de autocomplementariedad puede pretender del alineamiento entre oligómeros, y tan alineamiento puede incluir o no salientes de un solo o múltiples nucleósidos. En otras realizaciones, el grado de autocomplementariedad es al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos un 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, o incluso un 100 por ciento. No obstante lo anterior, se debería
indicar que la formación de cadenas bicatenarias no es un requisito de los oligómeros de ARN de la invención.
Se aplican consideraciones similares a la formación de pares de bases intermoleculares entre oligonucleótidos de ARN de diferentes secuencias de bases. Por lo tanto, cuando una pluralidad de oligómeros de ARN se usa en conjunto, la pluralidad de oligómeros puede, pero no es necesario, incluye secuencias que son al menos parcialmente complementarias entre sí. En una realización, la pluralidad de oligómeros incluye un oligómero que tiene una primera secuencia de bases y un oligómero que tiene una segunda secuencia de bases, en los que la primera secuencia de bases y la segunda secuencia de bases son complementarias en al menos un 50 por ciento. Por ejemplo, como entre dos 8-meros que son complementarios al menos en un 50 por ciento, éstos pueden formar 4, 5, 6, 7, o 8 pares de bases oscilantes de G-C, A-U, y/o G-U. Puede no ser necesario que tales pares de bases impliquen bases localizadas en cualquier extremo de los oligómeros de ARN complementarios. El grado de complementariedad puede depender del alineamiento entre oligómeros, y tal alineamiento puede incluir o no salientes de un solo o múltiples nucleósidos. En otras realizaciones, el grado de complementariedad es de al menos un 60 por ciento, al menos un 70 por ciento, al menos un 80 por ciento, al menos un 90 por ciento, o incluso de un 100 por ciento.
Como alternativa, la estabilización del ácido nucleico se puede conseguir a través de modificaciones en la estructura principal de fosfato. Los ácidos nucleicos estabilizados preferentes de la presente invención tienen una estructura principal modificada. Se ha demostrado que la modificación de la estructura principal de ácidos nucleicos proporciona aumento de la actividad de los ácidos nucleicos cuando se administran in vivo. Un tipo de estructura principal modificada es una modificación de la estructura principal de fosfato. La inclusión de ácidos nucleicos inmunoestimulantes de al menos dos enlaces de fosforotioato en el extremo la posición 5' del oligonucleótido y múltiples enlaces (preferentemente cinco) de fosforotioato en el extremo en la posición 3', en algunas circunstancias puede proporcionar la actividad máxima y proteger el ácido nucleico de la degradación por exo y endonucleasas intracelulares. Otros ácidos nucleicos modificados incluyen ácidos nucleicos modificados con fosfodiéster, combinaciones de ácidos nucleicos de fosfodiéster y fosforotioato, alquilfosfonato y arilfosfonato, alquilfosforotioato y arilfosforotioato, metilfosfonato, metilfosforotioato, fosforoditioato, p-etoxi, morfolino, y combinaciones de los mismos. Los ácidos nucleicos detienen enlaces de fosforotioato proporcionan actividad máxima y protegen el ácido nucleico de la degradación por exo y endonucleasas intracelulares, y combinaciones de los mismos. Cada una de estas combinaciones y sus efectos en particular en células inmunes se analiza con más detalle con respecto a ácidos nucleicos CpG en las Patentes de Estados Unidos expedidas Nº 6.207.646 y Nº 6.239.116. Se cree que estos ácidos nucleicos modificados pueden presentar actividad estimulador ha debido al aumento de la resistencia a nucleasas, aumento de la captación celular, aumento de la unión a proteínas, y/o localización intracelular alterada.
Algunas estructuras principales modificadas tales como fosforotioatos se pueden sintetizar usando técnicas automatizadas que usan cualquiera de las químicas de fosforamidato o H-fosfonato. Se pueden preparar aril y alquilfosfonatos, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.469.863; y se pueden preparar alquilfosfotriésteres (en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.023.243 y en la Patente Europea Nº 092.574) mediante síntesis automatizada en fase sólida usando reactivos disponibles en el mercado. Se han descrito procedimientos para preparar otras modificaciones y sustituciones de estructura principal de ADN. Uhlmann E y col. (1990) Chem Rev 90: 544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165.
Otros ácidos nucleicos estabilizados incluyen: análogos de ADN no iónicos, tales como alquil y aril-fosfatos (en los que el oxígeno del fosfonato cargado se sustituye con un grupo alquilo o arilo), fosfodiéster y alquilfosfotriésteres, en los que el resto de oxígeno cargado está alquilado. También se ha mostrado que algunos ácidos nucleicos que contienen diol, tales como tetraetilenglicol o hexaetilenglicol, en cualquier extremo o en ambos, son básicamente resistentes a la degradación con nucleasas.
Otra clase de modificaciones de la estructura principal incluyen 2'-O-metilribonucleósidos (2'-OMe). Estos tipos de sustituciones se describen de forma extensa en la técnica anterior y en particular con respecto a sus propiedades de inmunoestimulación en Zhao y col. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 24: 3453-8. Zhao y col. describen procedimientos de preparación de modificaciones de 2'OMe para ácidos nucleicos.
Los oligómeros de ARN que contienen G y U inmunoestimulantes usados en la invención tienen una longitud de 5 a aproximadamente 40 nucleótidos. Por lo tanto comer ciertas realizaciones distintas, el oligómero de ARN que contiene G y U puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, o 40 nucleótidos. En una realización, el oligómero de ARN que contiene G y U puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 nucleótidos. En una realización, el oligómero de ARN que contiene G y U puede tener una longitud de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, o 12 nucleótidos. En una realización, el oligómero de ARN que contiene G y U puede tener una longitud de 8, 9, 10, 11, o 12 nucleótidos.
Por ejemplo, se ha descubierto que los oligómeros de ARN con las siguientes secuencias de bases son útiles en las composiciones y en la práctica de la invención: 5'-GUGUUUAC-3'; 5'-GUAGGCAC-3'; 5'-CUAGGCAC-3'; 5'-CUCGGCAC-3'; y 5'-GUGUUUAC-3' en combinación con 5'-GUAGGCAC-3'.
Dado que se ha descubierto que los efectos inmunoestimulantes de los oligómeros de ARN que contienen G y U son dependientes de MyD88, los inventores tienen la creencia de que los oligómeros de ARN que contienen G y U inmunoestimulantes de la invención pueden interactuar con al menos un TLR como una etapa al ejercer su efecto inmunoestimulante. Los oligómeros de ARN que contienen G y U inmunoestimulantes de la invención pueden de este modo representar o imitar al menos partes de ligandos naturales para el al menos un TLR. Tales ligandos naturales pueden incluir ARN ribosómico, procariota o eucariota, así como ciertos ARN virales. El TLR o los TLR pueden ser TLR8, TLR7, o algún TLR aún por definir. Anteriormente no se han descrito ligandos naturales para TLR1,TLR 7, TLR8, y TLR10.
Se ha descubierto que las moléculas de ARN inmunoestimulante descritas en el presente documento se producen en la naturaleza en todos los tipos de ARN, normalmente en asociación con secuencia altamente conservada o característica estructural fundamental. En un ejemplo, se ha descubierto que el ARN inmunoestimulante se produce en el contexto de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES).
Un IRES es un elemento del ARN de actuación mínima en posición cis –contenido dentro de una característica estructural compleja en la región sin traducir en la posición 5' (5' UTR) de ARN viral y otros ARNm que regula el inicio de la traducción del genoma viral de una forma independiente de la protección. Hellen CU y col. (2001) Genes Dev 15: 1593-1612. El inicio de la traducción del ARN viral independiente de la protección se observó en primer lugar en picornavirus. Jackson RJ y col. (1990) Trends Biochem Sci 15: 477-83; Jackson RJ y col. (1995) RNA 1: 985-1000.
En la mayoría de las células eucariotas, el inicio de la traducción del ARNm comienza con el reclutamiento del factor de inicio eucariótico del complejo de unión a protección (eIF)4F, formado por eIF4E (proteína de unión a protección), eIF4A, y eIF4G, al extremo del ARNm protegido la posición 5'. La subunidad ribosómica 40S, que porta eIF3, y el complejo iniciador ternario ARNt-eIF2-GTP se reclutan a continuación al extremo del ARNm en la posición 5' a través de la interacción entre eIF3 y eIF4G. La subunidad 40S a continuación explora el ARNm en una dirección en la posición 5' a 3' hasta que encuentra un codón de inicio apropiado, tras lo cual se engrana el anticodón iniciador de metionina-ARNt, la subunidad 60S se une para formar un ribosoma 80S, y la traducción comienza.
Por lo tanto, se cree que la significancia de un IRES, al menos en el contexto de un virus, es la capacidad del IRES para conferir una ventaja selectiva al virus sobre la traducción en la célula dependiente de la protección habitual.
Se ha informado que los siguientes virus tienen elementos de IRES en su genoma: todos los picornavirus; virus de la diarrea viral bovina; virus de la fiebre porcina clásica; virus de la parálisis del grillo; virus de la encefalomiocarditis; virus de la fiebre aftosa; virus de la leucemia murina de Friend gag ARNm; VHC; virus de la inmunodeficiencia humana env ARNm; virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi; virus de la leucemia murina de Moloney gag ARNm; virus intestinal Plautia stali; poliovirus; rinovirus; virus Rhopalosiphum padi; y virus del sarcoma de Rous. Hellen CU y col. (2001) Genes Dev 15: 1593-1612. Esta lista no pretende ser limitante.
Las proteínas virales del virus de la hepatitis C (VHC) se traducen a partir de un ARN de sentido positivo monocatenario de 9,5 kb que está flanqueado por los UTR en las posiciones 5' y 3'. El UTR en la posición 5' altamente conservado incluye un IRES presente en los nucleótidos 40-370. Reynolds JE y col. (1996) RNA 2: 867
78. Se cree que el UTR en la posición 5' del VHC tiene cuatro dominios estructurales principales (I-IV), de los cuales los dominios II y III tienen subdominios. El subdominio Illd incluye un tallo-lazo de 27 nt (nucleótidos 253-279) que se ha informado, sobre la base de estudios mutacionales in vivo, que son críticos en la traducción mediata por IRES del VHC. Kieft JS y col. (1999) J Mol Biol 292: 513-29; Klinck R y col. (2000) RNA 6: 1423-31. la secuencia del 27-mero IIId se proporciona, mediante 5 '-GCCGAGUAGUGUUGGGUCGCGAAAGGC-3' (SEC ID Nº: 4), en la que la parte UUGGGU forma el lazo terminal. Se informa que la estructura de tallo-lazo incluye un número de pares de bases que no son de Watson-Crick, habituales de otros ARN, que incluyen pares de bases de U°G y U°A, G°A, y A°A oscilantes.
Como otro ejemplo, se ha descubierto que las secuencias de ARN inmunoestimulante que se describen en el presente documento se producen en secuencias ricas en G y U cerca del extremo en la posición 5' del ARN viral del virus de la inmunodeficiencia humana de tipo 1 (HTV-1) que es fundamental para el empaquetamiento eficaz del ARN viral. Russell RS y col. (2002) Virology 303: 152-63. De forma específica, de acuerdo con la presente invención se ha encontrado que dos secuencias fundamentales ricas en G y U dentro de U5, es decir, 5'-GUAGUGUGUG-3' (SEC ID Nº: 2) y 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEC ID Nº: 3), que corresponden a los nucleótidos 99-108 y 112-123 de la cepa BHI0, respectivamente, son altamente inmunoestimulantes (véase el Ejemplo 11 que sigue a continuación). Se indicará que la SEC ID Nº: 2 incluye tanto GUAGU como GUGUG, y la SEC ID Nº: 3 incluye GUGUG.
Además como otro ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de ARN inmunoestimulante usadas en la invención se producen en el lazo E del ARN ribosómico 5S de un gran número de especies de bacterias.
TLR8 y TLR7 una homología de secuencias elevada con TLR9 (FIG. 8). TLR9 es el receptor de CpG-ADN y transduce señales inmunoestimulantes. En TLR9 se han descrito dos motivos de unión a ADN (Solicitud de Patente de Estados Unidos Nº 09/954.987) que también están presentes en TLR8 y TLR7 con algunas modificaciones (FIG. 9). A pesar de esta similitud, sin embargo, TLR7 y TLR8 no se unen a CpG-ADN.
Se ha descubierto que la guanosina, en particular la guanosina en combinación con uracilo, y ciertos ácidos nucleicos que contienen guanosina y derivados de los mismos, son ligamentos naturales de TLR8. Se ha descubierto que ARN, ARN oxidado, ácidos nucleicos ricos en G y U, y al menos moléculas de ácidos nucleicos parcialmente bicatenario que tienen al menos un par de bases de G-U son ligandos de TLR8. En ciertas realizaciones preferentes que implican guanosina, derivados de guanosina, y ácidos nucleicos ricos en G y U, la guanosina es el ribonucleósido. Se cree que las moléculas de ácidos nucleicos que contienen GUU, GUG, GGU, GGG y UGG y UGU, UUG y UUU, múltiplos y cualquier combinación de los mismos son ligamentos de TLR8. En algunas realizaciones, el ligando de TLR8 es un oligonucleótido rico en G y U que incluye una secuencia de hexámeros (UUGUGG)n, (UGGUUG)n, (GUGUGU)n, o (GGGUUU)n en los que n es un número entero de 1 a 8, y preferentemente n es al menos 3. Además, también se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que mezclas de complejos de ribonucleósido de vanadilo (es decir, mezclas de adenina, citosina, guanosina, y complejos de ribonucleósido uracilo y vanadilo), y complejos de ribonucleósido de guanosina y vanadilo solos, son ligandos de TLR8. Además, se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que ciertas imidazoquinolinas, incluyendo resiquimod e imiquimod, son ligandos de TLR8.
También se ha descubierto que la guanosina, y ciertos ácidos nucleicos que contienen guanosina y derivados de los mismos, son ligando los naturales de TLR7. Se ha descubierto que ARN, ARN oxidado, ácidos nucleicos ricos en G, y al menos moléculas de ácido nucleico bicatenario que son ricas en contenido de G son ligandos de TLR7. En ciertas realizaciones preferentes que implican guanosina, derivados de guanosina, y ácidos nucleicos ricos en G, la guanosina es el ribonucleósido. Además, también se ha descubierto que mezclas de complejos de ribonucleósido de vanadilo (es decir, mezclas de adenina, citosina, guanosina, y complejos de ribonucleósido uracilo y vanadilo), y complejos de ribonucleósido de guanosina y vanadilo solos, son ligandos de TLR7. Además, se ha descubierto de acuerdo con la presente invención que la 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina) es un ligando de TLR7.
Además de tener diversos ligandos, se cree que los diversos TLR se expresan de forma diferencial en diversos tejidos y en diversos tipos de células inmunes. Por ejemplo, se ha informado que el TLR7 humano se expresa en placenta, pulmón, bazo, nódulos linfáticos, amígdala y en células dendríticas plasmacitoides precursoras (pDC). Chuang T-H y col. (2000) Eur Cytokine Netw 11: 372-8); Kadowaki N y col. (2001) J Exp Med 194: 863-9. Se ha informado que el TLR8 humano se expresa en pulmón, leucocitos de sangre periférica (PBL), placenta, bazo, a nódulos linfáticos, y en monocitos. Kadowaki N y col. (2001) J Exp Med 194: 863-9; Chuang T -H y col. (2000) Eur Cytokine Netw 11: 372-8. Se ha informado que el TLR9 humanos se expresa en bazo, nódulos linfáticos, médula ósea, PBL, y en las pDC, linfocitos B, y las DC CD123+. Kadowaki N y col. (2001) J Exp Med 194: 863-9; Bauer S y col. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98: 9237-42; Chuang T -H y col. (2000) Eur Cytokine Netw 11: 372-8.
Anteriormente se han descrito derivados de guanosina como activadores de linfocitos B y linfocitos NK, pero sus receptores el mecanismo de acción no se comprendieron. Goodman MG y col. (1994) J Pharm Exp Ther 274: 155257; Reitz AB y col. (1994) J Med Chem 37: 3561-78. Tales derivados de guanosina incluyen, pero no se limitan a, 8bromoguanosina, 8-oxoguanosina, 8-mercaptoguanosina, y 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina).
Las imidazoquinolinas son modificadores de la respuesta inmune de molécula pequeña sintéticos que se cree que inducen la expresión de varias citoquinas que incluyen interferones (por ejemplo, IFN-α e IFN-γ), factor alfa de necrosis tumoral (TNF-α) y algunas interleuquinas (por ejemplo, IL-1, IL-6 e IL-12). Las imidazoquinolinas son capaces de estimular una respuesta inmune de Thl, como se pone en evidencia en parte por su capacidad para inducir aumentos en los niveles de IgG2a. Se ha informado que algunos agentes de imidazoquinolina también son capaces de inhibir la producción de citoquinas Th2 tales como IL-4, IL-5, e IL-13. Algunas de las citoquinas inducidas por imidazoquinolinas son producidas por macrófagos y células dendríticas. Se ha informado que algunas especies de imidazoquinolinas aumentan la actividad lítica de los linfocitos NK y que estimulan la proliferación y diferenciación de linfocitos B, induciendo de ese modo la producción y secreción de anticuerpos.
Como se usa en el presente documento, un agente de imidazoquinolina incluye imidazoquinolin aminas, imidazopiridin aminas, cicloalquilimidazopiridin aminas fusionadas en las posiciones 6 y 7, e imidazoquinolin aminas unidas por puente en las posiciones 1 y 2. Estos compuestos se han descrito en las patentes de Estados Unidos Nºs 4689338, 4929624, 5238944, 5266575, 5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5494916, 5482936, 5525612, 6039969 y 6110929. Algunas especies de agentes de imidazoquinolina en particular incluyen 4-amino-α,αdimetil-2-etoximetil-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-1-etanol (resiquimod o R-848 o S-28463; documento de patente PCT/US01/28764, documento de patente WO 02/22125); y 1-(2-metilpropil)-1H-imidazo[4,5-c]quinolina-4-amina (imiquimod o R-837 o S-26308). En la actualidad se usa imiquimod en el tratamiento tópico de verrugas tales como verrugas genitales y anales y también se ha sometido ensayo en el tratamiento tópico del carcinoma de células basales.
Se conocen secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de TLR3 humano y murino. Véanse, por ejemplo, los Números de Referencia en GenBank U88879, NM_003265, NM_126166, AF355152; y AAC34134, NP_003256, NP_569054, AAK26117. Se informa que el TLR3 humano tiene una longitud de 904 aminoácidos y tiene una secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 20. Una secuencia de nucleótidos correspondiente se proporciona como la SEC ID Nº: 21. Se informa que el TLR3 murino quien una longitud que 905 aminoácidos y tiene una secuencia como se proporciona en la SEC ID Nº: 22. Una secuencia de nucleótidos correspondientes se proporciona como la SEC ID Nº: 23. El polipéptido de TLR3 incluyó un dominio extracelular que tienes región de repetición rica en
leucina, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que incluyó el dominio de TIR.
Como se usa en el presente documento, un "polipéptido TLR3" se refiere un polipéptido que incluye un TLR3 de longitud completa de acuerdo con una de las secuencias mencionadas anteriormente, ortólogos, variantes alélicas, SNP, variantes que incorporan sustituciones de aminoácidos conservativas, proteínas de fusión de TLR3, y 5 fragmentos funcionales de cualquiera de los mencionados anteriormente. algunas realizaciones precedentes incluyen polipéptidos TLR3 humanos que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR3 humano de la SEC ID Nº: 20. Algunas
10 realizaciones preferentes también incluyen polipéptidos TLR3 de murino que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR3 de murino de la SEC ID Nº: 22.
15 Como se usa en el presente documento, "señalización de TLR3" se refiere una capacidad de un polipéptido TLR3 para activar la ruta de señalización de TLR/IL-1R (TIR), también denominada en el presente documento la ruta de translocación de señales de TLR. Los cambios en la actividad de TLR3 se pueden medir con ensayos tales como los que se desvelan en el presente documento, que incluyen la expresión de genes bajo el control de promotores y potenciadores sensibles a κB. Tales genes de origen natural incluyen los genes que codifican IL-1β, IL-6, IL-8, la
20 subunidad p40 de interleuquina 12 (IL-12 p40), y las moléculas coestimulantes CD80 y CD86. Otros genes se pueden colocar bajo el control de tales elementos reguladores (véase a continuación) y por lo tanto sirven para indicar el nivel de señalización de TLR3. se pueden añadir secuencias de nucleótidos adicionales a la SEC ID Nº: 21
o a la SEC ID Nº: 23, preferentemente en el extremo en la posición 5' o 3' del marco de lectura abierto de la SEC ID Nº: 21, para proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido quimérico que incluye un resto
25 detectable o indicador, por ejemplo, FLAG, luciferasa (luc), proteína fluorescente de color verde (GFP), y otros conocidos por los expertos en la materia.
Se conocen secuencias de nucleótidos y aminoácidos de ser humano y murino TLR7. Véanse, por ejemplo, los Números de Referencia en GenBank AF240467, AF245702, NM_016562, AF334942, NM_133211; y AAF60188, AAF78035, NP_057646, AAL73191, AAL73192. Se informa que el TLR7 humano tiene una longitud de 1049 5 aminoácidos y tiene una secuencia que se proporciona en la SEC ID Nº: 24. Una secuencia de nucleótidos correspondientes se proporciona como la SEC ID Nº: 25. Se informa que el TLR7 de murino tiene una longitud de
1050 aminoácidos y tiene una secuencia que se proporciona en la SEC ID Nº: 26. Una secuencia de nucleótidos correspondientes se proporciona como la SEC ID Nº: 27. El polipéptido TLR7 incluye un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
5 Como se usa en el presente documento un "polipéptido TLR7" se refiere a un polipéptido que incluye un TLR7 de longitud completa de acuerdo con una de las secuencias mencionadas anteriormente, ortólogos, variantes alélicas, SNP, variantes incorporan sustituciones de aminoácidos conservativas, proteínas de fusión de TLR7, y fragmentos funcionales de cualquiera de los mencionados anteriormente. Algunas realizaciones preferentes incluyen polipéptidos TLR7 humanos que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más
10 preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR7 humano de la SEC ID Nº: 24. Algunas realizaciones también incluyen polipéptidos de TLR7 murino que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más
15 preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR7 murino de la SEC ID Nº: 26.
Como se usa en el presente documento "señalización de TLR7" se refiere a una capacidad de un polipéptido TLR7 para activar la ruta de señalización de TLR/IL-1R (TIR), también denominada en el presente documento ruta de 20 transducción de señales de TLR. Los cambios en la actividad de TLR7 se pueden medir con ensayos tales como los que se desvelan en el presente documento, que incluyen expresión de genes bajo el control de promotores y potenciadores sensibles a κB. Tales genes de origen natural incluyen los genes que codifican IL-lβ, IL-6, IL-8, la subunidad p40 de interleuquina 12 (IL-12 p40), y las moléculas coestimulantes CD80 y CD86. Otros genes se pueden colocar bajo el control de tales elementos reguladores (véase a continuación) y por lo tanto sirven para 25 indicar el nivel de señalización de TLR7. Se pueden añadir secuencias de nucleótidos adicionales a la SEC ID Nº: 25
o la SEC ID Nº: 27, preferentemente al extremo en la posición 5’ o 3’ del marco de lectura abierto de la SEC ID Nº: 25, para proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido quimérico que incluye un resto detectable o indicador, por ejemplo, FLAG, luciferasa (luc), proteína fluorescente de color verde (GFP), y otros conocidos por los expertos en la materia.
Se conocen secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TLR8 de ser humano y murino. Véanse, por ejemplo, los Números de Referencia en GenBank AF246971, AF245703, NM_016610, XM_045706, AY035890, NM_133212; y AAF64061, AAF78036, NP_057694, XP_045706, AAK62677, NP_573475. Se informa que el TLR8 humano existe al 5 menos en dos isoformas, una con una longitud de 1041 aminoácidos que tiene una secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 28, y la otra con una longitud de 1059 aminoácidos que tiene una secuencia como se proporciona en la SEC ID Nº: 30. Se proporcionan secuencias de nucleótidos correspondientes en la SEC ID Nº: 29 y en la SEC ID Nº: 31, respectivamente. Se cree que la más corta de estas dos isoformas es más importante. El TLR8 murino tiene una longitud de 1032 aminoácidos y tiene una secuencia como se proporciona en la SEC ID Nº: 32. La secuencia de
10 nucleótidos correspondiente se proporciona como la SEC ID Nº: 33. El polipéptido TLR8 incluye un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
Como se usa en el presente documento un "polipéptido TLR8 " se refiere a un polipéptido que incluye un TLR8 de longitud completa de acuerdo con una de las secuencias mencionadas anteriormente, ortólogos, variantes alélicas, 15 SNP, variantes incorporan sustituciones de aminoácidos conservativas, proteínas de fusión de TLR8, y fragmentos funcionales de cualquiera de los mencionados anteriormente. Algunas realizaciones preferentes incluyen polipéptidos de TLR8 humano que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias 20 de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos del TLR8 humano de la SEC ID Nº: 28. Algunas realizaciones precedentes también incluyen polipéptidos de TLR8 murino que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR8 murino de la
SEC ID Nº: 32.
Como se usa en el presente documento "señalización de TLR8" se refiere a una capacidad de un polipéptido TLR8 para activar la ruta de señalización de TLR/IL-1R (TIR), también denominada en el presente documento ruta de transducción de señales de TLR. Los cambios en la actividad de TLR8 se pueden medir con ensayos tales como los 5 que se desvelan en el presente documento, que incluyen expresión de genes bajo el control de promotores y potenciadores sensibles a κB. Tales genes de origen natural incluyen los genes que codifican IL-1β, EL-6, IL-8, la subunidad p40 de interleuquina 12 (IL-12 p40), y las moléculas coestimulantes CD80 y CD86. Otros genes se pueden colocar bajo el control de tales elementos reguladores (véase a continuación) y por lo tanto sirven para indicar el nivel de señalización de TLR8. Se pueden añadir secuencias de nucleótidos adicionales a la SEC ID Nº: 29
10 o la SEC ID Nº: 33, preferentemente al extremo en la posición 5’ o 3’ del marco de lectura abierto SEC ID Nº: 29, para proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido quimérico que incluye un resto detectable o indicador, por ejemplo, FLAG, luciferasa (luc), proteína fluorescente de color verde (GFP), y otros conocidos por los expertos en la materia.
Se conocen secuencias de nucleótidos y aminoácidos de TLR9 de ser humano y murino. Véanse, por ejemplo, los Números de Referencia en GenBank NM_017442, AF259262, AB045180, AF245704, AB045181, AF348140, AF314224, NM_031178; y NP_059138, AAF 72189, BAB19259, AAF78037, BAB19260, AAK29625, AAK28488, NP_112455. Se informa que el TLR9 humano existe al menos en dos isoformas, una con una longitud de 1032 aminoácidos que tiene una secuencia proporcionada en la SEC ID Nº: 34, y la otra con una longitud de 1055 aminoácidos que tiene una secuencia como se proporciona en la SEC ID Nº: 36. Se proporcionan secuencias de nucleótidos correspondientes en la SEC ID Nº: 35 y en la SEC ID Nº: 37, respectivamente. Se cree que la más corta de estas dos isoformas es más importante. El TLR9 murino tiene una longitud de 1032 aminoácidos y tiene una secuencia como se proporciona en la SEC ID Nº: 38. Una secuencia de nucleótidos correspondientes se proporciona como la SEC ID Nº: 39. El polipéptido TLR9 incluye un dominio extracelular que tiene una región de repetición rica en leucina, un dominio transmembrana, y un dominio intracelular que incluye un dominio TIR.
Como se usa en el presente documento un "polipéptido TLR9" se refiere a un polipéptido que incluye un TLR9 de longitud completa de acuerdo con una de las secuencias mencionadas anteriormente, ortólogos, variantes alélicas, SNP, variantes incorporan sustituciones de aminoácidos conservativas, proteínas de fusión de TLR9, y fragmentos funcionales de cualquiera de los mencionados anteriormente. Algunas realizaciones preferentes incluyen polipéptidos TLR9 humanos que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR9 humano de la SEC ID Nº: 34. Algunas realizaciones preferentes también incluyen polipéptidos de TLR9 murino que tienen una identidad de secuencias de al menos un 65 por ciento, más preferentemente una identidad de secuencias de al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente con una identidad de secuencias de al menos un 95 por ciento con la secuencia de aminoácidos de TLR9 murino de la SEC ID Nº: 38.
Como se usa en el presente documento "señalización de TLR9" se refiere a una capacidad de un polipéptido TLR9 para activar la ruta de señalización de TLR/IL-1R (TIR), también denominada en el presente documento ruta de transducción de señales de TLR. Sin desear quedar ligado a ninguna teoría en particular, se cree que la ruta de señalización de TLR/IL-1R implica la señalización a través del marcador 88 de diferenciación mieloide de moléculas (MyD88) y el factor 6asociado a receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAF6), que conduce a la activación de quinasas del complejo de IκB quinasa y las quinasas c-jun NH2-terminales (por ejemplo, Jnk 1/2). Hacker H y col. (2000) J Exp Med 192: 595-600. Los cambios en la actividad de TLR9 se pueden medir con ensayos tales como los que se desvelan en el presente documento, que incluyen expresión de genes bajo el control de promotores y potenciadores sensibles a κB. Tales genes de origen natural incluyen los genes que codifican IL-lβ, IL-6, IL-8, la subunidad p40 de interleuquina 12 (IL-12 p40), y las moléculas coestimulantes CD80 y CD86. Otros genes se pueden colocar bajo el control de tales elementos reguladores (véase a continuación) y por lo tanto sirven para indicar el nivel de señalización de TLR9. Se pueden añadir secuencias de nucleótidos adicionales a la SEC ID Nº: 35
o la SEC ID Nº: 39, preferentemente al extremo en la posición 5’ o 3’ del marco de lectura abierto SEC ID Nº: 35, para proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido quimérico que incluye un resto detectable o indicador, por ejemplo, FLAG, luciferasa (luc), proteína fluorescente de color verde (GFP), y otros conocidos por los expertos en la materia.
Los expertos en la materia conocen bien complejos de ribonucleósido de vanadilo (es decir, mezclas de complejos de ribonucleósido adenina, citosina, guanosina, y uracilo y vanadilo), como inhibidores de ARNsa. Berger SL y col. (1979) Biochemistry 18: 5143; Puskas RS y col. (1982) Biochemistry 21: 4602. Los complejos de ribonucleósido de
5 vanadilo están disponibles en el mercado en proveedores que incluyen Sigma-Aldrich, Inc.
El oligómero de ARN que contiene G y U inmunoestimulante no contiene un dinucleótido de CpG y no es un ácido nucleico inmunoestimulante de CpG. En algunas realizaciones, se usa un ácido nucleico inmunoestimulante de CpG inmunoestimulante en los procedimientos de la invención.
Un ácido nucleico inmunoestimulante de CpG es un ácido nucleico que contiene un dinucleótido de CG, cuyo resto
10 de C está sin metilar. Se sabe que los ácidos nucleicos inmunoestimulantes de CpG estimulan respuestas inmunes de tipo Th1. Las secuencias de CpG, aunque son relativamente tras el ADN humano se encuentran normalmente en el ADN de organismos infecciosos tales como bacterias. El sistema inmune humano aparentemente ha evolucionado para reconocer secuencias CpG como una señal de advertencia temprana de la infección y para iniciar una
respuesta inmune inmediata y potente frente patógenos invasores sin causar reacciones adversas observadas frecuentemente con otros agentes inmunoestimulantes. Por lo tanto, los ácidos nucleicos que contienen CpG, que confían en este mecanismo innato de defensa inmune pueden usar una ruta única y natural para terapia inmune. Los efectos de los ácidos nucleicos de CpG en la modulación inmune se han descrito de forma extensa en los documentos de patente de Estados Unidos tales US 6.194.388 B1, US 6.207.646 B1, US 6.239.116 B1 y US
6.218.371 B1, y las solicitudes de patentes publicadas, tales como PCT/US98/03678, PCT/US98/10408, PCT/US98/04703, y PCT/US99/09863.
Un ácido nucleico de CpG es un ácido nucleico que incluya al menos un dinucleótido de CpG sin metilar. Un ácido nucleico que contiene al menos un dinucleótido de CpG sin metilar es una molécula de ácido nucleico que contiene una citosina sin metilar en una secuencia de dinucleótidos citosina-guanina (es decir, "ADN CpG" o ADN que contiene una citosina en la posición 5' seguida de guanosina en la posición 3' y unidas por un enlace de fosfato) y activa el sistema inmune. Los ácidos nucleicos de CpG pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Por lo general, las moléculas bicatenarias son más estables in vivo, mientras que las moléculas monocatenarias presentan un aumento de la actividad inmune. Por lo tanto en algunos aspectos de la invención es preferente que el ácido nucleico sea monocatenario y en otros aspectos es preferente que el ácido nucleico sea bicatenario. En ciertas realizaciones, aunque el ácido nucleico sea monocatenario, éste es capaz de formar estructuras secundarias y terciarias (por ejemplo, volviéndose plegar sobre sí mismo, o por hibridación con sí mismo a través de su totalidad o en segmentos seleccionados a lo largo de su longitud). En consecuencia, aunque la estructura primaria del ácido nucleico puede ser monocatenaria, sus estructuras de orden superior pueden ser bi o tricatenarias. Las expresiones ácido nucleico de CpG oligonucleótido de CpG cómo se usan en el presente documento se refieren a un ácido nucleico de CpG inmunoestimulante a menos que se indique de otro modo. Todo el ácido nucleico inmunoestimulante puede estar sin metilar o algunas partes pueden estar sin metilar pero al menos el C del 5' CG 3' debe estar sin metilar.
En un aspecto, la invención proporciona un procedimiento in vitro para activar una célula inmune. El procedimiento implica poner en contacto an célula inmune con una composición inmunoestimulante de la invención, que se ha descrito anteriormente, en una cantidad eficaz para inducir la activación de la célula inmune. Como se usa en el presente documento, una "célula inmune" es una célula que pertenece al sistema inmune. Las células inmunes participan en la regulación y en la ejecución de respuestas inflamatorias e inmunes. Estas incluyen, pero no se limitan a, linfocitos B (células B), linfocitos T (células T), linfocitos citolíticos naturales (NK), células dendríticas, otras células que presentan antígenos específicos de tejido (por ejemplo, células de Langerhans), macrófagos, monocitos, granulocitos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos), y mastocitos. Esplenocitos, timocitos, y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) incluyen células inmunes. Las células inmunes se pueden aislar de la sangre, bazo, médula ósea, nódulos linfáticos, timo, y otros tejidos usando procedimientos de conocidos por los expertos en la materia. Las células inmunes también pueden incluir ciertas líneas celulares así como cultivos primarios mantenidos in vitro o ex vivo.
En una realización, la activación de la célula inmune implica la secreción de una citoquina por la célula inmune. En una realización, la activación de la célula inmune implica la secreción de una quimioquina por la célula inmune. En una realización, la activación de la célula inmune implica la expresión de una molécula coestimulante/auxiliar por la célula inmune. En una realización, la molécula coestimulante/auxiliar se selecciona entre el grupo que consiste en moléculas de adhesión intercelular (ICAM, por ejemplo, CD54), antígenos asociados a función leucocitaria (LFA, por ejemplo, CD58), B7 (CD80, CD86), y CD40.
La "activación de una célula inmune" hará referencia a una transición de una célula inmune desde un estado de descanso o quiescente a un estado de aumento de la actividad metabólica y fenotipo asociado con la función celular inmune. Tal función celular inmune puede incluir, por ejemplo, secreción de productos solubles tales como inmunoglobulinas, citoquinas, y quimioquinas; expresión de superficie celular de moléculas coestimulantes/auxiliares y antígenos de MHC; migración de célula inmune; fagocitosis y actividad citotóxica hacia células diana; y maduración de célula inmune. En algunos casos, la activación inmune puede hacer referencia a la activación inmune de Th1; en otros casos, la activación inmune puede hacer referencia a la activación inmune de Th2.
"Activación inmune de Th1" cómo se usa el presente documento se refiere a la activación de células inmunes para expresar productos secretados de tipo Th1, que incluyen ciertas citoquinas, quimioquinas, y subclases de inmunoglobulinas; y activación de ciertas células inmunes. Los productos secretados de tipo Th1 incluyen, por ejemplo, las citoquinas IFN-γ, IL-2, IL-12, IL-18, TNF-α, y la quimioquina IP-10 (CXCL10). En el ratón, la activación inmune de Th1 estimula la secreción de IgG2a. La activación inmune de Th1 también puede incluir la activación de linfocitos NK y células dendríticas, es decir, células implicadas en la inmunidad celular. Se cree que la activación inmune de Th1 contrarregula la activación inmune de Th2.
"Activación inmune de Th2" como se usa en el presente documento se refiere a la activación de células inmunes para que expresen productos secretados de tipo Th2, que incluyen ciertas citoquinas y subclases de inmunoglobulina. Los productos secretados de tipo Th2 incluyen, por ejemplo, las citoquinas IL-4 e IL-10. En el ratón, la activación inmune de Th2 estimula la secreción de IgGl e IgE. Se cree que la activación inmune de Th2 contrarregula la activación inmune de Th1.
En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento mediante la inducción de una respuesta inmune en un sujeto. El procedimiento implica la administración a un sujeto de una composición de la invención en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune en el sujeto. Por lo tanto, las composiciones de la invención se pueden usar para tratar un sujeto con necesidad de activación inmune. Un sujeto con necesidad de activación inmune puede incluir un sujeto con necesidad de activación inmune de tipo Th1.
Las composiciones y procedimientos de la invención se pueden usar, solos o en conjunto con otros agentes, para tratar un sujeto con necesidad de activación inmune de tipo Th1. Un "sujeto con necesidad de activación inmune de tipo Th1" es un sujeto que tiene o que está en riesgo de desarrollar una enfermedad, trastorno, o afección que se beneficiaría de una respuesta inmune sesgada hacia Th1. Tal sujeto puede tener o puede estar en riesgo de tener un trastorno mediado por Th2 que es susceptible a regulación cruzada o supresión mediada por Th1. Tales trastornos incluyen, por ejemplo, ciertas enfermedades autoinmunes específicas de órganos. Como alternativa, tal sujeto puede tener o puede estar en riesgo de tener un estado deficiente en Th1. Tales trastornos incluyen, por ejemplo, tumores, infecciones con agentes patógenos intracelulares, y SIDA.
Como se usa en el presente documento, "ARN rico en G y U" hará referencia a ARN con una longitud de 5-40 nucleótidos de longitud que como composición de bases tiene al menos un 60 por ciento, más preferentemente al menos un 80 por ciento, y lo más preferentemente al menos un 90 por ciento de guanina (G) y uracilo (U). Tal composición de bases se mide con respecto a la longitud completa del ARN si no tiene más de 10 bases de longitud, y sobre un estiramiento de al menos 10 bases contiguas si el ARN tiene más de 10 bases de longitud.
Como se usa en el presente documento, "ARN rico en G" hará referencia a ARN con una composición de bases de al menos un 70 por ciento, más preferentemente al menos un 80 por ciento, incluso más preferentemente al menos un 90 por ciento, y lo más preferentemente al menos un 95 por ciento de guanina (G). Tal composición de bases se mide con respecto a la longitud completa del ARN si no tiene más de 10 bases de longitud, y sobre un estiramiento de al menos 10 bases contiguas si el ARN tiene más de 10 bases de longitud.
En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen un conjugado de ADN:ARN. Un conjugado de ADN:ARN hará referencia a una molécula o complejo que incluye al menos un desoxirribonucleósido unido al menos un ribonucleósido. Los componentes desoxirribonucleósido y ribonucleósido deben estar unidos por interacción de pares de bases. Como alternativa, los componentes de desoxirribonucleósido y ribonucleósido pueden estar unidos por enlaces covalente entre los restos de azúcar de él al menos un desoxirribonucleósido y el al menos un ribonucleósido. El enlace covalente entre los restos de azúcar puede ser directo o indirecto, por ejemplo a través de un engarce. Por lo general, las interacciones de pares de bases son, pero no se limitan a, interacciones de pares de bases de tipo Watson-Crick no covalentes. En la invención se contemplan otras interacciones de pares de bases, incluyendo interacciones no covalente es (por ejemplo, emparejamiento de bases de Hoogstein) y covalentes. Por lo general, las interacciones de pares de bases también implicarán formación de dúplex que implican dos hebras, pero la invención también se contemplan interacciones de orden superior.
En el presente documento se hace referencia a que un conjugado de ADN:ARN que implica un enlace covalente entre los restos de azúcar del al menos un desoxirribonucleósido y el al menos un ribonucleósido tiene una estructura principal de ADN:ARN quimérica. El conjugado de ADN:ARN que tiene una estructura principal de ADN:ARN quimérica tendrá una estructura primaria definida por su secuencia de bases, y puede tener adicionalmente una estructura secundaria o de orden superior. Una estructura secundaria o de orden superior incluirá al menos una interacción de pares de bases intramolecular, por ejemplo, una estructura de tallo-lazo, o interacción de pares de bases intermolecular.
Formación de pares de bases heterodúplex hará referencia a interacción de pares de bases intramolecular o intermolecular entre ADN y ARN. Por ejemplo, se puede producir formación de pares de bases heterodúplex entre moléculas de ADN y ARN complementarias individuales. Como alternativa, tal como en el caso de moléculas de ácidos nucleicos de estructura principal quimérica de ADN:ARN adecuadas, se puede producir formación de pares de bases heterodúplex entre regiones complementarias de ADN y ARN dentro de la misma molécula.
En algunas realizaciones, las composiciones de la presente invención incluyen una estructura principal de ADN:ARN quimérica que tiene un sitio de escisión entre el ADN y el ARN. Un sitio de escisión se refiere a un elemento estructural a lo largo de la estructura principal quimérica que es susceptible a la escisión con cualquier medio adecuado. El sitio de escisión puede ser un enlace fosfodiéster que es relativamente susceptible a la escisión mediante endonucleasas. En este caso, el ADN y el ARN cada uno puede incluir enlaces internucleótido que están estabilizados, de modo que la estructura principal quimérica es la más susceptible a la escisión con endonucleasas en la unión del fosfodiéster entre el ADN estabilizado y el ARN estabilizado. El sitio de escisión se puede diseñar de modo que sea susceptible a la escisión en ciertas condiciones de pH, por ejemplo, relativamente más estable a pH más elevado que ha pH más bajo, o viceversa. Tal sensibilidad al pH se puede conseguir, por ejemplo, mediante preparación de la composición de ADN:ARN quimérico en liposomas. El sitio de escisión puede implicar un enlace disulfuro. Tal enlace disulfuro puede ser relativamente más estable en condiciones de oxidación que en condiciones de reducción, por ejemplo, las últimas condiciones presentes dentro de un endosoma. El sitio de escisión también puede implicar un engarce que es susceptible a escisión con una enzima, pH, condiciones redox, o similares. En algunas realizaciones, la composición puede incluir más de un sitio de escisión.
Los conjugados de la invención permiten la selección de proporciones molares fijas de los componentes de los conjugados. En el caso de conjugados de ADN:ARN puede ser ventajoso o conveniente tener una proporción de 1:1 de ADN y ARN. Los conjugados que son ADN:ARN heterodúplex normalmente tendrán una proporción de 1:1 de ADN y ARN. Los conjugados que tienen una estructura principal de ADN:ARN quimérica también pueden tener normalmente una proporción de 1:1 de ADN y ARN. En la invención se contemplan conjugados que tienen otras proporciones de ADN:ARN, que incluyen, pero no se limitan a, 1:2, 1:3, 1:4, 2:1, 3:1, 4:1, etcétera. La conjugación puede estabilizar uno o más componentes en comparación con la estabilidad del mismo componente o componentes solos. La conjugación también puede facilitar la administración de los compuestos en células a una proporción seleccionada.
Los sitios de escisión pueden servir para cualquiera de varios fines útiles en la presente invención. Una vez administrados a una célula de interés, los componentes unidos a través del sitio (o sitios) de escisión se pueden liberar para que lleguen a ser independiente u óptimamente activos dentro de la célula o en la proximidad de la célula. En algunas realizaciones, los sitios de escisión pueden ser importantes para la farmacocinética de al menos uno de los componentes del conjugado. Por ejemplo, los sitios de escisión se pueden diseñar y seleccionar para que confieran un tiempo de liberación prolongado de uno de los componentes.
En el presente documento también se describen procedimientos eficaces para identificar compuestos inmunoestimulantes y los compuestos y agentes identificados de este modo. Por lo general, los procedimientos de identificación sistemática implican someter a ensayo compuestos que inhiben o aumentan la señalización a través de un TLR en particular. Los procedimientos usan un TLR, un ligando de referencia adecuado para el TLR, y un compuesto inmunoestimulante candidato. El TLR seleccionado se pone en contacto con un compuesto de referencia adecuado (ligando de TLR) y se mide una señal de referencia mediada por TLR. El TLR seleccionado también se pone en contacto con un compuesto inmunoestimulante candidato y se mide una señal de ensayo mediada por TLR. La señal de ensayo y la señal de referencia se comparan a continuación. Un compuesto inmunoestimulante candidato favorable se puede usar posteriormente como un compuesto de referencia en el ensayo. Tales procedimientos se pueden adaptar para identificación sistemática de alto rendimiento, automatizada de compuestos candidatos. Algunos ejemplos de tales procedimientos de identificación sistemática de alto rendimiento se describen en los documentos de Patente de Estados Unidos Nºs 6.103.479; 6.051.380; 6.051.373; 5.998.152; 5.876.946; 5.708.158; 5.443.791; 5.429.921; y 5.143.854.
La mezcla de ensayo comprende un compuesto inmunoestimulante candidato. Por lo general, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecuta en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferente a las diversas concentraciones. Por lo general, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a concentración cero de agente o a una concentración de agentes inferior a los límites de detección del ensayo. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos incluyen numerosas clases químicas, aunque por lo general son compuestos orgánicos. Preferentemente, los compuestos inmunoestimulantes candidatos son compuestos orgánicos pequeños, es decir, los que tienen un peso molecular superior a 50 y sin embargo inferior a aproximadamente 2500. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos poliméricos pueden tener pesos moleculares superiores, por ejemplo, oligonucleótidos en el intervalo de aproximadamente 2500 a aproximadamente
12.500. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos comprenden grupos químicos funcionales necesarios para interacciones estructurales con polipéptidos, y pueden incluir al menos un grupo amino, carbonilo, hidroxilo o carboxilo, preferentemente al menos dos de los grupos químicos funcionales y más preferentemente al menos tres de los grupos químicos funcionales. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos pueden comprender estructura de carbono cíclica o heterocíclica y/o estructuras aromáticas o poliaromáticas sustituidas con uno o más de los grupos funcionales identificados anteriormente. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos también pueden ser biomoléculas tales como ácidos nucleicos, péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los mencionados anteriormente, o combinaciones de los mismos y similares. Cuando el compuesto inmunoestimulante candidato es un ácido nucleico, el compuesto inmunoestimulante candidato por lo general es una molécula de ADN o de ARN, aunque también se contemplan ácidos nucleicos modificados que tienen enlaces o subunidades no naturales.
Los compuestos inmunoestimulantes candidatos se obtienen a partir de la diversidad de fuentes, que incluyen bibliotecas de compuestos naturales, sintéticos, o semisintéticos, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para síntesis aleatoria y dirigida de una amplia diversidad de compuestos orgánicos y biomoléculas, que incluyen expresión de oligonucleótidos aleatorios, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, bibliotecas de presentación de fagos de péptidos aleatorios, y similares. Como alternativa, algunas bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales están disponibles o se producen fácilmente. Además, algunas bibliotecas y compuestos naturales y producidos de forma sintética se pueden modificar fácilmente a través de medios químicos, físicos, y bioquímicos convencionales. Además, algunos agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales de los compuestos inmunoestimulantes candidatos.
Por lo tanto, una fuente de compuestos inmunoestimulantes candidatos son bibliotecas de moléculas basadas en ligandos de TLR conocidos, por ejemplo, oligonucleótidos de CpG conocidos por que interactúan con TLR9, en los que la estructura del ligando se cambia la una o más posiciones de la molécula para que contenga más unos pocos
restos químicos o restos químicos diferentes. Los cambios estructurales realizados a las moléculas en la creación de bibliotecas de inhibidores análogos pueden ser sustituciones y/o adiciones dirigidas, aleatorias, o una combinación de sustituciones y/o adiciones dirigidas y aleatorias. Un experto habitual en la materia de preparación de bibliotecas de combinación puede preparar fácilmente tales bibliotecas basándose en ligandos existentes de TLR9.
En la meta también se puede incluir unas diversidad de otros reactivos. Estos incluyen reactivos tales como sales, tampones, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc. que se pueden usar para facilitar la unión óptima de proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Tal reactivo también puede reducir interacciones no específicas o de fondo de los componentes de la reacción. También se pueden usar otros reactivos que mejoran la eficacia del ensayo tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, y similares.
El orden de adición de componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación, y otros parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Tal experimentación simplemente implica la optimización de los parámetros del ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Por lo general, las temperaturas de incubación están entre 4 ºC y 40 ºC. Los tiempos de incubación se minimizan preferentemente para facilitar una identificación sistemática de alto rendimiento, rápida, y por lo general están entre 1 minuto y 10 horas.
Después de la incubación, el nivel de señalización de TLR se detecta mediante cualquier procedimiento conveniente disponible para el usuario. Para ensayos de tipo unión libres de células, a menudo se usa una etapa de separación para separar componentes unidos de los no unidos. La etapa de separación se puede conseguir en una diversidad de formas. Por ejemplo, la separación se puede conseguir en solución, o, de forma conveniente, al menos uno de los componentes se inmoviliza en un sustrato sólido, a partir del que se pueden separar fácilmente los componentes no unidos. el sustrato sólido puede consistir en una amplia diversidad de materiales y en una amplia diversidad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperla, varilla, partícula de resina, etc. El sustrato se elige preferentemente para maximizar proporciones de señal a ruido, principalmente para minimizar la unión al fondo, as así como para facilidad separación y costes.
La separación se puede realizar por ejemplo retirando una perla o varilla de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito tal como un pocillo de placa de microtitulación, aclarando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una solución de lavado o disolvente. La etapa de separación incluye preferentemente múltiples aclarados o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos se pueden lavar varias veces con una solución de lavado, por lo general incluye los componentes de la mezcla de incubación que no participan en reuniones específicas tales como sales, tampón, detergente, proteína no especifica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas se pueden lavar una o más veces con una solución de lavado y se pueden aislar usando un imán.
La detección se puede realizar de cualquier forma conveniente para ensayos basados en células tales como medida de un polipéptido inducido dentro, en la superficie de, o secretado por la célula. Algunos ejemplos de procedimientos de detección útiles en ensayos basados en células incluyen análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), bioluminiscencia, fluorescencia, ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), reacción en cadena de polimerasa y transcriptasa inversa (RT-PCR), y similares. Algunos ejemplos de procedimientos de detección útiles ensayos libres de células incluyen bioluminiscencia, fluorescencia, ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), reacción en cadena de polimerasa y transcriptasa inversa (RT-PCR), y similares.
Un sujeto hará referencia a un ser humano o animal que incluye, pero no se limita a un perro, gato, caballo, vaca, cerdo, oveja, cabra, pollo, roedor, por ejemplo, ratas y ratones, primate, por ejemplo, mono, y peces o especies de acuicultura tales como peces de aleta (por ejemplo, salmón) y mariscos (por ejemplo, gambas y vieiras). Algunos sujetos adecuados para procedimientos terapéuticos o profilácticos incluyen especies de vertebrados e invertebrados. Los sujetos pueden ser mascotas domésticas (por ejemplo, perros, gatos, peces, etc.), animales de ganado agrícola (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, pollos, etc.), animales de laboratorio (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, etc.), animales de zoo (por ejemplo, leones, jirafas, etc.), pero no se limitan a los mismos. Aunque muchas de las realizaciones que se describen en el presente documento se refieren a trastornos humanos, la invención también es útil para tratar a otros vertebrados no humanos.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar", cuando se usa con respecto a uno de los trastornos que se describen en el presente documento, se refiere tanto a tratamiento profiláctico que disminuye la probabilidad de que un sujeto desarrolle el trastorno así como a tratamiento de un trastorno establecido, por ejemplo, para reducir o eliminar el trastorno o síntomas de trastorno, o para prevenir que el trastorno o síntomas del trastorno empeoren.
Un sujeto que tiene un trastorno se refiere a un sujeto que tiene una manifestación del trastorno que se puede medir de forma objetiva. Por lo tanto, por ejemplo, un sujeto que tiene un cáncer es un sujeto que tiene células cancerosas detectables. Un sujeto que tiene una infección es un sujeto que se ha expuesto a un organismo infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del organismo en el cuerpo. La infección puede ser latente (inactiva) o activa.
Un sujeto en riesgo de tener un trastorno se define como un sujeto que tiene un riesgo más elevado de lo normal de desarrollar el trastorno. El riesgo normal por lo general es el riesgo de una población de individuos normales que no tienen el trastorno y que no están predispuestos de forma identificable, por ejemplo, genética o ambientalmente, al desarrollo del trastorno. Por lo tanto, un sujeto en riesgo de tener un trastorno puede incluir, pero no se limita a, un sujeto que está predispuesto genéticamente desarrollar el trastorno, así como sujeto que está o estará expuesto a un agente ambiental conocido o que se cree que causa del trastorno. Algunos agentes ambientales incluyen específicamente, pero no se limitan a, agentes infecciosos tales como virus, bacterias, hongos, y parásitos. Otros agentes ambientales pueden incluir, por ejemplo, humo del tabaco, ciertos agentes químicos orgánicos, asbesto, y similares.
La expresión "cantidad eficaz" de un ácido nucleico u otro agente terapéutico se refiere a la cantidad necesaria o suficiente para observar un efecto biológico deseado. En general, una cantidad eficaz es la cantidad necesaria para provocar la activación del sistema inmune, dando como resultado potencialmente el desarrollo de una respuesta inmune específica de antígeno. En algunas realizaciones, el ácido nucleico u otro agente terapéutico se administran en una cantidad eficaz para estimular o inducir una respuesta inmune de Th1 o una respuesta inmune general. Una cantidad eficaz para estimular una respuesta inmune de Th1 se puede definir como la cantidad que estimula la producción de una o más citoquinas de tipo Th1, tales como IL-2, IL-12, TNF-α, y EFN-γ, y/o producción de uno o más anticuerpos de tipo Th1.
Además en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento de tratamiento para inducir una respuesta inmune en un sujeto que implica la administración a un sujeto de un antígeno, y la administración al sujeto de una composición inmunoestimulante de la invención en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune al antígeno. Se debe indicar que el antígeno se puede administrar antes, después, o de forma simultánea con la composición inmunoestimulante de la invención. Además, tanto el antígeno como el compuesto inmunoestimulante se pueden administrar sujeto más de una vez.
La invención proporciona adicionalmente, en otro aspecto adicional, un procedimiento de tratamiento por inducción de una respuesta inmune en un sujeto que implica aislar células dendríticas de un sujeto, poner en contacto de las células dendríticas ex vivo con una composición inmunoestimulante de la invención, poner en contacto las células dendríticas ex vivo con un antígeno, y administrar las células de dendríticas puestas en contacto con el sujeto.
El término "antígeno" se refiera una molécula capaz de provocar una respuesta inmune. El término antígeno incluye ampliamente cualquier tipo de molécula que es reconocida por un sistema hospedador como si fuera extraña. Los antígenos incluyen, pero no se limitan a, antígenos microbianos, antígenos para el cáncer, y alérgenos. Los antígenos incluyen, pero no se limitan a, células, extractos celulares, proteínas, polipéptidos, péptidos, polisacáridos, conjugados de polisacáridos, miméticos peptídicos y no peptídicos de polisacáridos y otras moléculas, moléculas pequeñas, lípidos, glicolípidos, y carbohidratos. Muchos antígenos tienen naturaleza proteica o polipeptídica, ya que proteínas y polipéptidos son generalmente más antigénicos que carbohidratos o grasas.
El antígeno puede ser un antígeno que está codificado por un vector de ácido nucleico o pueden estar codificado en un vector de ácido nucleico. En el primer caso, el vector de ácido nucleico se administra al sujeto y el antígeno se expresa in vivo. En el último caso, el antígeno se puede administrar directamente al sujeto. Un antígeno no codificado en un vector de ácido nucleico como se usa en el presente documento se refiere a cualquier tipo de antígeno que no es un ácido nucleico. Por ejemplo, en algunos aspectos de la invención el antígeno no codificado en un vector de ácido nucleico es un péptido o un polipéptido. Modificaciones menores de las secuencias de aminoácidos primarias de antígeno peptídicos o polipeptídicos también pueden dar como resultado un polipéptido que tiene una actividad antigénica básicamente equivalente en comparación con el polipéptido homólogo sin modificar. Tales modificaciones pueden ser deliberadas, tal como por mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser espontáneas. Todos los polipéptidos producidos con estas modificaciones se incluyen en el presente documento siempre y cuando todavía exista antigenicidad. El péptido o el polipéptido, por ejemplo, se pueden derivar por vía viral.
Los antígenos útiles en la invención pueden tener cualquier longitud, que varía de fragmentos de péptidos pequeños de una proteína o polipéptido de longitud completa hasta la forma de longitud completa. Por ejemplo, el antígeno puede tener una longitud inferior a 5, inferior a 8, inferior a 10, inferior a 15, inferior a 20, inferior a 30, inferior a 50, inferior a 70, inferior a 100, o más restos de aminoácidos, con la condición de que estimule una respuesta inmune específica.
El ácido nucleico que codifica al antígeno está unido de forma operativa a una secuencia de expresión genética que dirige la expresión del ácido nucleico antigénico dentro de una célula eucariota. La secuencia de expresión genética es cualquier secuencia de nucleótidos reguladora, tal como una secuencia promotora o combinación potenciadora del promotor, que facilita la transcripción y la traducción eficaces del ácido nucleico antigénico al que se une de forma operativa. La secuencia de expresión genética, por ejemplo, puede ser un promotor de mamífero o viral, tal como un promotor constitutivo o inducible. Los promotores de mamífero constitutivos incluyen, pero no se limitan a, los prometedores de los siguientes genes: hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), adenosina desaminasa, piruvato quinasa, promotor de β-actina y otros promotores constitutivos. Algunos promotores virales a modo de ejemplo que funcionan de forma constitutiva en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores del
citomegalovirus (CMV), virus de simio (por ejemplo, SV40), virus del papiloma, adenovirus, virus de inmunodeficiencia humana (VIH), virus del sarcoma de Rous, las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus, y el promotor de timidina quinasa del virus del herpes simple. Los expertos habituales en la materia conocen promotores constitutivos. Los promotores útiles como secuencias de expresión genética de la invención también incluyen promotores inducibles. Los promotores inducibles se expresan en presencia de un agente inductor. Por ejemplo, el promotor de metalotioneína se induce para que promueva la transcripción y la traducción en presencia de ciertos iones metálicos. Los expertos habituales en la materia conocen otros promotores inducibles.
En general, la secuencia de expresión genética incluirá, cuando sea necesario, secuencias de no transcripción en la posición 5' y secuencias de no traducción en la posición 5' implicadas con el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, tales como una caja TATA, secuencia de protección, secuencia CAAT, y similares. Especialmente, tales secuencias de no transcripción en la posición 5' incluirán una región promotora que incluye una secuencia promotora para control de la transcripción del ácido nucleico antigénico unido de forma operativa. Las secuencias de expresión genética incluyen opcionalmente secuencias potenciadoras o secuencias activadas cadena arriba cuando se desee.
El ácido nucleico antigénico se une de forma operativa a la secuencia de expresión genética. Como se usa en el presente documento, se dice que la secuencia de ácidos nucleicos antigénica y la secuencia de expresión genética están unidas de forma operativa cuando se unen covalente mente de una manera tal que se produce la expresión o transcripción y/o traducción de la secuencia de codificación antigénica bajo la influencia o control de la secuencia de expresión genética. Se dice que dos secuencias de ADN están unidas de forma operativa si la inducción de un promotor en la secuencia de expresión genética en la posición 5' da como resultado la transcripción de la secuencia antigénica si la naturaleza de la unión entre las dos secuencias de ADN no (1) da como resultado la introducción de una mutación de desplazamiento del marco de lectura, (2) interfiere con la capacidad de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia antigénica, o (3) interfiere con la capacidad del ARN correspondiente transcrito a traducir en una proteína. Por lo tanto, una secuencia de expresión genética estaría unida de forma operativa a una secuencia de ácidos nucleicos antigénica si la secuencia de expresión genética fuera capaz de efectuar transcripción de una secuencia de ácidos nucleicos antigénica de modo que el transcrito resultante se traduce en la proteína o polipéptido deseados.
El ácido nucleico antigénico de la invención se puede administrar sistema inmune solo o en asociación con un vector. En su sentido más amplio, un vector es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia del ácido nucleico antigénico a las células del sistema inmune de modo que el antígeno se puede expresar y está presente en la superficie de la célula inmune. El vector generalmente transporta el ácido nucleico a las células inmunes con una reducción de la degradación con respecto al alcance de la degradación que daría como resultado la ausencia del vector. El vector incluye opcionalmente la secuencia de expresión genética que se ha descrito anteriormente para aumentar la extensión del ácido nucleico antigénico en las células inmunes. En general, los vectores útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, fagémidos, virus, otros vehículos derivados de fuentes virales o bacterianas que se han manipulado mediante la inserción incorporación de las secuencias de ácidos nucleicos antigénicos. Los vectores virales son un tipo de vector preferente e incluyen, pero no se limitan a, secuencias de ácidos nucleicos de los siguientes virus: retrovirus, tales como virus de leucemia murina de Moloney, virus del sarcoma murino de Harvey, virus de tumor de mama murino, y virus del sarcoma de Rous; adenovirus, virus adenoasociados; virus de tipo SV40; virus de polioma; virus Epstein-Barr; virus del papiloma; virus del herpes; virus vaccinia; virus de la polio; y virus de ARN tal como un retrovirus. Se pueden usar fácilmente otros vectores no mencionados pero que se conocen en la técnica.
Algunos vectores virales preferentes se basan en virus eucariotas no citopáticos en los que genes no esenciales se ha sustituido con el gen de interés. Algunos virus no citopáticos incluyen retrovirus, cuyo ciclo vital implica transcripción inversa del ARN viral genómico en ADN con posterior integración proviral en ADN celular hospedador. Se han aprobado retrovirus para ensayos de terapia genética en seres humanos. Los más útiles son los retrovirus que tienen déficit de replicación (es decir, son capaces de dirigir la síntesis de las proteínas deseadas, pero son incapaces de fabricar una partícula infecciosa). Tales vectores de expresión retroviral alterada genéticamente tienen utilidad general para la transducción de genes de alta eficacia in vivo. En Kriegler, M., Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, W.H. Freeman Co., New York (1990) y Murray, EJ. Methods in Molecular Biology, vol. 7, Humana Press, Inc., Cliffton, New Jersey (1991) se proporcionan protocolos convencionales para producir retrovirus con déficit de replicación (incluyendo las etapas de incorporación de material genético exógeno en un plásmido, transfección de una línea celular empaquetada con plásmido, producción de retrovirus recombinantes mediante la línea celular de empaquetamiento, colección de partículas virales de los medios de cultivo, e infección de las células diana con partículas virales).
Un virus preferente para ciertas aplicaciones es el virus adenoasociado, un virus de ADN bicatenario. El virus adenoasociados puede someter a ingeniería para que tenga déficit de replicación y sea capaz de infectar una amplia gama de tipos y especies celulares. Adicionalmente tiene ventajas, tales como estabilidad en calor y disolvente de lipídico; frecuencias de transducción elevadas en células de diversos linajes, incluyendo células hematopoyéticas; y falta de inhibición de superinfección permitiendo de este modo múltiples series de transducciones. Según se informa, algunos virus adenoasociados de tipo silvestre manifiestan cierta preferencia por sitios de integración en ADN celular
humano, minimizando de este modo la posibilidad de mutagénesis de inserción y variabilidad de expresión de genes insertados característica de la infección retroviral. Además, se ha seguido infecciones de virus adenoasociados de tipo silvestre en cultivo tisular para más de 100 pasos en ausencia de presión selectiva, lo que implica que la integración genómica del virus adenoasociado es un suceso relativamente estable. El virus adenoasociado también puede funcionar de una forma extracromosómica. Los virus adenoasociados recombinante es que carecen de la proteína replicasa aparentemente carecen de esta especificidad de secuencia de integración.
Otros vectores incluyen vectores plásmidos. En la técnica se han descrito de forma extensa vectores plásmidos y son bien conocidos por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. En los últimos años, se han encontrado encontrados vectores plásmidos que son particularmente ventajosos para administración de genes a células in vivo debido a su incapacidad para replicarse e integrarse en un genoma hospedador. Estos plásmidos, sin embargo, tienen un promotor compatible con la célula hospedadora, pueden expresar un péptido de un gen codificado de forma operativa dentro del plásmido. Algunos plásmidos usados habitualmente incluyen pBR322, pUC18, pUC19, pRc/CMV, SV40, y pBlueScript. Los expertos habituales en la materia conocen bien otros plásmidos. Además, los plásmidos se pueden diseñar a medida usando enzimas de restricción y reacciones de ligación para retirar y añadir fragmentos específicos de ADN.
Recientemente se ha descubierto que se pueden administrar plásmidos que portan genes al sistema inmune usando bacterias. Las formas modificadas de bacterias tales como Salmonella se pueden transfectar con el plásmido y usar como vehículos de administración. Los vehículos de administración bacteriana se pueden administrar a un sujeto hospedador por vía oral o mediante otros medios de administración. Las bacterias administran el plásmido a células inmunes, por ejemplo, linfocitos B, células dendríticas, probablemente pasando a través de la barrera intestinal. Se han establecido niveles elevados de protección inmune usando esta metodología. Tales procedimientos de administración son útiles para la administración sistémica de antígenos, ácidos nucleicos, y/u otros agentes terapéuticos.
En algunos aspectos, los ácidos nucleicos administran junto con agentes terapéuticos tales como medicamentos específicos para trastornos. Como se usa en el presente documento, un medicamento específico para trastornos es una terapia o agente que se usa predominantemente en el tratamiento o prevención de un trastorno.
En un aspecto, la combinación de ácidos nucleicos y medicamentos específicos para trastornos permite la administración de dosis más elevadas de medicamentos específicos para trastornos sin tantos efectos secundarios como normalmente se experimentan con las dosis elevadas. En otro aspecto, la combinación de ácidos nucleicos y medicamentos específicos para trastornos permite la administración de dosis subterapéuticas, menores de cualquier compuesto, pero con una eficacia más elevada que la que se conseguiría de otro modo usando tales dosis bajas. Como un ejemplo, mediante la administración de una combinación de un ácido nucleico inmunoestimulante y un medicamento, es posible conseguir una respuesta eficaz incluso cuando el medicamento se administrará una dosis que sola no proporcionaría un beneficio terapéutico (es decir, una dosis subterapéutica). Como otro ejemplo, la administración combinada consigue una respuesta incluso cuando el ácido nucleico se administra una dosis que sola no proporcionaría un beneficio terapéutico.
Los ácidos nucleicos y/u otros agentes terapéuticos también se pueden administrar en programas fijos o en diferentes relaciones en el tiempo entre sí. Las diversas combinaciones pueden tener ventajas sobre los procedimientos de la técnica anterior de modulación de respuestas inmunes o prevención o tratamiento de trastornos, en particular con respecto a la disminución de la toxicidad no especifica para tejidos normales.
El cáncer es una enfermedad que implica el crecimiento descontrolado (es decir, división) de células. Algunos de los mecanismos conocidos que contribuyen a la proliferación descontrolada de las células cancerígenas incluyen independencia de factores de crecimiento, insuficiencia para detectar mutación genómica, y señalización celular inapropiada. La capacidad de las células cancerígenas para ignorar controles de crecimiento normales puede dar como resultado un aumento de la tasa de proliferación. Aunque las causas del cáncer no se han establecido de forma firme, existen algunos factores conocidos que contribuyen, o al menos predisponen a un sujeto, al cáncer. Tales factores incluyen mutaciones genéticas en particular (por ejemplo, mutación del gen BRCA para el cáncer de mama, APC para el cáncer de colon), exposición a agentes que se sospecha que causan cáncer, o agentes carcinógenos (por ejemplo, asbesto, radiación UV) y disposición familiar para cánceres en particular tales como el cáncer de mama.
El cáncer puede ser un cáncer maligno o no maligno. Los cánceres o tumores incluyen, pero no se limitan a cáncer del tracto biliar; cáncer de cerebro; cáncer de mama; cáncer de cuello uterino; coriocarcinoma; cáncer de colon; cáncer de endometrio ; cáncer de esófago; cáncer gástrico; neoplasias intraepiteliales; linfomas; cáncer de hígado; cáncer de pulmón (por ejemplo, microcítico y no microcítico); melanoma; neuroblastomas; cáncer oral; cáncer de ovarios; cáncer de páncreas; cáncer de próstata; cáncer rectal; sarcomas; cáncer de piel; cáncer testicular; cáncer de tiroides; y cáncer renal, así como otros carcinomas y sarcomas. En una realización, el cáncer es leucemia de células pilosas, leucemia mielógena crónica, leucemia de linfocitos T cutáneos, mieloma múltiple, linfoma folicular, melanoma maligno, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células renales, carcinoma de próstata, carcinoma de células de la vejiga, o carcinoma de colon.
Un "sujeto que tiene un cáncer" es un sujeto que tiene células cancerígenas detectables.
Un "sujeto con riesgo de desarrollar un cáncer" es uno que tiene una probabilidad más elevada de lo normal de desarrollar cáncer. Estos sujetos incluyen, por ejemplo, sujetos que tienen una anomalía genética que se ha demostrado que está asociada con una probabilidad más elevada de desarrollar un cáncer, sujetos que tienen una disposición familiar de cáncer, sujetos expuestos a agentes que causan cáncer (es decir, agentes carcinógenos) tales como tabaco, asbesto, otras toxinas químicas, y sujetos tratados anteriormente para el cáncer y en remisión aparente.
Un "antígeno para el cáncer" como se usa en el presente documento es un compuesto, tal como un péptido o proteína, asociado con una superficie celular tumoral o cancerígena y que es capaz de provocar una respuesta inmune cuando se expresa en la superficie de un antígeno que presenta células en el contexto de una molécula de MHC. Los antígenos para el cáncer se pueden preparar a partir de células cancerígenas preparando extractos en bruto de células cancerígenas, por ejemplo, como se describe en Cohen PA y col. (1994) Cancer Res 54: 1055-8, purificando parcialmente los antígenos, mediante tecnología recombinante, o mediante síntesis de novo de antígenos conocidos. Los antígenos para el cáncer incluyen, pero no se limitan a, antígenos que se expresan de forma recombinante, una parte inmunógena de, o un tumor o cáncer completo. Tales antígenos se pueden aislar o preparar de forma recombinante o mediante cualquier otro medio conocido la técnica.
Las expresiones "antígeno para el cáncer" y "antígeno tumoral" se usan indistintamente se refieren a antígenos que se expresan esencialmente mediante células cancerígenas y que por lo tanto se pueden aprovechar con el fin de dirigirse a células cancerígenas. Algunos antígenos para el cáncer son antígenos que pueden estimular potencialmente de forma aparente de respuestas inmunes específicas de tumor. Algunos de estos antígenos están codificados, aunque no necesariamente expresados, por células normales. Estos antígenos se pueden caracterizar como los que normalmente son silenciosos (es decir, no se expresan) en células normales, los que se expresan solamente en ciertos estadios de diferenciación y los que se expresan de forma temporal tales como antígenos embrionarios y fetales. Otros antígenos para el cáncer están codificados por genes celulares mutantes, tales como oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), proteínas de fusión que resultan de supresiones internas o translocaciones cromosómicas. Además otros antígenos para el cáncer se pueden codificar con genes virales tales como los conservados en virus de tumor de ARN y ADN. Ejemplos de antígenos tumorales incluyen MAGE, MART-1/Melan-A, gp100, Dipeptidil peptidasa IV (DPPIV), proteína de unión a adenosina desaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno asociado a Colorrectal (CRC)--C017-1A/GA733, Antígeno Carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos inmunogénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, am11, Antígeno Específico de Próstata (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2, y PSA-3, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), cadena de receptores de linfocitos T/CD3-zeta, familia MAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia GAGE de antígenos tumorales (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-fetoproteína, E-cadherina, α-catenina, β-catenina e γ-catenina, p120ctn, gp100Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína de poliposis adenomatosa coli (APC), fodrina, Conexina 37, idiotipo de Ig, gangliósidos p15, gp75, GM2 y GD2, productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano, familia Smad de antígenos tumorales, lmp-1, P1A, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa de cerebro, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2.
Algunos cánceres o tumores y antígenos tumorales asociados con tales tumores (pero no de forma exclusiva), incluyen leucemia linfoblástica aguda (etv6; am11; ciclofilina b), linfoma de linfocitos B (idiotipo de Ig), glioma (Ecadherina; α-catenina; β-catenina; γ-catenina; p120ctn), cáncer de vejiga (p21ras), cáncer biliar (p21ras), cáncer de mama (familia MUC; HER2/neu; c-erbB-2), carcinoma de cuello uterino (p53; p21ras), carcinoma de colon (p21ras; HER2/neu; c-erbB-2; familia MUC), cancer colorrectal (antígeno asociado a Colorrectal (CRC)--C017-1A/GA733; APC), coriocarcinoma (CEA), cáncer de células epiteliales (ciclofilina b), cáncer gástrico (HER2/neu; c-erbB-2; ga733 glicoproteína), cáncer hepatocelular (α-fetoproteína), linfoma de Hodgkins (lmp-1; EBNA-1), cáncer de pulmón (CEA; MAGE-3; NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p15, gp75, antígeno oncofetal, gangliósidos GM2 y GD2), mieloma (familia MUC; p21ras), carcinoma de pulmón de células no microcíticas (HER2/neu; c-erbB-2), cáncer nasofaríngeo (lmp-1; EBNA-1), cáncer de ovarios (familia MUC; HER2/neu; c-erbB-2), cáncer de próstata (Antígeno Específico de Próstata (PSA) y sus epítopos inmunogénicos PSA-1, PSA-2, y PSA-3; PSMA; HER2/neu; c-erbB-2), cáncer pancreático (p21ras; familia MUC; HER2/neu; c-erbB2; glucoproteína ga733), cáncer renal (HER2/neu; c-erbB-2), cánceres de células escamosas de cuello uterino y esófago (productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano), cáncer testicular (NY-ESO-1), leucemia de linfocitos T (epítopos de HTLV-1), y melanoma (Melan-A/MART-1; cdc27; MAGE-3; p21ras;
gp100Pmel117).
Para ejemplos de antígenos tumorales que se unen a cualquiera o a ambas moléculas MHC de clase I y MHC de clase II, véanse las siguientes referencias: Coulie, Stem Cells 13: 393-403, 1995; Traversari y col. J Exp Med 176: 1453-1457, 1992; Chaux y col. J Immunol 163: 2928-2936, 1999; Fujie y col. Int J Cancer 80: 169-172, 1999; Tanzarella y col. Cancer Res 59: 2668-2674, 1999; van der Bruggen y col. Eur J Immunol 24: 2134-2140, 1994;
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Las composiciones y procedimientos de tratamiento de la invención se pueden usar solos o en conjunto con otros agentes y procedimientos útiles para el tratamiento del cáncer. En la actualidad, el cáncer se trata usando una diversidad de modalidades que incluyen cirugía, terapia de radiación y quimioterapia. La elección de la modalidad de tratamiento dependerá del tipo, ubicación y diseminación del cáncer. Por ejemplo, la cirugía y la terapia radiación pueden ser más apropiadas en el caso de masas tumorales bien definidas, sólidas y menos prácticas en el caso de cánceres tumorales no sólidos tales como leucemia y linfoma. Una de las ventajas de la cirugía y de la terapia de radiación es la capacidad de controlar hasta cierto punto el impacto de la terapia, y por lo tanto limitar la toxicidad hacia los tejidos normales en el organismo. Sin embargo, la cirugía y la terapia de radiación a menudo van seguidas de quimioterapia para protegerse frente a cualquier célula cancerígena que permanece o que es resistente a la radiación. La quimioterapia también es el tratamiento más apropiado para cánceres diseminados tales como leucemia y linfoma así como para metástasis.
Quimioterapia se refiere a terapia que usa agentes químicos y/o biológicos para atacar a células cancerígenas. A diferencia de la cirugía o la radiación localizada, la quimioterapia se administra generalmente de una manera sistémica y por lo tanto toxicidad para los tejidos normales es una preocupación importante. Debido a que muchos agentes de quimioterapia se dirigen a las células cancerígenas basándose en sus perfiles proliferativos, tejidos tales como el tracto gastrointestinal y la médula ósea que normalmente son proliferativos también son susceptibles a los efectos de la quimioterapia. Uno de los principales efectos secundarios de la quimioterapia es la mielosupresión (que incluye anemia, neutropenia y trombocitopenia), que resulta de la muerte de precursores hematopoyéticos normales.
Se han desarrollado muchos agentes quimioterapéuticos para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, no todos los tumores responden a los agentes quimioterapéuticos y otros aunque inicialmente responden a los agentes quimioterapéuticos pueden desarrollar resistencia. Como resultado, la búsqueda de fármacos eficaces contra el cáncer se ha intensificado en un esfuerzo por encontrar agentes aún más eficaces con menos toxicidad no específica.
Los medicamentos para el cáncer funcionan en una diversidad de formas. Algunos medicamentos para el cáncer trabajan teniendo como objetivo mecanismos fisiológicos que son específicos para células tumorales. Algunos ejemplos incluyen la orientación de genes específicos y sus productos genéticos (es decir, principalmente proteínas) que se encuentran mutados en cánceres. Tales genes incluyen, pero no se limitan a, oncogenes (por ejemplo, Ras, Her2, bcl-2), genes supresores de tumores (por ejemplo, EGF, p53, Rb), y dianas del ciclo celular (por ejemplo, CDK4, p21, telomerasa). Algunos medicamentos para el cáncer se pueden dirigir alternativamente a rutas de transducción de señales y mecanismos moleculares que están alterados en células cancerígenas. La dirección de las células cancerígenas a través de los epítopos expresados en su superficie celular se consigue mediante el uso de anticuerpos monoclonales. En el presente documento este último tipo de medicamento para el cáncer se denomina generalmente inmunoterapia.
Otros medicamentos se dirigen a células diana distintas de las células cancerígenas. Por ejemplo, algunos medicamentos preparan el sistema inmune para atacar a las células tumorales (es decir, vacunas contra el cáncer). Sin embargo, otros medicamentos, llamados inhibidores de la angiogénesis, funcionan atacando el suministro de sangre de los tumores sólidos. Dado que los cánceres más malignos son capaces de experimentar metástasis (es decir, salir del sitio del tumor primario y establecerse en otro sitio, formando de este modo un tumor secundario), los medicamentos que impiden esta metástasis también son útiles en el tratamiento del cáncer. Algunos mediadores angiogénicos incluyen FGF básico, VEGF, angiopoyetinas, angiostatina, endostatina, TNF-α, TNP-470, trombospondina-1, factor plaquetario 4, CAI, y ciertos miembros de la familia de proteínas integrinas. Una categoría de este tipo de medicamento es un inhibidor de metaloproteinasa, que inhibe las enzimas usadas por las células cancerígenas para existir en el sitio del tumor primario y extravasarse en otro tejido.
Algunas células cancerígenas son antigénicas y por lo tanto pueden ser dirigidas por el sistema inmune. En un aspecto, la administración combinada de medicamentos para ácidos nucleicos y cáncer, en particular los que se clasifican como inmunoterapias para el cáncer, es útil para estimular una respuesta inmune específica frente a un antígeno para el cáncer.
La teoría de la vigilancia inmune es que una función principal del sistema inmune es detectar y eliminar células neoplásicas antes de que se forme un tumor. Un principio básico de esta teoría es que las células cancerígenas son antigénicamente diferentes de las células normales y por lo tanto provocan reacciones inmunes que son similares a las que causan rechazo de aloinjertos inmunológicamente incompatibles. Algunos estudios han confirmado que las células tumorales son diferentes, ya sea cualitativa o cuantitativamente, en su expresión de antígenos. Por ejemplo, los "antígenos específicos de tumores" son antígenos que se asocian específicamente con células tumorales pero no con células normales. Algunos ejemplos de antígenos específicos de tumores son antígenos virales en tumores inducidos por virus de ADN o ARN. Los antígenos "asociados a tumores" están presentes tanto en células tumorales como en células normales, pero están presentes en una cantidad diferente o una forma diferente en las células tumorales. Algunos ejemplos de tales antígenos son antígenos oncofetales (por ejemplo, antígeno carcinoembrionario), antígenos de diferenciación (por ejemplo, antígenos T y Tn) y productos de oncogenes (por ejemplo, HER/neu).
Se han identificado diferentes tipos de células que pueden destruir dianas tumorales in vitro e in vivo: linfocitos citolíticos naturales (NK), linfocitos T citolíticos (CTL), linfocitos citolíticos activados por linfoquinas (LAK) y macrófagos activados. Los linfocitos NK pueden eliminar las células tumorales sin haberse sensibilizado previamente a antígenos específicos, y la actividad no requiere la presencia de antígenos de clase I codificados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) en células diana.
Se cree que los linfocitos NK participan en el control de tumores nacientes y en el control del crecimiento metastásico. Por el contrario a los linfocitos NK, los CTL pueden destruir células tumorales solamente después de que se hayan sensibilizado a antígenos tumorales y cuando el antígeno diana se expresa en las células tumorales que también expresan la clase I de MHC. Se cree que los CTL son células efectoras en el rechazo de tumores trasplantados y de tumores causados por virus de ADN. Los linfocitos LAK son un subgrupo de linfocitos nulos distintos de las poblaciones de NK y CTL. Los macrófagos activados pueden destruir células tumorales de una manera que no es ni dependiente de antígenos ni restringida por MHC una vez activados. Se cree que los macrófagos activados disminuyen la tasa de crecimiento de los tumores que infiltran. En los ensayos in vitro se han identificado otros mecanismos inmunes tales como reacciones citotóxicas mediadas por células, dependientes de anticuerpos y lisis por anticuerpo más complemento. Sin embargo, se cree que estos mecanismos efectores inmunes son menos importantes in vivo que la función de NK, los CTL, LAK y macrófagos in vivo (para revisión véase Piessens WF y col. "Tumor Immunology", En: Scientific American Medicine. Vol. 2, Scientific American Books, N.Y., pp. 1-13, 1996).
El objetivo de la inmunoterapia es aumentar la respuesta inmune de un paciente a un tumor establecido. Un procedimiento de inmunoterapia incluye el uso de adyuvantes. Las sustancias adyuvantes derivadas de microorganismos, tales como el bacilo de Calmette-Guérin, aumentan la respuesta inmune y mejoran la resistencia a tumores en animales.
Algunos agentes inmunoterapéuticos son medicamentos que se derivan de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente o reconocen un antígeno para el cáncer. Algunas inmunoterapias basadas en anticuerpos pueden funcionar mediante la unión a la superficie celular de una célula cancerígena y de ese modo estimular el sistema inmune endógeno para atacar a la célula cancerígena. Otra forma en la que funciona la terapia basada en anticuerpos es un sistema de administración para la dirección específica de sustancias tóxicas para células cancerígenas. Algunos anticuerpos están generalmente conjugados con toxinas tales como ricina (por ejemplo, de semillas de ricino), caliqueamicina y maitansinoides, con isótopos radiactivos tales como Yodo-131 e Itrio-90, con agentes quimioterapéuticos (como se describe en el presente documento), o con modificadores de la respuesta biológica. De esta manera, las sustancias tóxicas se pueden concentrar en la región del cáncer y se puede minimizar la toxicidad no específica para células normales. Además del uso de anticuerpos que son específicos para antígenos para el cáncer, también son útiles en la invención anticuerpos que se unen a la vasculatura, tales como los que se unen a células endoteliales. Esto se debe a que los tumores sólidos en general, dependen de los vasos sanguíneos recién formados para sobrevivir, y por lo tanto la mayoría de los tumores son
capaces de reclutar y estimular el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Como resultado, una estrategia de muchos medicamentos para el cáncer es atacar los vasos sanguíneos que alimentan un tumor y/o los tejidos conectivos (o estroma) que apoyan tales vasos sanguíneos.
Las vacunas contra el cáncer son medicamentos que pretenden estimular una respuesta inmune endógena frente a las células cancerígenas. Las vacunas producidas en la actualidad activan principalmente el sistema inmune humoral (es decir, la respuesta inmune dependiente de anticuerpos). Otras vacunas actualmente en desarrollo se centran en la activación del sistema inmune mediada por células que incluyen linfocitos T citotóxicos, que son capaces de destruir las células tumorales. En general, las vacunas contra el cáncer mejoran la presentación de antígenos para el cáncer tanto a células que presentan antígenos (por ejemplo, macrófagos y células dendríticas) y/u otras célula inmunes tales como linfocitos T, linfocitos B y linfocitos NK.
Aunque las vacunas contra el cáncer pueden tomar una de varias formas, como se analiza a continuación, su finalidad es administrar antígenos para el cáncer y/o antígenos asociados con cáncer a células que presentan de antígenos (APC) con el fin de facilitar el procesamiento endógeno de dichos antígenos por APC y la presentación final de la presentación de antígenos en la superficie celular en el contexto de moléculas de clase I de MHC. Una forma de vacuna contra el cáncer es una vacuna de células completas que es una preparación de células cancerígenas que se han eliminado de un sujeto, tratadas ex vivo y que a continuación se vuelven a introducir como células completas en el sujeto. También se pueden usar lisados de células tumorales como vacunas contra el cáncer para provocar una respuesta inmune. Otra forma de vacuna contra el cáncer es una vacuna peptídica que usa proteínas pequeñas específicas de cáncer o asociadas a cáncer para activar linfocitos T. Las proteínas asociadas a cáncer son proteínas que no se expresan exclusivamente por células cancerígenas (es decir, otras células normales todavía pueden expresar estos antígenos). Sin embargo, la expresión de antígenos asociados con el cáncer por lo general está regulada de forma positiva coherentemente con cánceres de un tipo en particular. Otras vacunas contra el cáncer incluyen vacunas de gangliósidos, vacunas de proteínas de choque térmico, vacunas virales y bacterianas, y vacunas de ácidos nucleicos.
Sin embargo, otra forma de vacuna contra el cáncer es una vacuna de células dendríticas que incluye células dendríticas completas que se han expuesto a un antígeno para el cáncer o un antígeno asociado con cáncer in vitro. También se pueden usar lisados fracciones de membrana de células dendríticas como vacunas contra el cáncer. Algunas vacunas de células dendríticas son capaces de activar directamente las APC. Una célula dendrítica es una APC profesional. Las células dendríticas forman la unión entre el sistema inmune innato y el adquirido mediante la presentación de antígenos y a través de su expresión de receptores de reconocimiento de patrones que detectan moléculas microbianas como LPS en su entorno local. Las células dendríticas internalizan, procesan y presentan antígenos específicos solubles a los que se exponen. El proceso de internalización y presentación de antígenos causa una rápida regulación positiva de la expresión del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) y moléculas coestimulantes, la producción de citoquinas y migración hacia órganos linfáticos en los que se cree que están implicadas en la activación de linfocitos T.
Como se usa en el presente documento, los agentes quimioterapéuticos abarcan todas las otras formas de medicamentos para el cáncer que no entran en las categorías de agentes de inmunoterapéuticos o vacunas contra el cáncer. Los agentes quimioterapéuticos cómo se usan en el presente documento incluyen agentes tanto químicos como biológicos. Estos agentes funcionan para inhibir una actividad celular de la que las células cancerígenas dependen para una supervivencia continua. Algunas categorías de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes de aniquilación/alcaloides, antimetabolitos, hormonas o análogos de hormonas, y diversos fármacos antineoplásicos. La mayoría de estos agentes, si no todos, son directamente tóxicos para las células cancerígenas y no requieren estimulación inmune.
Una "enfermedad infecciosa" o, equivalentemente, una "infección" como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno que surge de la invasión de un anfitrión, superficialmente, localmente, o sistémicamente, por un organismo infeccioso. Los organismos infecciosos incluyen bacterias, virus, hongos y parásitos. En consecuencia, "enfermedad infecciosa" incluye infecciones bacterianas, infecciones virales, infecciones por hongos e infecciones parasitarias.
Un sujeto que tiene una enfermedad infecciosa es un objeto que se ha expuesto a un organismo infeccioso y tiene niveles detectables agudos o crónicos del organismo en el cuerpo. La exposición al organismo infeccioso se produce generalmente con la superficie externa del sujeto, por ejemplo, piel o membranas mucosas y/o se refiere a la penetración de la superficie externa del sujeto por el organismo infeccioso.
Un sujeto en riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa es un sujeto que tiene un riesgo de exposición a un patógeno que causa la infección más elevado de lo normal. Por ejemplo, un sujeto en riesgo puede ser un sujeto que está planeando viajar a una zona en la que se encuentra un determinado tipo de agente infeccioso o puede ser un sujeto que a través de forma de vida o procedimientos de médica está expuesto a fluidos corporales que pueden contener organismos infecciosos o directamente al organismo o a un sujeto vivo en una zona en la que se ha identificado un organismo infeccioso. Los sujetos con riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa también incluyen generalmente poblaciones a las que una agencia médica recomienda vacunación frente a un organismo infeccioso en particular.
Un sujeto con riesgo de desarrollar una enfermedad infecciosa incluye los sujetos que tienen un riesgo general de exposición a un microorganismo, por ejemplo, gripe, pero que no tienen la enfermedad activa durante el tratamiento de la invención, así como sujetos que se considera que están en riesgo específico de desarrollar una enfermedad infecciosa debido a factores médicos o ambientales que exponen al sujeto a un microorganismo en particular.
Las bacterias son organismos unicelulares que se multiplican asexualmente por fisión binaria. Se clasifican y se nombran en función de su morfología, reacciones de tinción, requisitos nutricionales y metabólicos, estructura antigénica, composición química, y homología genética. Las bacterias se pueden clasificar en tres grupos basados en sus formas morfológicas, esféricos (cocos), varilla recta (Bacilos) y varilla curvada o espiral (vibrio, campylobacter, spirillum, y espiroquetas). Las bacterias también se caracterizan más habitualmente basándose en sus reacciones de tinción en dos clases de organismos, gram-positivas y gram-negativas. Gram se refiere al procedimiento de tinción que se realiza normalmente en laboratorios de microbiología. Los organismos grampositivas conservan la tinción siguiendo el procedimiento de tinción y aparecen con un color violeta oscuro. Los organismos gram-negativos no retienen la tinción pero absorben la contratinción y por lo tanto aparecen de color rosa.
Las bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a, bacterias gram negativas y gram positivas. Las bacterias gram positivas incluyen, pero no se limitan a, especies de Pasteurella, especies de Staphylococci, y especies de Streptococcus. Las bacterias gram negativas incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli, especies de Pseudomonas, y especies de Salmonella. Algunos ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a: Helicobacter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria sps (por ejemplo, M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Grupo A de Streptococcus), Streptococcus agalactiae (Grupo B de Streptococcus), Streptococcus (grupo viridans), Streptococcus faecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (especies anaeróbicas), Streptococcus pneumoniae, Campylobacter sp. patógeno, Enterococcus sp., Haemophilus influenzae, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium sp., Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, y Actinomyces israelli.
Los virus son agentes infecciosos pequeños que generalmente contienen un núcleo de ácido nucleico y un revestimiento de proteína, pero no son organismos vivos de forma independiente. Los virus también pueden tomar la forma de ácidos nucleicos infecciosos que carecen de una proteína. Un virus no puede sobrevivir en ausencia de una célula viva dentro de la que se puede replicar. Los virus entran en células vivas específicas, ya sea por endocitosis o por inyección directa de ADN (fago) y se multiplican, causando la enfermedad. El virus multiplicado se puede liberar a continuación e infectar células adicionales. Algunos virus son virus que contienen ADN y otros son virus que contienen ARN. En algunos aspectos, la invención también tiene la intención de tratar enfermedades en las que están implicados priones en la progresión de la enfermedad, como por ejemplo encefalopatía espongiforme bovina (es decir, enfermedad de las vacas locas, BSE) o infección tembladera en animales, o la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en seres humanos.
Los virus incluyen, pero no se limitan a, enterovirus (que incluyen, pero no se limitan a, virus de la familia picornaviridae, tales como virus de la polio, virus coxsackie, ecovirus), rotavirus, adenovirus, virus de la hepatitis. Algunos ejemplos específicos de virus que se han encontrado en seres humanos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana, tales como VIH-1 (también denominado HTLV-III, LAV o HTLV-III/LAV, o VIH-III; y otros aislados, tales como VIH-LP; Picornaviridae (por ejemplo, virus de la polio, virus de la hepatitis A; enterovirus, virus Coxsackie humanos, rinovirus, ecovirus); Calciviridae (por ejemplo, cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (por ejemplo, virus de la encefalitis equina, virus de la rubéola); Flaviviridae (por ejemplo, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronaviridae (por ejemplo, coronavirus); Rhabdoviridae (por ejemplo, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (por ejemplo, virus del ébola); Paramyxoviridae (por ejemplo, virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus sincitial respiratorio); Orthomyxoviridae (por ejemplo, virus de la gripe); Bungaviridae (por ejemplo, virus Hantaan, virus bunga, flebovirus y virus Nairo); Arenaviridae (virus de la fiebre hemorrágica); Reoviridae (por ejemplo, reovirus, orbivirus y rotaviruses); Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B); Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (virus del papiloma, virus del polioma); Adenoviridae (la mayoría de los adenovirus); Herpesviridae (virus del herpes simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virus variólico, virus vaccinia, virus de la viruela); Iridoviridae (por ejemplo, virus de la fiebre del cerdo africano); y virus sin clasificar (por ejemplo, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiformes, el agente de la hepatitis delta (que se cree que es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B), los agentes de hepatitis no A, no B (clase 1 = transmitido por vía interna; clase 2 = transmitido por vía parenteral (es decir, Hepatitis C); virus Norwalk y relacionados, y astrovirus).
Los hongos son organismos eucariotas, de los cuales solamente unos pocos causan infección en mamíferos vertebrados. Dado que los hongos son organismos eucariotas, difieren de forma significativa de las bacterias procariotas en tamaño, organización estructural, ciclo de vida y mecanismo de la multiplicación. Los hongos se clasifican generalmente basándose en características morfológicas, modos de de reproducción y características de cultivo. Aunque los hongos pueden causar diferentes tipos de enfermedad en sujetos, tales como alergias
respiratorias después de la inhalación de antígenos de hongos, intoxicación por hongos debido a la ingestión de sustancias tóxicas, tales como toxina de Amanita phalloides Amanita phalloides y falotoxina producida por setas venenosas y aflatoxinas, producidas por especies de Aspergillus, no todos los hongos causan enfermedades infecciosas.
Los hongos infecciosos pueden causar infecciones sistémicas o superficiales. La infección sistémica primaria se puede producir en sujetos sanos normales, y las infecciones oportunistas se encuentran con mayor frecuencia en individuos inmunocomprometidos. Los agentes fúngicos más comunes que causan infección sistémica primaria incluyen Blastomyces, Coccidioides, y Htoplasma. Los hongos comunes que causan infección oportunista en sujetos inmunocomprometidos o inmunosuprimidos incluyen, pero no se limitan a, Candida albicans, Cryptococcus neoformans, y diversas especies de Aspergillus. Las infecciones fúngicas sistémicas son infecciones invasivas de los órganos internos. El organismo normalmente entra en el cuerpo a través de los pulmones, el tracto gastrointestinal o catéteres intravenosos. Estos tipos de infecciones pueden ser causadas por hongos patógenos primarios o por hongos oportunistas.
Las infecciones fúngicas superficiales implican crecimiento de hongos sobre una superficie externa sin invasión de los tejidos internos. Las infecciones fúngicas superficiales habituales incluyen infecciones fúngicas cutáneas que implican piel, cabello o uñas.
Las enfermedades asociadas con infección por hongos incluyen aspergilosis, blastomicosis, candidiasis, cromoblastomicosis, coccidioidomicosis, criptococosis, infecciones oculares por hongos, pelo por hongos, uñas, e infecciones de la piel, histoplasmosis, lobomicosis, micetoma, otomicosis, paracoccidioidomicosis, Penicillium marneffei diseminada, feohifomicosis, rinosporidioisis, esporotricosis y zigomicosis.
Los parásitos son organismos que dependen de otros organismos para sobrevivir y por lo tanto deben entrar, o infectar, otro organismo para continuar su ciclo de vida. El organismo infectado, es decir, el anfitrión, proporciona tanto nutrición como hábitat al parásito. Aunque en su sentido más amplio el término parásito puede incluir todos los agentes infecciosos (es decir, bacterias, virus, hongos, protozoos y helmintos), hablando en general, el término se utiliza para hacer referencia únicamente a protozoos, helmintos y artrópodos ectoparásitos (por ejemplo, garrapatas, ácaros, etc.). Los protozoos son organismos unicelulares que se pueden replicar tanto por vía intracelular como por vía extracelular, en particular en la sangre, tracto intestinal o la matriz extracelular de los tejidos. Los helmintos son organismos pluricelulares que casi siempre son extracelulares (siendo una excepción Trichinella spp.). Los helmintos normalmente requieren la salida de un huésped primario y la transmisión en un anfitrión secundario con el fin de replicarse. A diferencia de estas clases mencionadas anteriormente, los artrópodos ectoparásitos forman una relación parasitaria con la superficie externa del cuerpo del anfitrión.
Los parásitos incluyen parásitos intracelulares y parásitos intracelulares obligados. Algunos ejemplos de parásitos incluyen, pero no se limitan a, Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmdodium vivax, Plasmodium knowlesi, Babesia microti, Babesia divergens, Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Leishmania major, Leishmania donovani, Leishmania braziliensis, Leishmania tropica, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma rhodesiense y Schistosoma mansoni.
En la bibliografía se han descrito ampliamente otros microorganismos médicamente relevantes, por ejemplo, véase
C. G. A Thomas, Medical Microbiology, Bailliere Tindall, Gran Bretaña 1983. Cada una de las listas mencionadas anteriormente es ilustrativa y no pretende ser limitante.
Las composiciones y procedimientos de la invención se pueden usar solos o en combinación con otros agentes y procedimientos útiles para el tratamiento de la infección. Algunos medicamentos para infección incluyen, pero no se limitan a, agentes antibacterianos, agentes antivirales, agentes antifúngicos y agentes antiparasitarios. Algunas expresiones como "agente antiinfeccioso", "antibiótico", "agente antibacteriano", "agente antiviral", "agente antifúngico", "agente antiparasitario" y "parasiticida" tienen significados bien establecidas para los expertos habituales en la materia y se definen en textos médicos convencionales. En resumen, los agentes antibacterianos destruyen o inhiben bacterias, e incluyen antibióticos, así como otros compuestos sintéticos o naturales que tienen funciones similares. Los agentes antivirales se pueden aislar o se pueden sintetizar de fuentes naturales y son útiles para destruir o inhibir virus. Los agentes antifúngicos se usan para tratar infecciones fúngicas superficiales, así como infecciones fúngicas sistémicas oportunistas y primarias. Los agentes antiparasitarios destruyen o inhiben parásitos. Muchos antibióticos son moléculas de bajo peso molecular que se producen como metabolitos secundarios por las células, tales como microorganismos. En general, los antibióticos interfieren con una o más funciones o estructuras que son específicas para el microorganismo y que no están presentes en las células anfitrionas.
Uno de los problemas con las terapias antiinfecciosas son los efectos secundarios que se producen en el anfitrión que se trata con el agente antiinfeccioso. Por ejemplo, muchos agentes antiinfecciosos pueden destruir o inhibir un amplio espectro de microorganismos y no son específicos para un tipo de especies en particular. El tratamiento con estos tipos de agentes antiinfecciosos da como resultado la destrucción de la flora microbiana normal que viven en el anfitrión, así como el microorganismo infeccioso. La pérdida de la flora microbiana puede conducir a complicaciones de la enfermedad y puede predisponer al anfitrión a infección por otros patógenos, ya que la flora microbiana compite con y funciona como barrera para agentes patógenos infecciosos. Otros efectos secundarios pueden surgir
como resultado de efectos específicos o no específicos de estas entidades químicas en células o tejidos no microbianos del anfitrión.
Otro problema con el uso generalizado de agentes antiinfecciosos es el desarrollo de cepas de microorganismos resistentes a antibióticos. Ya se han desarrollado enterococos resistentes a la vancomicina, pneumococos resistentes a la penicilina, S. aureus multirresistente y cepas de tuberculosis multirresistentes y se están convirtiendo en problemas clínicos importantes. El uso generalizado de agentes antiinfecciosos probablemente producirá muchas cepas de bacterias resistentes a antibióticos. Como resultado, se requerirán nuevas estrategias de agentes antiinfecciosos para combatir a estos microorganismos.
Los antibióticos antibacterianos que son eficaces para destruir o inhibir una amplia gama de bacterias se denominan antibióticos de amplio espectro. Otros tipos de antibióticos antibacterianos son predominantemente eficaces frente a bacterias de la clase gram-positiva o gram-negativa. Estos tipos de antibióticos se conocen como antibióticos de espectro reducido. Otros antibióticos que son eficaces frente a un único organismo o enfermedad y no frente a otros tipos de bacterias, se conocen como antibióticos de espectro limitado.
En ocasiones los agentes antibacterianos se clasifican en función de su modo de acción principal. En general, los agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de la pared celular, inhibidores de la membrana celular, inhibidores de la síntesis de proteínas, inhibidores de la síntesis de ácidos nucleicos o funcionales, e inhibidores competitivos. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular inhiben una etapa en el proceso de síntesis de la pared celular, y en general en la síntesis de peptidoglicanos bacterianos. Los inhibidores de la síntesis de la pared celular incluyen antibióticos de β-lactama, penicilinas naturales, penicilinas semisintéticas, ampicilina, ácido clavulánico, cefalolsporinas y bacitracina.
Las β-lactamas son antibióticos que contienen un anillo de β-lactama de cuatro miembros que inhibe la última etapa de la síntesis de peptidoglicano. Los antibióticos de β-lactama se pueden sintetizar o pueden ser naturales. Los antibióticos de β-lactama producidos por penicillium son las penicilinas naturales, tales como la penicilina G o penicilina V. Estas se producen por fermentación de Penicillium chrysogenum. Las penicilinas naturales tienen un espectro de actividad estrecho y generalmente son eficaces frente a Estreptococos, Gonococos, y Estafilococos. Otros tipos de penicilinas naturales, que también son eficaces frente a bacterias gram-positivas, incluyen penicilinas F, X, K, y O.
Las penicilinas semisintéticas son generalmente modificaciones de la molécula de ácido 6-aminopenicilánico producida por un moho. El ácido 6-aminopenicilánico se puede modificar mediante la adición de cadenas laterales que producen penicilinas que tienen espectros de actividad más amplios que las penicilinas naturales u otras propiedades ventajosas diversas. Algunos tipos de penicilinas semisintéticas tienen amplios espectros frente a bacterias gram-positivas y gram-negativas, pero son inactivados por la penicilinasa. Estas penicilinas semisintéticas incluyen ampicilina, carbenicilina, oxacilina, azlocilina, mezlocilina y piperacilina. Otros tipos de penicilinas semisintéticas tienen actividades más estrechas frente a bacterias gram-positivas, pero han desarrollado propiedades de modo que no se inactivan con la penicilinasa. Estas incluyen, por ejemplo, meticilina, dicloxacilina y nafcilina. Algunas de las penicilinas semisintéticas de amplio espectro se pueden usar en combinación con inhibidores de β-lactamasa, tales como ácidos clavulánicos y sulbactam. Los inhibidores de la β-lactamasa no tienen acción antimicrobiana pero funcionan para inhibir la penicilinasa, protegiendo de este modo a la penicilina semisintética de la degradación.
Uno de los efectos secundarios graves asociados con las penicilinas, tanto naturales como semisintéticas, es la alergia a la penicilina. Las alergias a la penicilina son muy graves y pueden causar la muerte rápidamente. En un tema que es alérgico a la penicilina, la molécula de β-lactama se unirá a una proteína del suero que inicia una respuesta inflamatoria mediada por IgE. La respuesta inflamatoria conduce a anafilaxis y posiblemente a la muerte
Otro tipo de antibiótico de β-lactama son las cefalolsporinas. Estas son sensibles a la degradación por bacterias βlactamasas, y por lo tanto, no siempre son eficaces en solitario. Sin embargo, las cefalosporinas son resistentes a la penicilinasa. Son eficaces frente a una diversidad de bacterias gram-positivas y gram-negativas. Las cefalosporinas incluyen, pero no se limitan a, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefamandol, cefaclor, cefazolina, cefuroxina, cefoxitina, cefotaxima, cefsulodina, cefetamet, cefixima, ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidina, y moxalactam.
La bacitracina es otra clase de antibióticos que inhiben la síntesis de la pared celular, inhibiendo la liberación de subunidades de muropéptido o peptidoglicano de la molécula que administra la subunidad a la parte exterior de la membrana. Aunque la bacitracina es eficaz frente a bacterias gram-positivas, su uso está limitado en general para administración tópica debido a su alta toxicidad.
Los carbapenems son otro antibiótico de β-lactama de amplio espectro, que son capaces de inhibir la síntesis de la pared celular. Algunos ejemplos de carbapenems incluyen, pero no se limitan a, imipenems. Las monolactamas son también antibióticos de β-lactama de amplio espectro, e incluyen, euztreonam. Un antibiótico producido por Streptomyces, la vancomicina, es también eficaz frente a bacterias gram-positivas mediante la inhibición de la síntesis de la membrana celular.
Otra clase de agentes antibacterianos son los agentes antibacterianos que son inhibidores de la membrana celular. Estos compuestos desorganizan la estructura o inhiben la función de las membranas bacterianas. Uno de los problemas con los agentes antibacterianos que son inhibidores de la membrana celular es que pueden producir efectos en células eucariotas así como en bacterias debido a las similitudes en los fosfolípidos en membranas bacterianas y eucariotas. Por lo tanto, estos compuestos son raramente lo suficientemente específicos como para permitir que estos compuestos se usen por vía sistémica y evitar el uso de dosis elevadas para administración local.
Un inhibidor de la membrana celular clínicamente útil es la Polimixina. Las polimixinas interfieren con la función de la membrana mediante la unión a fosfolípidos de la membrana. La polimixina es eficaz principalmente frente a bacterias gram-negativas y se usa generalmente en infecciones graves por Pseudomonas o infecciones por Pseudomonas que son resistentes a antibióticos menos tóxicos. Los efectos secundarios graves asociados con la administración sistémica de este compuesto incluyen daños en el riñón y otros órganos.
Otros inhibidores de la membrana celular incluyen Anfotericina B y Nistatina que son agentes antifúngicos usados principalmente en el tratamiento de infecciones fúngicas sistémicas e infecciones por levaduras de Candida. Los imidazoles son otra clase de antibiótico que es un inhibidor de la membrana celular. Los imidazoles se usan como agentes antibacterianos, así como agentes anti fúngicos, por ejemplo, se usan para el tratamiento de infecciones por levadura, infecciones dermatofíticas, , e infecciones fúngicas sistémicas. Los imidazoles incluyen, pero no se limitan a clotrimazol, miconazol, ketoconazol, itraconazol, y fluconazol.
Muchos agentes antibacterianos son inhibidores de la síntesis de proteínas. Estos compuestos evitan que las bacterias sinteticen proteínas estructurales y enzimas y por lo tanto causan la inhibición del crecimiento o función o muerte celular de células bacterianas. En general, estos compuestos interfieren con los procesos de transcripción y traducción. Los agentes antibacterianos que bloquean la transcripción incluyen, pero no se limitan a, Rifampinas y Etambutol. Las rifampinas, que inhiben la enzima ARN polimerasa, tienen una actividad de amplio espectro y son eficaces frente a bacterias gram-positivas y gram-negativas, así como Mycobacterium tuberculosis. El etambutol es eficaz frente a Mycobacterium tuberculosis.
Los agentes antibacterianos que bloquean la traducción prefieren con ribosomas bacterianos para evitar que el ARNm se traduzca en las proteínas. En general esta clase de compuestos incluye, pero no se limita a, tetraciclinas, cloranfenicol, los macrólidos (por ejemplo, eritromicina) y los aminoglucósidos (por ejemplo, estreptomicina).
Los aminoglucósidos son una clase de antibióticos que son producidos por la bacteria Streptomyces, tales como, por ejemplo, estreptomicina, kanamicina, tobramicina, amikacina, y gentamicina. Los aminoglucósidos se han usado frente a una amplia diversidad de infecciones bacterianas causadas por bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La estreptomicina se ha usado ampliamente como un fármaco principal en el tratamiento de la tuberculosis. La gentamicina se usa frente a muchas cepas de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, incluyendo infecciones por Pseudomonas, especialmente en combinación con Tobramicina. La kanamicina se usa frente a muchas bacterias Gram-positivas, incluyendo estafilococos resistentes a la penicilina. Un efecto secundario de los aminoglucósidos que ha limitado su uso clínico es que a dosis que son esenciales para la eficacia, se ha demostrado que el uso prolongado deteriora la función renal y causa daño a los nervios auditivos conduciendo a sordera.
Otro tipo de agente antibacteriano inhibidor de la traducción son las tetraciclinas. Las tetraciclinas son una clase de antibióticos que son de amplio espectro y son eficaces frente a una diversidad de bacterias gram-positivas y gramnegativas. Los ejemplos de tetraciclinas incluyen tetraciclina, minociclina, doxiciclina y clortetraciclina. Son importantes para el tratamiento de muchos tipos de bacterias pero son particularmente importantes en el tratamiento de la enfermedad de Lyme. Como resultado de su baja toxicidad y efectos secundarios directos mínimos, las tetraciclinas se han usado en exceso y se han utilizado mal por la comunidad médica, lo que lleva a problemas. Por ejemplo, su uso excesivo ha llevado al desarrollo generalizado de resistencia.
Los agentes anti-bacterianos tales como los macrólidos se unen de forma reversible a la subunidad ribosómica 50 S e inhiben la elongación de la proteína por la peptidil transferasa o evitan la liberación de ARNt no cargado del ribosoma bacteriano o ambos. Estos compuestos incluyen eritromicina, roxitromicina, claritromicina, oleandomicina, y azitromicina. La eritromicina es activa frente a la mayoría de bacterias Gram-positivas, Neisseria, Legionella y Haemophilus, pero no frente a Enterobacteriaceae. La lincomicina y clindamicina, que bloquean la formación de enlace peptídico durante la síntesis de proteínas, se usan frente a bacterias gram-positivas.
Otro tipo de inhibidor de la traducción es el cloranfenicol. El cloranfenicol se une el ribosoma 70 S inhibiendo la enzima peptidil transferasa bacteriana evitando de este modo el crecimiento de la cadena de polipéptido durante la síntesis de proteínas. Un efecto secundario grave asociado con el cloranfenicol es la anemia aplásica. La anemia aplásica se desarrolla a dosis de cloranfenicol que son eficaces para el tratamiento de bacterias en una pequeña proporción (1/50.000) de los pacientes. El cloranfenicol que una vez fue un antibiótico altamente prescrito en la actualidad se usa en raras ocasiones como resultado de las muertes por anemia. Debido a su eficacia todavía se usa en situaciones que amenazan la vida (por ejemplo, fiebre tifoidea).
Algunos agentes antibacterianos interrumpen la síntesis o función de ácidos nucleicos, por ejemplo, se unen a ADN
o ARN de modo que sus mensajes no se pueden leer. Estos incluyen, pero no se limitan a, quinolonas y
cotrimoxazol, ambos agentes químicos sintéticos y rifamicinas, una sustancia química natural o semisintética. Las quinolonas bloquean la replicación del ADN bacteriano mediante la inhibición de la ADN girasa, la enzima necesaria por las bacterias para producir su ADN circular. Son de amplio espectro y algunos ejemplos incluyen norfloxacina, ciprofloxacina, enoxacina, ácido nalidíxico y temafloxacina. El ácido nalidíxico es un agente bactericida que se une a la enzima ADN girasa (topoisomerasa), que es esencial para la replicación del ADN y permite que los superenrollamientos se relajen y se reformen, inhibiendo la actividad de la ADN girasa. El uso principal del ácido nalidíxico es en el tratamiento de infecciones del tracto urinario inferior (UTI), ya que es eficaz frente a varios tipos de bacterias Gram-negativas, tales como E. coli, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae y especies de Proteus que son causas comunes de UTI. El cotrimoxazol es una combinación de sulfametoxazol y trimetoprim, que bloquea la síntesis bacteriana del ácido fólico necesaria para fabricar nucleótidos de ADN. La rifampicina es un derivado de rifamicina que es activo frente a bacterias Gram-positivas (incluyendo Mycobacterium tuberculosis y meningitis causada por Neisseria meningitidis) y algunas bacterias Gram-negativas. La rifampicina se une a la subunidad beta de la polimerasa y bloquea la adición del primer nucleótido que es necesario para activar la polimerasa, bloqueando de este modo la síntesis del ARNm.
Otra clase de agentes antibacterianos son compuestos que funcionan como inhibidores competitivos de enzimas bacterianas. Los inhibidores competitivos son todos en su mayoría estructuralmente similares a un factor de crecimiento bacteriano y compiten por la unión, pero no realizan la función metabólica en la célula. Estos compuestos incluyen sulfonamidas y formas modificadas químicamente de sulfanilamida que tienen una actividad antibacteriana aún mayor y más amplia. Las sulfonamidas (por ejemplo, gantrisina y trimetoprim) son útiles para el tratamiento de Streptococcus pneumoniae, estreptococos beta-hemolíticos y E. coli, y se han usado en el tratamiento de UTI no complicada causada por E. coli, y en el tratamiento de la meningitis meningocócica.
Los agentes antivirales son compuestos que previenen la infección de células por virus o la replicación del virus dentro de la célula. Hay muchos menos fármacos antivirales que fármacos antibacterianos debido a que el proceso de replicación viral está tan estrechamente relacionada con la replicación del ADN dentro de la célula hospedadora, que los agentes antivirales no específicos solían ser tóxicos a menudo para el anfitrión. Hay varias etapas en el proceso de infección viral que se pueden bloquear o inhibir con agentes antivirales. Estas etapas incluyen la unión del virus a la célula hospedador han (inmunoglobulina o péptidos de unión), desrevestimiento del virus (por ejemplo amantadina), síntesis o traducción del ARNm viral (por ejemplo, interferón), replicación del ARN o ADN viral (por ejemplo, análogos de nucleósidos), maduración de nuevas proteínas de virus (por ejemplo, inhibidores de la proteasa), y nacimiento y liberación del virus.
Otra categoría de agentes antivirales son análogos de nucleósidos. Los análogos de nucleósidos son compuestos sintéticos que son similares a los nucleósidos, pero que tienen un grupo desoxirribosa o ribosa incompleto o anómalo. Una vez que los análogos de nucleósido están en la célula, estos se encuentran fosforilados, produciendo la forma trifosfato que compite con los nucleótidos normales para su incorporación en el ADN o ARN viral. Una vez que la forma trifosfato del análogo de nucleósido se incorpora en la cadena de ácido nucleico en crecimiento, causa asociación irreversible con la polimerasa viral y por lo tanto terminación de la cadena. Los análogos de nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, aciclovir (usado para el tratamiento del virus del herpes simple y el virus de la varicela zóster), ganciclovir (útil para el tratamiento de citomegalovirus), idoxuridina, ribavirina (útil para el tratamiento del virus sincitial respiratorio) , didesoxiinosina, didesoxicitidina, y zidovudina (azidotimidina).
Otra clase de agentes antivirales incluye citoquinas tales como interferones. Los interferones son citoquinas que son secretadas por las células infectadas con virus, así como células inmunes. Los interferones funciona mediante la unión a receptores específicos en células adyacentes a las células infectadas, provocando el cambio en la célula que lo protege de la infección por el virus. El α y β-interferón también induce la expresión de moléculas de MHC de Clase I y Clase II en la superficie de las células infectadas, dando como resultado un aumento de la presentación de antígenos para el reconocimiento de la célula inmune anfitriona. Los α y β-interferones están disponibles como formas recombinantes y se han usado para el tratamiento de la infección por hepatitis crónica B y C. En las dosis que son eficaces para terapia antiviral, los interferones tienen efectos secundarios graves, como fiebre, malestar general y pérdida de peso.
La terapia con inmunoglobulina se usa para la prevención de la infección viral. La terapia con inmunoglobulina para infecciones virales es diferente de la de las infecciones bacterianas, porque en lugar de ser específica de antígeno, las terapia con inmunoglobulina funciona mediante la unión a viriones extracelulares y evita que se adhieran y que entren en células que son susceptibles a la infección viral. La terapia es útil para la prevención de la infección viral durante el periodo de tiempo en el que los anticuerpos están presentes en el anfitrión. En general hay dos tipos de terapias con inmunoglobulina, la terapia con inmunoglobulina normal y la terapia con globulina hiperinmune. La terapia con globulina inmune normal usa un producto de anticuerpo que se prepara a partir del suero de donantes de sangre normales y se combina. Este producto combinado contiene bajos títulos de anticuerpos para una amplia gama de virus humanos, tales como hepatitis A, parvovirus, enterovirus (especialmente en neonatos). La terapia con globulina hiperinmune usa anticuerpos que se preparan a partir del suero de individuos que tienen títulos elevados de un anticuerpo para un virus en particular. Esos anticuerpos se usan a continuación frente a un virus específico. Algunos ejemplos de globulinas hiperinmunes incluyen inmunoglobulina zóster (útil para la prevención de la varicela en niños inmunocomprometidos y neonatos), inmunoglobulina antirrábica humana (útil en la profilaxis posterior a la exposición de un sujeto mordido por un animal rabioso), inmunoglobulina de la hepatitis B (útil en la prevención del
virus de la hepatitis B, especialmente en un sujeto expuesto al virus), y inmunoglobulina RSV (útil en el tratamiento de infecciones por el virus sincitial respiratorio).
Los agentes antifúngicos son útiles para el tratamiento y prevención de hongos infecciosos. Los agentes antifúngicos se clasifican en ocasiones por su mecanismo de acción. Algunos agentes antifúngicos funcionan como inhibidores de la pared celular mediante la inhibición de la glucosa sintasa. Estos incluyen, pero no se limitan a, basiungina/ECB. Otros agentes antifúngicos funcionan mediante la desestabilización de la integridad de la membrana. Estos incluyen, pero no se limitan a, imidazoles, tales como clotrimazol, sertaconzol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, y voriconacol, así como FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502, MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina y terbinafina. Otros agentes antifúngicos funcionan descomponiendo la quitina (por ejemplo, quitinasa) o inmunosupresión (crema 501).
Los agentes antiparasitarios son agentes que destruyen parásitos directamente. Tales compuestos se conocen en la técnica y por lo general están disponibles en el mercado. Algunos ejemplos de antiparasitarios útiles para administración humana incluyen, pero no se limitan a, albendazol, anfotericina B, benznidazol, bitionol, HCl de cloroquina, fosfato de cloroquina, clindamicina, deshidroemetina, dietilcarbamazina, furoato de diloxanida, eflomitina, flirazolidaona, glucocorticoides, halofantrina, yodoquinol, ivermectina, mebendazol, mefloquina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato, metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromomicina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel, fosfato de primaquina, proguanil, pirantel, pirimetanamina-sulfonamidas, pirimetanmina-sulfadoxina, HCl de quinacrina, sulfato de quinina, gluconato de quinidina, espiramicina, estibogluconato sódico (gluconato de antimonio y sodio), suramina, tetraciclina, doxiciclina, tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoxazol, y triparsamida.
Las composiciones y procedimientos de la invención también pueden encontrar uso en el tratamiento de alergia y asma.
Una "alergia" se refiere a hipersensibilidad adquirida a una sustancia (alérgeno). Algunas afecciones alérgicas incluyen, pero no se limitan a, eczema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, conjuntivitis alérgica, asma bronquial, urticaria (ronchas) y alergias alimentarias, otras afecciones atópicas que incluyen dermatitis atópica; anafilaxis; alergia a medicamentos; y angioedema. Algunas enfermedades alérgicas incluyen, pero no se limitan a, rinitis (fiebre del heno), asma, urticaria, y dermatitis atópica.
La alergia es una enfermedad asociada con la producción de anticuerpos de una clase de inmunoglobulina en particular, IgE, frente a alérgenos. El desarrollo de una respuesta mediada por IgE a los aeroalérgenos comunes también es un factor que indica predisposición hacia el desarrollo de asma. Si un alérgeno encuentra una IgE específica que se une a un receptor Fc de IgE (FCSR) en la superficie de un basófilo (que circula en la sangre) o mastocito (dispersado a través del tejido sólido), la célula se activa, dando como resultado la producción y liberación de mediadores tales como histamina, serotonina y mediadores lipídicos.
Un sujeto que tiene una alergia es un sujeto que en la actualidad está experimentando o ha experimentado previamente una reacción alérgica como respuesta a un alérgeno.
Un sujeto con riesgo de desarrollar una alergia o asma es un sujeto que se ha identificado como que ha tenido una alergia o asma en el pasado, pero que en la actualidad no está experimentando la enfermedad activa, así como un sujeto que se considera que presenta riesgo de desarrollar asma o alergia debido a factores genéticos o ambientales. Un sujeto con riesgo de desarrollar alergia o asma también puede incluir un sujeto que presenta cualquier riesgo de exposición a un alérgeno o un riesgo de desarrollar asma, es decir, alguien que ha padecido un ataque de asma previamente o tiene una predisposición a los ataques asmáticos. Por ejemplo, un sujeto con riesgo puede ser un sujeto que está planeando viajar a una zona en la que se encuentra un determinado tipo de alérgeno o iniciador asmático o incluso puede ser cualquier sujeto que vive en una zona en la que se ha identificado un alérgeno. Si el sujeto desarrolla respuestas alérgicas a un antígeno en particular y el sujeto puede estar expuesto al antígeno, es decir, durante la temporada de polen, entonces ese sujeto está en riesgo de exposición al antígeno.
El nombre genérico para las moléculas que causan una reacción alérgica es alérgeno. Un "alérgeno" como se usa en el presente documento es una molécula capaz de provocar una respuesta inmunitaria caracterizada por la producción de IgE. Un alérgeno es una sustancia que puede inducir una respuesta alérgica o asmática en un sujeto susceptible. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, el término alérgeno se refiere a un tipo específico de antígeno que puede desencadenar una respuesta alérgica que está mediada por anticuerpos IgE. El procedimiento y las preparaciones de la presente invención se extienden a una amplia clase de tales alérgenos y fragmentos de alérgenos o haptenos que actúan como alérgenos. El listado de alérgenos es enorme y puede incluir pólenes, venenos de insectos, caspa de animales, polvo, esporas de hongos, y fármacos (por ejemplo, penicilina).
Existen numerosas especies de alérgenos. La reacción alérgica se produce cuando la inmunoglobulina del tipo IgE sensibilizante de tejido reacciona con alérgenos extraños. El anticuerpo IgE se une a mastocitos y/o basófilos y estas células especializadas liberan mediadores químicos (aminas vasoactivas) de la reacción alérgica cuando se estimulan para que lo hagan mediante alérgenos que se unen por puente a los extremos de la molécula de anticuerpo. Entre los mediadores mejor conocidos de reacciones alérgicas en el hombre se encuentran histamina,
factor de activación de plaquetas, metabolitos del ácido araquidónico, y serotonina. La histamina y las otras aminas vasoactivas normalmente se almacenan en mastocitos y leucocitos basófilos. Los mastocitos se dispersan a lo largo de los tejidos animales y los basófilos circulan dentro del sistema vascular. Estas células fabrican y almacenan histamina dentro de la célula a menos que se produzca la secuencia especializada de sucesos que implican la unión de IgE para desencadenar su liberación.
Los síntomas de la reacción alérgica varían, dependiendo de la ubicación dentro del organismo en el que la IgE reacciona con el antígeno. Si la reacción se produce a lo largo del epitelio respiratorio, los síntomas son estornudos, tos y reacciones asmáticas. Si la interacción se produce en el tracto digestivo, como en el caso de alergias alimentarias, son comunes dolor abdominal y diarrea. Las reacciones sistémicas, por ejemplo después de una picadura de abeja, pueden ser graves y a menudo mortales.
La hipersensibilidad de tipo retardado, también conocida como reacción alérgica de tipo IV, es una reacción alérgica caracterizada por un periodo de retraso de al menos 12 horas desde la invasión del antígeno en el sujeto alérgico hasta la aparición de la reacción inflamatoria o inmune. Los linfocitos T (linfocitos T sensibilizados) de individuos en una condición alérgica reaccionan con el antígeno, estimulando la los linfocitos T para que liberen linfoquinas (factor inhibidor de migración de macrófagos (MIF), factor activador de macrófagos (MAF), factor mitogénico (MF), factor de reactivo de la piel (SRF), factor quimiotáctico, factor de aceleración de la neovascularización, etc.), que funcionan como mediadores de la inflamación, y la actividad biológica de estas linfoquinas, junto con los efectos directos e indirectos de los linfocitos que aparecen localmente y otras células inmunes inflamatorias, dan lugar a la reacción alérgica de tipo IV. Las reacciones de alergia retardadas incluyen reacción de tipo tuberculina, reacción de rechazo a homoinjerto, reacción de protección del tipo dependiente de células, reacción de hipersensibilidad por dermatitis de contacto, y similares, que se sabe que son las que se suprimen más fuertemente con agentes esteroideos. En consecuencia, los agentes esteroideos son eficaces frente a enfermedades que son causadas por reacciones alérgicas retardadas. El uso a largo plazo de agentes esteroideos en concentraciones que se usan en la actualidad puede, sin embargo, conducir al grave efecto secundario conocido como dependencia de esteroides. Los procedimientos de la invención resuelven algunos de estos problemas, al proporcionar dosis más bajas y menores a administrar.
La hipersensibilidad inmediata (o respuesta anafiláctica) es una forma de reacción alérgica que se desarrolla muy rápidamente, es decir, en cuestión de segundos o minutos desde la exposición del paciente al alérgeno causal, y está mediada por anticuerpos IgE preparados por los linfocitos B. En los pacientes no alérgicos, no hay anticuerpo IgE de relevancia clínica; pero, en una persona que padece enfermedades alérgicas, el anticuerpo IgE media la hipersensibilidad inmediata mediante la sensibilización de los mastocitos que son abundantes en la piel, órganos linfoides, en las membranas de los ojos, nariz y boca, y en el tracto respiratorio e intestinos.
Los mastocitos tienen receptores de superficie para IgE y los anticuerpos IgE en pacientes que padecen alergia pasan a ser vinculantes para ellos. Como se ha analizado anteriormente de forma breve, cuando la IgE unida se pone en contacto posteriormente con el alérgeno apropiado, se hace que el mastocito se desgranule y que libere diversas sustancias denominadas mediadores bioactivos, tales como histamina, en el tejido circundante. Es la actividad biológica de estas sustancias la que es responsable de los síntomas clínicos habituales de la hipersensibilidad inmediata; es decir, la contracción del músculo liso en las vías respiratorias o el intestino, la dilatación de los vasos sanguíneos pequeños y el aumento de su permeabilidad a proteínas plasmáticas y agua, la secreción de moco pegajoso y espeso, y en la piel, enrojecimiento, hinchazón y la estimulación de terminaciones nerviosas que se traduce en picor o dolor.
"Asma" tal como se usan el presente documento se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias, y aumento de la reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. Con frecuencia, aunque no de forma exclusiva, el asma se asocia con una afección atópica o alérgica. Los síntomas del asma incluyen episodios recurrentes de sibilancias, dificultad para respirar y opresión en el pecho y tos, como resultado de la obstrucción del flujo de aire. La inflamación de las vías respiratorias asociada con asma se puede detectar a través de observación de una serie de cambios fisiológicos, tales como, la denudación del epitelio de las vías respiratorias, deposición de colágeno por debajo de la membrana basal, edema, activación de mastocitos, infiltración de células inflamatorias, incluyendo neutrófilos, eosinófilos, y linfocitos. Como resultado de la inflamación de las vías respiratorias, los pacientes con asma a menudo experimentan hiperreactividad de las vías respiratorias, limitación del flujo de aire, síntomas respiratorios, y cronicidad de la enfermedad. Algunas limitaciones del flujo de aire incluyen broncoconstricción aguda, edema de las vías respiratorias, formación de tapón mucoso, y remodelación de las vías respiratorias, características que a menudo conducen a obstrucción bronquial. En algunos casos de asma, se puede producir fibrosis de la membrana sub-basal, que conduce a anomalías persistentes en la función pulmonar.
Las investigaciones realizadas durante los últimos años han puesto de manifiesto que el asma es probablemente el resultado de interacciones complejas entre células inflamatorias, mediadores, y otras células y tejidos que residen en las vías respiratorias. Mastocitos, eosinófilos, células epiteliales, macrófagos y linfocitos T activados desempeñan un papel importante en el proceso inflamatorio asociado con el asma. Djukanovic R y col. (1990) Am Rev Respir Dis
142: 434-457. Se cree que estas células pueden influir en la función de las vías respiratorias a través de secreción de mediadores preformados y recién sintetizados que pueden actuar directa o indirectamente sobre el tejido local.
También se ha reconocido que las subpoblaciones de linfocitos T (Th2) desempeñan un papel importante en la regulación de la inflamación alérgica en las vías respiratorias mediante la liberación de citoquinas selectivas y mediante el establecimiento de cronicidad de la enfermedad. Robinson DS y col. (1992) N Engl J Med 326: 298-304.
El asma es un trastorno complejo que surge en diferentes etapas en el desarrollo y se puede clasificar en función del grado de los síntomas como aguda, subaguda o crónica. Una respuesta inflamatoria aguda se asocia con un reclutamiento temprano de las células en las vías respiratorias. La respuesta inflamatoria subaguda implica el reclutamiento de células, así como la activación de células residentes que causan un patrón de inflamación más persistente. La respuesta inflamatoria crónica se caracteriza por un nivel persistente de daño celular y un proceso de reparación en curso, que puede dar como resultado anomalías permanentes en las vías respiratorias.
Un "sujeto que tiene asma" es un sujeto que tiene un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y aumento de la reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma se asocia con frecuencia, aunque no de forma exclusiva, con síntomas atópicos o alérgicos. Un "iniciador" como se usa en el presente documento se refiere a una composición o condición ambiental que desencadena el asma. Los iniciadores incluyen, pero no se limitan a, alérgenos, temperaturas frías, ejercicio, infecciones virales, SO2.
Las composiciones y procedimientos de la Invención se pueden usar solos o en conjunto con otros agentes y procedimientos útiles en el tratamiento del asma. Un "medicamento para asma/alergia" como se usa en el presente documento es una composición de material que reduce los síntomas de, previene el desarrollo de, o inhibe una reacción asmática o alérgica. diversos tipos de medicamentos para el tratamiento de asma y alergia se describen en las Directrices para el Diagnóstico y Gestión del Asma, Informe 2 del Panel Experto, Publicación del NIH Nº 97/4051, 19 de julio de 1997. El resumen de los medicamentos como se describe en la publicación del NIH se presenta a continuación. En la mayoría de las realizaciones, el medicamento para asma/alergia en algún grado para el tratamiento de asma y alergia.
Los medicamentos para el tratamiento del asma generalmente se separan en dos categorías, medicamentos de alivio rápido y medicamentos de control a largo plazo. Los pacientes con asma toman los medicamentos de control a largo plazo en una base diaria para conseguir y mantener el control del asma persistente. Los medicamentos de control a largo plazo incluyen agentes antiinflamatorios como corticosteroides, cromolina sódica y nedocromil; broncodilatadores de acción prolongada, tales como agonistas β2 de acción prolongada y metilxantinas; y modificadores de leucotrienos. Los medicamentos de alivio rápido incluyen agonistas β2 de acción corta, anticolinérgicos y corticosteroides sistémicos. Hay muchos efectos secundarios asociados con cada uno de estos fármacos y ninguno de los fármacos solos o en combinación es capaz de prevenir o tratar el asma completamente.
Algunos medicamentos para el asma incluyen, pero no se limitan, inhibidores de PDE-4, agonistas broncodilatadores/beta-2, agentes de apertura del canal de K+, antagonistas de VLA-4, antagonistas de neuroquinas, inhibidores de la síntesis del tromboxano A2 (TXA2), xantinas, antagonistas del ácido araquidónico, inhibidores de la 5 lipoxigenasa , antagonistas del receptor de TXA2, antagonistas de TXA2, inhibidor de proteínas de activación 5lipox, e inhibidores de proteasas.
Los broncodilatadores/agonistas β2 son una clase de compuestos que causan broncodilatación o relajación del músculo liso. Algunos broncodilatadores/agonistas β2 incluyen, pero no se limitan a, salmeterol, salbutamol, albuterol, terbutalina, D2522/formoterol, fenoterol, bitolterol, pirbuerol metilxantinas y orciprenalina. Los agonistas β2 de acción prolongada y broncodilatadores son compuestos que se usan para prevención a largo plazo de síntomas, además de las terapias antiinflamatorias. Algunos agonistas β2 de acción prolongada incluyen, pero no se limitan a, salmeterol y albuterol. Estos compuestos se usan generalmente en combinación con corticosteroides y generalmente no se usan sin ninguna terapia inflamatoria. Se han asociado con efectos secundarios tales como taquicardia, temblor del músculo esquelético, hipopotasemia, y prolongación del intervalo QTc en sobredosis.
Las metilxantinas, incluyendo, por ejemplo, teofilina, se han usado para el control a largo plazo y prevención de los síntomas. Estos compuestos causan broncodilatación que resulta de la inhibición de la fosfodiesterasa y probablemente del antagonismo de la adenosina. Las toxicidades agudas relacionadas con la dosis son un problema particular con estos tipos de compuestos. Como resultado, la concentración en suero de rutina se debe controlar para tener en cuenta la toxicidad y el estrecho rango terapéutico que surge de las diferencias individuales en la eliminación metabólica. Los efectos secundarios incluyen taquicardia, taquiarritmias, náuseas y vómitos, estimulación del sistema nervioso central, dolor de cabeza, convulsiones, hematemesis, hiperglucemia e hipopotasemia. Algunos agonistas β2 de acción corta incluyen, pero no se limitan a, albuterol, bitolterol, pirbuterol, y terbutalina. Algunos de los efectos adversos asociados con la administración de agonistas β2 de acción corta incluyen taquicardia, temblor del músculo esquelético, hipopotasemia, aumento de ácido láctico, dolor de cabeza, e hiperglucemia.
Algunos procedimientos convencionales para el tratamiento o prevención de la alergia han implicado el uso de antihistamínicos o terapias de desensibilización. Los antihistamínicos y otros fármacos que bloquean los efectos de mediadores químicos de la reacción alérgica ayudan a regular la intensidad de los síntomas alérgicos pero no impiden la reacción alérgica y no tienen efecto sobre las respuestas alérgicas posteriores. Las terapias de
desensibilización se realizan suministrando pequeñas dosis de un alérgeno, normalmente por inyección bajo la piel, con el fin de inducir una respuesta de tipo IgG frente al alérgeno. Se cree que la presencia de anticuerpo IgG ayuda a neutralizar la producción de mediadores resultantes de la inducción de anticuerpos IgE. Inicialmente, el sujeto se trata con una dosis muy baja del alérgeno para evitar la inducción de una reacción grave y la dosis se aumenta lentamente. Este tipo de terapia es peligroso porque el sujeto en realidad se está administrando con los compuestos que provocan la respuesta alérgica y pueden surgir reacciones alérgicas graves.
Algunos medicamentos para la alergia incluyen, pero no se limitan a, antihistamínicos, esteroides, e inductores de prostaglandinas. Los antihistamínicos son compuestos que contrarrestan la histamina liberada por mastocitos o basófilos. Estos son compuestos se conocen bien en la técnica y se usan normalmente para el tratamiento de la alergia. Los antihistamínicos incluyen, pero no se limitan a, astemizol, azelastina, betatastina, buclizina, ceterizina, análogos de cetirizina, CS 560, desloratadina, ebastina, epinastina, fexofenadina, HSR 609, levocabastina, loratadina, mizolastina, norastemizol, terfenadina, y tranilast.
Los inductores de prostaglandina son compuestos que inducen la actividad de la prostaglandina. Las prostaglandinas funcionan regulando la relajación del músculo liso. Algunos inductores de prostaglandina incluyen, pero no se limitan a, S-5751.
Los medicamentos para el asma/alergia también incluyen esteroides e inmunomoduladores. Los esteroides incluyen, pero no se limitan a, beclometasona, fluticasona, triamcinolona, budesonida, corticosteroides y budesonida.
Algunos corticosteroides incluyen, pero no se limitan a, dipropionato de beclometasona, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona, y acetónido de triamcinolona. Aunque la dexametasona es un corticosteroide que tiene acción antiinflamatoria, no se usa regularmente para el tratamiento del asma/alergia en una forma inhalada porque se absorbe altamente y tiene efectos secundarios supresores a largo plazo en una dosis eficaz. La dexametasona, sin embargo, se puede usar de acuerdo con la invención para el tratamiento del asma/alergia, ya que cuando se administra en combinación con los ácidos nucleicos de la invención se puede administrar a una dosis baja para reducir los efectos secundarios. Algunos de los efectos secundarios asociados con corticosteroides incluyen tos, disfonía, muguet oral (candidiasis), y en dosis más elevadas, efectos sistémicos, tales como supresión adrenal, osteoporosis, supresión del crecimiento, adelgazamiento de la piel y formación de hematomas con facilidad. Barnes y Peterson (1993) Am Rev Respir Dis 148: S1-S26; y Kamada AK y col. (1996) Am J Respir Crit Care Med 153: 1739-48.
Los corticosteroides sistémicos incluyen, pero no se limitan a, metilprednisolona, prednisolona y prednisona. Los corticosteroides están asociados con anomalías reversibles en el metabolismo de la glucosa, aumento del apetito, retención de líquidos, aumento de peso, alteración del humor, hipertensión, úlcera péptica y necrosis aséptica de los huesos. Estos compuestos son útiles para prevención a corto plazo (3-10 días) de la reacción inflamatoria en el asma persistente controlada de forma inadecuada. También funcionan en una prevención a largo plazo de los síntomas en el asma persistente grave para suprimir y controlar y en realidad revertir la inflamación. Algunos de los efectos secundarios asociados con el uso a largo plazo incluyen supresión del eje suprarrenal, supresión del crecimiento, adelgazamiento dérmico, hipertensión, diabetes, síndrome de Cushing, cataratas, debilidad muscular y, en casos raros, función inmunológica alterada. Se recomienda que estos tipos de compuestos se usen en su dosis eficaz más baja (directrices para el diagnóstico y tratamiento del asma; informe al panel de expertos; Publicación del NIH Nº 97-4051; julio de 1997).
Los inmunomoduladores incluyen, pero no se limitan a, el grupo que consiste en agentes antiinflamatorios, antagonistas de leucotrienos, muteínas de IL-4, receptores solubles de IL-4, inmunosupresores (tales como vacuna de péptido de tolerancia), anticuerpos anti-IL-4, antagonistas de IL-4, anticuerpos anti-IL-5, proteínas de fusión Fc del receptor IL-13 solubles, anticuerpos anti-IL-9, antagonistas de CCR3, antagonistas de CCR5, inhibidores de VLA4, y reguladores negativos de IgE.
Los modificadores de leucotrienos son de uso frecuente para el control a largo plazo y la prevención de síntomas en el asma leve persistente. Los modificadores de leucotrienos funcionan como antagonistas de los receptores de leucotrienos compitiendo de forma selectiva para receptores LTD-4 y LTE-4. Estos compuestos incluyen, pero no se limitan a, comprimidos de zafirlukast y comprimidos de zileutón. Los comprimidos de zileutón funcionan como inhibidores de la 5-lipoxigenasa. Estos fármacos se han asociado con la elevación de las enzimas hepáticas y algunos casos de hepatitis reversible e hiperbilirrubinemia. Los leucotrienos son mediadores bioquímicos que se liberan de los mastocitos, eosinófilos, y basófilos, que provocan la contracción del músculo liso de las vías respiratorias y aumentan la permeabilidad vascular, secreciones mucosas y activan las células inflamatorias en las vías respiratorias de pacientes con asma.
Otros inmunomoduladores incluyen neuropéptidos que se ha demostrado que tienen propiedades inmunomoduladoras. Los estudios funcionales han mostrado que la sustancia P, por ejemplo, puede influir en la función de los linfocitos por mecanismos mediados por receptores específicos. También se ha mostrado que la sustancia P modula las respuestas de hipersensibilidad inmediata distintas mediante la estimulación de la generación de mediadores derivados del ácido araquidónico a partir de mastocitos de la mucosa. McGillies J y col. (1987) Fed Proc 46: 196-9 (1987). La sustancia P es un neuropéptido que se identificó primero en 1931. Von Euler y
Gaddum J Physiol (London) 72: 74-87 (1931). Su secuencia de aminoácidos fue informada por Chang y col. en 1971. Chang MM y col. (1971) Nature New Biol 232: 86-87. La actividad inmunorreguladora de fragmentos de la sustancia P ha sido estudiada por Siemion IZ y col. (1990) Molec Immunol 27: 887-890 (1990).
Otra clase de compuestos son los reguladores negativos de IgE. Estos compuestos incluyen péptidos u otras moléculas con la capacidad de unirse al receptor de IgE y de ese modo evitar la unión de IgE específica de antígeno. Otro tipo de regulador negativo de IgE es un anticuerpo monoclonal dirigido frente a la región de unión al receptor de IgE de la molécula de IgE humana. Por lo tanto, un tipo de regulador negativo de IgE es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo anti-IgE. El anti-IgE se está desarrollando en Genentech. Un experto en la materia podría preparar fragmentos de anticuerpos funcionalmente activos de péptidos que tienen la misma función de unión. Otros tipos de reguladores negativos de IgE son polipéptidos capaces de bloquear la unión del anticuerpo IgE a los receptores Fc en las superficies celulares y desplazar a IgE de los sitios de unión a IgE a los que ya está unido.
Un problema asociado con los reguladores negativos de IgE es que muchas moléculas no tienen una fuerza de unión al receptor correspondiente con respecto a la interacción muy fuerte entre la molécula de IgE nativa y su receptor. Las moléculas que tienen esta fuerza tienden a unirse de forma irreversible al receptor. Sin embargo, tales sustancias son relativamente tóxicas ya que se pueden unir covalentemente y bloquear otras moléculas estructuralmente similares en el organismo. En este contexto es de interés que la cadena del receptor de IgE pertenece a una familia de genes más grandes en la que, por ejemplo, están contenidos varios de los diferentes receptores Fc de IgG. Estos receptores son absolutamente fundamentales para la defensa del organismo, por ejemplo, frente a infecciones bacterianas. Además, las moléculas activadas para unión covalente son a menudo relativamente inestables y por lo tanto es probable que tengan que administrarse varias veces al día y después en concentraciones relativamente elevadas con el fin de hacer posible bloquear completamente el grupo en renovación de forma continua de receptores de IgE en mastocitos y leucocitos basófilos.
Como medicamentos de control a largo plazo se usan cromolina sódica y nedocromil para la prevención principalmente de los síntomas del asma que proceden del ejercicio o síntomas alérgicos que surgen por alérgenos. Se cree que estos compuestos bloquean reacciones tempranas y tardías a alérgenos al interferir con la función del canal de cloruro. También estabilizan las membranas de los mastocitos e inhiben la activación y liberación de mediadores de eosinófilos y células epiteliales. Por lo general se requiere un periodo de cuatro a seis semanas de administración para conseguir un beneficio máximo
Los anticolinérgicos se usan generalmente para el alivio del broncoespasmo agudo. Se cree que estos compuestos funcionan por inhibición competitiva de los receptores colinérgicos muscarínicos. Los anticolinérgicos incluyen, pero no se limitan a, bromuro de ipratropio. Estos compuestos invierten solamente el broncoespasmo mediado de forma colinérgica y no modifican ninguna reacción con el antígeno. Algunos efectos secundarios incluyen sequedad de la boca y secreciones respiratorias, aumento de sibilancias en algunos individuos, y visión borrosa si se pulveriza en los ojos.
Además de medicamentos para el asma/alergia convencionales, se han usado otros procedimientos para el tratamiento del asma/alergia solos o en combinación con medicamentos establecidos. Un procedimiento preferente para aliviar alergias, pero con frecuencia imposible, es la evitación de alérgenos o iniciadores. Otro procedimiento usado en la actualidad para el tratamiento de enfermedades alérgicas implica la inyección de dosis crecientes de alérgeno para inducir tolerancia al alérgeno y para evitar reacciones alérgicas adicionales.
Se sabe que la terapia de inyección de alérgenos (inmunoterapia con alérgeno) reduce la gravedad de la rinitis alérgica. Se teorizado que este tratamiento implica la producción de una forma diferente de anticuerpo, un anticuerpo protector que se denomina "anticuerpo de bloqueo". Cooke RA y col. (1935) Serologic Evidence of Immunity with Coexisting Sensitization in a Type of Human Allergy, Exp Med 62: 733. Otros intentos de tratar la alergia implican la modificación del alérgeno químicamente de modo que su capacidad para causar una respuesta inmune en el paciente permanece sin cambios, mientras que su capacidad para causar una reacción alérgica se altera sustancialmente. Sin embargo, estos procedimientos pueden necesitar varios años para ser eficaces y están asociados con el riesgo de efectos secundarios tales como shock anafiláctico.
Las composiciones y procedimientos de la invención se pueden usar para modular una respuesta inmune. La capacidad para modular una respuesta inmune permite la prevención y/o tratamiento de trastornos en particular que se pueden ver afectados a través de la modulación del sistema inmune.
El tratamiento después de un trastorno ha comenzado con objetivos para reducir, mejorar o eliminar por completo el trastorno, y/o sus síntomas asociados, o para evitar que empeore. El tratamiento de los sujetos antes de que haya comenzado un trastorno (es decir, tratamiento profiláctico) tiene como objetivo reducir el riesgo de desarrollar el trastorno. Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" se refiere al tratamiento profiláctico de pacientes que están en riesgo de desarrollar un trastorno (dando como resultado una disminución de la probabilidad de que el sujeto desarrolle el trastorno), y para la inhibición de un desarrollo adicional de un trastorno ya establecido.
Para el tratamiento de un sujeto pueden ser necesarias dosis diferentes, dependiendo de la actividad del compuesto, modo de administración, finalidad de la inmunización (es decir, profiláctica o terapéutica), naturaleza y gravedad del
trastorno, edad y el peso corporal del sujeto. La administración de una dosis dada se puede realizar tanto mediante administración individual en forma de una unidad de dosis individual o bien varias unidades de dosis más pequeñas. La administración de dosis múltiples a intervalos específicos de semanas o meses de diferencia es habitual para estimular las respuestas inmunes específicas del antígeno.
Combinado con las enseñanzas que se proporcionan en el presente documento, mediante la elección entre los diversos compuestos activos y factores importantes como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal del paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo de administración preferente, se puede planificar un régimen de tratamiento profiláctico o terapéutico eficaz que no cause toxicidad sustancial y sin embargo sea totalmente eficaz para tratar al sujeto en particular. La cantidad eficaz para cualquier aplicación particular puede variar dependiendo de factores tales como la enfermedad o afección que se está tratando, el agente terapéutico en particular que se está administrando (por ejemplo, en el caso de un ácido nucleico inmunoestimulante, el tipo de ácido nucleico, es decir, un ácido nucleico CpG, el número de motivos de CpG sin metilar o su posición en el ácido nucleico, el grado de modificación de la estructura principal para el oligonucleótido, etc.), la talla del sujeto, o la gravedad de la enfermedad o afección. Un experto en la materia puede determinar de forma empírica la cantidad eficaz de un ácido nucleico en particular y/u otro agente terapéutico sin necesidad de experimentación indebida.
Las dosis objeto de los compuestos que se describen en el presente documento por lo general varían de aproximadamente 0,1 µg a 10.000 mg, de forma más habitual de aproximadamente 1 µg/día a 8000 mg, y lo más habitualmente de aproximadamente 10 µg a 100 µg. Expresado en términos de peso corporal del sujeto, las dosis habituales varían de aproximadamente 0,1 µg a 20 mg/kg/día, más habitualmente de aproximadamente 1 a 10 mg/kg/día, y lo más habitualmente de aproximadamente 1 a 5 mg/kg/ día.
Las composiciones farmacéuticas que contienen ácidos nucleicos y/u otros compuestos se pueden administrar mediante cualquier vía adecuada para la administración de medicamentos. Una diversidad de vías de administración están disponibles. El modo en particular seleccionado dependerá, por supuesto, del agente o agentes seleccionados en particular, la afección en particular que se está tratando, y la dosificación necesaria para eficacia terapéutica. Los procedimientos de tratamiento de la presente invención, hablando en general, se pueden poner en práctica usando cualquier día de administración que sea médicamente aceptable, lo que significa cualquier modo que produzca niveles eficaces de una respuesta inmune sin causar efectos adversos clínicamente inaceptables. Las vías de administración preferentes se analizan en el presente documento. Para uso en terapia, una cantidad eficaz del ácido nucleico y/u otro agente terapéutico se puede administrar a un sujeto de cualquier modo que administre el agente a la superficie deseada, por ejemplo, mucosal, sistémica.
La administración de la composición farmacéutica de la presente invención se puede conseguir con cualquier medio conocido por el experto en la materia. Las vías de administración incluyen, pero no se limitan a, oral, parenteral, intravenosa, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, inhalación, subcutánea, ocular, vaginal, y rectal. Para el tratamiento o prevención de asma o alergia, tales compuestos preferentemente se inhalan, ingieren o administran por vías sistémicas. Las vías sistémicas incluyen oral y parenteral. Los medicamentos inhalados son preferentes en algunas realizaciones debido a la administración directa al pulmón, el sitio de inflamación, principalmente en pacientes asmáticos. Varios tipos de dispositivos se usan regularmente para la administración por inhalación. Estos tipos de dispositivos incluyen inhaladores de dosis medida (MDI), MDI accionado por la respiración, inhalador de polvo seco (DPI), cámaras espaciadoras/de mantenimiento en combinación con MDI, y nebulizadores.
Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar a un tejido en particular, tipo de célula, o al sistema inmune, o ambos, con la ayuda de un vector. En su sentido más amplio, un "vector" es cualquier vehículo capaz de facilitar la transferencia de las composiciones a las células diana. El vector generalmente transporta el ácido nucleico inmunoestimulante, anticuerpo, antígeno, y/o medicamento específico para el trastorno a las células diana con una degradación reducida con respecto al grado de degradación que resultaría en ausencia del vector.
En general, los vectores se dividen en dos clases: vectores biológicos y vectores químicos/físicos. Los vectores biológicos y los vectores químicos/físicos son útiles en la administración y/o absorción de agentes terapéuticos.
La mayoría de los vectores biológicos se usan para la administración de ácidos nucleicos y esto sería lo más adecuado en la administración de agentes terapéuticos que son o que incluyen ácidos nucleicos inmunoestimulantes.
Además de los vectores biológicos que se analizan en el presente documento, se pueden usar vectores químicos/físicos para administrar agentes terapéuticos que incluyen ácidos nucleicos inmunoestimulantes, anticuerpos, antígenos, y medicamentos específicos para el trastorno. Como se usa en el presente documento, un "vector químico/físico" se refiere a una molécula natural o sintética, distinta de las que se derivan de fuentes bacteriológicas o virales, capaces de administrar el ácido nucleico y/u otro medicamento.
Un vector químico/físico de la invención preferente es un sistema de dispersión coloidal. Los sistemas de dispersión coloidal incluyen sistemas basados en lípidos que incluyen emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas mixtas y liposomas. Un sistema coloidal de la invención preferente es un liposoma. Los liposomas son vesículas de membrana artificial que son útiles como un vector de administración in vivo o in vitro. Se ha mostrado que las
vesículas unilamelares grandes (LUV), que varían en tamaño de 0,2 a 4,0 µm pueden encapsular macromoléculas grandes. ARN, ADN y viriones intactos se pueden encapsular dentro del interior acuoso y se pueden administrar a células de una forma biológicamente activa. Fraley y col. (1981) Trends Biochem Sci 6: 11.
Los liposomas se pueden dirigir a un tejido en particular mediante el acoplamiento del liposoma a un ligando específico tal como un anticuerpo monoclonal, azúcar, glicolípido, o proteína. Los ligandos que pueden ser útiles para dirigir un liposoma a una célula inmune incluyen, pero no se limitan a: intactos o fragmentos de moléculas que interactúan con receptores y moléculas específicos de células inmunes, tales como anticuerpos, que interactúan con los marcadores de superficie celular de las células inmunes. Tales ligandos se pueden identificar fácilmente mediante ensayos de unión bien conocidos por los expertos en la materia. además, en otras realizaciones, el liposoma se puede dirigir alcance acoplándolo a uno de los anticuerpos inmunoterapéuticos que se han analizado anteriormente. Además, el vector se puede acoplar con un péptido de direccionamiento nuclear, que dirigirá el vector al núcleo de la célula anfitriona.
Las formulaciones de lípidos para transfección están disponibles en el mercado en QIAGEN, por ejemplo, como EFFECTENE™ (un lípido no liposómico con un potenciador de condensación de ADN especial) y SUPERFECT™ (una nueva tecnología dendrimérica de actuación).
Los liposomas están disponibles en el mercado en Gibco BRL, por ejemplo, como LIPOFECTIN™ y LIPOFECTACE™, que están formados por lípidos catiónicos tales como cloruro de N-[1-(2,3 dioleiloxi)propil]-N,N,Ntrimetilamonio (DOTMA) y bromuro de dimetil dioctadecilamonio (DDAB). Los procedimientos para fabricar liposomas se conocen bien en la técnica y se han descrito en muchas publicaciones. También se han revisado liposomas en Gregoriadis G (1985) Trends Biotechnol 3: 235-241.
En una realización, el vehículo es una micropartícula o implante biocompatible que es adecuado para la implantación
o la administración al receptor mamífero. Los implantes bioerosionables a modo de ejemplo que son útiles de acuerdo con este procedimiento se describen en la solicitud Internacional de PCT Nº PCT/US/03307 (Publicación Nº W095/24929, titulada "Sistema Polimérico de Administración de Genes". El documento PCT/US/0307 describe una matriz polimérica preferentemente biodegradable, biocompatible para el revestimiento de un gen exógeno bajo el control de un promotor apropiado. La matriz polimérica se puede usar para conseguir una liberación sostenida del agente terapéutico en el sujeto.
La matriz polimérica se presenta preferentemente en forma de una micropartícula tal como una microesfera (en la que el ácido nucleico y/o el otro agente terapéutico se dispersa por toda una matriz polimérica sólida) o una microcápsula (en la que el ácido nucleico y/o el otro agente terapéutico se almacena en el núcleo de una cubierta polimérica). Otras formas de la matriz polimérica para contener el agente terapéutico incluyen películas, revestimientos, geles, implantes, y endoprótesis vasculares. El tamaño y la composición del dispositivo de matriz polimérica se selecciona para dar como resultado una cinética de liberación favorable en el tejido en el que se introduce la matriz. El tamaño de la matriz polimérica adicional se selecciona de acuerdo con el procedimiento de administración que se va a usar, por lo general inyección en un tejido o administración de una suspensión mediante aerosol en las zonas nasal y/o pulmonar. Preferentemente, cuando se usa una ruta de aerosol, la matriz polimérica y el ácido nucleico y/o el otro agente terapéutico están incluidos en un vehículo tensioactivo. La composición de la matriz polimérica se puede seleccionar para que tenga tanto tasas de degradación favorables como para que también se forme de un material que es bioadhesivo, para aumentar aún más la eficacia de la transferencia cuando la matriz se administra a una superficie nasal y/o pulmonar que ha sufrido una lesión. La composición de la matriz también se puede seleccionar para que no se degrade, sino más bien, para que se libere por difusión durante un periodo de tiempo prolongado. En algunas realizaciones preferentes, el ácido nucleico se administra al sujeto a través de un implante mientras que el otro agente terapéutico se administra de forma aguda. Algunas microesferas biocompatibles que son adecuadas para administración, tales como administración oral o mucosal, se desvelan en Chickering y col. (1996) Biotec Bioeng 52: 96-101 y Mathiowitz E y col. (1997) Nature 386: 410-414 y Solicitud de Pat. de PCT WO97/03702.
Las matrices poliméricas tanto no biodegradables como biodegradables se pueden usar para administrar el ácido nucleico y/o el otro agente terapéutico al sujeto. Las matrices biodegradables son preferentes. Tales polímeros pueden ser polímeros naturales o sintéticos. El polímero se selecciona basándose en el periodo de tiempo durante el cual se desea la liberación, generalmente en el orden de unos pocos horas a un año o más. Por lo general, la liberación durante un periodo que varía entre unas pocas horas y de tres a doce meses es más deseable, en particular para los agentes de ácidos nucleicos. El polímero opcionalmente se presenta en forma de un hidrogel que puede absorber hasta aproximadamente un 90 % de su peso en agua y, además, está opcionalmente reticulado con iones polivalentes u otros polímeros.
Los polímeros bioadhesivos de interés en particular incluyen hidrogeles bioerosionables descritos por H.S. Sawhney,
C.P. Pathak y J.A. Hubell en Macromolecules, (1993) 26: 581-587, cuyas enseñanzas se incorporan en el presente documento. Estos incluyen ácidos polihialurónico, caseína, gelatina, glutina, polianhídridos, ácido poliacrílico, alginato, quitosano, poli(metacrilatos de metilo), poli(metacrilatos de etilo), poli(metacrilato de butilo), poli(metacrilato de isobutilo), poli(metacrilato de hexilo), poli(metacrilato de isodecilo), poli(metacrilato de laurilo), poli(metacrilato de fenilo), poli(acrilato de metilo), poli(acrilato de isopropilo), poli(acrilato de isobutilo), y poli(acrilato de octadecilo).
Si el agente terapéutico es un ácido nucleico, el uso de agentes de compactación también puede ser deseable. Los agentes de compactación también se pueden usar solos, o en combinación con, un vector biológico o químico/físico. Un "agente de compactación", como se usa en el presente documento, se refiere a un agente, tal como una histona, que neutraliza las cargas negativas en el ácido nucleico y por lo tanto permite la compactación del ácido nucleico en un gránulo fino. La compactación del ácido nucleico facilita la absorción del ácido nucleico por la célula diana. Los agentes de compactación se pueden usar solos, es decir, para administrar un ácido nucleico en una forma que se absorbe de manera más eficaz por la célula o, más preferentemente, en combinación con uno o más de los vectores que se han descrito anteriormente.
Otras composiciones a modo de ejemplo que se pueden usar para facilitar la absorción de un ácido nucleico incluyen fosfato cálcico y otros mediadores químicos de transporte intracelular, composiciones de microinyección, electroporación y composiciones de recombinación homóloga (por ejemplo, para la integración de un ácido nucleico en una ubicación preseleccionada dentro del cromosoma de la célula diana).
Los compuestos se pueden administrar solos (por ejemplo, en solución salina o tampón) o usando cualquier tipo de vector de administración conocidos en la técnica. Por ejemplo se han descrito los siguientes vehículos de administración: cocleatos (Gould-Fogerite y col., 1994, 1996); Emulsomas (Vancott y col., 1998, Lowell y col., 1997); ISCOM (Mowat y col., 1993, Carlsson y col., 1991, Hu y col., 1998, Morein y col., 1999); liposomas (Childers y col., 1999, Michalek y col., 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b); vectores bacterianos vivos (por ejemplo, Salmonella, Escherichia coli, Bacillus Calmette-Guerin, Shigella, Lactobacillus) (Hone y col., 1996, Pouwels y col., 1998, Chatfield y col., 1993, Stover y col., 1991, Nugent y col., 1998); vectores virales vivos (por ejemplo, Vaccinia, adenovirus, Herpes Simple) (Gallichan y col., 1993, 1995, Moss y col., 1996, Nugent y col., 1998, Flexner y col., 1988, Morrow y col., 1999); microesferas (Gupta y col., 1998, Jones y col., 1996, Maloy y col., 1994, Moore y col., 1995, O'Hagan y col., 1994, Eldridge y col., 1989); vacunas de ácidos nucleicos (Fynan y col., 1993, Kuklin y col., 1997, Sasaki y col., 1998, Okada y col., 1997, Ishii y col., 1997); polímeros (por ejemplo, carboximetilcelulosa, quitosano) (Hamajima y col., 1998, Jabbal-Gill y col., 1998); anillos de polímero (Wyatt y col., 1998); proteosomas (Vancott y col., 1998, Lowell y col., 1988, 1996, 1997); fluoruro sódico (Hashi y col., 1998); plantas transgénicas (Tacket y col., 1998, Mason y col., 1998, Haq y col., 1995); virosomas (Gluck y col., 1992, Mengiardi y col., 1995, Cryz y col., 1998); y, partículas similares a virus (Jiang y col., 1999, Leibl y col.,1998).
Las composiciones de la invención se administran en soluciones farmacéuticamente aceptables, que pueden contener rutinariamente concentraciones farmacéuticamente aceptables de sal, agentes de taponamiento, conservantes, vehículos compatibles, adyuvantes, y opcionalmente otros ingredientes terapéuticos.
La expresión vehículo farmacéuticamente aceptable se refiere a una o más cargas, diluyentes o sustancias de encapsulación sólidas o líquidas compatibles que son adecuadas para la administración a un ser humano u otro animal vertebrado. El término vehículo se refiere a un ingrediente orgánico o inorgánico, natural o sintético, que se combina con el principio activo para facilitar la aplicación. Los componentes de las composiciones farmacéuticas también son capaces de mezclarse con los compuestos de la presente invención, y entre sí, de tal manera que no hay interacción que perjudique sustancialmente a la eficacia farmacéutica deseada.
Para administración oral, los compuestos (es decir, ácidos nucleicos, antígenos, anticuerpos, y otros agentes terapéuticos) se pueden formular fácilmente por combinación del compuesto o compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten que los compuestos de la invención se formulen como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para ingestión oral por un sujeto a tratar. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener como excipiente sólido, moliendo opcionalmente una mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir agentes auxiliares adecuados, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de gragea. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metil celulosa, hidroxipropilmetil-celulosa, carboximetilcelulosa sódica, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como polivinil pirrolidona reticulada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato sódico. Opcionalmente, las formulaciones orales también se pueden formular en solución salina o tampones para neutralizar las condiciones ácidas internas o se pueden administrar sin ningún tipo de vehículo.
Los núcleos de grageas se proporcionan con revestimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas, que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los revestimientos de comprimidos o grageas para identificación o para caracterización de diferentes combinaciones de dosis de compuestos activos.
Las preparaciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste por presión hechas con gelatina, así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un agente plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por presión pueden contener los principios activos en mezcla con carga tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, y/o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, agentes estabilizantes. En las cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o
suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. También se pueden usar microesferas formuladas para administración oral. Tales microesferas se han definido bien la técnica. Todas las formulaciones para administración oral se deberían presentar en dosificaciones adecuadas para tal administración.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la invención se pueden administrar convenientemente en forma de una presentación de pulverización de aerosol desde envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado la unidad de dosificación se puede determinar proporcionando una válvula para suministrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos por ejemplo de gelatina para uso en un inhalador o insuflador que contiene una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
Los compuestos, cuando es deseable administrarlos por vía sistémica, se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo, por inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en envases de dosis múltiples, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyección oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetil celulosa sódica, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener agentes estabilizantes adecuados o agentes que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Como alternativa, los compuestos activos pueden estar en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril libre de pirógenos, antes de su uso.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales o vaginales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Además de las formulaciones que se han descrito anteriormente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden formular con materiales adecuados poliméricos o hidrófobos (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados poco solubles, por ejemplo, como una sal poco soluble.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender vehículos o excipientes sólidos o en fase gel adecuados. Algunos ejemplos de tales vehículos o excipientes incluyen pero no se limitan a carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las formas líquidas adecuadas o la preparación farmacéutica sólida son, por ejemplo, soluciones acuosas o salinas para inhalación, microencapsuladas, encocleadas, revestidas en partículas de oro microscópicas, contenidas en liposomas, nebulizadores, aerosoles, gránulos para su implantación en la piel, o secos sobre un objeto punzante para ser arañado en la piel. Las composiciones farmacéuticas también incluyen gránulos, polvos, comprimidos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gotas o preparaciones con liberación prolongada de compuestos activos, en cuya preparación se usan habitualmente excipientes y aditivos y/o agentes auxiliares tales como disgregantes, aglutinantes, agentes de revestimiento, agentes de hinchamiento, lubricantes, aromatizantes, edulcorantes o solubilizantes como se ha descrito anteriormente. Las composiciones farmacéuticas son adecuadas para su uso en una diversidad de sistemas de administración de fármacos. Para una breve revisión de procedimientos de administración de fármacos, véase Langer R (1990) Science 249: 1527-1533.
Los ácidos nucleicos y opcionalmente otros agentes terapéuticos y o antígenos se pueden administrar per se (puros)
o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Cuando se usan en medicina, las sales deberían ser farmacéuticamente aceptables, pero las sales no farmacéuticamente aceptables se pueden usar convenientemente para preparar sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Tales sales incluyen, pero no se limitan a, las preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, p-toluenosulfónico, tartárico, cítrico, metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico , naftaleno-2-sulfónico, y bencenosulfónico. Además, dichas sales se pueden preparar como sales de metales alcalinos o alcalinotérreos,
tales como sales de sodio, potasio o calcio del grupo del ácido carboxílico.
Los agentes de taponamiento adecuados incluyen: ácido acético y una sal (1-2 % en p/v); ácido cítrico y una sal (1-3 % en p/v); ácido bórico y una sal (0,5-2,5 % en p/v); y ácido fosfórico y una sal (0,8-2 % en p/v). Los conservantes adecuados incluyen cloruro de benzalconio (0,003-0,03 % en p/v); clorobutanol (0,3-0,9 % en p/v); parabenos (0,010,25 % en p/v) y timerosal (0,004-0,02 % en p/v).
Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica de la farmacia. Todos los procedimientos incluyen la etapa de poner los compuestos en asociación con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, las composiciones se preparan asociando uniforme e íntimamente los compuestos en asociación con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, dando forma al producto. Las unidades de dosis líquidas son viales o ampollas. Las unidades de dosis sólidas son comprimidos, cápsulas y supositorios.
Otros sistemas de administración pueden incluir sistemas de liberación en el tiempo, liberación retardada o administración de liberación sostenida. Tales sistemas pueden evitar administraciones repetidas de los compuestos, aumentando la conveniencia para el sujeto y el médico. Muchos tipos de sistemas de administraciones están disponibles y son conocidos por los expertos habituales en la materia. Estos incluyen sistemas de base de polímeros tales como poli(lactida-glicólido), copolioxalatos, policaprolactonas, poliesteramidas, poliortoésteres, ácido polihidroxibutlrico, y polianhídridos. Las microcápsulas de los polímeros mencionados anteriormente que contienen fármacos se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.075.109. Los sistemas de administración también incluyen sistemas no poliméricos que son: lípidos que incluyen esteroles tales como el colesterol, ésteres de colesterol y ácidos grasos o grasas neutras tales como mono, di y triglicéridos; sistemas de liberación de hidrogel; sistemas silásticos; sistemas basados en péptidos; revestimientos de cera; comprimidos formados por compresión usando aglutinantes y excipientes convencionales; implantes parcialmente fusionados; y similares. algunos ejemplos específicos incluyen, pero no se limitan a: (a) sistemas de erosión en los que un agente de la invención está contenido en una forma dentro de una matriz tales como los que se describen en las Patentes de Estados Unidos Nºs 4.452.775, 4.675.189, y 5.736.152, y (b) sistemas de difusión en los que un componente activo se permea a una velocidad controlada desde un polímero tal como se describe en las Patentes de Estados Unidos Nºs 3.854.480,
5.133.974 y 5.407.686. Además, se pueden usar sistemas de administración de hardware basados en bomba, algunos de los cuales están adaptadas para su implantación.
En el presente documento también se desvelan procedimientos de identificación de compuestos inmunoestimulantes y la optimización de los compuestos y agentes identificados de este modo. En general, los procedimientos de identificación sistemática implican someter a ensayo compuestos que inhiben o potencian la señalización a través de un TLR en particular. Los procedimientos usan un TLR, un ligando de referencia adecuado para el TLR, y un compuesto inmunoestimulante candidato. El TLR seleccionado se pone en contacto con un compuesto adecuado de referencia (ligando de TLR) y se mide una señal de referencia mediada por TLR. El TLR seleccionado también se pone en contacto con un compuesto inmunoestimulante candidato y se mide una señal de ensayo mediada por TLR. A continuación se comparan la señal de ensayo y la señal de referencia.
Un compuesto inmunoestimulante candidato favorable se puede usar posteriormente como un compuesto de referencia en el ensayo. tales procedimientos se pueden adaptar a identificación sistemática de alto rendimiento, automatizada de compuestos candidatos. Algunos ejemplos de tales procedimientos de identificación sistemática de alto rendimiento se describen en las Patentes de Estados Unidos Nºs 6.103.479; 6.051.380; 6.051.373; 5.998.152; 5.876.946; 5.708.158; 5.443.791; 5.429.921; y 5.143.854.
Como se usa en el presente documento "señalización de TLR" se refiere a una capacidad de un polipéptido de TLR para activar la ruta de señalización de Toll/IL-IR (TIR), también denominada en el presente documento ruta de transducción de señales de TLR. Los cambios en la actividad de TLR se pueden medir con ensayos diseñados para medir la expresión de los genes bajo el control de promotores y potenciadores sensibles a κB. Tales genes pueden ser genes de origen natural o pueden ser genes introducidos artificialmente en una célula. Los genes indicadores de origen natural incluyen los genes que codifican IL-1β, IL-6, IL-8, la subunidad p40 de interleuquina 12 (1L-12 p40), y las moléculas coestimulantes CD80 y CD8G. Otros genes se pueden colocar bajo el control de tales elementos de regulación y por lo tanto sirven para indicar el nivel de señalización de TLR.
La mezcla de ensayo comprende un compuesto inmunoestimulante candidato. Por lo general, una pluralidad de mezclas de ensayo se ejecuta en paralelo con diferentes concentraciones de agente para obtener una respuesta diferente a las diversas concentraciones. Por lo general, una de estas concentraciones sirve como un control negativo, es decir, a concentración cero de agente o a una concentración de agente debajo de los límites de detección del ensayo. los compuestos inmunoestimulantes candidatos pueden incluir numerosas clases químicas, aunque por lo general son compuestos orgánicos. En algunas realizaciones, los compuestos inmunoestimulantes candidatos son ARN pequeños o compuestos orgánicos pequeños, es decir, compuestos orgánicos que tienen un peso molecular superior a 50 Daltons pero inferior a aproximadamente 2500 Daltons. Los compuestos inmunoestimulantes candidatos poliméricos pueden tener pesos moleculares más elevados, por ejemplo, oligonucleótidos en el intervalo de aproximadamente 2500 a aproximadamente 12.500.
Los compuestos inmunoestimulantes candidatos también pueden ser biomoléculas tales como ácidos nucleicos, péptidos, sacáridos, ácidos grasos, esteroles, isoprenoides, purinas, pirimidinas, derivados o análogos estructurales de los mencionados anteriormente, o combinaciones de los mismos y similares. Cuando el compuesto inmunoestimulante candidato es un ácido nucleico, el compuesto inmunoestimulante candidato por lo general es una molécula de ADN o ARN, aunque también se contemplan ácidos nucleicos modificados que tienen enlaces o subunidades no naturales.
Los compuestos inmunoestimulantes candidato se pueden obtener a partir de una amplia diversidad de fuentes, incluyendo bibliotecas de compuestos naturales, sintéticos, o semisintéticos, o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, están disponibles numerosos medios para la síntesis aleatoria y dirigida de una amplia variedad de compuestos orgánicos y biomoléculas, incluyendo la expresión de oligonucleótidos aleatorios, bibliotecas combinatorias orgánicas sintéticas, bibliotecas de presentación de fagos de péptidos aleatorios, y similares. Como alternativa, están disponibles bibliotecas de compuestos naturales en forma de extractos bacterianos, fúngicos, vegetales y animales o se producen fácilmente. Adicionalmente, las bibliotecas y compuestos naturales y producidos por vía sintética se pueden modificar fácilmente a través de química convencional, medios físicos y bioquímicos. Además, algunos agentes farmacológicos conocidos se pueden someter a modificaciones químicas dirigidas o aleatorias, tales como acilación, alquilación, esterificación, amidificación, etc., para producir análogos estructurales de los compuestos inmunoestimulantes candidatos.
En la mezcla también se puede incluir una diversidad de otros reactivos. Estos incluyen reactivos tales como sales, tampones, proteínas neutras (por ejemplo, albúmina), detergentes, etc., que se pueden usar para facilitar la unión óptima de proteína-proteína y/o proteína-ácido nucleico. Tal reactivo también puede reducir las interacciones no específicas o de fondo de los componentes de la reacción. También se deben usar otros reactivos que mejoran la eficacia del ensayo, tales como inhibidores de proteasas, inhibidores de nucleasas, agentes antimicrobianos, y similares.
El orden de adición de los componentes, temperatura de incubación, tiempo de incubación, y otros parámetros del ensayo se pueden determinar fácilmente. Tal experimentación simplemente implica la optimización de los parámetros de ensayo, no la composición fundamental del ensayo. Las temperaturas de incubación por lo general están entre 4 ºC y 40 ºC, más generalmente de aproximadamente 37 ºC. Los tiempos de incubación se minimizan preferentemente para facilitar la identificación sistemática de alto rendimiento, rápida, y por lo general están entre 1 minuto y 10 horas.
Después de la incubación, el nivel de señalización de TLR se detecta por cualquier procedimiento conveniente disponible para el usuario. Para ensayos de tipo de unión libre de células, a menudo se usa una etapa de separación para separar componentes unidos de no unidos. La etapa de separación se puede conseguir en una variedad de maneras. Por ejemplo, la separación se puede realizar en solución, o, convenientemente, al menos uno de los componentes se inmoviliza sobre un sustrato sólido, a partir del cual los componentes no unidos se pueden separar fácilmente. El sustrato sólido se puede fabricar a partir de una amplia diversidad de materiales y con una amplia diversidad de formas, por ejemplo, placa de microtitulación, microperla, varilla de medición, partícula de resina, etc. El sustrato se elige preferentemente para maximizar las proporciones de señal a ruido, principalmente para minimizar la unión de fondo, así como para facilitar la separación y el coste.
La separación se puede realizar, por ejemplo, mediante la retirada de una perla o varilla de medición de un depósito, vaciando o diluyendo un depósito tal como un pocillo de placa de microtitulación, aclarando una perla, partícula, columna cromatográfica o filtro con una solución de lavado o disolvente. La etapa de separación incluye preferentemente múltiples aclarados o lavados. Por ejemplo, cuando el sustrato sólido es una placa de microtitulación, los pocillos se pueden lavar varias veces con una solución de lavado, que por lo general incluye los componentes de la mezcla de incubación que no participan en uniones específicas tales como sales, tampón, detergente, proteína no específica, etc. Cuando el sustrato sólido es una perla magnética, las perlas se puede lavar una o más veces con una solución de lavado y se pueden aislar usando un imán.
La detección se puede realizar de cualquier manera conveniente para los ensayos basados en células tal como medida de un polipéptido inducida dentro, en la superficie de, o secretada por la célula. Algunos ejemplos de procedimientos de detección útiles en ensayos basados en células incluyen análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), bioluminiscencia, fluorescencia, ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA), reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa inversa (RT-PCR), y similares. Algunos ejemplos de procedimientos de detección útiles en ensayos libres de células incluyen bioluminiscencia, fluorescencia, ELISA, RT-PCR, y similares.
Ejemplos
Ejemplo 1. Respuesta de PBMC humanas para oligorribonucleótidos que contienen G y U.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) de donantes sanos, sembradas a 3 x 105 células/pocillo, estimuladas in vitro con diversos agentes inmunoestimulantes de ensayo y control durante 16 horas, y a continuación se analizaron mediante ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas (ELISA) usando
pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen para citoquinas IL-12 p40 y TNF-α secretadas, realizado de acuerdo con el protocolo del fabricante. También se incluyeron ciertos controles negativos, incluyendo medio solo y DOTAP (pocillo de cultivo de 10 µg/ 200 µl; "Liposomas") solo. Los agentes inmunoestimulantes de control incluían la imidazoquinolona R-848 (2 µg/ml), lipopolisacárido (LPS; 1 µg/ml), Pam3Cys (5 µg/ml), poli IC (50 µg/ml), and ADN CpG (50 µg/ml). Se trata de ligandos informados para TLR7, TLR4, TLR2, TLR3, y TLR9, respectivamente. Los agentes inmunoestimulantes de ensayo incluían las siguientes moléculas de ARN, cada una a 50 µg/ml, con y sin DOTAP (10 µg en total "con Liposomas" y “sin Liposomas”, respectivamente): GUGUUUAC solo; GUAGGCAC solo; GUGUUUAC en combinación con GUAGGCAC; GUAGGA; GAAGGCAC; CUAGGCAC; CUCGGCAC; y CCCCCCCC. Cada uno de estos oligonucleótidos de ARN contenía un enlace de fosforotioato entre el penúltimo nucleósido y el nucleósido en el extremo una posición 3'.
La FIG. 1 representa la respuesta de PBMC humanas a los agentes de ensayo y de control enumerados anteriormente, tal como se mide mediante cantidades secretadas de IL-12 p40 (pg/ml). Como se puede observar en la FIG. 1, las PBMC eran sensibles a R-848, LPS, Pam3Cys, y poli IC, mientras que no eran sensibles a DOTAP solo. De forma significativa, las PBMC humanas secretaron grandes cantidades de IL-12 p40 (10-20 ng/ml) como respuesta a oligonucleótidos de ARN que contienen G y U, GUGUUUAC solo; GUAGGCAC solo; GUGUUUAC en combinación con GUAGGCAC; CUAGGCAC; si CUCGGCAC, cada uno en combinación con DOTAP. También de forma significativa, las PBMC humanas no secretaron cantidades significativas de IL-12 p40 como respuesta a oligonucleótidos de ARN libres de G y U, GAAGGCAC y CCCCCCCC. Parecía que el efecto inmunoestimulante de las moléculas de ARN que contienen G y U aumentaba en gran medida por la inclusión de DOTAP. En este experimento, parecía que el ARN 6-mer que contiene G y U, GUAGGA ejercía poco o ningún efecto inmunoestimulante ya sea con o sin DOTAP.
La FIG. 2 representa la respuesta de PBMC humanas a los agentes de ensayo y de control enumerados anteriormente, tal como se mide mediante cantidades secretadas de TNF-α. Se observó un patrón de resultados similar al igual que en la FIG. 1, es decir, las PBMC humanas secretaron grandes cantidades de TNF-α (40100 ng/ml) como respuesta a oligonucleótidos de ARN que contienen G y U, GUGUUUAC solo; GUAGGCAC solo; GUGUUUAC en combinación con GUAGGCAC; CUAGGCAC; y CUCGGCAC, cada uno en combinación con DOTAP. También de forma similar a los resultados de la FIG. 1, las PBMC humanas no secretaron cantidades significativas de TNF-α como respuesta a oligonucleótidos de ARN libres de G y U, GAAGGCAC y CCCCCCCC, o como respuesta al ARN 6-mer que contiene G y U, GUAGGA. Parecía que el efecto inmunoestimulante de las moléculas de ARN que contienen G y U aumentaba en gran medida por la inclusión de DOTAP.
En este ejemplo se observará que es posible el siguiente emparejamiento de bases de autocomplementariedad parcial, en el que se muestran pares de bases oscilantes de G-U unidos con un punto y los pares de bases de G-C y A-U se muestran unidos con una línea:
Ejemplo 2. Comportamiento de respuesta a la dosis de PBMC humanas para oligorribonucleótidos que contienen G y U.
Los experimentos que se describen en el ejemplo precedente se repitieron con concentraciones variables de oligonucleótidos de ARN para evaluar el comportamiento de respuesta a la dosis de las PBMC humanas para oligonucleótidos de ARN que contienen G y U de la invención. Se añadió un total de 10, 3 o 1 µg de ARN a 10 µg de DOTAP y a continuación se añadieron a los pocillos de cultivo de 200 µl. Después de 16 horas, se realizaron ELISA
para IL-12 p40 y TNF-α como se describe en el Ejemplo 1.
La FIG. 3 representa la respuesta a la dosis de PBMC humanas a los diversos ARN como se mide mediante cantidades secretadas de IL-12 p40 (ng/ml). Como se puede observar a partir de la FIG. 3, las PBMC humanas secretaron cantidades crecientes de IL-12 p40 como respuesta a cantidades crecientes de oligómeros de ARN que contienen G y U, GUGUUUAC; GUAGGCAC; CUAGGCAC; y CUCGGCAC, cada uno en combinación con DOTAP. Por el contrario, la FIG. 3 también muestra que parecía que las PBMC humanas no secretaban IL-12 p40 como respuesta a cualquiera de las cantidades sometidas a ensayo de oligómeros de ARN libres de G y U, GAAGGCAC o CCCCCCCC.
Se midió la correspondiente respuesta a la dosis de PBMC humanas para los diversos ARN mediante cantidades secretadas de TNF-α. Se observó un patrón de resultados similar al igual que en la FIG. 3, es decir, las PBMC humanas secretaron cantidades crecientes de TNF-α como respuesta a cantidades crecientes de oligonucleótidos de ARN que contienen G y U, GUGUUUAC; GUAGGCAC; CUAGGCAC; y CUCGGCAC, cada uno en combinación con DOTAP. También de forma similar a los resultados de la FIG. 3, parece que las PBMC humanas no secretaban cantidades significativas de TNF-α como respuesta a cualquiera de las cantidades sometidas a ensayo de oligonucleótidos de ARN libres de G y U, GAAGGCAC y CCCCCCCC.
Ejemplo 3. Sensibilidad de la secuencia de bases de oligómeros de ARN
Se realizaron mutaciones puntuales en el oligonucleótido de ARN GUAGGCAC sustituyendo A o C en posiciones seleccionadas. Los diversos oligorribonucleótidos incluían los siguientes: GUAGGCAC; GUAGGA; GAAGGCAC; AUAAACAC; AUAGACAC; AUAAGCAC; GUAAACAC; CUAGGCAC; CUCGGCAC; y GUGUUUAC. Dos oligonucleótidos se valoraron en PBMC humanas aisladas de donantes sanos y se sembraron a 3 x 105 células/pocillo. Se añadió un total de 10 µg de ARN a 10 µg de DOTAP y a continuación se añadieron a los pocillos de cultivo de 200 µl. El TNF-α humano se midió con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados se muestran en la FIG. 4.
Ejemplo 4. Efecto de DOTAP en la respuesta de PBMC humanas a diversos estímulos.
Para caracterizar adicionalmente el papel de DOTAP en los efectos inmunoestimulantes de los oligómeros de ARN que contienen G y U observados en los ejemplos mencionados anteriormente, se aislaron PBMC humanas de donantes sanos, se sembraron a 3 x 105 células/pocillo, y se estimularon en presencia de ligandos de TLR conocidos, ya sea con o sin DOTAP ("con Liposomas" o "sin Liposomas", respectivamente). Los ligandos de TLR conocidos examinados eran el ARN total preparado a partir de hifas (hifas), ARN total preparado a partir de levadura (levadura), ARN total preparado a partir de la línea celular HL-60 promielocítica (HL60), in vitro ARN ribosómico transcrito para Sp6 de E. coli, ARN ribosómico transcrito in vitro para T7 de E. coli, LPS, poli IC, Pam3Cys, y R-848. Como controles negativos se usaron medio solo y DOTAP solo. También se incluyó el panel de los ARN de los ejemplos mencionados anteriores, de nuevo a 10 µg/ml y sin DOTAP.
El ARN total se aisló de la línea celular HL-60 promielocítica humana usando Trizol (Sigma). Antes del aislamiento, las células se trataron durante 4 horas con peróxido de hidrógeno 500 µM (H2O2), que induce apoptosis en esta línea celular (HL60 500). Las células sin tratar sirvieron como control (HL60 0).
Se aisló ARN de Candida albicans a partir de levadura o de hifas (inducido por 4 h de incubación con suero bovino fetal al 10 %). Se alimentaron células de un cultivo de 100 ml, se lavaron y se volvieron a suspender en 10 ml de tampón de Tris/EDTA (10 mM, 1 mM). el ARN se aisló por extracción con fenol ácido caliente de acuerdo con procedimientos que se describen en Ausubel FM y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York.
El fragmento genómico de 16S ARN de E. coli se amplificó con los cebadores 5'-ATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACG-3' (SEC ID Nº: 5) y 5'-TAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCC-3' (SEC ID Nº: 6) de ADN de E.coli genómico y se coronó en el vector pGEM T easy. Se realizó transcripción in vitro usando T7 o Sp6 ARN polimerasa. El ARN transcrito se purificó adicionalmente mediante extracción con cloroformo/fenol, se precipitó, y se usó a 10 µg.
Después de 16 horas de incubación, se realizaron ELISA tal como se hizo anteriormente para evaluar la secreción de IL-12 p40 y TNF-α. Los resultados representativos se muestran en la FIG. 5.
La FIG. 5 representa el efecto de DOTAP en la cantidad de IL-12 p40 secretado por PBMC humanas después de la incubación con y sin DOTAP. Como se puede observar a partir de la figura, parecía que los siguientes estímulos ejercían un efecto inmunoestimulante mayor en presencia de DOTAP que en su ausencia: hifas, levadura, Sp6 de E. coli, y T7 de E. coli. Parecía que los siguientes estímulos ejercían un efecto inmunoestimulante reducido en presencia de DOTAP que en su ausencia: LPS, poli IC. Parecía que los siguientes estímulos ejercían aproximadamente el mismo efecto inmunoestimulante en presencia o ausencia de DOTAP: HL60, Pam3Cys y R
848.
Ejemplo 5. El efecto inmunoestimulante de oligómeros de ARN que contienen G y U depende de las especies y de MyD88.
Las siguientes células de murino se aislaron y se incubaron con diversos ARN y otros ligandos de TLR para evaluar la especificidad de especies, tipo celular, y ruta de señalización: macrófagos de tipo silvestre en presencia de IFN-γ; macrófagos deficientes en MyD88 en presencia de IFN-γ; J774 (línea celular de macrófagos de ratón); y RAW 264.7 (línea celular de macrófagos de ratón, por ejemplo, TIB-71 de la ATCC). Se generaron macrófagos de hueso murino a partir de ratones C57BL/6 de tipo silvestre o deficientes en MyD88 por cultivo de células de médula ósea con 50 ng/ml de M-CSF durante 5 días. Las células se sembraron a 25.000 células/pocillos se trataron con 20 ng/ml de IFN-γ durante 16 horas. Las líneas celulares de macrófagos de murino RAW y J774 se sembraron a
10.000 células/pocillo.
Se examinaron los siguientes agentes de ensayo y de control: R-848 (2 µg/ml), ODN 1668 (ADN CpG; 5'-TCCATGACGTTCCTGATGCT-3'; SEC ID Nº: 7); LPS (1 µg/ml); poli IC (50 µg/ml); Pam3Cys (5 µg/ml); Ionomicina/TPA; las siguientes moléculas de ARN, cada una con ("+ Lipo") y sin DOTAP (pocillo de cultivo de 10 µg/200 µl): GUGUUUAC solo (ARN1); GUAGGCAC solo (ARN2); GUGUUUAC en combinación con GUAGGCAC (ARN1/2); UCCGCAAUGGACGAAAGUCUGACGGA (ARN6; SEC ID Nº: 8); GAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUU (ARN9; SEC ID Nº: 9); y las siguientes moléculas de ADN, que corresponden a ARN1, ARN2, y ARN1/2: GTGTTTAC solo (DNA1); GTAGGCAC solo (DNA2); y GTGTTTAC en combinación con GTAGGCAC (ADN1/2). Cada uno de estos oligonucleótidos de ARN y ADN contenía un enlace fosforotioato entre el penúltimo nucleósido y el nucleósido en el extremo en la posición 3'. Cada uno del ARN6 y ARN9 contenía además un enlace fosforotioato entre el penúltimo nucleósido y el nucleósido en el extremo en la posición 5'. El ARN6 corresponde a un tallo lazo de ARN ribosómico derivado de Listeria monocytogenes. El ARN9 corresponde a un tallo lazo derivado del virus de inmunodeficiencia humana (VIH, un retrovirus de ARN). Las células se cultivaron durante 12 horas y los sobrenadantes se cosecharon. IL-12 p40, IL-6, y TNF-α murino se midieron con ELISA usando partes de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos se muestran en la FIG. 6.
El panel A de la FIG. 6 muestra que los macrófagos de murino de tipo silvestre en presencia de IFN-γ secretan cantidades significativas de IL-12 p40 como respuesta a R-848; ODN 1668 (ADN CpG); LPS; poli IC; Pam3Cys; y oligómeros de ARN que contienen G y U, GUGUUUAC en combinación con GUAGGCAC (con DOTAP). Por el contrario, el panel B de la FIG. 6 muestra que los macrófagos de murino deficientes en MyD88 en presencia de IFNγ secretan poco o ningún IL-12 p40 como respuesta a cualquiera de los agentes de ensayo y control examinados, demostrando de este modo una dependencia de MyD88 para la respuesta inmunoestimulante a estos compuestos. Tal resultado es coherente con la participación con un TLR en la respuesta inmunoestimulante para cualquiera de estos compuestos, incluyendo en particular los oligonucleótidos de ARN que contienen G y U de la invención. Los paneles C y D de la FIG. 6 muestran patrones de respuesta generalmente similares, aunque algo atenuados, de las líneas celulares de macrófagos de ratón J774 y RAW 264.7 así como para macrófagos de murino de tipo silvestre en presencia de IFN-γ, como se muestra en el panel A. Se encontraron resultados básicamente similares en ELISA realizados en paralelo midiendo IL-6 y TNF-α.
En estudios adicionales que implican células de tipo silvestre de MyD88, se observó que la adición de bafilomicina anulaban en gran medida o totalmente el efecto inmunoestimulante de los oligómeros de ARN. Junto con la dependencia de MyD88, esta observación es coherente con la implicación de al menos uno de TLR3, TLR7, TLR8, y TLR9.
Ejemplo 6. Uso de éster de colesterilo en lugar de lípido catiónico
Para investigar la posibilidad de usar oligómero de ARN modificado con éster de colesterilo en lugar de oligómero de ARN más lípido catiónico, el oligómero de ARN, GUGUGUGU, se preparó con (R 1058) y sin (R 1006) una modificación del éster de colesterilo en la posición 3'. Estos dos oligómeros de ARN con y sin DOTAP, se añadieron en un intervalo de concentraciones a cultivos durante la noche de PBMC humanas. Los sobrenadantes del cultivo se cosecharon, y se midió TNF-α, IL-12 p40, e IFN-α humanos con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos para experimentos que incluyen DOTAP se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1. Modificación de Éster de Colesterilo en Lugar de DOTAP
ID
TNF-α + DOTAP TNF-α -DOTAP IFN-α + DOTAP IFN-α -DOTAP
CE50 µM
pg/ml máx CE50, µM pg/ml máx CE50 µM pg/ml máx CE50 µM pg/ml máx
R 1006
2,8 40000 7,8 2200 4,5 5000 - --
R 1058
0,2 75000 1,0 3000 0,5 3800 0,5 1500
Los resultados indican que R 1058, con la modificación del éster de colesterilo, es más potente que R 1006, que tiene la misma secuencia de bases pero sin colesterol, ambos con y sin DOTAP.
Ejemplo 7. Efecto de la longitud del oligómero.
Los oligómeros de ARN, GUGUGUGU, GUGUGUG, GUGUGU, GUGUG, GUGU, GUG, y GU, con y sin DOTAP, se añadieron en un intervalo de concentraciones a cultivos de una noche de PBMC humanas. Los sobrenadantes del cultivo se cosecharon, y se midieron los TNF-α, IL-12 p40, y IFN-α humanos con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos para los experimentos que incluyen DOTAP se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Efecto de la longitud del oligómero de ARN
ID
SEC TNF-α IL-12 p40 IFN-α
CE50, µM
pg/ml máx CE50, µM pg/ml máx CE50, µM pg/ml máx
R1006
GUGUGUGU 2,8 40000 1,6 7000 4,5 5000
R1048
GUGUGUG 2,2 30000 2,6 10000 4,6 2700
R1049
GUGUGU 6,7 30000 2,1 8000 4,8 3400
R1050
GUGUG 7,6 40000 3,9 14000 6,9 400
R1051
GUGU - - > 20 14000 - --
R1052
GUG - - > 20 6000 5,5 800
R1053
GU - - > 20 5000 - -
Ejemplo 8. Efecto de la estabilización de enlaces internucleósidos.
Se sintetizaron oligómeros de ARN, GUGUGUGU, con enlaces específicos de fosforotioato y fosfodiéster como se muestra en la Tabla 2, en la que "*" representa fosforotioato y "_" representa fosfodiéster. Se añadieron oligómeros de ARN, con y sin DOTAP, en un intervalo de concentraciones a cultivos durante la noche de PBMC humanas. Se
15 cosecharon los cultivos del sobrenadante, y se midieron TNF-α, IL-12 p40, y IFN-α con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos para los experimentos que incluyen DOTAP se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Efecto de la Estabilización de Enlaces Internucleósidos
ID
SEC TNF-α IFN-α
CE50, µM
máx, pg/ml CE50, µM máx, pg/ml
R1006
G*U*G*U*G*U*G*U 2,8 40000 4,5 5000
R1054
G*U_G*U*G*U*G*U 5,6 40000 6,7 3700
R1055
G*U_G*U_G*U*G*U > 20 20000 - --
R1056
G*U_G*U_G*U_G*U > 20 12000 - --
R1057
G_U_G_U_G_U_G_U - - 0,1 6000
20 Del mismo modo, se sintetizo un 40-mer con todos los enlaces fosfodiéster capaz de formar una estructura de tallolazo y que tiene una secuencia de bases como se proporciona con 5'-CACACACUGCUUAAGCGCUUGCCUGCUUAAGUAGUGUGUG-3' (R 1041; SEC ID Nº: 10) y se sometió al ensayo en cultivo durante la noche con PBMC humanas. Se encontró que este oligómero de ARN era muy potente en su capacidad para inducir IFN-α, con una CE50 < 0,1 µM y un máximo de 5000 pg/ml.
Ejemplo 9. Conjugados de ADN:ARN.
Se preparó una serie de conjugados de ADN:ARN, conteniendo cada uno la secuencia de ARN, GUGUGUGU, y una secuencia poli-dT o una secuencia poli-dG. Los oligómeros eran los que siguen a continuación, en los que de nuevo "*" representa fosforotioato y "_" representa fosfodiéster:
G*U*G*U*G*U*G*U_dG_dG*dG*dG*dG*dG (R 1060; SEC ID Nº: 11) dG*dG*dG*dG_dG_G*U*G*U*G*U*G*U (R 1061; SEC ID Nº: 12) G*U*G*U*G*U*G*U*dT*dT*dT*dT*dT*dT (R 1062; SEC ID Nº: 13) dT*dT*dT*dT*dT*G*U*G*U*G*U*G*U (R 1063; SEC ID Nº: 14) Se cultivaron PBMC humanas durante la noche en presencia de conjugado de ADN:ARN añadido, con y sin DOTAP.
Se cosecharon sobrenadantes del cultivo y se midieron TNF-α, IL-6, IL-12 p40, IP-10, y IFN-α con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos para los experimentos que incluyen DOTAP se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4. Conjugados de ADN:ARN Inmunoestimulantes
ID
TNF-α IL-6 IP-10
CE50, µM
pg/ml máx CE50, µM pg/ml máx CE50, µM pg/ml máx
R1060
4,9 20000 - - - --
R1061
4,3 20000 > 20 10000 1,1 180
R1062
0,3 80000 0,4 28000 0,1 400
R1063
0,3 60000 0,8 28000 0,1 250

Ejemplo 10. ARN de Transferencia.
Se cultivaron PBMC humanas durante la noche en presencia de diversas concentraciones (1, 3, y 10 µg/ml) de ARNt obtenidos de fuentes de germen de trigo, bovino, levadura, y E. coli, añadidos a medio de cultivo con y sin DOTAP. Se cosecharon sobrenadantes del cultivo y se midieron TNF-α e IL-12 p40 con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. También estaban presentes ARNt de levadura y E. coli, y en menor medida ARNt bovino, TNF-α inducido e IL-12 p40 cuando DOTAP también estaba presente. Además, el ARNt de E. coli a 3 y 10 µg/ml indujo cantidades menores de ambas citoquinas incluso sin DOTAP.
Ejemplo 11. ARN de VIH.
Se incubaron PBMC humanas durante la noche con cualquiera de dos secuencias fundamentales ricas en G y U, es decir 5'-GUAGUGUGUG-3' (SEC ID Nº: 2) y 5'-GUCUGUUGUGUG-3' (SEC ID Nº: 3), que corresponden a los nucleótidos 99-108 y 112-123 de la cepa BH10 del VIH-1, respectivamente, cada una con y sin DOTAP. Los cultivos del sobrenadante se cosecharon, y se midieron IL-12 p40 y TNF-α humanos con ELISA usando pares de anticuerpos emparejados de BD-Pharmingen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los resultados representativos se muestran en la FIG. 7. La figura muestra que ambas de estas moléculas de ARN, a concentraciones micromolares en presencia de DOTAP, inducían 50-100 ng/ml de TNF y 50-200 ng/ml de IL-12 p40.
Ejemplo 12. Respuesta de PBMC Humanas a Factor de Respuesta Rigurosa.
Cuando las bacterias se dejan en ayunas, entran en una respuesta programada denominada respuesta rigurosa. Esto implica la producción de alarmonas de ácido nucleico y pérdida de ribosomas. Las bacterias que crecen a tasas elevadas contienen 70.000-80.000 ribosomas que representan tanto como un 50 % de su peso seco. A medida que el crecimiento se desacelera, los ribosomas innecesarios se hidrolizan. Se planteó la hipótesis de que las células en crecimiento rápido en su fase estacionaria inicial contienen grandes cantidades de oligorribonucleótidos que se liberan en los medios cuando las células entran en un ambiente de pH neutro.
La FIG. 10 representa la respuesta de PBMC humanas al factor de respuesta rigurosa (SRF). SRF se producen mediante un crecimiento rápido de bacterias (en este caso de Listeria monocytogenes) en medios ricos hasta su fase logarítmica tardía. Las bacterias se sedimentaron y se volvieron a suspender en un volumen igual de PBS durante 24 h. tan expresa centrífuga para retirar las bacterias. El sobrenadante se esteriliza pasándolo a través de un filtro de 0,2 µm. la solución esterilizada se pasó a través de un filtro molecular con un límite de 10 kDa. Esta fracción se separó en una columna C18 y el eluyente se sometió al ensayo. A una concentración de 5 µg/ml, SRF indujo TNF de PBMC humanas. Si SRF se trataba con cualquiera de las tres ARNsas, la actividad se destruía. La actividad no era debida a sustancias distintas del ARN por que el SRF tratado con Rnasa presentaba una capacidad de estimulación cercana a la del fondo. Esto implicaba que la actividad era debida al ARN.
Ejemplo 13. Respuesta de PBMC Humanas a Complejos de Ribonucleósido de Vanadilo.
Durante los estudios de SRF se determinó de forma sorprendente que el inhibidor de RNAsa, complejos de ribonucleósido de vanadilo (RVC), podían estimular las PBMC humanas para producir TNF (FIG. 11) e IL-6.
La FIG. 11 representa la respuesta de PBMC humanas a los complejos de ribonucleósido de vanadilo (RVC). Durante el ensayo de inhibidores de RNAsa se descubrió de forma inesperada que los RVC eran estimulantes para las PBMC humanas. El RVC 2 mM indujo la liberación de TNF sustancial. También se sometió ensayo la imidazoquinolina antiviral, resiquimod (R-848) representado como X y se usó a 0,1 µg/ml.
Ejemplo 14. Respuesta de TLR7 Humano y TLR8 humano a Ribonucleósidos.
Las observaciones del Ejemplo 13 se podrían extender a células 293 reconstituidas genéticamente con TLR7 y TLR8 pero no ha células 293 no transfectadas (FIG. 12). Durante el análisis de complejos de ribonucleósido de vanadilo individuales, se determinó de forma inesperada que una mezcla de los ribonucleósidos A, U, C, y G o del ribonucleósido G individual era eficaz en ausencia de vanadato en la estimulación de PBMC para producir TNF y TLR7 o TLR8 para activar NF-kB (FIG. 12).
La FIG. 12 representa la respuesta de TLR7 humano y TLR8 humano a ribonucleósidos. Se determinó que la respuesta por PBMC humanas a ARN o RVC estaba mediada por TLR7 o TLR8 y adicionalmente que la respuesta se podría dirigir solamente con ribonucleósidos. Las células 293 humanas se transfectaron de forma simulada o se transfectaron con TLR7 humano o TLR8 humano y se controló la respuesta a la ribonucleósidos. Los marcos de lectura abierta de TLR7 humano (hTLR7) y TLR8 humano (hTLR8) se amplificaron con PCR a partir de una biblioteca de ADNc de PBMC humanas usando los siguientes pares de cebadores: para TLR7, 5'-CACCTCTCATGCTCTGCTCTCTTC-3' (SEC ID Nº: 15) y 5'-GCTAGACCGTTTCCTTGAACACCTG-3' (SEC ID Nº: 16); y para TLR8, 5'-CTGCGCTGCTGCAAGTTACGGAATG-3' (SEC ID Nº: 17) y 5'-GCGCGAAATCATGACTTAACGTCAG-3' (SEC ID Nº: 18). La información de la secuencia para la selección del cebador se obtuvo a partir de los números de referencia de Genbank AF240467 y AF245703. Todos los fragmentos de TLR de longitud completa se clonaron en vector pGEM-T Easy (Promega, Mannheim, Alemania), se escindieron con Notl, se clonaron en el vector de expresión pcADN 3.1(-) (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) y se secuenciaron. Las secuencias de la región de codificación de hTLR7 y hTLR8 corresponden a los números de referencia AF240467 (SEC ID Nº: 25) y AF245703, respectivamente (SEC ID Nº: 29).
Para controlar la activación transitoria de NF-KB, se electroporaron 3 x 106 células 293 HEK (ATCC, VA, USA) a 200 voltios y 960 µF con 1 µg de plásmido de expresión de TLR, 20 ng de plásmido indicador de luciferasa de NF-KB y 14 µg de plásmido de pcADN3.1(-) como vehículo en 400 µl de medio RPMI complementado con suero bovino fetal al 25 % (FCS). Las células se sembraron a 105 células por pocillo y después de cultivo durante la noche se estimularon con R-848 (indicado en la FIG. 12 como X; sintetizado en el mercado por GLSynthesis Inc., Worcester, MA, USA), RVC o ribonucleósido durante un periodo adicional de 7 horas. Las células estimuladas se lisaron usando tampón de lisis indicador (Promega, Mannheim, Alemania), y el lisado se sometió ensayo para actividad de luciferasa usando un luminómetro Berthold (Wildbad, Alemania).
Como se representa en la FIG. 12, los transfectantes de TLR7 respondieron a R-848, RVC, una mezcla de ribonucleósidos (A, G, C, U a 0,5 mM) y el ribonucleósido de guanosina. Del mismo modo, TLR8 presentaba un patrón de respuesta similar.
Ejemplo 16. Respuesta de TLR7 y TLR8 a Mezclas de Dos Ribonucleósidos.
La FIG. 13 representa la respuesta de TLR7 y TLR8 a mezclas de dos ribonucleósido. En un experimento realizado como en la FIG. 11 se determinó que TLR 8 respondía mejor a una combinación de los ribonucleósidos G y U, sin embargo, TLR7 respondía mejora G solo. Adicionalmente, se puede observar que se proporcionaba una respuesta menor con una combinación de C y U. Estos datos muestran que los ribonucleósidos de la composición apropiada sirven como ligandos para TLR7 y TLR8. El estímulo de TPA no específico sirvió solamente como un control. X representa R-848.
Ejemplo 17. PBMC Humanas Responden a una Mezcla de los Ribonucleósidos G y U.
La FIG. 14 representa la respuesta de PBMC humanas a una mezcla de los ribonucleósidos G y U. Se puede observar que los ribonucleósidos G y U actúan de forma si enérgica para inducir TNF de las PBMC humanas. En este ejemplo, la proporción de G:U de 1:10 era óptima.
Ejemplo 18. PBMC Humanas Responden a Oligorribonucleótidos Ricos en G y U.
La FIG. 15 representa cómo las PBMC humanas responden a oligonucleótidos ricos en G y U de ARN. Los oligonucleótidos 5'-GUUGUGGUUGUGGUUGUG-3' tanto de ARN como de ADN, (SEC ID Nºs: 1 y 19) se sometieron a ensayo a 30 µM en PBMC humanas y el TNF se controló. Las PBMC humanas eran sensibles a oligonucleótidos de ARN ricos en G y U y no a oligonucleótidos de ADN ricos en G y U.
Ejemplo 19. PBMC Humanas Responden al ARN Oxidado.
La FIG. 16 representa la respuesta de PBMC humanas al ARN oxidado. Se aisló ARN 16S ribosómico de E. coli y se sometió a oxidación química. Los tratamientos fueron (mod A) ácido ascórbico 0,2 mM más CuCl2 0,2 mM durante 30 min a 37 ºC o (mod B) 0 ácido ascórbico 0,2 mM más CuCl2 0,02 mM durante 30 min a 37 ºC. Este tratamiento induce la oxidación en la posición 8 de la guanosina y también induce roturas en la hebra en la posición 3' de la guanosina modificada. Se mostró que el ARN ribosómico inducía la producción de TNF de PBMC humanas. También era evidente que la oxidación del ARN ribosómico potencia en gran medida la respuesta.
Ejemplo 20. TLR7 Humano Responde al Ribonucleósido de Guanosina Oxidado.
La FIG. 17 representa respuestas de TLR7 y TLR8 humanos al ribonucleósido de guanosina oxidado. Las células transfectadas de forma simulada o transfectadas con TLR7 humano o TLR8 humano, como en el Ejemplo 14, se sometieron a ensayo para la respuesta a la 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina) a 1 mM. Se puede mostrar claramente que el TLR7 humano es sensible a la 7-alil-8-oxoguanosina. Por lo tanto, parece que un ligando para TLR7 son ácidos nucleicos oxidados.
Ejemplo 21. TLR7 Humano Responde a Otro Ribonucleósido de guanosina Modificado.
La FIG. 18 representa respuestas de TLR7 humano al otro ribonucleósido de guanosina modificado. Las células transfectadas con TLR7 humano, como en el Ejemplo 14, se sometieron a ensayo para una respuesta dependiente de la dosis a 7-alil-8-oxoguanosina (loxorribina). Adicionalmente, se sometieron a ensayo otras guanosinas modificadas. Se puede mostrar claramente que el TLR7 humano era sensible a 7-alil-8-oxoguanosina de una forma dependiente de la dosis. Como se ha mostrado anteriormente, el TLR7 humano era sensible a la guanosina; sin embargo la FIG. 18 también muestra que el TLR7 humano respondía medianamente a la forma desoxi de la guanosina así como a la 8-bromo-guanosina.
Ejemplo 22. Distribución de TLR Humanos.
La FIG. 19 representa la distribución de TLR1-TLR9 humanos. Diversas células inmunes humanas purificadas se identificaron sistemáticamente por PCR para TLR1 a través de 9 expresiones. Se mostró que células dendríticas CD 123+ linfoides humanas (DC) eran fuertemente positivas para TLR9 y TLR7 mientras quedan más débiles para TLR8. sin embargo, se mostró lo inverso para DC CD11c+ mieloide. Esto es muy significativo porque los dos tipos de DC tienen funciones muy diferentes en el sistema inmune. De forma significativa, la FIG. 19 también muestra que los neutrófilos humanos eran fuertemente positivos para TLR8 humano mientras que muy débiles para TLR9 y negativo para TLR7. Esto también es importante porque los neutrófilos a menudo son las primeras células en involucrarse con agentes patógenos infecciosos y por lo tanto se cree que para iniciar respuestas.
Ejemplo 23.
Se células HEK-293 de forma estable con TLR7 humano o TLR8 humano. Adicionalmente, las células se transfectaron de forma estable con constructo indicador de luciferasa de NF-κB. Las células se valoraron con cantidades variables de oligonucleótidos de ARN y se cultivaron durante 16 h. La actividad de luciferasa se midió con procedimientos convencionales y se normalizó frente a transfectantes estimulados de forma simulada. La actividad de luciferasa medida para el transfectante estimulado de forma simulada se ajustó hasta un valor de inducción de NF-KB de 1 vez. Los resultados se muestran en la FIG. 20, en la que el NF-KB antiguo inducido por el oligonucleótido de ARN de estimulación se representa frente a la concentración del ribonucleótido de ensayo. La estimulación con GUGUGUGU se muestra para TLR8 humano. La estimulación con GUAGUCAC se muestra para TLR7 humano y TLR8 humano.
Equivalentes
Se considera que la memoria descriptiva escrita mencionada anteriormente es suficiente para permitir que un experto en la materia ponga en práctica la invención. La presente invención no está limitada en su alcance por los ejemplos que se proporcionan, ya que los ejemplos pretenden ser una simple ilustración de un aspecto de la invención y otras realizaciones funcionalmente equivalentes están dentro del alcance de la invención. Diversas modificaciones de la invención, además de las que se muestran y se describen en el presente documento serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y entran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Las ventajas y objetos de la invención no se incluyen necesariamente por cada realización de la invención.
LISTADO DE SECUENCIAS
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<150> US 60/370.515
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<170> Patentln versión 3.1
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<212> ADN
<213> Mus musculus
<400> 39

Claims (29)

  1. REIVINDICACIONES
    1.
    Una composición inmunoestimulante, que comprende: un oligómero de ARN aislado con una longitud de 5-40 nucleótidos que tiene una secuencia de bases que comprende al menos un 60 % de guanina (G) y uracilo (U), en la que la secuencia de bases está libre de dinucleótidos CpG; y un lípido catiónico.
  2. 2.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que la secuencia de bases:
    (a)
    comprende 5'-RURGY-3', en el que R representa purina, U representa uracilo, G representa guanina, e Y representa pirimidina;
    (b)
    comprende 5'-GUAGU-3', en el que A representa adenina;
    (c)
    comprende 5'-GUAGUGU-3';
    (d)
    comprende 5'-GUUGB-3', en el que B representa U, G, o C, en el que C representa citosina;
    (e)
    comprende 5'-GUGUG-3';
    (f)
    comprende 5'-GUGUUUAC-3';
    (g)
    comprende 5'-GUAGGCAC-3';
    (h)
    comprende 5'-CUAGGCAC-3';
    (i)
    comprende 5'-CUCGGCAC-3'; o
    (j)
    es autocomplementaria en al menos un 50 por ciento.
  3. 3. La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el oligómero:
    (a)
    tiene una longitud de 5-12 nucleótidos;
    (b)
    tiene una pluralidad de oligómeros, que comprende opcionalmente un oligómero que tiene una primera secuencia de bases y un oligómero que tiene una segunda secuencia de bases, en el que la primera secuencia de bases y la segunda secuencia de bases tienen una complementariedad de al menos un 50 por ciento, o un oligómero que tiene una secuencia de bases que comprende 5'-GUGUUUAC-3' y un oligómero que tiene una secuencia de bases que comprende 5'-GUAGGCAC-3';
    (c)
    comprende una unión de la estructura principal no natural, opcionalmente un enlace de fosforotioato;
    (d)
    comprende una base modificada seleccionada entre el grupo que consiste en 7-desazaguanina, 8-azaguanina, 5metiluracilo, y pseudouracilo; o
    (e)
    un azúcar modificado.
  4. 4.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el lípido catiónico es metil-sulfato de N-[1-(2,3dioleoiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP).
  5. 5.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un antígeno, opcionalmente en la que el antígeno es un alérgeno, un antígeno para el cáncer o un antígeno microbiano.
  6. 6.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende adicionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  7. 7.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, en la que la secuencia de bases comprende al menos un 80 por ciento de guanina (G) y uracilo (U).
  8. 8.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 7, en la que la secuencia de bases comprende al menos un 90 por ciento guanina (G) y uracilo (U).
  9. 9.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 7, en la que dicho oligómero de ARN comprende 5'-GUUGB-3', en el que B representa U, G, o C.
  10. 10.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 9, en la que dicho oligómero de ARN comprende múltiplos de 5'-GUUGB-3' unidos a través de un nucleósido de unión intermedio, que se selecciona entre el grupo que consiste en G y U.
  11. 11.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 9 o 10, en la que B representa U.
  12. 12.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 10 u 11, en la que el nucleósido de unión intermedio es
    U.
  13. 13.
    Un procedimiento in vitro para activar una célula inmune, en el que dicha célula inmune se pone en contacto con la composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en una cantidad eficaz para inducir la activación de la célula inmune.
  14. 14.
    Una composición como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 -12, para uso en un procedimiento de tratamiento mediante inducción de una respuesta inmune en un sujeto.
  15. 15.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 14 para uso en el procedimiento de la reivindicación 14, en el que el sujeto tiene o está en riesgo de tener un cáncer, una infección con un agente seleccionado entre el grupo que consiste en virus, bacterias, hongos, y parásitos.
  16. 16.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 14 para uso del procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo dicho procedimiento: administrar un antígeno a un sujeto; y administrar al sujeto dicha composición en una cantidad eficaz para inducir una respuesta inmune al antígeno.
  17. 17.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 14, para uso en el procedimiento de la reivindicación 14, comprendiendo dicho procedimiento:
    aislar células dendríticas de un sujeto; poner en contacto las células dendríticas ex vivo con la composición; poner en contacto las células dendríticas ex vivo con un antígeno; y administrar al sujeto las células dendríticas puestas en contacto.
  18. 18.
    Una composición como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en un procedimiento de tratamiento por inducción de la señalización de TLR8.
  19. 19.
    La composición de acuerdo con la reivindicación 18 para uso en el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 18 que comprende adicionalmente la cantidad eficaz de un ligando para un segundo TLR seleccionado entre el grupo que consiste en: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR9 y TLR10 para inducir la señalización por el segundo TLR.
  20. 20.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 19, para uso en el procedimiento de la reivindicación 19 en la que el ligando para el TLR8 y el ligando para el segundo TLR están unidos.
  21. 21.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende: un conjugado de ADN:ARN, en el que el ADN del conjugado comprende un motivo de CpG eficaz para estimular la señalización de TLR9 y el ARN del conjugado comprende un oligómero de ARN aislado como se define la reivindicación 1, que es eficaz para estimular la señalización por TLR8.
  22. 22.
    La composición como se reivindica en la reivindicación 21, en la que el conjugado comprende una estructura principal de ADN:ARN quimérica, opcionalmente una estructura principal quimérica que comprende un sitio de escisión entre el ADN y el ARN o un heterodúplex de ADN:ARN bicatenario.
  23. 23.
    Una mezcla de nucleósidos que consiste básicamente en G o un derivado de guanosina seleccionado entre el grupo que consiste en: 8-bromoguanosina, 8-oxoguanosina, 8-mercaptoguanosina, 7-alil-8-oxoguanosina, complejo de ribonucleósido de guanosina y vanadilo, inosina, y nebularina, y U en una proporción entre 1 G:50 U y 10 G:1 U, para uso en un procedimiento de tratamiento por estimulación de la señalización de TLR8, en el que los nucleósidos son ribonucleósidos, o comprende una mezcla de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos.
  24. 24.
    Una composición de acuerdo con la reivindicación 1 o una mezcla de acuerdo con la reivindicación 23 para uso en un procedimiento de tratamiento por estimulación de la señalización de TLR 8.
  25. 25.
    Un procedimiento para complementar una respuesta inmune mediada por TLR8 ex vivo, que comprende: poner en contacto TLR8 con una cantidad eficaz de una composición como se reivindica en la reivindicación 1 para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8; y poner en contacto un TLR distinto de TLR8 con una cantidad eficaz de un ligando para el TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8.
  26. 26.
    Una composición como se reivindica en la reivindicación 1 para uso en un procedimiento de tratamiento mediante el complemento de una respuesta inmune mediada por TLR8 en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento:
    administrar a un sujeto con necesidad de una respuesta inmune una cantidad eficaz de la composición para inducir una respuesta inmune mediada por TLR8; y administrar al sujeto una cantidad eficaz de un ligando para un TLR distinto de TLR8 para inducir una respuesta inmune mediada por el TLR distinto de TLR8.
  27. 27.
    Una composición como se reivindica en la reivindicación 26 para uso en el procedimiento de la reivindicación 26, en la que el TLR distinto de TLR8 es TLR9.
  28. 28.
    Una composición como se reivindica en la reivindicación 26 para uso en el procedimiento de la reivindicación 26, en la que el ligando para TLR9 es un ácido nucleico CpG, opcionalmente con una estructura principal estabilizada.
  29. 29.
    Una composición como se reivindica en la reivindicación 19, en la que el oligómero de ARN aislado:
    (a)
    es ARN bicatenario;
    (b)
    es ARN ribosómico;
    (c)
    es ARN de transferencia;
    (d)
    es ARN mensajero;
    (e)
    es ARN viral;
    (f)
    tiene una composición de bases de al menos un 70 % de G, y opcionalmente forma parte de un heterodúplex de ADN:ARN, o consiste básicamente en el ribonucleósido de guanosina;
    (g)
    tiene una composición de bases de al menos un 60 % de G y U; o
    (h)
    consiste básicamente en G y U.
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