BRPI0616770A2 - modulação de respostas imunes mediadas por tlr empregando oligonucleotìdeos adaptadores - Google Patents

Abstract

MODULAçãO DE RESPOSTAS IMUNES MEDIADAS POR TLR EMPREGANDO OLIGONUCLEOTìDEOS ADAPTADORES. A invenção se refere à capacidade de determinados oligonucleotídeos de modificar o perfil de ligantes de TLR, tais como os ligantes de TLR7, TLR8 e TLR9.

Description

"MODULAÇÃO DE RESPOSTAS IMUNES MEDIADAS POR TLREMPREGANDO OLIGONUCLEOTÍDEOS ADAPTADORES"

PEDIDOS CORRELATOS

Esse pedido reivindica prioridade de acordo com 35U. S . C. §119 do Pedido Provisório US número de série60/720.981, depositado em 27 de setembro de 2005 e intitulado"MODULATION OF TLR-MEDIATED IMMUNE RESPONSES USING ADAPTORNUCLEOTIDES", o conteúdo total sendo incorporado aqui comoreferência.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção se refere à modulação de respostasimunes mediadas por TLR empregando ácidos nucléicos especí-ficos .

HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A reação de determinados motivos no DNA bacterianoé uma função importante na imunidade natural, 0 DNAbacteriano já é conhecido de longa data como sendo mitogê-nico para os linfócitos B dos mamíferos (células Β) ,considerando-se que o DNA de mamíferos geralmente não é. Adescoberta de que esse reconhecimento imune foi direcionadoàs seqüências de DNA específicas centradas em um motivocontendo um dinucleotídeo de CpG não metilado abriu o campopara abordagens imunológicas moleculares. Krieg AM e outros(1995) Nature 374:546-9. Os efeitos imunoestimulatórios doassim chamado DNA CpG podem ser reproduzidos usando oligo-desoxinucleotídeos sintéticos (ODN) contendo dinucleotídeosCpG no contexto de determinada seqüência de flanqueamentopreferida, um motivo CpG. ODN contendo CpG (CpG-ODN) foireportado como exercendo vários efeitos em vários tipos decélulas do sistema imune, incluindo proteção das células Bprimárias da apoptose, promoção de entrada do ciclo dacélula e desviando uma resposta imune na direção de umaresposta imune do tipo Thl, por exemplo, indução dainterleucina 6 (IL-6), interleucina 12 (IL-12), gamainterferon (IFN-y), ativação de linfócitos T citoliticosespecíficos par. antígeno (CLT) e indução no -camundongo deIgG2a.

Foi descoberto recentemente que os efeitos imuno-moduladores de CpG DNA envolvem sinalização por receptor 9semelhante à Toll (TLR9). Acredita-se que CpG DNA sejainternalizado na célula através de uma via não específica deseqüência e trafegue para o compartimento endossômico, ondeele interage com TLR9 em uma maneira específica paraseqüência. A via de sinalização de TLR9 conduz à indução devários genes relacionados à função imune, incluindonotavelmente NF-kB.

Os TLRs são uma grande família de receptores quereconhecem estruturas moleculares específicas que estãopresentes nos agentes patogênicos (padrão molecularassociado ao agente patogênico ou PAMPs) e são tambémdenominados receptores de reconhecimento padrão (PRRs). PRRsexpressando células imunes são ativados pelo reconhecimentodos PAMPs e desencadeamento da geração de ótimas respostasimunes adaptadoras. PPRs consistindo em 10 subtiposdiferentes de TLR, TLR1 a TLR10, foram descritos. Tais TLRsforam descritos como estando envolvidos no reconhecimento doRNA de filamento duplo (TLR3), lipopolissacarideo (LPS)(TLR4), flagelina bacteriana (TLR5), compostos antiviróticospequenos (TLR7 e TLR7), DNA bacteriano ou CpG ODN (TLR9).(Vide revisão de Uhlmann e outros (2003) Curr Opin DrugDiscov Devei 6:204-17). Além disso, foram identificadamoléculas de RNA que se acredita, interajam e sinalizematravés de TLR7 e TLR8. (Vide Pedido de Patente Interna-cional PCT/US03/10406). Acredita-se que tais moléculas deRNA imunoestimuladoras tenham uma seqüência de base queinclui pelo menos uma guanina e pelo menos uma uracila. 0RNA rico em G, imunoestimulador não requer um motivo CpGconforme descrito para TLR9. Acredita-se que a classecorrespondente de moléculas RNA encontrada na naturezaesteja presente no RNA ribossômico (RNAr), RNA detransferência (RNAt), RNA mensageiro (RNAm) e RNA virótico(RNAv).

Seguindo-se a descoberta do CpG DNA imunoestimula-dor, vários relatórios foram realizados descrevendoseqüências de DNA curtas com efeitos imunoinibidores. Hámuito se sabe que as seqüências poli_G eram imunoinibidoras.

0 Pedido de Patente PCT Publicado WO 00/14217 descreve ODNcontendo um motivo inibidor NiN2GN3G onde pelo menosquaisquer dois de Ni, N2 e N3 são G (guanosina). Krieg ecolegas descreveram um grupo de 15-mer ODN, possuindo trêsou quatro Gs consecutivos, que bloquearam a proteção daapoptose e entrada do ciclo celular induzido por ODNestimulador. Lenert P e outros (2001) Antisense Nucleic AcidDrug Dev 11:247-56; Stunz LL e outros (2002) Eur J Immunol32:1212-22; Lenert P e outros (2003) Antisense Ácidonucléico Drug Dev 13:143-50.0 efeito imunoinibidor dessesODN foi reportado como sendo especifico para CpG-ODN e paraenvolver um mecanismo que não a competição simples paraabsorção celular. Stunz LL e outros (2002) Eur. J. Immunol.32:· 1212-22. Independentemente, Klinman e colegas reportaramum ODN inibidor simples. Zeuner RA e outros (2002) ArthritisRheum 46:2219-24; Yamada H e outros (2002) J Immunol169:5590-4.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A invenção provê métodos e composições paramodulação de respostas imunes mediadas por TLR incluindoinibição de algumas respostas, potencialização de outrasrespostas e alguma combinação das mesmas. A invenção parteda premissa parcial da verificação de que determinadosoligonucleotidéos são aparentemente capazes de alterar operfil de sinalização de TLR dos ligantes TLR. Assim, essesoligonucleotideos "adaptadores são capazes de converteressencialmente ligantes TLR7 em ligantes TLR8, de acordo comuma modalidade e ligantes TLR7/8 nos ligantes TLR8 de acordocom outra modalidade.

Assim, em um aspecto, a invenção provê um métodopara estimulação' da resposta imune mediada por TLR8compreendendo administração a um indivíduo que necessite, deum ligante TLR7/8 e um oligonucleotídeo adaptador em umaquantidade eficaz para estimular a resposta imune mediadapor TLR8.Em outro aspecto, a invenção provê um método pararedirecionar a resposta imune mediada por TLR7 to a respostaimune mediada por TLR8 compreendendo administração a umindivíduo experimentando uma resposta imune mediada porTLR7, de um oligonucleotídeo adaptador em uma quantidadeeficaz para redirecionar a resposta imune mediada por TLR7para a resposta imune mediada por TLR8.

Ainda em outro aspecto, a invenção provê umacomposição compreendendo um ligante TLR7/8 e um oligonucleo-tídeo adaptador.

Em uma modalidade, o ligante TLR7/8 é um liganteTLR7, tal como um ligante específico para TLR7. 0 liganteTLR7 pode ser um análogo de guanosina, tal como, porém nãolimitado a guanocina substituída C8. 0 ligante TLR7 pode ser3M-001. O ligante TLR7 pode ser um composto à base deadenosina, tal como, porém não limitado a 6-amino-9-benzil-2-(3-hidróxi-propóxi)-9H-purin-8-ol, ou 6-amino-9-benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol. O ligante TLR7 pode ser 7-deaza-guanosina.

Exemplos de guanosina substituída. C8 incluem 7-alil-7, 8-diidro-8-oxo-guanosina (Ioxoribina), 7-tia-8-oxo-guanosina (imunosina, isatoribina, ANA245, 7-tia-8-oxo-7,8-diidroguanosina, 5-amino-3-(β-D-ribofuranosil)-3H, 6H-tiazol[4, 5-d]pirimidina-2,7-diona), 8-mercaptoguanosina, 8-bromo-guanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-diidroguanosina, C8-arilamino-2'-desoxiguanosina, C8-propinil-guanosina, ribonu-cleosídeos guanina substituídos C8-e N7-, 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidróxi-2'-desoxiguanosina,guanosina substituída 7-deaza-8, e 8-hidroxiguanosina. Emalgumas modalidades, a guanosina substituída C8 éloxoribina, imunosina ou 7-deaza guanosina.

Em outra modalidade, o ligante TLR7/8 é um liganteTLR8 incluindo um ligante específico de TLR8. 0 ligante TLR8pode ser 3M-002. Nas modalidades onde ligante é um liganteTLR8, a resposta imune mediada por TLR8 pode ser melhoradapelo menos 2 vezes, 3 vezes, 4-vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15vezes, 20 vezes ou mais o nível da resposta imune obtida naausência do oligonucleotídeo adaptador.

Em outra modalidade, o ligante TLR7/8 é um liganteTLR7 e um ligante TLR8. Um exemplo de tal ligante TLR 7/8 éuma imidazoquinolina. Exemplos de imidazoquinolinas incluemimidazoquinolina amina, imidazopiridina amina, cicloalqui-limidazopiridina amina 6,7-fundida, imidazoquinolina amina1,2 ligada em ponte, R-848 (S-28463 ou resiquimod), 4-amino-2-etóximetil-a, α-dimetil-lH-imidazo[4 , 5-c] quinolinas-l-eta-nol, 1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (R-837 ou Imiquimod) ou S-27609. Em lagunas modalidadesimportantes, a imidazoquinolina é R-848.

0 ligante TLR7/8 pode ser 3M-003. Nas modalidadesonde o ligante é um TLR7 e ligante TLR8, a resposta imunemediada por TLR8 pode ser melhorada pelo menos 2 vezes, 3vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes oumais, em relação ao nível da resposta imune mediada por TLR8obtida na ausência do oligonucleotídeo adaptador.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo adaptadorcompreende a fórmula 5' X -N5 -X3' ou a fórmula 5' X -N4 3',onde X pode ser qualquer nucleotídeo e pode estar presenteou ausente e N4 e N5 representam quatro ou cinco Tscontínuos (timidina), U (uracila) ou A (adenina), tal que, Nem N4 ou N5 seja idêntico. Dependendo da modalidade, ooligonucleotideo possui 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17 ou mais nucleotídeos de comprimento. Nas modalidadesimportantes, ele compreende pelo menos uma ligaçãointernucleotídeo fosfotioato (até e incluindo uma estruturacompletamente fosforotioada).

Em uma modalidade correlata, o oligonucleotideoadaptador compreende a fórmula 5' Xa-TTTTT-Xb, 3', onde Xa eXb podem ser independentemente qualquer nucleotídeo e podemestar presentes ou ausentes. Xa e Xb podem ser um ou maisnucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotídeos). Em umamodalidade, o oligonucleotideo compreende 6, 7 ou mais Tscontínuos. Em uma modalidade importante, o oligonucleotideoadaptador é um homopolímero de timidina (dT), que possuiopcionalmente 17 nucleotídeos de comprimento.

Em outra modalidade, o oligonucleotideo adaptadorcompreende a fórmula 5'Xa-UUUUU-Xb 3' onde Xa e Xb podem serindependentemente, qualquer nucleotídeo e podem estarpresentes ou ausentes. Xa e Xb podem ser um ou maisnucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotídeos). Em umamodalidade, o oligonucleotideo pode compreender 6, 7 ou maisU contínuos. Em uma modalidade importante, o oligo-nucleotideo é um homopolímero de uracila (dU) , que possuiopcionalmente 17 nucleotídeos de comprimento.Ainda em outra modalidade, o oligonucleotideoadaptador compreende a fórmula 5'Xa-AAAAA-Xb3' , onde Xa e Xbpodem ser independentemente, qualquer nucleotideo e podemestar presentes ou ausentes. Xa e Xb podem ser um ou maisnucleotideos (por exemplo, 1-100 nucleotideos). Em umamodalidade, o oligonucleotideo pode compreender 6, 7 ou maisAs contínuos. Em uma modalidade importante, o oligonu-cleotideo é um homopolímero de adenina (dA), que possuiopcionalmente 17 nucleotideos de comprimento.

Ainda em outra modalidade, o oligonucleotideoadaptador compreende a fórmula 5' Cn-Tm -Cp 3', onde η é uminteiro variando de 0-100, ρ é um inteiro variando de 0-100,e m é um inteiro variando de 0-100. Em uma modalidade, asoma de η e ρ é igual ou inferior ao valor de m tal que, oteor de C de todo o oligonucleotideo é de 50%, inferior a50%, inferior a 45%, inferior a 40%, inferior a 35%,inferior a 30%, inferior a 25%, inferior a 20%, inferior a15%, inferior a 10%, inferior a 5%, ou menor. Em algumasmodalidades, η varia de 3-7, m varia de 2-10 e ρ varia de 4-8, contanto que as porcentagens citadas acima sejamsatisfeitas. Exemplos incluem 5'C3TioC43' (SEQ ID NO: 1) e5'C4T8C53' (SEQ ID NO: 2).

O oligonucleotideo adaptador pode compreender ummotivo CpG, ou pode não possuir tal motivo. 0 motivo podeser um motivo CpG não metilado.

Em uma modalidade, o ligante TLR7/8 e o oligo-nucleotideo adaptador são administrados separadamente aoindivíduo. Nessas e em outras modalidades, o ligante e ooligonucleotídeo podem ainda ser administrados substancial esimultaneamente um com o outro. Ainda em outra modalidade, ooligonucleotídeo e o ligante TLR7/8 são conjugados um aooutro. Em uma modalidade, o oligonucleotídeo adaptador écovalentemente anexado ao ligante TLR7/8.

Em uma modalidade, o oligonucleotídeo adaptador éum DNA, enquanto em outra é um RNA. Em uma modalidade, ooligonucleotídeo adaptador não é imunoestimulador quandoempregado sozinho. Em uma modalidade, o oligonucleotídeoadaptador sozinho não estimula uma resposta imune mediadapor TLR7 ou TLR8.

Em uma modalidade, a composição compreende, adi-cionalmente, um antígeno e/ou o método compreende, adicio-nalmente administração de um antígeno ao indivíduo.

Em uma modalidade, o indivíduo sofre de umainfecção. Em outra modalidade, o indivíduo sofre de câncer.Ainda em outra modalidade, o indivíduo sofre de alergia ouasma.

A composição pode ser uma preparação farmacêuticacompreendendo, adicionalmente, um veículo farmaceuticamenteaceitável.

Em um aspecto, a invenção provê o emprego doligante TLR e .combinação de oligonucleotídeo adaptador,conforme descrito acima, para a preparação de um medicamentopara vacinar um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção provê um método parapreparação de uma vacina. O método inclui a etapa decolocação do ligante TLR e combinação de oligonucleotídeoadaptador, conforme descrito acima, em associação intima comum antigeno e, opcionalmente, um veiculo farmaceuticamenteaceitável.

Em um aspecto, a invenção provê o emprego doligante TLR e combinação de oligonucleotideo adaptador,conforme descrito acima, para a preparação de um medicamentopara tratamento de infecção em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção provê uma composiçãoútil para o tratamento de infecção que inclui o ligante TLRè combinação de oligonucleotideo adaptador, conformedescrito acima, e um agente antimicrobiano ou medicamento.

Em um aspecto, a invenção provê o emprego doligante TLR e combinação do oligonucleotideo adaptador,conforme descrito acima, para a preparação de um medicamentopara tratamento de câncer em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção provê uma composiçãoútil para o tratamento de câncer que inclui o ligante TLR ecombinação de oligonucleotideo adaptador, conforme descritoacima, e um medicamento para o câncer.

Em um aspecto, ã invenção provê o emprego doligante TLR e combinação do oligonucleotideo adaptador,conforme descrito acima, para a preparação de um medicamentopara tratamento de uma condição alérgica em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção provê uma composiçãoútil para o tratamento de uma condição alérgica que inclui oligante TLR e combinação do oligonucleotideo adaptador,conforme descrito acima, e um medicamento para alergia.Em um aspecto, a invenção provê o emprego doligante TLR e combinação de oligonucleotideo adaptador,conforme descrito acima, para a preparação de um medicamentopara tratamento de asma em um indivíduo.

Em um aspecto, a invenção provê uma composiçãoútil para o tratamento de asma que inclui o ligante TLR ecombinação do oligonucleotideo adaptador, conforme descritoacima, e um medicamento para asma.

Em outros aspectos, a invenção provê métodos declassificação para identificação de ligantes TLR7/8 enucleotídeos adaptadores. Assim, em um aspecto, a invençãoprovê um método para identificação de um ligante TLR8compreendendo contato de uma célula expressando TLR8 com umligante de teste na presença e ausência de um oligonu-cleotideo adaptador, e medição da estimulação da célulaexpressando TLR8 na resposta ao ligante de teste na presençae ausência do oligonucleotideo adaptador. Um ligante TLR8 éidentificado por uma estimulação aumentada na presença dooligonucleotideo adaptador. A estimulação aumentada épreferivelmente um aumento em relação ao nível de estímulonão zero na ausência do oligonucleotideo adaptador.

Em outro aspecto, a invenção provê um método paraidentificação de um ligante TLR7 compreendendo contato deuma célula expressando TLR7 e uma célula expressando TLR8com um ligante de teste na presença e ausência de umoligonucleotideo adaptador, e medição da estimulação dacélula expressando TLR7 e a célula expressando TLR8 emresposta ao ligante de teste, na presença e ausência dooligonucleotídeo adaptador. Um ligante TLR7 é identificadopor uma estimulação diminuída na célula expressando TLR7 euma estimulação aumentada na célula expressando TLR8, napresença do oligonucleotídeo adaptador. A estimulaçãoaumentada, nesse aspecto, é preferivelmente um aumento nonível de estimulação zero na ausência do oligonucleotídeoadaptador.

Em outro aspecto, a invenção provê um método paraidentificação de um oligonucleotídeo adaptador compreendendocontato da célula expressando TLR8 com um ligante TLR7conhecido, na presença e ausência do oligonucleotídeoadaptador de teste, e medição da estimulação da célulaexpressando TLR8, em resposta ao ligante TLR7 na presença deum oligonucleotídeo adaptador de teste. 0 nível deestimulação pode ser comparado ao nível na ausência dooligonucleotídeo de teste, o nível na ausência do liganteTLR7 e a presença do oligonucleotídeo de teste, e/ou napresença do ligante TLR7 e um oligonucleotídeo adaptadorconhecido. Um oligonucleotídeo adaptador é identificado porestimulação aumentada da célula expressando TLR8 em suapresença, em comparação à sua ausência, em uma modalidade,contanto que o oligonucleotídeo propriamente não estejamediando uma resposta imune mediada por TLR8 (conformedeterminado pelos ensaios de controle mencionados acima).

Os ligantes TLR7 e TLR8 e os oligonucleotídéosadaptadores podem ser qualquer um dos citados nos parágrafosprecedentes e modalidades. As células expressando TLR7 ouTLR8s podem se células que expressam naturalmente TLR7 ouTLR8 ou podem ser células fabricadas para expressar (porexemplo, ectopicamente) TLR7 ou TLR8. A estimulação pode semedida por sinalização através de TLR7 ou TLR8 e efeitos ajusante dos mesmos incluindo, porém não limitado à expressãogênica (por exemplo, conforme visualizado usando umaconstrução repórter que é conjugada aos elementos promotoresde um alvo a jusante de TLR7 ou TLR8) , expressão, produçãoou secreção de fator de crescimento aumentado (citocina) esemelhantes.

Esses e outros aspectos e concretizações dainvenção serão descritos em maiores detalhes aqui.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras 1A-1B mostram o aperfeiçoamentoseletivo e inibição da atividade mediada por R-848 em TLR8 eTLR7 humanos por ODN. A Figura IA mostra a inibição daatividade de R-848 no TLR7 humano por ODN 6056 (SEQ ID NO:3) e 1982 (SEQ ID NO: 4) (quanto às seqüências vide Tabelas1 e 2) . As células HEK293 expressando TLR7 estável e umaconstrução repórter NF-κΒ luciferase foram incubadas com 2μΜ de R-848 na presença ou ausência das quantidadesindicadas do homopolimero oligo(dT)17 ODN 6056, ou doheteropolimero ODN 1982. A atividade de R-848 sozinho foiajustada a 100%. Todos os pontos de dados foram avaliados emtriplicata e a média (+/-SD) é revelada. Os resultadosmostrados são dos mais de dois experimentos independentes. AFigura IB mostra o aperfeiçoamento seletivo da seqüência daatividade R-848 em TLR8 humano por um oligo(dT)17 ODN. Ascélulas HEK293 expressando estavelmente hTLR8 e umaconstrução repórter de NF-KB-Iuciferase foram incubadas comquantidades crescentes de R-848 na ausência ou presença de0,1, 1 e 5 μΜ do homopolimero oligo(dT)17 ODN 6056 ou doheteropolimero ODN 1982. A estimulação da ativação de NF-κΒfoi calculada com referência ao histórico médio. Todos ospontos de dados foram avaliados em triplicata e a média (±SD) revelada. Os resultados mostram um dos quatro experi-mentos independentes.

As Figuras 2A-C mostram a especificidade alvoalterada dos ligantes TLR7, loxoribina e 7-deaza-guanosina,quando combinados com um oligo(dT)17 ODN. Na Figura 2A, ascélulas HEK293 expressando estavelmente hTLR7, hTLR8 ouhTLR9 foram incubadas com quantidades crescentes deloxoribina. A ativação de NF-κΒ foi medida por avaliação daatividade da luciferase 16 horas mais tarde e revelada comoestimulação multiplicada acima do histórico médio. Na Figura2B, as células HEK293 expressando hTLR8 foram incubadas comquantidades crescentes de loxoribina na ausência ou presençadas concentrações indicadas do homopolimero ODN 6056 ou doheteropolimero ODN 1982. A ativação NF-κΒ é fornecida comouma indução de multiplicação acima do histórico médio. NaFigura 2C, quantidades crescentes de 7-deaza-guanosina(painel esquerdo) e inosina (painel direito) foram avaliadasnas células HEK293 expressando hTLR8 na ausência (círculoscheios) ou presença (círculos sem preenchimento) de 5 μΜ ODN6056 e estimulação de NF-κΒ acima do histórico médio foicalculada. Todos os pontos de dados foram avaliados emtriplicata. São mostrados os dados de um dos trêsexperimentos.

As Figuras 3A-3B mostram que ODN 6056 inibe aativação de NF-κΒ mediada por TLR7 nas células HEK293. Ascélulas HEK293 expressando hTLR7 estavelmente e construçãorepórter de NF-KB-Iuciferase foram incubadas por 16 horascom 2,5 mm de loxoribina (Figura 3A) ou 2 μΜ de R-848(Figura 3B), na presença ou ausência das concentraçõesindicadas de ODN 6056. A estimulação da ativação de NF-kBfoi calculada com referência ao histórico médio. Todos ospontos de dados foram avaliados em triplicata e a média (±SD) é revelada. Os resultados mostrados são de um de doisexperimentos independentes.

As Figuras 4A-4D mostram redirecionamento daprodução de citocina induzida por loxoribina por ODNespecifico. PBMC humanos foram incubados com 1 mM deloxoribina na ausência ou presença separada de quantidadescrescentes de ODN 6056 e ODN 1982. Os sobrenadantes foramcoletados 24 horas mais tarde e quantidades de IFN-α (Figura4A), IL-12p40 (Figura 4B), IFN-δ (Figura 4C) e TNF-α (Figura4D) foram medidas por ELISA. Os valores representam a médiade 3 ' doadores (± SEM) . Os dados são de um experimentorepresentativo de quatro experimentos.

As Figuras 5A-5F mostram estimulação de monócitoshumanos para produzir IL-12p40 e TNF-α mediante co-culturacom loxoribina e oligo(dT)17 ODN. PBMC humanos foramincubados com quantidades indicadas de loxoribina e ODN. Acoloração intracelular foi realizada empregando anti-IL-12p40/p70 (Figura 5Α) e anticorpos de anti-TNF-α (Figura5B). As células foram coloridas simultaneamente comanticorpos anti-CD 14 e anti-CD 19. As células foram retidaspor células CD14-positivas e a porcentagem de células IL-12p40/p70- ou TNF-a-positivas foi calculada. Os resultadosmostram a média de três doadores (± SEM) . As Figuras 5C-5Frevelam manchas de citometria de fluxo representativas. Émostrado um de dois experimentos independentes.

As Figuras 6A-6L mostram estimulação de células NKhumanas para produção de co-cultura de IFN-δ com loxoribinae oligo(dT)17 ODN 6056. PBMC humanos foram incubados comquantidades indicadas de loxoribina e ODN. A coloraçãointracelular foi realizada empregando anticorpos anti-IFN-δ.As células foram coloridas com anticorpos anti-CD56 e anti-CD3. As células foram retidas por células CD56-positivas/CD3negativas (células NK). A porcentagem de células IFN-δ-positivas foi calculada e é mostrada dentro das manchas decitometria de fluxo. São mostrados dois doadores represen-tativos dos cinco doadores.

As Figuras 7A e 7B mostram a influência da co-incubação de loxoribina com ODN na produção de citocina depopulações de células isoladas. Na Figura 7A, os monócitosforam isolados de PBMC humano (96% de pureza) empregando CD14 mAb e incubados com quantidades indicadas de loxoribinana presença ou ausência de ODN. A quantidade de IL-12p40 foideterminada nos sobrenadantes por ELISA. Os dados mostramresultados para dois doadores individuais (barras cinza epreta). É mostrado um dos 3 experimentos semelhantes. NaFigura 7B, PDC foram enriquecidos (85% de pureza) a partirde PBMC humanos de dois doadores (barras cinza e preta)empregando BDC A-4 mAb e incubados com combinações indicadasde loxoribina e ODN por 24 horas. IFN-α foi detectada nossobrenadantes por ELISA. São mostrados os dados de um dostrês experimentos semelhantes.

A Figura 8A mostra o efeito nas células hTLR8-LUC-293 incubadas com 50 μΜ de R-848 na presença das quantidadesindicadas de ODN por 16 horas. A estimulação de NF-κΒ foimedida para avaliar a atividade da luciferase. A atividadede NF-κΒ induzida por 50 μΜ de R-848 sozinho foi ajustadapara 100%. A Figura 8B mostra células hTLR8-LUC-293incubadas com concentrações crescentes de R-848 na presençade 1 μΜ de ODN indicado por 16 horas. A estimulação de NF-κΒfoi medida por avaliação da atividade da luciferase.

As Figuras 9A e 9B mostram sinalização de TLR7 ede TLR8 empregando uma combinação de TLR7 ligante especifico6-amino-9-benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol e ODN 6056. A Figura9A mostra os efeitos na combinação de sinalização de TLR7. AFigura 9B mostra os efeitos na combinação de sinalização deTLR8 .

A Figura 10 mostra o efeito na sinalização de TLR8de dois RNAs diferentes. Poli(rU)i8 (SEQ TD NO: 5) estimulaTLR8 na ausência de um ligante TLR7/8. 0 RNA oligo misto(SEQ ID NO: 16) não estimula TLR8 sozinho.

A Figura 11 mostra os efeitos de dois RNAs nasinalização de TLR8 de R-848, na presença de um liganteTLR7/8.A Figura 12 mostra os dois efeitos mediados porTLR8 de ODN 6056 nos ligantes TLR7 (loxoribina, imunosina) ,um ligante que é ambos um ligante TLR7 e um ligante TLR8 (R-848), e um composto que não é um ligante TLR7/8(ribavirina).

As Figuras 13A-D mostram as estruturas da imuno-sina (A), duas variantes/monômeros da imunosina (B e C) quepodem ser conjugadas a um oligonucleotideo na terminação 3'ou internamente (B) ou na terminação 5' (C), e 6-amino-9-benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol (D).

A Figura 14 mostra a estrutura de um conjugadoimunosina-oligonucleotídeo compreendendo um ligante.

As Figuras 15A-C mostram as estruturas de R-848(A), CL-029 (B) e imunosina (C), e pontos nos quais osligantes e/ou oligonucleotideos podem ser anexados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A invenção se refere, em parte, à descoberta deque determinados oligonucleotideos são capazes de modularrespostas imunes mediadas por TLR. Conforme usado aqui,modulação de resposta imune mediada por TLR se refere àcapacidade de manipular sinalização de um ou mais TLRs. Porexemplo, é possível de acordo com a invenção alterar operfil de TLR de ligantes TLR específicos, tal que, napresença de determinados oligonucleotideos esses ligantessinalizam através de um TLR diferente. Como outro exemplo,na presença de determinados oligonucleotideos, os ligantesTLR sabem sinalizar através de um ou mais TLR, demonstrandoa sinalização através de apenas um TLR, e em muitos casos,tal sinalização é melhorada. Ainda em outro exemplo, napresença de determinados oligonucleotideos a eficácia epotência da sinalização de TLR é significativamenteaumentada. Assim, a invenção torna possível inibir/oumelhorar significativamente a sinalização por qualquer um oupor qualquer combinação de TLR7, TLR8, e TLR9.

A invenção tem como premissa, em parte, a obser-vação de que a coincubação do derivado de imidazoquinolina,Resiquimod (R-848), que propriamente ativa ambos TLR7 eTLR8, com um oligonucleotídeo homopolímero oligo(dT)17 (ODN6056) aumentou a atividade de R-848 nas células HEKexpressando TLR8, de forma significativa, considerando-seque a sinalização mediada por TLR7 foi abolida. De modosemelhante, a combinação de loxoribina análoga a guanosina,que ativa propriamente TLR7, e de oligo(dT)17 ODN 6056induziu a sinalização mediada por TLR8 em um modo seletivode seqüência e aboliu a sinalização mediada por TLR7.

o perfil da citocina induzida por loxoribina nascélulas imunes humanas foi também alterado por co-incubação20 com o oligo(dT)17. IL-12, TNF-α ou IFN-δ foram altamentesecretados, porém a produção de IFN-α foi suprimida. Emboranão pretendendo ligação com qualquer mecanismo específico,presume-se que a alteração observada nas citocinas induzidasse deve a uma comutação nos tipos de células sendo ativadasdo plasmacitóide DC pela loxoribina sozinha, para monócitospor sua combinação com ODN e indica que os monócitos nãoexpressam TLR7 funcional.A invenção, portanto, é útil na modulação de umafaixa de respostas imunes. A invenção em uma modalidadeespecifica é útil para inibir sinalização de TLR7 (e daresposta imune mediada por TLR7 associada), opcionalmenteenquanto induzindo sinalização de TLR8 (e da resposta imunemediada por TLR8 associada). Em uma modalidade especifica, ainvenção provê a indução (incluindo melhora) da sinalizaçãode TLR8 (e da resposta imune medida por TLR8 associada).Dependendo da natureza do oligonucleotideo adaptador, tambémé possível induzir sinalização de TLR9 ao mesmo tempo (eresposta imune mediada por TLR9 associada). Por exemplo, umacombinação de um oligonucleotideo adaptador que compreendeum motivo CpG e um ligante TLR7, tal como loxoribina,induziria a sinalização de TLR8 e TLR9 (e suas respostasimunes associadas).

A invenção também é útil no tratamento de umaampla faixa de condições que se beneficiariam da inibiçãodas respostas imunes mediadas por TLR7 e/ou indução(incluindo aperfeiçoamento) das respostas imunes mediadaspor TLR8, opcionalmente na ausência ou presença dasrespostas imunes mediadas por TLR9.

As condições que poderiam se beneficiar dasrespostas imunes mediadas por TLR7 incluem condiçõesautoimunes, tais como, porém não limitadas a lúpus e artritereumatóide, especificamente aquelas associadas com infecçãopor um vírus de DNA. A inibição da resposta imune mediadapor TLR7 com indução concomitante de uma resposta imunemediada por TLR8 pode ser usada quando for desejávelmelhorar a resposta da célula T que está sendo suprimida porcélulas reguladoras T. Tais condições incluem, porém nãoestão limitadas a algumas formas de câncer, bem como,infecção por HCV, HBV e HIV. A inibição de TLR7 e indução deTLR8 combinadas poderia ser benéfica no tratamento de doençaautoimune ou onde for desejável para induzir uma respostaimune, porém evitar toxicidade associada ao TLR7. A indução(incluindo aperfeiçoamento) de uma resposta imune mediadapor TLR8, independente da modulação de uma resposta imune mediada por TLR7, é útil, entre outras coisas, no tratamentodo câncer e infecções na obtenção de uma vacina ou nãovacina.

A invenção também é útil no tratamento dascondições que se beneficiariam dos giros na produção decitocinas, onde um indivíduo é o se torna refratário aoefeito de determinadas citocinas (por exemplo, IFN-α, comoalgumas vezes é observado no tratamento das infecçõesviróticas).

TLRs

Receptores semelhantes à Toll (TLRs) são umafamília de polipeptídeos altamente conservados quedesempenham um papel importante na imunidade inata aosmamíferos. Atualmente foram identificados dez elementos dafamília, designados TLR1-TLR10. Os domínios citoplásmicosdos vários TLRs são caracterizados por um domínio dereceptor (TIR) de Toll-interleucina 1 (IL-I). Medzhitov R eoutros (1998) Mol Cell 2:253-8. 0 reconhecimento da invasãode micróbios pelos TLRs dsencadeia a ativação de uma cascatade sinalização que é evolucionariamente conservada emDrosophila e nos mamíferos. A proteína adaptadora contendodomínio TIR, MyD88, foi reportada como se associando aosTLRs e recrutando a cinase associada ao receptor IL-I (IRAK)e fator 6 associado ao receptor (TNF) de fator de necrose detumor (TRAF6) para os TLRs. Acredita-se que a via desinalização dependente de MyD88 conduza a ativação dosfatores de transcrição de NF-κΒ e proteínocinases ativadaspor mitogênio (MAPKs) de c-Jun NH2 cinase terminal (Jnk) ,etapas críticas na ativação imune e produção de citocinasinflamatórias. Para uma revisão vide Aderem A e outros(2000) Nature 406:782-87.

Acredita-se que os TLRs sejam expressosdiferencialmente em vários tecidos e em vários tipos decélulas imunes. Por exemplo, TLR7 humano foi reportado comosendo expresso na placenta, pulmão, baço, nodos linfáticos,tonsila e nas células dendríticas precursoras plasmacitóides(pDCs). Chuang T.H e outros (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8); Kadowaki N e outros (2001) J Exp Med 194:863-9. TLR8humano foi reportado como sendo expresso no pulmão,leucócitos de sangue periférico (PBL), placenta, baço, nodoslinfáticos e monócitos. Kadowaki N e outros (2001) J Exp Med194:863-9; Chuang T-H e outros (2000) Eur Cytokine Netw11:372-8. 0 TLR9 humano é reportadamente expresso no baço,nodos linfáticos, medula óssea, PBL, e nos pDCs e células B.Kadowaki N e outros (2001) J Exp Med 194:863-9; Bauer S eoutros (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:9237-42; Chuang T-He outros (2000) Eur Cytokine Netw 11:372-8.O nucleotídeo e as seqüências de aminoácido deTLR7 de humanos e murinos são conhecidos. Vide, por exemplo,Números de Acesso ao GenBank AF240467, AF245702, NM_016562,AF334 942, NM_133211; e AAF60188, AAF78035, NP_057646,AAL73191, e AAL73192, o conteúdo de todos sendo incorporadoaqui como referência. 0 TLR7 humano é reportado comopossuindo 1.04 9 aminoácidos de comprimento. O TLR7 de murinoé reportado como possuindo 1.050 aminoácidos de comprimento.

Os polipeptideos de TLR7 incluem domínio extracelularpossuindo uma região de repetição rica em leucina, umdomínio de transmenbrana e um domínio intracelular queincluir um domínio TIR.

O nucleotídeo e as seqüências de aminoácido deTLR8 de humanos e murinos são conhecidos. Vide, por exemplo,Números de Acesso ao GenBank AF246971, AF245703, NM_016610,XM_04 57 0 6, AY0358 90, NM_133212; e AAF64061, AAF78036,NP_057694, XP_045706, AAK62677, e NP_573475, o conteúdo dosmesmos sendo incorporado aqui como referência. TLR8 humano éreportado como existindo em pelo menos duas isoformas, umadas quais sendo de 1.041 aminoácidos de comprimento e aoutra de 1.059 aminoácidos de comprimento. 0 TLR8 de murinopossui 1.032 aminoácidos de comprimento. Os polipeptideos deTLR8 incluem um domínio extracelular possuindo uma região derepetição rica em leucina, um domínio de transmembrana, e umdomínio intracelular que inclui um domínio TIR.

0 nucleotídeo e as seqüências de aminoácido deTLR9 humano e de murino são conhecidos. Vide, por exemplo,Números de Acesso ao GenBank NM 017442, AF259262, AB045180,AF245704, ΑΒ045181, AF348140, AF314224, NM_031178; eΝΡ_059138, AAF7218 9, ΒΑΒ19259, AAF78037, ΒΑΒ19260, ΑΑΚ29625,ΑΑΚ28488, e ΝΡ_112455, ο conteúdo dos mesmos sendoincorporado aqui como referência. 0 TLR9 humano é reportadocomo existindo em pelo menos duas isoformas, uma que possui1.032 aminoácidos de comprimento e a outra que possui 1.055aminoácidos. O TLR9 de murino possui 1.032 aminoácidos decomprimento. Os polipeptideos de TLR9 incluem um domínioextracelular possuindo uma região de repetição rica emleucina, um domínio de transmembrana e um domíniointracelular que inclui um domínio TIR.

Respostas Imunes Mediadas por TLR

Conforme usado aqui, o termo "sinalização de TLR"se refere a qualquer aspecto da sinalização intracelularassociado à sinalização através de um TLR. Conforme usadoaqui, o termo "resposta imune mediada por TLR" se refere àresposta imune que está associada à sinalização de TLR (porexemplo, é o resultado).

A resposta imune mediada por TLR7 é uma respostaassociada à sinalização de TLR7. Resposta imune mediada porTLR7 é caracterizada, geralmente pela indução de IFN-α ecitocinas induzíveis por IFN, tais como, EP-IO e I-TAC. Osníveis de citocinas IL-I α/β, IL-6, IL-8, ΜΙΡ-Ια/β e MIP-3α/β induzidos em uma resposta imune mediada por TLR7 sãoinferiores aos que foram induzidos em uma resposta imunemediada por TLR8.

A resposta imune mediada por TLR8 é uma respostaassociada à sinalização de TLR8. Essa resposta é carac-terizada pela indução de citocinas pró-inflamatórias, taiscomo, IFN-γ, IL-12p40/70, TNF-α, IL-I α/β, IL-6, IL-8, MIP-Iα/β e MIP-3 α/β.

A resposta imune mediada por TLR9 é uma respostaassociada à sinalização de TLR9. Essa resposta écaracterizada pelo menos pela produção e/ou secreção de IFN-γ e IL-12, embora em níveis inferiores aos obtidos atravésde uma resposta imune mediada por TLR8.

Liqante TLR7/8

Conforme usado aqui, um "ligante TLR7/8" serefere, coletivamente, a qualquer agente que seja capaz deaumentar a sinalização de TLR7 e/ou de TLR8 (isto é, umagonista de TLR7 e/ou TLR8). Assim, quando empregado naausência dos oligonucleotídeos adaptadores da invenção,alguns ligantes TLR7/8 induzem sinalização de TLR7 sozinho(por exemplo, ligantes específicos para TLR7), algunsinduzem sinalização de TLR8 sozinho (por exemplo, ligantesespecíficos para TLR8), e outros induzem ambas a sinalizaçãode TLR7 e de TLR8. Foi verif icado de acordo com a invençãoque, quando tais ligantes são combinados com nucleotídeosadaptadores, o perfil de sinalização de TLR desses ligantesé alterado. Em alguns casos, a sinalização de TLR7 é inibidae a sinalização de TLR8 é induzida. Em outros casos, asinalização de TLR8 é induzida (isto é, aumentada de umnível de base) ou aperfeiçoada (isto é, aumentada de umnível diferente do de base), e ainda em outras modalidades,ambas as sinalizações de TLR8 e TLR9 são induzidas oumelhoradas.Conforme usado aqui, o termo "ligante TLR7" serefere a qualquer agente que seja capaz de aumentarsinalização de TLR7 (isto é, um agonista de TLR7) . Comrelação a isso, o nivel de sinalização de TLR7 pode seraperfeiçoado em relação a um nivel preexistente desinalização ou pode ser induzido em relação a um nivel debase de sinalização. Os ligantes TLR7 incluem, semlimitação, análogos de guanosina tais como, guanosinassubstituídas C8, misturas de ribonucleosídeos consistindoessencialmente em G e U, ribonucleotídeos de guanosina e RNAou moléculas semelhantes a RNA (PCT/US03/10406), e compostoscom base em adenosina (por exemplo, 6-amino-9-benzil-2-(3-hidróxi-propóxi)-9H-purin-8-ol (CL-029, Sumitomo), 6-amino-9-benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol (mostrado na Figura 13D), eoutros compostos correlatos, tais como aqueles descritos naUS 6310070 BI). Os ligantes TLR7 também são revelados emGorden e outros, J. Immunol. 2005, 174:1259-1268 (porexemplo, 3M-001, N- [4-(4-amino-2-etil-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-l-il) butil-] metanossulfonamida; C17H23N5O2S; pesomolecular 361).

Conforme usado aqui, o termo "análogos deguanosina" se refere aos nucleotídeos semelhantes àguanosina (excluindo a guanosina) possuindo uma modificaçãoquímica envolvendo a base guanina, açúcar de nucleosídeo deguanosina ou ambos a base de guanina e o açúcar nucleosídeode guanosina. Análogos de guanosina incluem, especifi-camente, sem limitação, 7-deaza-guanosina.Os análogos de guanosina incluem, adicionalmente,guanosinas substituídas C8, tais como, 7-tia-8-oxoguanosina(imunosina), 8-mercaptoguanosina, 8-bromoguanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-diidroguanosina, C8-arilamino-2'-desoxiguanosina, C8-propinil-guanosina, e ribonucleosídeosde guanina substituídos com C8 e N7, tais como, 7-alil-8-oxoguanosina (Ioxoribina) e 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidróxi-2'-desoxiguanosina, 8-hidroxigua-nosina, e guanosina substituída 7-deaza 8.

Conforme usado aqui, o termo "ligante TLR8" serefere a qualquer agente que seja capaz de aumentarsinalização de TLR8 (isto é, um agonista de TLR8) . Comrelação a isso, o nível de sinalização de TLR8 pode seraperfeiçoado em relação a um nível preexistente desinalização ou pode ser induzido em relação a um nível debase de sinalização. Ligantes TLR8 incluem misturas deribonucleosídeos consistindo essencialmente em G e U,ribonucleotídeos de guanosina e RNA ou moléculas semelhantesà RNA (PCT/US03/104 06). Ligantes TLR8 adicionais são tambémrevelados em Gorden e outros J. Immunol. 2005, 174:1259-1268(por exemplo, 3M-002, 2-propiltiazol[4,5-c]quinolin-4-amina;Ci3Hi3N3S; peso molecular 243).

Alguns ligantes TLR7/8 são ligantes de ambos TLR7e TLR8. Esses incluem imidazoquinolinas, misturas deribonucleosídeos consistindo essencialmente em G e U,ribonucleotídeos de guanosina, e RNA ou moléculas seme-lhantes à RNA (PCT/US03/10406). Ligantes TLR7/8 adicionaissão também revelados em Gorden e outros J. Immunol. 2005,174:1259-1268 (por exemplo, 3M-003, hidrato de 4-amino-2-(etoximetil)-a,a-dimetil-6,7,8,9-tetraidro-lH-imidazo[4, 5-c] quinolina-l-etanol; C17H26N4O2; peso molecular 318).

As imidazoquinolinas são modificadores de respostaimune que se acredita induzam a expressão de váriascitocinas incluindo interferons (por exemplo, IFN-α), TNF-ae algumas interleucinas (por exemplo, IL-I, IL-6 e IL-12).As imidazoquinolinas são capazes de estimular uma respostaimune Thl, conforme evidenciado em parte por sua capacidadede induzir aumentos nos níveis de IgG2a. Os agentes deimidazoquinolina são também reportados como sendo capazes deinibir a produção das citocinas Th2, tais como, IL-4, IL-5 eIL-13. Algumas das citocinas induzidas por imidazoquinolinassão produzidas por macrófagos e células dendríticas. Algumasespécies de imidazoquinolinas foram reportadas comoaumentando a atividade litica na célula NK e estimulando aproliferação e diferenciação da célula B, pelo que,induzindo a produção e secreção de anticorpos.

Conforme usado aqui, as imidazoquinolinas incluemimidazoquinolina aminas, imidazopiridina aminas, cicloalqui-limidazopiridina aminas fundidas 6-7, e 1,2-imidazoquinolinaaminas ligadas em ponte. Esses compostos foram descritos nasPatentes US números 4689338, 4929624, 5238944, 5266575,5268376, 5346905, 5352784, 5389640, 5395937, 5494916,5482936, 5525612, 6039969 e 6110929. Espécies específicas deimidazoquinolinas incluem R-848 (S-28463); 4-amino-2-etoximetil-α, a-dimetil-lH-imidazo [ 4 , 5-c] quinolinas-l-etanol ;1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (R-837ou Imiquimod), e S-27609. Imiquimod é concorrentemente usadono tratamento tópico de verrugas, tais como, verrugasgenitais e anais e foi testado no tratamento tópico decarcinoma de célula basal.

Conforme usado aqui, o termo "ligante TLR9" serefere a qualquer agente que seja capaz de aumentar asinalização de TLR9 (isto é, um agonista de TLR9) . LigantesTLR9 incluem, especificamente, sem limitação, ácidosnucléicos imunoestimuladores, e especificamente ácidosnucléicos imunoestimuladores CpG.

Conforme usado aqui, o termo "ácidos nucléicos CpGimunoestimuladores" se referem a qualquer ácido nucléicocontendo CpG que seja capaz de ativar uma célula imune. Pelomenos o C do dinucleotideo CpG é típica, porém nãonecessariamente, não metilado. Ácidos nucléicos CpGimunoestimuladores são descritos em várias patentes emitidase pedidos de patente publicados incluindo as Patentes USnúmeros 6.194,388; 6.207.646; 6.218.371; 6.239.116;6.339.068; 6.406.705; e 6.429.199.

Em algumas modalidades, o ligante TLR é um liganteespecífico. Conforme usado aqui, um ligante TLR7 específicoé que, na ausência dos oligonucleotídeos adaptadores dainvenção, sinaliza através de TLR7, porém não de TLR8 ouTLR9. De modo semelhante, um ligante TLR8 específico é umque, na ausência dos oligonucleotídeos adaptadores dainvenção, sinaliza através de TLR8, porém'nãõ de TLR7 ou deTLR9. Preferivelmente, um ligante TLR7 específico sinalizaatravés de TLR7 e não através de outros TLRs, quando usadona ausência do oligonucleotídeo adaptador, e um ligante TLR8específico sinaliza através de TLR8 e não através de outrosTLRs quando usado na ausência do oligonucleotídeo adaptador.

Em algumas modalidades, o ligante TLR não é um RNA.

O emprego dos ligantes TLR7/8 com nucleotídeosadaptadores pode estimular ambos TLR8 e a TLR9, resultandonos efeitos a jusante de ambos receptores, concorrentemente.

Por exemplo, a estimulação de TLR9 pelo oligonucleotídeopode resultar, por exemplo, na produção de IFN-alfa,enquanto o estimulo de TLR8 pelo oligonucleotídeo poderesultar, por exemplo, na produção de TNF-alfa e IFN-gama.

Os ligantes e oligonucleotídeos podem ser conjugados entresi ou podem ser fisicamente separados um do outro.

Nucleotídeos Adaptadores

De acordo com a invenção, os ligantes TLR7/8 sãoempregados em combinação com nucleotídeos adaptadores. Umoligonucleotídeo adaptador, conforme usado aqui, é umoligonucleotídeo que, quando empregados com um liganteTLR7/8 modula a atividade daquele ligante por inibiçãosinalização de TLR7 por um ligante TLR7, indução dasinalização de TLR8 por um ligante TLR7, e/ouaperfeiçoamento da sinalização de TLR8 por um ligante quepode se ambos um ligante TLR7 e um ligante TLR8.

Conforme usado aqui, o termo oligonucleotídeo éempregado intercambiavelmente com o termo ácido nucléico.

Preferivelmente, o termo exclui plasmídeos, vetores e/ouácidos nucléicos anti-sentido. Em algumas modalidades, ooligonucleotídeo pode ser imumonodulador, enquanto em outrasmodalidades pode ser não-imumodulador quando usado sozinho.Os oligonucleotideos podem ter qualquer comprimento, porémpreferivelmente possuem 7 ou 8 até 100 nucleotideos decomprimento.

Uma ampla classe de nucleotideos adaptadorescompreende a fórmula 5' X -N4-X3' ou 5' X -N5-X3' onde Xpode ser qualquer nucleotideo e pode estar presente ouausente e N4 e N5 representam quatro e cinco T (timidina), U(uracil), ou A (adenina) contínuos, tal que, cada N em N4 ouN5 é idêntico. O oligonucleotídeo pode ter 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17 ou mais nucleotideos de comprimento.Ele preferivelmente compreende pelo" menos uma ligaçãofosforotioato internucleotídeo (até e incluindo umaestrutura completamente fosforotioada).

Assim, uma classe de nucleotideos adaptadorescompreende a fórmula 5' Xa-TTTTT-Xb 3', onde Xa e Xb podem serindependentemente, qualquer nucleotideo e podem estarpresentes ou ausentes. Xa e Xb podem representar um ou maisnucleotideos (por exemplo, 1-100 nucleotideos). 0oligonucleotídeo pode ter 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotideos decomprimento. 0 oligonucleotídeo pode compreender 6, 7 oumais Ts contínuos. Preferivelmente, o oligonucleotídeoadaptador é um dT homopolímero (isto é, oligo dT de umcomprimento citado aqui). Mesmo mais preferivelmente, ooligonucleotídeo adaptador é um homopolímero de timidina(dT) de 17 nucleotideos de comprimento. Mais preferível-mente, ele compreende pelo menos uma ligação internucleo-tideo fosforotioada (até e incluindo uma estruturacompletamente fosforotioada).

0 oligonucleotideo adaptador pode ser compreendidode 100% T, 99% T, 98% T, 97% T, 96% T, 95% T, 94% T, 93% T,92% T, 91% T, 90% T, 85% T, 80% T, 75% T, 70% T, 65% T, 60%T, 55% T, 50% T, 45% T ou menos, dependendo da modalidade.

Outra classe de nucleotideos adaptadores compreendea fórmula 5'Xa-UUUUU-Xb3' onde Xa e Xb podem serindependentemente, qualquer nucleotideo e podem estarpresentes ou ausentes. Xa e Xb podem representar um ou maisnucleotideos (por exemplo, 1-100 nucleotideos). Ooligonucleotideo pode ter 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotideos decomprimento. O oligonucleotideo pode compreender 6, 7 oumais Us contínuos. Em uma modalidade importante, o oligonu-cleotideo é um dU homopolímero que possui, preferivelmente,17 nucleotideos de comprimento e possuindo, pelo menos umaligação de internucleotídeo fosforotioada (até e incluindouma estrutura completamente fosforotioada)·.

O oligonucleotideo adaptador pode ser compreendidode 100% U, 99% U, 98% U, 97% U, 96% U, 95% U, 94% U, 93% U,92% U, 91% U, 90% U, 85% U, 80% U, 75% U, 70% U, 65% U, 60%U, 55% ü, 50% U, 45% U ou menos, dependendo da modalidade.

Ainda outra classe de nucleotideos adaptadorescompreende a fórmula 5' Xa-AAAAA-Xb3' onde Xa e Xb podem serindependentemente, qualquer nucleotideo e podem estarpresentes ou ausentes. Xa e Xb podem representar um ou maisnucleotídeos (por exemplo, 1-100 nucleotideos). Ooligonucleotídeo pode possúir 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou mais nucleotideos decomprimento. O oligonucleotídeo pode compreender 6, 7 oumais As contínuos. Em uma modalidade importante, ooligonucleotídeo é um dA homopolímero que possui preferivel-mente 17 nucleotídeos de comprimento e possuindo pelo menosuma ligação internucleotídeo fosforotioada (até e incluindouma estrutura completamente fosforotioada).

O oligonucleotídeo adaptador pode ser compreendidode 100% A, 99% A, 98% A, 97% A, 96% A5 95% A, 94% A, 93% A5,92% A5, 91% A5, 90% A5, 85% A, 80% A5, 75% A5, 70% A5, 65%A5, 60% A5, 55% A5, 50% A5, 45% A ou menos, dependendo damodalidade.

Outra classe de nucleotídeos adaptadores compreendea fórmula 5' Cn-Tm-Cp 3', onde η é um inteiro variando de 0-100 (por exemplo, 3-7), ρ é um inteiro variando de 0-100(por exemplo, 4-8), e m é um inteiro variando de 0-100 (porexemplo, 2-10). Preferivelmente, a soma de η e ρ é igual ouinferior ao valor de m, tal que, o teor de C é 50%, inferiora 50%, inferior a 45%, inferior a 40%, inferior a 35%,inferior a 30%, inferior a 25%, inferior a 20%, inferior a15%, inferior a 10%, inferior' a 5% ou menos. Em algumasmodalidades, η varia de 3-7, m varia de 2-10 e ρ varia de 4-8, contanto que as porcentagens acima sejam satisfeitas.Algumas espécies dessa fórmula são mostradas na Figura 8.Exemplos incluem 5' C3Ti0C4 3' (SEQ ID NO: 1), 5'C4T8C5 3'(SEQ ID NO: 2), 5' C5T6C6 3' (SEQ ID NO: 6), 5' C6T4C7 3' (SEQID NO: 7), e 5' C7T2C8 3' (SEQ ID NO: 8).

Em algumas modalidades, os oligonucleotideosadaptadores compreendem um motivo CpG imunoestimulador. 0motivo pode ser metilado ou desmetilado. No último exemplo,todo o oligonucleotídeo pode ser desmetilado ou porçõespodem ser desmetiladas, porém pelo menos o C de 5' CG 3'deve ser desmetilado. O motivo desmetilado e seus efeitos namodulação imune foram descritos extensivamente nas PatentesUS, tais como, US 6.194.388 BI; US 6.207.646 BI; US6.239.116 BI; e US 6.218.371 BI; e pedidos de patentepublicados, tais como, PCT/US98/03678, PCT/US98/10408,PCT/US98/04 7 03, e PCT/US99/09863. Todo o conteúdo dessaspatentes e pedidos de patente é incorporado aqui comoreferência.

Conforme declarado acima, os termos "oligonucleo-tídeo" e "ácido nucléico" são empregados intercambiavelmentepara significar nucleotídeos múltiplos (isto é, moléculascompreendendo um açúcar (por exemplo, ribose oudesoxiribose) ligadas a um grupo fosfato e a uma baseorgânica que pode ser trocada, sendo tanto uma pirimidina(por exemplo, citosina (C) , timidina (T) ou uracila (U)) ouuma purina (por exemplo, adenina (A) ou guanina (G)). Assim,o termo engloba tanto oligonucleotideos de DNA quanto RNA.Os termos também incluem polinucleosídeos (isto é, umpolinucleosídeo menos o fosfato) e qualquer outra baseorgânica contendo polímero. Oligonucleotideos podem serobtidos das fontes de ácido nucléico existentes (porexemplo, genônico ou cDNA), porém são preferivelmentesintéticos (por exemplo, produzidos por um sintetizador deácido nucléico).

Os oligonucleotideos podem ser de filamentosduplos ou de filamento simples. Em determinadas modalidades,quando o oligonucleotideo é de filamento simples, ele écapaz de formar estruturas secundárias e terciárias (porexemplo, por dobrar de volta sobre si mesmo, ou porhibridizar propriamente tanto completamente ou em segmentosselecionados ao longo de seu comprimento) . Consequentemente,embora a estrutura primária de tal oligonucleotideo possaser de filamento simples, suas estruturas de ordem maiorpodem ser de filamentos duplos ou triplos.

Os oligonucleotideos podem variar de comprimento,porém eles possuem um comprimento preferivelmente igual ouinferior a 100 nucleotideos (ou bases). Os oligonucleotideosadaptadores preferivelmente não são plasmideos ou vetores.Preferivelmente eles também não são capazes de atividadeanti-sentido ou pelo menos os efeitos que se manifestam deacordo com a invenção não estão relacionados a qualqueratividade anti-sentido.

Os oligonucleotideos podem ter estruturas modifi-cadas. Por exemplo, eles podem compreender pelo menos umaligação internucleotideo que não é uma ligação fosfodiéster.Tal ligação pode ser uma ligação fosforotioato. Em algumasmodalidades, os oligonucleotideos podem ter estruturasquiméricas (isto é, estruturas compreendidas de pelo menosdois tipos diferentes de ligações de internucleotideo).Conforme usado aqui, o termo "estrutura fosforo-tioada" se refere a uma estrutura de fosfato de açúcarestabilizada de um oligonucleotideo, onde um oxigêniofosfato não ligado em ponte é substituído por enxofre, empelo menos uma ligação de internucleotídeo. Em umamodalidade, um oxigênio de fosfato não ligado em ponte ésubstituído por enxofre em cada e todas as ligações deinternucleotídeo.

Fonte e Preparação de Oligonucleotídeos

Os oligonucleotídeos da presente invenção podemenglobar várias modificações e substituições químicas, emcomparação ao RNA e DNA naturais, envolvendo uma ponte deinternucleosídeo de fosfodiéster, . uma unidade de β-D-ribosee/ou uma base de nucleosídeo natural (adenina, guanina,citosina, timina, uracila) . Exemplos de modificações químicassão conhecidos dos versados na técnica e são descritas, porexemplo, em Uhlmann E. e outros (1990) Chem Rev 90:543;"Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis andProperties & Synthesis and Analytical Techniques, S.Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993; Crooke ST eoutros (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:107-29; eHunziker J e outros (1995) Mod Synth Methods 7:331-417. Umoligonucleotideo de acordo com a invenção pode ter uma oumais modificações, onde cada modificação está localizada emuma ponte de internucleosídeo de fosfodiéster específicae/ou em uma unidade de β-D-ribose específica e/ou em umaposição de base de nucleosídeo natural específica, emcomparação com o oligonucleotídeo da mesma seqüência eu écomposto de DNA ou RNA natural.

Por exemplo, os oligonucleotideos podem incluiruma ou mais modificações e onde cada modificação éselecionada independentemente de:

a) a substituição de uma ponte de internucleo-sideo fosfodiéster localizada nas extremidades 3' e/ou 5' deum nucleosideo por uma ponte de internucleosideo modificada,

b) a substituição da fonte de fosfotiéster,localizada nas extremidades 3' e/ou 5' de um nucleosideo poruma ponte desfosfo,

c) a. substituição de uma unidade fosfato deaçúcar da estrutura de fosfato de açúcar por outra unidade,

d) a substituição de uma unidade β-D-ribose poruma unidade de açúcar modificada, e

e) a substituição de uma base de nucleosideonatural por uma base de nucleosideo modificada.

Seguem-se exemplos mais detalhados da modificaçãoquímica de um oligonucleotídeo.

Os oligonucleotideos podem incluir ligações deinternucleotídeos modificadas, tais como as descritas em (a)o (b) acima). Essas ligações modificadas podem ser parcial-mente resistentes à degradação (por exemplo, são estabi-lizadas). Um "oligonucleotídeo estabilizado" significa umoligonucleotídeo que é relativamente resistente a umadegradação in vivo (por exemplo, através de exo ouendonuclease) resultando de tais modificações. Os oligonu-cleotideos que possuem ligações fosforotioato, em algumasmodalidades, podem prover atividade máxima e protegem ooligonucleotídeo da degradação por exo e endonucleasesintracelulares.

Uma ponte de internucleosídeo fosfodiéster locali-zada nas extremidades 3' e/ou 5' de um nucleosideo pode sersubstituída por uma ponte de internucleosídeo modificado,onde a ponte de internucleosídeo modificado é selecionada,por exemplo, de fosforotioato, fosforoditioato, NR1R2-fosforamidato, boranofosfato, α-hidroxibenzil fosfonato,éster fosfato-O-alquila (Ci-C2i) , éster fosfato-[aril (C6-Ci2) -O-alquil (C1-C2I) ] , alquilfosfonato (Ci-C8) e/ou pontesarilfosfonato (C6-Ci2) , α-hidroximetil-aril (C7-Ci2), (porexemplo, conforme revelado no WO 95/01363) , onde arila (C6-C12) , arila (C6-C20) e arila (C6-Ci4) são opcionalmentesubstituídas■por halogênio, alquila, alcóxi, nitro, ciano eonde R1 e R2 são, independentemente, hidrogênio, alquila (C6-Ci8), arila (C6-C20), aril- (C6-C20) -alquila- (Ci-C8) , preferi-velmente hidrogênio, alquila (C1-C8) , preferivelmentealquila- (Ci-C4) e/ou metoxietila ou R1 e R2 formam, emconjunto com o átomo de nitrogênio que transporta os mesmos,um anel heterociclico.de 5-6 elementos, que pode conter,adicionalmente, um heteroátomo adicional do grupo 0, SeN.

A ponte de fosfodiéster localizada nas extremidades3' e/ou 5' de um nucleosideo pode ser substituída por umaponte de defosfo (as pontes defosfo são descritas, porexemplo, em Uhlmann E e Peyman A em "Methods in MolecularBiology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides andAnalogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993,capítulo 16, pp. 355 ff), onde uma ponte defosfo é selecio-nada, por exemplo, de 3'-tioformacetal, metilidroxilamina,oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetilenossulfona e/ougrupos silila.

A unidade de açúcar fosfato (isto é, uma β-D-ribose e ponte de internucleosídeo fosfodiéster em conjuntoformando uma unidade de açúcar fosfato) da estrutura deaçúcar fosfato (isto é, uma estrutura de açúcar fosfato écomposta de unidades de açúcar fosfato) pode ser substituídapor outra unidade, onde a outra unidade é, por exemplo,apropriada para formação de um oligômero "derivado demorfolino" (conforme descrito, por exemplo, em Stirchak EP eoutros (1989) Nucleic Acids Res 17:6129-41), que é, porexemplo, a substituição com uma unidade derivada de morfo-lino, ou para formação de um ácido nucléico de poliamida,("PNA"; conforme descrito, por exemplo, em Nielsen PE eoutros (1994) Bioconjug Chem 5:3-7), que é, por exemplo, asubstituição com uma unidade de estrutura de PNA, porexemplo, 2-aminoetilglicina. 0 oligonucleotídeo pode teroutras modificações e substituições da estrutura decarboidrato, tais como, ácidos nucléicos peptídicos comgrupos fosfato (PHONA), ácidos nucléicos travados (LNA), eoligonucleotídeos possuindo seções de estrutura com ligantesalquila ou ligantes amino. 0 ligante alquila pode serramificado ou não ramificado, substituído ou não substituídoe uma mistura racêmica ou quiralmente pura.

A unidade de β-ribose ou a unidade de β-ϋ-2'-desoxiribose pode ser substituída por uma unidade de açúcarmodificado, onde a unidade de açúcar modificado éselecionada, por exemplo, de ß-D-ribose, a-D-2'-desoxi-ribose, L-2'-desoxiribose, 2'-F-2'-desoxiribose, 2'-F-arabinose, 2' -O-alquil (C1-C6) -ribose, 2'-O-metilribose, 2'-O-alquenil (C2-C6) -ribose, 2' - [O-alquil (C1-C6) -O-alquil (C1-C6) ]-ribose, T-NH2-2'-desoxiribose, ß-D-xilo-furanose, a-arabinofuranose, 2,4-didesóxi~p-D-eritro-hexo-piranose, ecarbociclica (descritas, por exemplo, em Froehler (1992) JAm Chem Soc 114:8320) e/ou análogos de açúcar de cadeiaaberta (descritos, por exemplo, em Vandendriessche e outros(1993) Tetrahedron 49:7223) e/oü análogos de biciclo açúcar(descritos, por exemplo, em Tarkov M e outros (1993) HelvChim Acta 76:481).

Em algumas modalidades, o açúcar modificado é umaribose 2' modificada. Em algumas modalidades o açúcar é 2'-O-metilribose, especificamente para um ou ambos osnucleotideos ligados por um fosfodiester ou uma ligação deinternucleosideo semelhante a fosfodiester.

Ácidos nucléicos também incluem purinas epirimidinas substituídas, tais como, C-5 propina pirimidinae bases modificadas com purina substituída 7-deaza-7. WagnerRW e outros (1996) Nat Biotechnol 14:840-4. As purinas epirimidinas incluem, porém não estão limitadas à adenina,citosina, guanina, e timina e outras nucleobases que nãoocorrem naturalmente, frações aromáticas substituídas e nãosubstituídas.

Uma base modificada é qualquer base que sejaquimicamente distinta das bases ocorrendo naturalmente,tipicamente encontradas no DNA e RNA, tais como, T, C, G, A,e U, porém que compartilham estruturas químicas básicas comessas bases que ocorrem naturalmente. A base de nucleosídeomodificada pode ser, por exemplo, selecionada de hipoxan-tina, uracila, diidrouracila, pseudouracila, 2-tiouracila,4-tiouracila, 5-aminouracila, 5-alquil(C1-C6)-uracila, 5-alquenil (C2-C6)-uracila, 5-alquil (C2-C6)-uracila, 5-(hidroxi-metil)uracila, 5-clorouracila, 5-fluoruracila, 5-bromoura-cila, 5-hidroxicitosina, 5-alquil(C1-C6) -citosina, 5-alquenil (C2-C6)-citosina, 5-alquil (C2-C6)-citosina, 5-cloro-citosina, 5-fluorcitosina, 5-bromocitosina, N-dimetil-guanina, 2,4-diamino-purina, 8-azapurina, uma 7-deazapurinasubstituída, preferivelmente purina substituída 7-deaza-7e/ou 7-deaza-8, 5-hidroximetilcitosina, N4-alquilcitosina,por exemplo, N4-etilcitosina, 5-hidroxidesoxicitidina, 5-hidroximetildesoxicitidina, · N4-alquildesoxicitidina, porexemplo, N4-etildesoxicitidina, 6-tiodesoxiguanosina, edesoxiribonucleosídeos de nitropirrol, C5-propinilpiri-midina, e diaminopurina, por exemplo, 2,6-diaminopurina,inosina, 5-metilcitosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloro-purina, hipoxantina ou outras modificações de uma base denucleosídeo natural. A lista é apenas exemplar e não deveser interpretada como limitante.

Nas fórmulas específicas descritas aqui, as basesmodificadas podem ser incorporadas. Por exemplo, a citosinapode ser substituída por uma citosina modificada. Umacitocina modificada, conforme usada aqui é um análogo debase de pirimidina ocorrendo naturalmente ou não natu-ralmente de citocina que pode substituir a base semprejudicar a atividade imumnoestimuladora do oligonucleo-tideo. As citosinas modificadas incluem, porém não estãolimitadas às citocinas substituídas 5, (por exemplo, 5-metil-citosina, 5-flúor-citosina, 5-cloro-citosina, 5-bromo-citosina, 5-iodo-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroxi-metil-citosina, 5-difluormetil-citosina, e 5-alquil-citosinasubstituída ou não substituída), citosinas substituídas 6,citosinas N4 substituídas (por exemplo, N4-etil-citosina) ,5-aza-citosina, 2-mercapto-citosina, isocitosina, pseudo-isocitosina, análogos de citosina com sistemas de anelcondensado (por exemplo, N,N'-propileno citosina oufenoxazina), e uracila e seus derivados (por exemplo, 5-flúor—uracil, 5—bromo-uracil, S-bromovinil-uracil, 4-tio—uracil, 5-hidróxi-uracil, 5-propinil-uracil). Algumas dascitosinas preferidas incluem 5-metil-citosina, 5-flúor-citosina, 5-hidróxi-citosina, 5-hidroximetil-citosina, e N4-etil-citosina. Em outra modalidade da invenção, a basecitosina é substituída por uma base universal (por exemplo,3-nitropirrol, base-P), um sistema de anel aromático (porexemplo, fluorbenzeno ou difluorbenzeno) ou um átomo dehidrogênio (dSpacer).

Como outro exemplo, a guanina pode ser substituídapor uma base guanina modificada. Uma guanina modificadaconforme usado aqui, é um análogo de base purina de guaninaocorrendo naturalmente ou não ocorrendo naturalmente, quepode substituir essa base sem prejudicar a atividadeimunoestimuladora do oligonucleotídeo. Guaninas modificadasincluem, porém não estão limitadas as 7-deazaguanina, guanina7-deaza-7 substituída (tal como, 7-deaza-7-alquinil(C2-C6)guanina), guanina 7-deaza-8 substituída, hipoxantina,guaninas N2-substituídas, (por exemplo, N2-metil-guanina),5-amino-3-metil-3H,6H-tiazol [4,5-d]pirimidina-2,7-diona,

2, 6-diaminopurina, 2-aminopurina, purina, indol, adenina,adeninas substituídas (por exemplo, N6-metil-adenina, 8-oxo-adenina), guanina 8 substituída (por exemplo, 8-hidroxi-guanina e 8-bromoguanina), e 6-tioguanina. Em outramodalidade da invenção, a base guanina base é substituídapor uma base universal (por exemplo, 4-metil-indol, 5-nitro-indol, e base-K), um sistema de anel aromático (por exemplo,benzimidazol ou dicloro-benzimidazol, amida do ácido 1-metil-lK-[1,2,4]triazol-3-carboxílico) ou um átomo dehidrogênio (dSpacer).

Para emprego na presente invenção, os oligonu-cleotídeos da invenção podem ser sintetizados de novoempregando qualquer um dos vários procedimentos bemconhecidos na técnica incluindo, por exemplo, o método de β-cianoetil fosforamidita (Beaucage SL e outros (1981)Tetrahedron Lett 22:1859), ou o método de H-fosfonato denucleosídeo (Garegg e outros (1986) Tetrahedron Lett27:4051-4; Froehler BC e outros (1986) Nucleic Acids Res14:5399-407; Garegg e outros (1986) Tetrahedron Lett27:4055-8; Gaffhey e outros (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22) . Essas químicas podem ser realizadas por váriossintetizadores de ácido nucléico automatizados disponíveiscomercialmente. Esses oligonucleotídeos são referidos comooligonucleotídeos sintéticos. Um oligonucleotideo isolado serefere, geralmente, a um oligonucleotideo que é separado doscomponentes aos quais ele está normalmente associado nanatureza. Como um exemplo, o oligonucleotideo pode ser umque seja separado de uma célula, de um núcleo, dosmitocôndrios ou da cromatina.

Estruturas modificadas, tais como, fosforotioatospodem ser sintetizadas empregando técnicas automatizadas queutilizam tanto químicas de fosforamidato quanto H-fosfonato.

Fosfonatos de arila e alquila podem ser fabricados, porexemplo, conforme descrito na Patente US número 4.469.863; ealquilfosfotriesteres (onde a fração de oxigênio carregada éalquilada, conforme descrito na Patente US número 5.023.243e Patente Européia número 092.574) podem ser preparados porsíntese de fase sólida automatizada empregando reagentescomercialmente disponíveis. Os métodos para fabricação deoutras modificações e substituições de estrutura de DNAforam descritos (por exemplo, Uhlmann E e outros (1990) ChemRev 90:544; Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1:165).

Isolados

Em determinadas modalidades os ligantes TLR7/8e/ou os oligonucleotídeos adaptadores são isolados. Umligante ou oligonucleotideo isolado é um ligante ouoligonucleotideo que é substancialmente puro ou está livrede outra substâncias com as quais é normalmente encontradona natureza ou em sistemas in vivo de modo prático eapropriado para seu uso pretendido. Especificamente, oligante ou oligonucleotideo é suficientemente puro esuficientemente isento de outros constituintes biológicosdas células, de modo a ser útil, por exemplo, na produçãodas preparações farmacêuticas. Uma vez que um ligante ouoligonucleotideo isolado pode ser misturado com um veiculofarmaceuticamente aceitável em uma preparação farmacêutica,o ligante ou oligonucleotideo pode compreender apenas umapequena porcentagem em peso da preparação. O ligante ou ooligonucleotideo não obstante é isolado, pelo fato de tersido substancialmente separado das substâncias com as quaisele pode estar associado nos sistemas vivos.

Conjugados

Conforme usado aqui, o termo "conjugado" se referea qualquer combinação de duas ou mais partes de componenteque sejam ligadas, direta ou indiretamente, através dequalquer interação fisico-quimica. Em uma modalidade, oconjugado é uma combinação de duas ou mais partes decomponentes que são ligados em conjunto, direta ouindiretamente, através da ligação covalente.

Em um aspecto a invenção provê uma composiçãoincluindo um conjugado de um ligante TLR e um oligonu-cleotideo adaptador. Em uma modalidade o conjugado éfabricado através de uma ligação covalente. Em uma modali-dade o conjugado compreende um ligante.

O conjugado pode incluir um ou mais nucleotideosadaptadores e um ou mais ligantes TLR7/8 da invenção. 0conjugado pode incluir, alternativa ou adicionalmente, umaou mais outras moléculas incluindo, porém não limitadas aosantigenos ou outros medicamentos.As Figuras 13-15 ilustram muitos aspectos de taisconjugados incluindo pontos de anexação em ambos os ligantese os oligonucleotideos e o uso opcional dos ligantes parafacilitar tal conjugação.

Em uma modalidade, o conjugado é um conjugado deum oligonucleotideo adaptador e determinados ligantes TLR7específicos, tais como, porém não limitados à imunosina ouloxoribina. O oligonucleotideo adaptador pode ser, porém nãoestá limitado a um poli(dT) oligonucleotideo variando de 8-20, preferivelmente 10-20, e mais preferivelmente de 14-18nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, osconjugados dos nucleotídeos adaptadores e determinadosligantes TLR7/8, tais como, imidazoquinolinas e guanosinassubstituídas CS sao excluídos, especificamente se ooligonucleotideo adaptador for propriamente imunoestimuladorou sinalizar através de TLR9.

As Figuras 13A-C ilustram a estrutura da imuno-sina, bem como as duas variantes monoméricas da mesma quepodem ser usadas no processo de conjugação. A variantemostarda' na Figura 13B pode ser conjugada em umoligonucleotideo em uma posição interna ou na extremidade3'. Assim, podem existir uma ou mais dessas variantesanexadas a um oligonucleotideo. A variante mostrada naFigura 13C pode ser conjugada a um oligonucleotideo naextremidade 5' . A Figura 14 ilustra a conjugação daimunosina em um oligonucleotideo usando um ligante. A Figura15 ilustra os pontos de anexação em R-848, CL-029 eimunosina aos quais os ligantes e/ou oligonucleotideos podemser conjugados. Os conjugados da invenção podem compreender1, 2, 3, 4, 5, ou mais ligantes, ou alternativamente, elespodem não apresentar ligantes. Um exemplo de um conjugado époli (dT) I4-L2-IM (onde L representa um ligante e IMrepresenta imunosina e o subscrito indica o número de cadaunidade no conjugado) (SEQ E) NO: 9). Outro exemplo é IM-L2-(dT)i4 (SEQ ID NO: 10). A diferença entre esses exemplos é acolocação da imunosina e os ligantes tanto na extremidade 3'quanto na extremidade 5'.

Os ligantes podem ser anexados a qualquer fraçãoreativa no oligonucleotideo incluindo, porém não limitado aum grupo fosfato de estrutura o um grupo açúcar hidroxila.Por exemplo, eles podem ser incorporados através dofosfodieξter, fosforotioato, metilfosfonato e/ou ligaçõesamida.

Os ligantes podem não ser nucleotideos pornatureza. Esses incluem, por exemplo, resíduos abáticos(dSpacer), oligoetilenoglicol, tais como, trietilenoglicol(espaçador 9) ou. hexaetilenoglicol (espaçador 18), oualcano-diol, tal como, butanodiol. Os ligantes podem seranexados um ao outro por ligações fosfodiéster ou fosfo-rotioato. Outros ligantes são ligantes alquilamino, taiscomo, ligantes amino C3, C6, C12 e também ligantesalquiltiol, tais como, ligantes C3 ou C6 tiol. Tiposdiferentes de ligantes podem também ser usados em umconjugado.

Os oligonucleotídeos podem ser ligados por resíduosaromáticos que podem ser adicionalmente substituídos porgrupos alquila ou alquila substituídos. Os oligonucleotídeostambém podem conter uma unidade duplicadora ou triplicadora,que permite conjugação de múltiplos ligantes de um ou detipos diferentes ao oligonucleotideo. Os oligonucleotídeostambém podem conter ligante resultante de reagentes demodificação de peptídeo ou reagentes de modificação deoligonucleotideo. Adicionalmente, eles podem conter um oumais resíduos de aminoácido naturais ou não naturais que sãoconectados por ligações de peptídeo (amida).

Os oligonucleotídeos diferentes são sintetizadospor métodos estabilizados e podem ser ligados em conjunto emlinha durante a síntese de fase sólida. Alternativamente,eles podem ser ligados em conjunto, seguindo-se a síntesedas unidades individuais.

Respostas Imunes

Em uma modalidade, a resposta imune mediada porTLR é a resposta imune semelhante a Thl. Conforme usadoaqui, o termo "semelhante a Thl" se refere a qualqueraspecto característico de uma resposta imune Thl. Umaresposta imune Thl pode incluir, caracteristicamente,indução de determinadas citocinas, tais como, IFN-γ,secreção (nos camundongos) de imunoglobulinas IgG2a eativação de macrófago. O termo "semelhante a Thl" contrastacom o termo "semelhante a Th2", que se refere ao fato depossuir um aspecto característico de uma resposta imune Th2,conforme discutido a seguir.

Uma resposta imune semelhante a Thl pode incluir aexpressão de qualquer uma das determinadas citocinas equimiocinas, incluindo IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TNF-α, IL-12,IL-18, IP-IO e qualquer combinação das mesmas, que sãocaracteristicamente associadas a uma resposta imune Thl.

Acredita-se que as respostas imunes Thl e as respostasimunes Th2 sejam contadoras-reguladoras. Em algumasconcretizações, a resposta imune semelhante a Thl podeincluir supressão de determinadas citocinas Th2 associadas,incluindo IL-4, IL-5, IL-10, e IL-13. A resposta imunesemelhante a Thl pode incluir expressão de determinadosisotipos de anticorpo, incluindo (nos camundongos) IgG2a,com ou sem supressão de determinados isotipos de anticorpoassociados a Th2, incluindo IgE e (nos camundongos) IgGl. Emuma modalidade, uma resposta imune semelhante a Thl é umaresposta Th1.

Uma resposta imune semelhante a Th2 pode incluirexpressão de quaisquer de determinadas citocinas e quimio-cinas, incluindo IL-4, IL-5, IL-10, IL-13, e qualquercombinação das mesmas, que são caracteristicamente associa-das à resposta imune Th2. Em algumas modalidades a respostaimune semelhante a Th2 pode incluir supressão dedeterminadas citocinas associadas ao Thl. A resposta imunesemelhante a Th2 pode incluir expressão de determinadosisotipos de anticorpo, incluindo IgE e (no camundongo) IgGl,com ou sem supressão de determinados isotipos de anticorpoassociados a Thl, incluindo (no camundongo) IgG2a. Em umamodalidade a resposta imune semelhante a Th2 é uma resposta Th2.Assim, em uma modalidade, a invenção provê uramétodo para induzir uma resposta imune semelhante a Thl emum indivíduo. A indução de uma resposta imune semelhante aThl inclui aumento ou melhora da resposta imune semelhante aThl. 0 método inclui a etapa de administração a um indivíduode uma quantidade eficaz de um ligante TLR7/8 e dooligonucleotídeo adaptador da invenção, para induzir aresposta imune semelhante a Thl no indivíduo.

Em uma modalidade a invenção provê um método parasuprimir a resposta imune semelhante a Th2 em um indivíduo.0 método inclui a etapa de administração a um indivíduo deuma quantidade eficaz de um ligante TLR7/8 e oligonu-cleotídeo adaptador da invenção para suprimir a respostaimune semelhante a Th2 no indivíduo. Tal método podeencontrar uso específico no tratamento de indivíduos queapresentam ou estão em risco de apresentar uma condiçãocaracterizada por uma resposta imune com o caráterpredominante de Th2. Tais condições incluem, sem limitação,alergia e asma.

Em uma modalidade a resposta imune envolve supra-regulação dos marcadores da superfície da célula de ativaçãoda célula imune, tais como, CD25, CD80, CD86, e CD 154. Osmétodos para medir a expressão da superfície da célula detais marcadores são bem conhecidos na técnica e incluemanálise FACS.

Para medição da resposta imune em uma célula oupopulação de células, em uma modalidade, a célula oupopulação de células, expressa pelo menos um e em algunsexemplos preferivelmente apenas um dentre TLR7, TLR8, ouTLR9. A célula pode expressar o TLR naturalmente ou pode sermanipulada para expressar o TLR através da introdução nacélula de um vetor de expressão apropriado para TLR. Em umamodalidade, a célula ou população de células é obtida comocélulas mononucleares de sangue periférico (PBMC). Em umamodalidade, a célula ou população de células é obtida comouma linhagem de célula expressando o TLR. Em uma modalidadea célula ou população de células é obtida como uma linhagemde célula estavelmente transfectada com um TLR.

Também para uso na medição de uma resposta imuneem uma célula ou população de células, pode ser convenienteintroduzir na célula ou população de células uma construçãorepoter, isto e, sensivel a (isto e, regulada por)sinalização intracelular por um TLR. Em uma modalidade, talrepórter é um gene colocado sob o controle de um promotorNF-κΒ. Em uma modalidade, o gene colocado sob controle dopromotor é luciferase, embora outros genes repórteres possamser empregados incluindo proteína fluorescente verde (GFP),β-galactosidase, fosfatase alcalina e semelhantes. Sobcondições de ativação apropriadas, como um exemplo, aconstrução repórter luciferease é expressa e emite um sinalde luz detectável que pode ser medido quantitativamenteempregando um luminômetro. Essas e outras construçõesrepórter são comercialmente disponíveis. Em outras modali-dades, as respostas imunes mediadas por TLR podem sermedidas por produção (RNAm ou proteína) ou secreção decitocinas, tais como, IFN-α, TNF-a, IL-12, IFN-γ esemelhantes. Os exemplos demonstram esses tipos de ensaio. Ainvenção também contempla o uso de métodos livres de célulade detecção de ativação de TLR.

A invenção também inclui um método para induzirrespostas imunes especificas para antigeno (conformedescrito em mais detalhes a seguir) e ativação imune inatanão especifica e resistência de amplo espectro ao desafioinfeccioso. 0 termo ativação imune inata não especifica deantigeno, conforme empregada aqui, se refere à ativação dascélulas imunes diferentes de B incluindo células NK, célulasT ou outras células imunes que possam responder em um modoindependente do antigeno ou alguma combinação dessascélulas. Uma resistência de amplo espectro ao desafioinfgccícso é induzida umci vsz cjuis 3. s células imunss estso n.sforma ativa e são iniciadas para responder a qualquerinvasão de composto ou microorganismo. As células nãoprecisam ser especificamente iniciadas contra um antigenoespecifico. Isso é especificamente útil em guerrasbiológicas e as outras circunstâncias descritas acima, taiscomo, viajantes.

Indivíduos

Conforme usado aqui, um indivíduo se refere a umvertebrado humano ou não humano. Vertebrados não humanosincluem animais de criação, animais domésticos e animais delaboratório. Indivíduos não humanos também incluem,especificamente, primatas não humanos, bem como roedores.Indivíduos não humanos também incluem, especificamente, semlimitação, galinhas, cavalos, bois, porcos, cabras, cães,gatos, porquinhos da índia, hamsters, visão e coelhos.

Conforme usado aqui, um indivíduo em risco dedesenvolver uma condição se refere a um indivíduo com umaexposição conhecida ou suspeita a um agente conhecido porcausar ou estar associado à condição ou uma predisposiçãoconhecida ou suspeita de desenvolver a condição (porexemplo, um marcador genético ou um histórico de família dacondição).

Em um aspecto a invenção provê um método paratratar um indivíduo possuindo deficiência do sistema imune.O método de acordo com esse aspecto da invenção inclui aetapa de administração ao indivíduo de uma quantidade ativade uma composicao da invencao para tratar o individuo. Adeficiência do sistema imune, conforme empregada aqui, serefere a uma capacidade anormalmente diminuída da capacidadedo sistema imune de montar uma resposta imune a um antígeno.

Em uma modalidade, uma deficiência do sistema imune é umadoença o transtorno onde o sistema imune do indivíduo nãoestá funcionando em capacidade normal ou onde seria útilpara reforçar a resposta imune do indivíduo, por exemplo,para eliminar um tumor ou câncer ou uma infecção noindivíduo. Um indivíduo possuindo uma deficiência imune,conforme usado aqui, se refere a um indivíduo onde existeuma capacidade diminuída do sistema imune de montar umaresposta imune, por exemplo, a um antígeno. Os indivíduospossuindo uma deficiência imune incluem indivíduos possuindouma deficiência imune adquirida, bem como indivíduospossuindo uma deficiência congênita do sistema imune. Osindivíduos possuindo deficiência imune adquiria incluem, semlimitação, indivíduos possuindo uma condição inflamatóriacrônica, indivíduos possuindo insuficiência renal crônica oufalência renal, indivíduos possuindo infecção, indivíduoscom câncer, indivíduos recebendo medicamentos imunosupres-sivos, indivíduos recebendo outro tratamento imunosupressivoe indivíduos com nutrição ruim. Em uma modalidade, oindivíduo possui uma população de células T CD4+. Em umamodalidade, o indivíduo possui uma infecção com vírus daimunodeficiência humana (HIV) ou síndrome da imunode-ficiência adquirida (AIDS). 0 processo de acordo com esseaspecto da invenção provê, assim, um método para reforço daresposta imune ou reforço da capacidade de montar umaresposta imune em um indivíduo que precise de uma respostaimune mais vigorosa.

Conforme usado aqui, inibe significará um resultadoou efeito comparado ao normal.

Conforme usado aqui, tratar conforme empregado nareferência a uma doença ou condição significará a inter-venção em tal doença ou condição, de modo a prevenir outornar lento o desenvolvimento, prevenir ou tornar lenta aprogressão, impedindo a progressão ou eliminando a doença oucondição. Por exemplo, o tratamento do câncer inclui aprevenção do desenvolvimento de um câncer (por exemplo, deum estado pré-cancerígeno), redução dos sintomas do câncere/ou inibição do crescimento de um câncer estabelecido.Condições

A invenção pretende tratar condições que sebeneficiariam da inibição e/ou indução de determinadasrespostas imunes mediadas por TLR. Conforme empregado aqui,uma condição associada à resposta imune ou imunoestimulaçãomediada por TLR7 se refere a qualquer doença ou outracondição em um indivíduo onde exista ativação imune,associada à sinalização de TLR7, e tal ativação sendoprejudicial. Tais condições envolvem, tipicamente, aativação de sinalização de TLR7, em resposta ao contato comum ligante TLR7.

Conforme empregado aqui, uma condição associada àresposta imune ou imunoestimulação mediada por TLR8 serefere a qualquer doença ou outra condição em um indivíduoonde exista ativação imune, associada à sinalização de TLR8,e tal ativação sendo prejudicial. Tais condições envolvem,tipicamente, a ativação de sinalização de TLR8, em respostaao contato com um ligante TLR8.

Conforme empregado aqui, uma condição associada àresposta imune ou imunoestimulação mediada por TLR9 serefere a qualquer doença ou outra condição em um indivíduoonde exista ativação imune, associada à sinalização de TLR9,e tal ativação sendo prejudicial. Tais condições envolvem,tipicamente, a ativação de sinalização de TLR9, em respostaao contato com um ligante TLR9.

Infecção

A invenção pode ser empregada para tratar condi-ções, tais como, infecção. Infecção se refere à qualquercondição onde existe um grupo anormal ou população demicróbios intracelulares ou extracelulares em um indivíduo.Tais micróbios podem ser endógenos ao indivíduo ou podem serestranhos ao indivíduo. Um indivíduo com uma infecção é umindivíduo que possui um distúrbio surgindo da invasão doindivíduo, superficial, local, ou sistemicamente, por ummicroorganismo infeccioso ou de crescimento supra-reguladoanormal ou micróbios endógenos ocorrendo naturalmente noindivíduo.O microorganismo infeccioso pode ser um vírus,bactéria, fungos ou parasita, conforme descrito acima.Vários tipos de micróbios podem causar infecção, incluindomicróbios que são bactérias, micróbios que são vírus,micróbios que são fungos e micróbios que são parasitas.

As bactérias são organismos unicelulares que semultiplicam assexuadamete por cissiparidade binária. Elassão classificadas e denominadas com ase em sua morfologia,reações a coloração, nutrição e requisitos metabólicos,estrutura antigênica, composição química e homologiagenética. As bactérias podem ser classificadas em trêsgrupos, com base em suas formas morfológicas, esférica(cocos), bastão reto (bacilo) e bastão curvo ou espiral(víbrio, campylobacter, espirilo e espiroquete) . Asbactérias são também mais .comumente caracterizadas com baseem suas reações a coloração em duas classes de organismos,gram-positivo e gram-negativo. Gram se refere ao método decoloração que é geralmente realizado nos laboratórios demicrobiologia. Organismos gram-positivos retêm a coloraçãoseguindo-se o procedimento de coloração e apresentam uma corvioleta forte. Os organismos gram-negativos não retêm acoloração, porém absorvem a coloração contadora e assimapresentam cor rosa.

As bactérias infecciosas incluem, porém não estãolimitadas às bactérias gram negativas e gram positivas. Asbactérias gram positivas incluem, porém não estão limitadasàs espécies Pasteurella, espécies Staphylococci e espéciesStreptococcus. As bactérias gram negativas incluem, porémnão estão limitadas às espécies Eseheriehia eoli, espéciesPseudomonas, e espécies Salmonella. Exemplos específicos debactérias infecciosas incluem, porém não estão limitados aHelieobaeter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionellapneumophilia, Myeobaeteria sps (por exemplo, M. tubereulosis,M. avium, M. intracellular, M. kansasii, M. gordonae),Staphylococeus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseriameningitidis, Listeria monoeytogenes, Streptococcus pyogenes(Streptococeus do grupo A), Streptoeoeeus agalaetiae(Streptoeoeeus do Grupo Β) , Streptoeoeeus (grupo viridans) ,Streptoeoeeus faeealis, Streptoeoeeus bovis, Streptoeoeeus(espécies anaeróbicas), Streptoeoeeus pneumoniae,Campylobaeter sp. patogênico, Enteroeoeeus sp., Haemophilusinfluenzae, Baeillus anthraeis, Corynebaeterium diphtheriae,Corynebaeterium sp. , Erysipelothrix rhusiopathiae,Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Enterobaeteraerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multoeida,Baeteroides sp., Fusobacterium nueleatum, Streptobacillusmoniliformis, Treponema pallidum, Treponema pertenue,Leptospira, Riekettsia, e Aetinomyees israelii.As bactérias incluem, porém não estão limitadas asespécies Pasteurella, espécies Staphylococci, espéciesStreptococcus, espécies Eseheriehia eoli, Pseudomonasr eespécies Salmonella. Exemplos específicos de bactériasinfecciosas incluem, porém não estão limitados aHelieobaeter pyloris, Borrelia burgdorferi, Legionellapneumophilia, Myeobaeteria sps (por exemplo, M.tubereulosis, M. aviumf M. intraeellular, M. kansasii, M.gordonae), Staphyloeoeeus aureus, Neisseria gonorrhoeae,Neisseria meningitidis, Listeria monoeytogenes,Streptoeoeeus pyogenes (Streptoeoeeus Grupo A),Streptoeoeeus agalaetiae (Streptoeoeeus Grupo Β) ,Streptoeoeeus (grupo viridans), Streptoeoeeus faeealis,Streptoeoeeus bovis, Streptoeoeeus (especies snserobicss),Streptoeoeeus pneumoniae, Campylobaeter sp. patogênico,Enteroeoecus sp. , Haemophilus influenzae, Bacillusanthraeis, Corynebaeterium diphtheriaer Corynebaeterium sp. ,Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens,Clostridium tetani, Enterobaeter aerogenes, Klebsiellapneumoniae, Pasturella multoeida, Baeteroides sp. ,Fusobaeterium nueleatum, Streptobacillus moniliformis,Treponema pallidum, Treponema pertenue, LeptospirafRiekettsia, e Actinomyees israelii.

Os vírus são pequenos agentes infecciosos quegeralmente contêm um núcleo de ácido nucléico e umrevestimento de proteína, porém não são independentementeorganismos vivos. Os vírus podem também tomar a forma deácidos nucléicos infecciosos sem uma proteína. Um vírus nãopode sobreviver na ausência de uma célula viva dentro daqual ele se replica. Os virus entram nas células vivasespecificas tanto por endocitose quanto por injeção diretado DNA (fago) e se multiplicam, causando a doença. Os virusmultiplicados podem então ser liberados e infectam célulasadicionais. Alguns virus são virus contendo DNA e outros sãovirus contendo RNA. Em alguns aspectos, a invenção tambémpretende tratar doenças nas quais os Prions estão implicadosna progressão da doença, tal como, por exemplo,encefalopatia bovina espongiforme (isto é, doença da vacalouca, BSE) ou infecção em animais por fragmentos, ou doençade Creutzfeldt-Jakob nos seres humanos.

Virus incluem, porém não estão limitados aosenterovirus (incluindo, porém não estando limitados aos dafamilia picornaviridae, tais como, virus da pólio, virusCoxsackie, virus Echo), rotavírus, adenovirus, virus dahepatite. Exemplos específicos de vírus que foram encon-trados nos seres humanos incluem, porém não estão limitadosaos Retroviridae (por exemplo, vírus da imunodeficiênciahumana, tais como, HIV-I (também referidos como HTLV-III,LAV ou HTLV-III/LAV, ou HIV-III; e outros isolados, taiscomo, HIV-LP; Picornaviridae (por exemplo, vírus da pólio,vírus da hepatite A, enterovirus, vírus Coxsackie humano,rinovírus, ecovírus); Calciviridae (por exemplo, cepas quecausam a gastroenterite); Togaviridae (por exemplo, vírus daencefalite eqüina, vírus da rubéola); Flaviviridae (porexemplo, vírus da dengue, vírus da encefalite, vírus dafebre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavírus);Rhabdoviridae (por exemplo, vírus da estomatite vesicular,vírus da raiva); Filoviridae (por exemplo, vírus ebola);Paramyxoviridae (por exemplo, vírus parainfluenza, vírus dacaxumba, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório);

Orthomyxoviridae (por exemplo, vírus da influenza) ;Bunyaviridae (por exemplo, vírus Hantaan, vírus Bunya, vírusdo flebótomo e vírus Nairo); Arenaviridae (vírus da febrehemorrágica); Reoviridae (por exemplo, reovírus, orbivírus erotavírus); Bornaviridae; Hepadnaviridae (vírus da hepatite

B) ; Parvoviridae (parvovírus); Papovaviridae (papilomavírus,poliomavírus); Adenoviridae (a maior parte dos adenovírus);Herpesviridae (vírus do herpes simples (HSV) 1 e 2, vírusvaricela-zoster, citomegalovírus (CMV)); Poxviridae (vírusda variola, virus da vacinia, virus da catapora);Iridoviridae (por exemplo, vírus da febre suína africana); evírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicosdas encefalopatias esponfigormes, o agente da hepatite delta(embora sendo um satélite defeituoso do vírus da hepatiteΒ) , os agentes da hepatite não-A, não-B (classe 1transmitidos internamente; classe 2 = transmitidosparenteraImente (isto é, hepatite C); vírus Norwalk ecorrelatos e astrovirus).

Exemplos de vírus que foram encontrados nos sereshumanos incluem, porém não estão limitados ao Retroviridae(por exemplo, vírus da imunodeficiência humana, tais como,HIV-I (também referidos como HTLV-III, LAV ou HTLV-III/LAV,ou HIV-III; e outros isolados, tais como, HIV-LP;Picornaviridae (por exemplo, vírus da pólio, vírus dahepatite A, enterovírus, virus Coxsackie humano, rinovirus,ecovirus); Calciviridae (por exemplo, cepas que causam agastroenterite); Togaviridae (por exemplo, virus daencefalite eqüina, virus da rubéola); Flaviviridae (porexemplo, virus da dengue, virus da encefalite, virus dafebre amarela); Coronaviridae (por exemplo, coronavirus);Rhabdoviridae (por exemplo, virus da estomatite vesicular,virus da raiva); Filoviridae (por exemplo, virus ebola);Paramyxoviridae (por exemplo, virus parainfluenza, virus dacaxumba, virus do sarampo, virus sincicial respiratório);Orthomyxoviridae (por exemplo, virus da influenza);Bunyaviridae (por exemplo, virus Hantaan, virus Bunya, virusdo flebótomo e virus Nairo); Arenaviridae (virus da febrehemorrágica); Reoviridac (por exemplo, reovírus, orbivírus erotavirus); Bornaviridae; Hepadnaviridae (virus da hepatiteB) ; Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (papilomavirus,poliomavirus); Adenoviridae (a maior parte dos adenovirus) Herpesviridae (virus do herpes simples (HSV) 1 e 2, virusvaricela-zoster, citomegalovirus (CMV)); Poxviridae (virusda varíola, vírus da vacínia, vírus da catapora);Iridoviridae (por exemplo, vírus da febre suína africana); evírus não classificados (por exemplo, os agentes etiológicosdas encefalopatias esponfigormes, o agente da hepatite delta(embora sendo um satélite defeituoso do vírus da hepatiteΒ), os agentes da hepatite não-A, não-B (classe 1transmitidos internamente; classe 2 = transmitidosparenteralmente (isto é, hepatite C); vírus Norwalk,correlatos e astrovírus).Os fungos são organismos eucarióticos, apenasalguns dos mesmos causando infecção nos mamíferos verte-brados. Uma vez que os fungos são organismos eucarióticos,eles diferem significativamente das bactérias procarióticasem tamanho, organização estrutural, ciclo de vida emecanismo de multiplicação. Os fungos são classificadosgeralmente com base nos aspectos morfológicos, modos dereprodução e características de cultivo. Embora os fungospossam causar diferentes tipos de doença nos indivíduos,tais como, alergias respiratórias seguindo-se a inalação deantígenos de fungos, intoxicação por fungos devido àingestão de substâncias tóxicas, tais como, da toxinaAmanita phalloides e falotoxina produzidas por cogumelosvenenosos e aflatoxinas, produzidas pelas espécies asper-gilos, nem todos os fungos causam doença infecciosa.

Fungos infecciosos podem causar infecções sistêmi-cas ou superficiais. A infecção sistêmica primária podeocorrer em indivíduos com saúde normal e infecções oportu-nistas são em suas maior parte freqüentemente encontradasnos indivíduos imunocomprometidos. A maior parte dos agentesde fungos comuns que causam infecção sistêmica primáriaincluem Blastomyces, Coccidioides, e Histoplasma. Os fungoscomuns que causam infecção oportunista nos indivíduosimunocomprometidos ou imunosuprimidos incluem, porém nãoestão limitados à Candida albicans, Cryptococcus neoformans,e varias espécies Aspergillus. Infecções por fungossistêmicos são infecções invasivas dos órgãos internos. Oorganismo geralmente entra no corpo através dos pulmões,trato gastrointestinal ou cateteres intravenosos. Essestipos de infecções podem ser causadas por fungos patogênicosprimários ou fungos oportunistas.

As infecções superficiais por fungos envolvem ocrescimento dos fungos sobre uma superfície externa, seminvasão dos tecidos internos. As infecções por fungossuperficiais, típicas, incluem infecções cutâneas por fungosenvolvendo pele, cabelos ou unhas.

As doenças associadas à infecção por fungosincluem aspergilose, blastomicose, candidiase, cromoblasto-micose, cocidioindomicose, criptococose, infecções dos olhospor fungos, infecções dos cabelos, unhas e pele por fungos,histoplasmose, lobomicose, micetoma, otomicose, para-cocidoidomicose, Penicillum marneffei disseminado,faeohipomicose, rinoespirodioise, esporotricose ezigomicose.

Os fungos incluem leveduras e bolores. Exemplos defungos incluem, sem limitação, Aspergillus spp, incluindoAspergillus fumigatus, Blastomyces dermatitidis, Candidaspp, incluindo Candida albicans, Coccidioides immitis,Cryptococcus neoformans, Histoplasma eapsulatum, Pneumoeystisearinii, Rhizomueor spp, e Rhizopus spp.

Os parasitas são organismos que dependem de outrosorganismos, a fim de sobreviver e assim devem entrar ouinfectar outro organismo para continuarem o ciclo de vida. Oorganismo infectado, isto é, o hospedeiro, provê ambosnutrição e habitat para o parasita. Embora em seu sentidomais amplo, o termo parasita possa incluir todos os agentesinfecciosos (isto é, bactérias, vírus, fungos, protozoáriose helmintos), de modo geral, o termo é usado como sereferindo unicamente aos protozoários, helmintos eartrópodes ectoparasíticos (por exemplo, carrapato, ácaros,etc.). Os protozoários são organismos de célula simples quepodem replicar ambos intracelular e extracelularmente,especificamente no sangue, trato intestinal ou na matrizextracelular dos tecidos. Os helmintos são organismosmulticelulares que quase sempre são extracelulares (umaexceção sendo Trichinella spp.). Os helmintos normalmenterequerem a saída de um hospedeiro primário e transmissãopara um hospedeiro secundário a fim de se replicarem. Emcontraste com essas classes mencionadas anteriormente, osartropodes ectoparasiticos formam uma relacao paraa superfície eterna do corpo hospedeiro.

Os parasitas incluem parasitas intracelulares eparasitas intracelulares obrigatórios. Exemplos de parasitasincluem, porém não estão limitados ao Plasmodium falciparum,Plasmodium ova Ie, Plasmodium malariae, Plasmdodium vivax,Plasmodium knowlesi, Babesia microti, Babesia divergens,Trypanosoma cruzi, Toxoplasma gondii, Trichinella spiralis,Leishmania major, Leishmania donovani, Leishmaniabraziliensis, Leishmania tropica, Trypanosoma gambiense,Trypanosoma rhodesiense e Schistosoma mansoni.

Outros organismos infecciosos (isto é, protistas)incluem Plasmodium spp. tais como, Plasmodium falciparum,Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, e Plasmodium vivax eToxoplasma gondii. Parasitas do sangue e/ou dos tecidosincluem Plasmodium spp., Babesia microti, Babesia divergens,Chlamydia trachomatis, Leishmania tropica, Leishmania spp.,Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosomagambiense e Trypanosoma rhodesiense (doença do sonoAfricana), Trypanosoma cruzi (Doença de Chagas), eToxoplasma gondii.

Outros microorganismos medicamente relevantesforam descritos extensivamente na literatura, vide, porexemplo, C.G.A Thomas, Medicai Microbiologyr BailliereTindall, Grã Bretanha 1983, todo o conteúdo sendoincorporado aqui como referência.

Câncer

Em um aspecto a invenção provê um método paratratamento de um individuo possuindo cancer.

Um indivíduo com câncer é um indivíduo que possuicélulas cancerígenas detectáveis. "Câncer" conforme usadoaqui, se refere a um crescimento descontrolado de célulasque interferem com o funcionamento normal dos órgãos esistemas do corpo. Os canceres que migram de seu localoriginal e invadem órgãos vitais podem eventualmenteconduzir à morte do indivíduo através da deterioraçãofuncional dos órgãos afetados. Os canceres hemopoiéticos,tais como, leucemia, são capazes de competir com oscompartimentos hemopoiéticos normais em um indivíduo, peloque conduzindo a falência hemopoiéticas (na forma de anemia,trombocitopenia e neutropenia) levando de forma final àmorte.Uma metastase é uma região de células cance-rígenas, distinta da localização do tumor primário,resultando da disseminação das células cancerígenas do tumorprimário para outras partes do corpo. Na época dodiagnóstico da massa de tumor primário, o indivíduo pode sermonitorado quanto a presença de metastase. As metastases sãomais freqüentemente detectadas através do uso único oucombinado de varreduras de imageamento de ressonânciamagnética (MRI), varreduras de tomografia computadorizada(CT), sangue e contagens de plaquetas, estudos da funçãohepática, raios χ do peito e varreduras ósseas, além domonitoramento de sintomas específicos.

Os canceres incluem, porém não estão limitados aocarcinomà celular basal, câncer do trato bilxar; canccr dabexiga; câncer ósseo; câncer do sistema nervoso central(CNS) e cérebro; câncer de mama; câncer cervical;coriocarcinoma; câncer do cólon e reto; câncer do tecidoconjuntivo; câncer do sistema digestivo; câncer endometrial;câncer esofaríngeo; câncer dos olhos; câncer da cabeça epescoço; neoplasma intraepitelial; câncer renal; câncer dalaringe; leucemia; câncer hepático; câncer pulmonar (porexemplo, célula pequena e não pequena); Iinfoma incluindoIinfoma de Hodgkin e não de Hodgkin; melanoma; mieloma;neuroblastoma; câncer da cavidade oral (por exemplo, lábios,língua, boca e faringe); câncer ovariano; câncer pancreá-tico; câncer da próstata; retinoblastoma; rabdomiosarcoma;câncer retal; câncer do sistema respiratório; sarcoma;câncer de pele; câncer do estômago; câncer testicular;câncer da tireóide; câncer uterino; câncer do sistemaurinário; bem como outros carcinomas, adenocarcinomas esarcomas.

Condições Autoimunes

As condições que envolvem uma resposta imune inataou uma resposta imune semelhante a Thl incluem inflamação,rejeição ao aloenxerto aguda ou crônica, doença de enxerto-versus-hospedeiro (GvHD), determinas doenças imunes, esepticemia. A invenção pode ser usada para tratar taiscondições, em vista da inibição seletiva da sinalização deTLR que pode ser obtida de acordo com a invenção.

As doenças autoimunes podem ser geralmente classi-ficadas como mediadas por anticorpo, mediadas por célula Tou uma combinacao de mediada por anticorpo e por celula T.

Acredita-se que o adaptador ODN e as combinações de liganteTLR da invenção sejam úteis para tratamento de vários tiposde autoimunidade envolvendo imunidade mediada por anticorpoou por célula T, incluindo diabetes melito dependente deinsulina (tipo 1), artrite reumatóide, esclerose múltipla,lúpus eritematoso sistêmico (SLE) e doença dos intestinosinflamados (isto é, doença de Crohn e colite ulcerativa). Osmodelos animais para essas doenças autoimunes estãodisponíveis e são úteis na avaliação da eficácia dascombinações da invenção nessa doenças. Outras doençasautoimunes incluem, sem limitação, alopecia em áreas,hemofilia adquirida, espondilite ancilosante, síndromeantifosfolipídeo, hepatite autoimune, anemia hemolíticaautoimune, síndrome de Behçet, cardiomiopatia, dermatite deespru celíaco, sindrome de disfunção imune de fadiga crônica(CFIDS), polineuropatia desmielinizante inflamatória,sindrome de Churg-Strauss, pênfigo cicatricial, sindrome deCREST, doença por crioaglutinina, lúpus discóide, crioglobu-linemia mista essencial, fibromialgia, fibromiosite,sindrome de Guillain-Barré, fibrose idiopática pulmonar,púrpura trombocitopênica idiopática, nefropatia de IgA,artrite juvenil, liquen plano, miastenia grave, poliarteritenodosa, policondrite, sindromes poliglandulares, dermato-miosite, agamaglobulinemia primária, cirrose biliarprimária, psoriase, fenômeno de Raynaud, sindrome de Reiter,sarcoidose, sindrome do homem rigido, artrite de Takayasu,artrite temporal/artrite de célula gigante, uveite,vasculite e vitiliyo.

Nas várias doenças autoimunes são observadosfreqüentemente anticorpos para antigenos próprios. Porexemplo, para lúpus eritematoso sistêmico- foram descritosautoanticorpos para DNA ou RNA de filamento simples ouduplo. Vallin H e outros (1999) J Immunol 163:6306-13; HoetRM e outros (1999) J Immunol 163:3304-12; ven Venrooij(1990) J Clin Invest 86:2154-60. Os níveis de autoanticorposencontrados nos pacientes autoimunes muito freqüentementesão encontrados como correlacionados à gravidade da doença.0 padrão de autoanticorpos que surgem, por exemplo, no SLEhumano, sugere que partículas macromoleculares intactas,tais como, complexos contendo RNA ou DNA possam serpropriamente anticorpos imunogênicos e anticorpos de ácidoantinucléico que poderiam, portanto, surgir. Lotz M e outros(1992) Mol Biol Rep 16:127; Mohan C e outros (1993) J ExpMed 177:1367-81. Tal DNA ou RNA liberado, por exemplo, dascélulas apoptóticas ou micróbios contendo DNA ou RNApresentes no soro de pacientes autoimunes seriamresponsáveis pela inflamação que contribui para a doençaautoimune. Fatenejad S (1994) J Immunol 152:5523-31;Malmegrim KC e outros (2002) Isr Med Assoc J 4:706-12;Newkirk MM e outros (2001) Arthritis Res 3:253-8. Narealidade, as seqüências contendo CopG seriam identificadasdo soro SLE que induz uma resposta imune eficiente dominadapela secreção IFN-α que se acredita contribua para odesenvolvimento das doenças autoimunes. Magnusson M e outros(2001) Scand J Immunol 54:543-50; Rõnnblom L e outros (2001)J Exp Med 194: F59-63. Além disso, os epitopos paraanticorpos anti-RNA poderiam ser identificados e sercompostos de seqüências ricas em G,U. Tsai DE e outros(1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:8864-8; Tsai DE e outros(1993) J Immunol 150:1137-45.

Alergia

Uma "condição alérgica" ou "alergia" se refere ahipersensibilidade adquirida a uma substância (alergeno). Um"indivíduo possuindo uma condição alérgica" se refere a umindivíduo que está experimentando correntemente ou jáexperimentou anteriormente uma reação alérgica em resposta aum alergeno. Condições alérgicas incluem, porém não estãolimitadas ao eczema, rinite alérgica ou coriza, febre defeno, conjuntivite alérgica, asma brônquica, urticária(erupções) e alergias a alimentos, outras condições atópicasincluindo dermatite atópica; anafilaxia; alergia medica-mentosa e angioedema.

A alergia é tipicamente uma condição episódicaassociada à produção de anticorpos de uma classe especificade imunogloblina, IgE, contra alergenos. O desenvolvimentode uma resposta mediada por IgE para os aeroalergenos comunsé também um fator que indica predisposição para odesenvolvimento de asma.· Se um alergeno encontra um IgEespecifico que se liga a um receptor IgE Fc (FceR) nasuperfície de um basófilo (circulando no sangue) ou célulamastóide (dispersa através de todo o tecido sólido), acélula se torna ativada, resultando na produção e liberaçãode mediadores, tais como, histamina, serotonina e mediadoresde lipídeo.

Uma reação alérgica ocorre quando a imunoglobulinade sensibilização do tecido do tipo IgE reage com o alergenoestranho. O anticorpo IgE é ligado às células mastóides e/oubasófilos e essas células especializadas liberam mediadoresquímicos (aminas . vasoativas) da reação alérgica quandoestimuladas para agir assim pelos alergenos ligando asextremidades da molécula de anticorpo. A histamina, o fatorde.ativação de plaqueta, metabólitos do ácido araquidônico,e serotonina estão entre os melhores mediadores conhecidosde reações alérgicas no homem. A histamina e outras aminasvasoativas são normalmente armazenados nas células mastóidese leucócitos basófilos. As células mastóides são dispersasatravés de todo o tecido animal e os basófilos circulamdentro do sistema vascular. Essas células fabricam earmazenam histamina dentro da célula, a menos que aseqüência especializada de eventos envolvendo a ligação deIgE ocorra para desencadear sua liberação.

Os sintomas de uma reação alérgica variam,dependendo do local dentro do corpo onde a IgE reage com oantigeno. Se a reação corre ao longo do epitéliorespiratório, os sintomas geralmente são espirro, tosse ereações asmáticas. Se a interação ocorrer no tratodigestivo, como no caso de alergias alimentares, dorabdominal e diarréia são comuns. As reações alérgicassistêmicas, por exemplo, seguindo à picada de abelha ouadministração de penicilina a um indivíduo alérgico, podemser severas e freqüentemente ameaçam a vida.

A alergia está associada a uma resposta imune dotipo Th2, que é caracterizada pelo menos em parte pelascitocinas Th2, IL-4 e IL-5 bem como um isotipo de anticorpocomutando para IgE. Respostas imunes Thl e Th2 sãomutuamente reguladoras de contagem, de modo que o desvio daresposta imune na direção de uma resposta imune do tipo Thlpode prevenir ou melhorar uma resposta imune do tipo Th2,incluindo alergia.

Asma

"Asma" conforme usado aqui, se refere a umdistúrbio do sistema respiratório causado por inflamação eestreitamento das vias aéreas, e reatividade aumentada dasvias aéreas aos agentes inalados. A asma é freqüentemente,embora não exclusivamente, associada a uma condição atópicaou alérgica. Os sintomas da asma incluem episódiosrecorrentes de respiração difícil, falta de respiração,aperto do peito, e tosse, resultando em obstrução do fluxoaéreo. A inflamação das vias aéreas associada à asma podeser detectada através da observação de várias alteraçõesfisiológicas, tais como, desnudação do epitélio das viasaéreas, deposição do colágeno abaixo da membrana de base,edema, ativação da célula mastóide, infiltração da célulainflamatória, incluindo neutrófilos, eosinófilos elinfócitos. Como resultado da inflamação das vias aéreas, ospacientes com asma freqüentemente experimentam hipersen-sibilidade das vias aéreas, limitação do fluxo de ar,sintomas respiratórios e cronicidade da doença. Aslimitações do fluxo de ar incluem broncoconstrição aguda,edema das vias aéreas, formação de tampão de muco eremodelação das vias aéreas, aspectos que freqüentementeconduzem à obstrução brônquica. Em alguns casos de asma, afibrose da membrana de subbase pode ocorrer, conduzindo aanormalidades persistentes na função pulmonar.

A pesquisa por vários anos revelou que a asma, damesma forma, resulta de interações . complexas entre ascélulas inflamatórias, mediadoras e outras células e tecidosresidentes nas vias aéreas. As células mastóides,eosinófilos, células epiteliais, macrófagos e células Tativadas todos desempenham um papel importante no processoinflamatório associado à asma. Djukanovic R e outros (1990)Am Rev Respir Dis 142:434-457. Acredita-se que essas célulaspossam influenciar a função das vias aéreas através dasecreção de mediadores pré-formados e sintetizadosrecentemente, que podem atuar direta ou indiretamente notecido local. Também foi reconhecido que as subpopulações delinfócitos T (Th2) desempenham um papel importante naregulação da inflamação alérgica nas vias aéreas porliberação das citocinas seletivas e no estabelecimento dequão crônica é a doença. Robinson DS e outros (1992) N EnglJ Med 326:298-304.

A asma é um transtorno complexo que surge emestágios diferentes do desenvolvimento e pode serclassificada com base no grau de sintomas como aguda,subaguda ou crônica. Uma resposta inflamatória aguda estáassociada a um recrutamento precoce das células nas viasaéreas. A resposta inflamatória subaguda envolve orecrutamento das células, bem como a ativação das célulasresidentes causando um padrão mais persistente deinflamação. A resposta inflamatória crônica é caracterizadapor um nivel persistente de dano da célula e um processo dereparo em andamento, o que pode resultar em anormalidadespermanentes da via aérea.

Um "indivíduo com asma" é um indivíduo que possuium transtorno do sistema respiratório, caracterizado porinflamação e estreitamento das vias aéreas e reatividadeaumentada das vias aéreas aos agentes inalados. Os fatoresassociados ao início da asma incluem, porém não estãolimitados aos alergenos, temperatura fria, exercícios,infecções viróticas e SO2.

Conforme mencionado aqui, a asma pode estarassociada a uma resposta imune do tipo Th2, que écaracterizada, pelo menos em parte, pelas citocinas Th2, IL-4 e IL-5, bem como isotipo de anticorpo comutando para IgE.As respostas imunes Thl e Th2 são mutuamente reguladorescontadores, de modo que o desvio da resposta imune nadireção de uma resposta imune do tipo Thl pode prevenir oumelhorar uma resposta imune do tipo Th2, incluindo alergia.

O ligante TLR7/8 e combinação de oligonucleotideoadaptador da invenção são também úteis para aperfeiçoar asobrevivência, diferenciação, ativação e maturação dascélulas dendriticas.

Em determinados aspectos, a invenção provê ummétodo para melhorar a dispersão do epitopo. "Dispersão doepítopo" conforme usado aqui, se refere à diversificação doepitopo, especificamente de uma resposta imune inicialfocada, especifica para o epitopo dominante, direcionadacontra uma proteína própria ou estranha, para epítopossubdominantes e/ou crípticos naquela proteína (dispersãointramolecular) ou outras proteínas (dispersão intermole-cular). A dispersão do epítopo resulta em múltiplasrespostas.imunes específicas para o epítopo.

Agentes Antimicrobianos

O ligante TLR7/8 e a combinação de oligonucleo-tideo adaptador podem ser usados em conjunto com um ou maisagentes antimicrobianos. Agentes antimicrobianos ou medicamentos incluem, porém não estão limitados aos agentesantibacterianos, agentes antiviróticos, agentes antifungo eagentes antiparasíticos. Frases, tais como, "agenteantiinfeccioso", "antibiótico", "agente antibacteriano","agente antivirótico", "agente antifungo", "agenteantiparasítico" e "parasiticida" possuem significados bemestabelecidos para os versados na técnica comum e sãodefinidos nos textos médicos comuns. Em resumo, agenteantibacterianos exterminam ou inibem bactérias e incluemantibióticos, bem como outros compostos sintéticos ounaturais possuindo funções semelhantes. Agentes antivi-róticos podem ser isolados de fontes naturais ou sintéticase são úteis para exterminar ou inibir virus. Agentesantifungos são usados para tratar infecções por fungossuperficiais, bem como infecções oportunistas e sistêmicasprimárias por fungos. Agentes antiparasiticos exterminam ouinibem parasitas. Muitos antibióticos são moléculas de pesomolecular baixo que são produzidas como metabolitossecundários pelas células, tais como, microorganismos. Emgeral, os antibióticos interferem com uma ou mais funções ouestruturas que são especificas para o microorganismo e quenão estão presentes nas células hospedeiras.

Um dos problemas com as terapias antiinfecciosassão os efeitos colaterais que ocorrem no hospedeiro que etratado com o agente antiinfeccioso. Por exemplo, muitosagentes antiinfecciosos podem exterminar ou inibir um amploespectro de microorganismos e não são específicos para umdeterminado tipo de espécies. 0 tratamento com esses tiposde agentes antiinfecciosos resulta no extermínio da floramicrobiana normal vivendo no hospedeiro, bem como dosmicroorganismos infecciosos. A perda da flora microbianapode levar a complicações da doença e predispor o hospedeiroa infecções por outros agentes patogênicos, uma vez que aflora microbiana compete e funciona como uma barreira aosagentes patogênicos infecciosos. Outros efeitos colateraispodem surgir como resultado dos efeitos específicos ou nãoespecíficos dessas entidades químicas nas células nãomicrobianas ou tecidos no hospedeiro.

Outro problema com o uso difundido de antiinfec-ciosos é o desenvolvimento de cepas de microorganismosresistentes aos antibióticos. Já, as cepas de enterococciresistente à vancomicina, pneumococci resistente àpenicilina, S.aureus múlti resistente e tuberculosis múltiresistente se desenvolveram e estão se tornando grandesproblemas clínicos. O uso difundido de antiinfecciosos damesma forma produzirá muitas cepas de bactérias resistentesaos antibióticos. Como resultado, novas estratégiasantiinfecciosas serão necessárias para combater essesmicroorganismos.

Antibióticos antibacterianos que são eficazes paraexterminar ou inibir uma ampla faixa de bactérias sãoreferidos como antibióticos de amplo espectro. Outros tiposde antibióticos antibacterianos são predominantemente,eficazes contra as bactérias da classe gram positiva ou gramnegativa. Esses tipos de antibióticos são referidos comoantibióticos de espectro estreito. Outros antibióticos quesão eficazes contra um organismo simples ou doença e nãocontra outros tipos de bactérias são referidos aqui comoantibióticos de espectro limitado.Os agentes antibacterianos são algumas vezesclassificados com base em seu modo primário de ação. Emgeral, agentes antibacterianos são inibidores da síntese daparede celular, inibidores da membrana celular, inibidoresda síntese da proteína, inibidores da síntese de ácidonucléico ou funcionais e inibidores competitivos. Osinibidores da síntese de parede celular inibem uma etapa oprocesso da síntese da parede da célula e, em geral, nasíntese de peptidoglicano bacteriano. Os inibidores desíntese da parede celular incluem antibióticos β-lactama,penicilinas naturais, penicilinas semi-sintéticas,ampicilina, ácido clavulânico, cefalosporinas e bacitracina.

As β-lactamas são antibióticos contendo um anel deβ-lactama de. quatro elementos que inibe a última etapa dasíntese do peptidoglicano. Os antibióticos β-lactama podemser sintetizados ou naturais. Os antibióticos β-lactamaproduzidos por penicillium são de penicilinas naturais, taiscomo, penicilina G ou penicilina V. Esses são produzidos porfermentação de Penicillium chrysogenum. As penicilinasnaturais possuem um espectro de atividade estreito e sãogeralmente eficazes contra Streptococcus, Gonococcusr eStaphyloeoeeus. Outros tipos de penicilinas naturais, quesão também eficazes contra bactérias gram positivas, incluempenicilinas F, X, K e 0.

Penicilinas semi-sintéticas são geralmentemodificações da molécula do ácido 6-aminopenicilânicoproduzido por um mofo. 0 ácido 6-aminopenicilânico pode sermodificado por adição de cadeias laterais que produzempenicilinas possuindo espectros mais amplos de atividade queas penicilinas naturais ou várias outras propriedadesvantajosas. Alguns tipos de penicilinas semi-sintéticaspossuem amplo espectro contra bactérias gram-positivas egram-negativas, porém são inativados por penicilinase. Essaspenicilinas semi-sintéticas incluem ampilicina,cabenicilina, oxaxilina, azlocilina, mezlocilina epiperacilina. Outros tipos de penicilinas semi-sintéticaspossuem atividades mais estreitas contra bactérias gram-positivas, porém foram desenvolvidas propriedades, tais que,elas não sejam inativadas pela penicilinase. Essas incluem,por exemplo, meticilina, dicloxacilina e nafcilina. Algunsdas penicilinas semi-sintéticas de amplo espectro podem serusadas em combinação com os inibidores β-lactamase, taiscomo, ácidos clavulânicos e sulbactam. Os inibidores de β-lactamase não possuem ação antimicrobiana, porém elesfuncionam para inibir a penicilinase, assim protegendo apenicilina semi-sintética da degradação.

Outro tipo de antibiótico β-lactama se constituinas cefalosporinas. Elas são sensíveis à degradação por β-lactamases bacterianas e assim, elas nem sempre são eficazessozinhas. As cefalosporinas, contudo, são resistentes àpenicilanase. Elas são eficazes contra uma variedade debactérias gram-positivas e gram-negativas. As cefalosporinasincluem, porém não estão limitadas à cefalotina, cefapirina,cefalexina, cefamandol, cefaclor, cefazolina, cefuroxina,cefoxitina, cefotaxima, cefsulodina, cefetamete, cefixima,ceftriaxona, cefoperazona, ceftazidina e moxalactama.A bacitracina é outra classe de antibióticos queinibe a síntese da parede celular, por inibição da liberaçãodas subunidades de muropeptídeo a partir da molécula quelibera a subunidade para fora da membrana. Embora abacitracina seja eficaz contra bactérias gram-positivas, seuuso é limitado, em geral, à administração tópica em razão desua alta toxicidade.

As carbapenemas se constituem em outro antibióticoβ-lactama de amplo espectro, embora sejam capazes de inibira síntese da parede celular. Monobactamas são tambémantibióticos β-lactama de amplo espectro e incluemeuztreonama. Um antibiótico produzido por Streptomyces,vancomicina, é também eficaz contra bactérias gram-positivaspor inibição da síntese da membrana celular.

Outra classe de agentes antibacterianos seconstitui nos agentes antibacterianos que são inibidores damembrana celular. Esses compostos desorganizam a estruturaou inibem a função das membranas bacterianas. Outro problemacom os agentes antibacterianos que são inibidores damembrana celular é que eles podem produzir efeitos nascélulas eucarióticas, bem como bactérias, em razão dassimilaridades nos fosfolipídeos nas membranas bacterianas eeucarióticas. Assim, esses compostos são raramenteespecíficos o bastante para permitir que os mesmos sejamempregados sistemicamente e impedem o uso de altas dosespara administração local.

Outro inibidor de membrana celular clinicamenteútil é a Polimixina. As polimixinas interferem com a funçãoda membrana por ligação dos fosfolipídeos à membrana. Apolimixina é eficaz principalmente contra bactérias gram-negativas e é geralmente usada em infecções graves porPseudomonas ou infecções por Pseudomonas que sejamresistentes aos antibióticos menos tóxicos. Os efeitoscolaterais graves associados à administração sistêmica dessecomposto incluem lesões aos rins e outros órgãos.

Outros inibidores da membrana celular incluemAnfotericina B e Nistatina que são agentes antifungos usadospredominantemente no tratamento de infecções sistêmicas porfungos e infecções por levedura Candida. Os imidazóis sãooutra classe de antibiótico que se constituem em um inibidorde membrana celular. Os imidazóis são usados como agentesantibacterianos, bem como agentes antifungo, por exemplo,usados para o tratamento de infecções por levedura,infecções dermatofiticas, e infecções sistêmicas por fungos.Os imidazóis incluem, porém não estão limitados aoclotrimazol, miconazol, cetoconazol, itraconazol efluconazol.

Muitos agentes antibacterianos são inibidores dasíntese da proteína. Esses compostos impedem as bactérias desintetizarem proteínas estruturais e enzimas e, assim,causam inibição do crescimento da célula bacteriana oufunção ou morte da célula. Em geral, esses compostosinterferem com os processos de transcrição ou tradução.Agentes antibacterianos que bloqueiam a transcrição incluem,porém não estão limitados às Rifampinas e Etambutol.Rifampinas, que inibem a polimerase de RNA possuem umaatividade de amplo espectro e são eficazes contra bactériasgram-negativas e gram-positivas, bem como Mycobacteriumtuberculosis. 0 etambutol é eficaz contra Mycobacteriumtuberculosis.

Agentes antibacterianos que bloqueiam a traduçãointerferem com os ribossomas bacterianos para prevenir RNAmde ser traduzido nas proteínas. Em geral, essa classe decompostos inclui, porém não está limitada às tetraciclinas,cloranfenicol, os macrolidos (por exemplo, eritromicina) eos aminoglicosídeos (por exemplo, estreptomicina).

Os aminoglicosídeos são uma classe de antibióticosque são produzidos pela bactéria Streptomyees, tais como,por exemplo, estreptomicina, canamicina, tobramicina,amicacina e gentamicina. Os aminoglicosídeos foram usadoscontra uma ampla variedade de infecções bacterianas causadaspor bactérias gram-positivas e gram-negativas. Aestreptomicina vem sendo usada extensivamente como ummedicamento primário no tratamento da tuberculose. Agentamicina é empregada contra muitas cepas de bactériasgram-positivas e gram-negativas, incluindo infecções porPseudomonas, especialmente em combinação com Tobramicina. Acanamicina é empregada contra muitas bactérias gram-positivas, incluindo Staphyloeoeei resistente à penicilina.Um efeito colateral dos aminoglicosídeos que tem limitadoseu uso clinicamente é que, em dosagens que são essenciaispara eficácia, o uso prolongado mostrou prejudicar a funçãorenal e causar lesão aos nervos auditivos conduzindo àsurdezOutro tipo de agente antibacteriano inibidor datradução se constitui nas tetraciclinas. As tetraciclinassão uma classe de antibióticos que são de amplo espectro esão eficazes contra uma grande variedade de bactérias gram-positivas e gram-negativas. Exemplos de tetraciclinasincluem tetraciclina, minociclina, doxiciclina e clortetra-ciclina. Elas são importantes para o tratamento de muitostipos de bactéria, porém são especificamente importantes notratamento da doença de Lyme. Como resultado de sua baixatoxicidade e efeitos colaterais diretos mínimos, astetraciclinas vêm sendo usadas em excesso e de formaincorreta pela comunidade médica, levando a problemas. Porexemplo, seu uso em excesso conduz ao desenvolvimentodisseminado de resistência.

Agentes antibacterianos, tais como, os macrolidosse ligam inversamente à subunidade de ribossomo 50S e inibemo alongamento da proteína por peptidil transferase ouimpedem a liberação de RNAt não carregado do ribossomobacteriano ou ambos. Esses compostos incluem eritromicina,roxitromicina, claritromicina, oleandomicina e aztromicina.

A eritromicina é ativa contra a maior parte das bactériasgram-positivas, Neisseriar Legionella e Haemophilusl porémnão contra Enterobacteriaceae. A lincomicina e a clinda-micina, que bloqueiam a formação de ligação de peptídeodurante a síntese da proteína, são usadas contra bactériasgram-positivas.

Outro tipo de inibidor de tradução é ocloranfenicol. O cloranfenicol liga o ribossomo 70S, inibindoa enzima bacteriana peptidil transferase, pelo que,prevenindo o crescimento da cadeia de polipeptideo durante asíntese da proteína. Um efeito colateral sério associado aocloranfenicol é a anemia aplástica. A anemia aplástica sedesenvolve em doses de cloranfenicol que são eficazes paratratar a bactéria em uma pequena proporção (1/50.000) dospacientes. O claranfenicol que foi um antibiótico altamenteprescrito tem seu uso agora banido, como resultado de mortespor anemia. Em razão de sua eficácia, ele ainda é usado emsituações que ameaçam a vida (por exemplo, febre tifóide).

Alguns agentes antibacterianos interrompem asíntese ou função do ácido nucléico, por exemplo, se ligamao DNA ou RNA, de modo que suas mensagens não podem serlidas. Esse incluem, porém não estão limitados às quinolonase co-trimoxazol, ambos substâncias químicas sintéticas erifamicinas, substâncias químicas naturais ou semi-sintéticas. As quinolonas bloqueiam a replicação do DNAbacteriano por inibição da DNA girase, a enzima que abactéria necessita para produzir seu DNA circular. Elas sãode amplo espectro e exemplos incluem norfloxacina,ciprofloxacina, enoxacina, ácido nalidíxico e temafloxacina.0 ácido nalidíxico é um agente bacteriano que se liga àenzima DNA girase (topoisomerase) que é essencial àreplicação do DNA e permite que os superespirais sejamrelaxados e reformados, inibindo a atividade da DNA girase.O uso principal do ácido nalidíxico é no tratamento dasinfecções do trato urinário inferior (UTI) em razão de suaeficácia contra vários tipos de bactérias gram-negativas,84tais como, E.coli, Enterobacter aerogenes, K. pneumoniae eespécies Proteus que são as causas comuns de UTI. Co-trimoxazol é uma combinação de sulfametoxazol e trimeto-prima, que bloqueiam a síntese bacteriana do ácido fóliconecessário à fabricação dos nucleotídeos de DNA. Arifampicina é um derivado da rifamicina que é ativa contrabactérias gram-positivas (incluindo Mycobacteriumtuberculosis e meningite causada por Nesseria meningitidis)e algumas bactérias gram-negativas. A rifampicina se liga àsubunidade beta da polimerase e bloqueia a adição doprimeiro nucleotídeo que é necessário para ativar apolimerase, pelo que, bloqueando a síntese do RNAm.

Outra classe de agentes antibacterianos é a doscompostos que funcionam como inibidores competitivos dasenzimas bacterianas. Os inibidores competitivos são em suamaior parte todos estruturalmente semelhantes a um fator docrescimento bacteriano e competem para ligação, porém nãorealizam a função metabólica na célula. Esses compostosincluem sulfonamidas e formas quimicamente modificadas desulanilamida, que possuem atividade antibacteriana maior emais ampla. As sulfonamidas (por exemplo, gantrisina etrimetoprima) são úteis para o tratamento da Streptococcuspneumoniae, streptocoeei beta-hemolítico e E.coli e foramusadas no tratamento de UTI não complicadas causadas porE.coli e no tratamento da meningite meningocócica.

Agentes antiviróticos são compostos que impedeminfecção das células por vírus ou replicação do vírus dentroda célula. Existem muito poucos medicamentos antiviróticosem relação aos medicamentos antibacterianos, uma vez que oprocesso de replicação virótica está muito proximamenterelacionado à replicação do DNA dentro da célula hospedeira,de modo que agentes antiviróticos não específicos possam serfreqüentemente tóxicos ao hospedeiro. Existem váriosestágios dentro do processo de infecção virótica que podemser bloqueados ou inibidos por agentes antiviróticos. Essesestágios incluem, anexação do vírus à célula hospedeira(imunoglobulina ou peptídeos de ligação), não revestimentodo vírus (por exemplo, amantadina), síntese ou tradução doRNAm virótico (por exemplo, interferon), replicação do RNAou DNA virótico (por exemplo, análogos de nucleosídeo),maturação das novas proteínas viróticas (por exemplo,inibidores de protease) e brotamento e liberação do vírus.

Outra categoria de agentes antiviróticos sãoanálogos de nucleosídeo. Os análogos de nucleosídeo sãocompostos sintéticos que são semelhantes aos nucleosídeos,porém que possuem um grupo desoxiribose ou ribose incompletoou anormal. Uma vez que os análogos de nucleosídeo estão nacélula viva, elas são fosforilados, produzindo a formatrifosfato que compete com os nucleotídeos normais paraincorporação ao DNA ou RNA virótico. Uma vez que a formatrifosfato do análogo de nucleosídeo é incorporada aocrescimento da cadeia do ácido nucléico,. ela causaassociação irreversível com a polimerase virótica e assim aterminação da cadeia. Os análogos de nucleosídeo incluem,porém não estão limitados ao aciclovir (usado para otratamento do vírus da herpes simples e vírus varicela-zoster), ganciclovir (útil para o tratamento do citomegalo-vírus), idoxuridina, ribavirina (útil para o tratamento dovirus sincicial respiratório), dedesoxinosina, didesoxiciti-dina e zidovudina (azidotimidina).

Outra classe de agentes antiviróticos incluemcitocinas, tais como, interferons. Os interferons sãocitocinas que são secretadas por células infectadas porvírus, bem como células imunes. Os interferons funcionam porligação aos receptores específicos nas células adjacentes àscélulas infectadas, causando alteração na célula que protegea mesma da infecção por vírus, α e β-interferons tambéminduzem a expressão das moléculas MHC da Classe I e ClasseII na superfície das células infectadas, resultando naapresentação de antígeno aumentada para reconhecimento da célula imune do hospedeiro, α e β-interferons estão dispo-níveis como formas recombinantes e foram usados no tratamentode infecção crônica por Hepatite B e C. Nas dosagens que sãoeficazes para terapia antivirótica, os interferons possuemvários efeitos colaterais, tais como febre, indisposição eperda de peso.

A terapia com imunoglobulina é empregada paraprevenção da infecção virótica. A terapia com imunoglobulinapara infecções viróticas é diferente das in.fecções bacte-rianas, uma vez que, ao invés de ser específica paraantígeno, a terapia com imunoglobulina funciona por ligaçãoaos vírus extracelulares e impedindo os mesmos de atacar eentrar nas células que são suscetíveis à infecção virótica.A terapia é útil para a prevenção de infecção virótica peloperíodo de tempo que os anticorpos estiverem presentes nohospedeiro. Em geral, existem dois tipos de terapias comimunoglobulina, terapia com globulina imune normal e terapiacom globulina hiper-imune. A terapia de globulina imunenormal utiliza um produto de anticorpo que é preparado pelosoro de doadores de sangue normais e agrupados. Esse produtoagrupado contém titulações baias de anticorpos para umaampla faixa de viroses humanas, tais como, Hepatite A,parvovírus, enterovírus (especialmente em recém-nascidos). Aterapia com globulina hiper-imune utiliza anticorpos que sãopreparados do soro de indivíduos que possuem titulaçõesaltas de um anticorpo para um vírus específico. Aquelesanticorpos podem então ser usados contra um vírus específico.

Exemplos de globulinas hiper-imunes incluem imunoglobulinazoster (útil para a prevenção da varicela em criançasimunocomprometidas e recém-nascidos), imunoglobulina daraiva humana (útil na profilaxia de pós-exposição de umindivíduo mordido por um animal com raiva), imunoglobulinada Hepatite B (útil na prevenção do vírus da Hepatite B,especialmente em um indivíduo exposto ao vírus) eimunoglobulina RSV (útil no tratamento das infecções porvírus sincicial respiratório).

Agentes antifungos são úteis no tratamento eprevenção de infecções por fungos. Agentes antifungos sãoalgumas vezes classificados por seu mecanismo de ação.

Alguns agentes antifungos funcionam como inibidores deparede de célula por inibição da glicose sintase. Essesincluem, porém não estão limitados a basiungina/ECB. Outrosagentes antifungos funcionam por desestabilização daintegridade da membrana. Esses incluem, porém não estãolimitados aos imidazóis, tais como, clotrimazol, sertã-conzol, fluconazol, itraconazol, cetoconazol, miconazol evoriconacol, bem como, FK 463, anfotericina B, BAY 38-9502,MK 991, pradimicina, UK 292, butenafina e terbinafina.Outros agentes antifungos funcionam por rompimento daquitina (por exemplo, quitinase) ou imunosupressão (501creme).

Parasiticidas são agentes que exterminam direta-mente os parasitas. Tais compostos são conhecidos na arte esão geralmente comercialmente disponíveis. Exemplos deparasiticidas úteis para administração humana incluem, porémnão estão limitados ao albendazol, anfotericina B, benznida-zol, bitionol, cloroquina HCl, fosfato de cloroquina,clindamicina, desidroemetina, dietilcarbamazina, furoato dediloxanida, eflornitina, furazolidanona, glicocorticóides,halofantrina, iodoquinol, ivermicina, mebendazol, meflo-quina, antimoniato de meglumina, melarsoprol, metrifonato,metronidazol, niclosamida, nifurtimox, oxamniquina, paromo-micina, isetionato de pentamidina, piperazina, praziquantel,fosfato de primaquina, proguanil, pamoato de pirantel,pirimetanmina-sulfonamidas, pirimetanmina-sulfadoxina, HClde quinacrina, sulfato de quinina, gliconato de quinidina,espiramicina, estibogluconato de sódio (gliconato deantimônio sódio), suramina, tetraciclina, desoxiciclina,tiabendazol, tinidazol, trimetroprim-sulfametoxazol etriparsamida.Terapia anticâncer

O ligante TLR7/8 e a combinação de oligonucleo-tideo adaptador da invenção podem ser usados em conjunto comterapias anticâncer.

Terapias anticâncer incluem medicamentos, radiaçãoe procedimentos cirúrgicos para o câncer. Conforme usadoaqui, "medicamento para o câncer", se refere a um agente queé administrado a um indivíduo com a finalidade de tratar umcâncer. Vários tipos de medicamentos para o tratamento docâncer são descritos aqui. Para a finalidade desse relatóriodescritivo, os medicamentos para o câncer são classificadoscomo agentes quimioterapêuticos, vacinas para o câncer,terapia hormonal e modificadores da resposta biológica.

O agente quimioterapêutico pode ser selecionado dogrupo consistindo em metotrexato, vincristina, adriamicina,cisplatina, cloroetilnitrosouréias não contendo açúcar, 5-fluoruracil, mitomicina C, bleomicina, doxorubicina, dacar-bazina, taxol, fragilina, Meglamina GLA, valrubicina,carmustaina e poliferposan, MMI270, BAY 12-9566, inibidor defamesil transferase RAS, MMP, MTA/LY231514, Alimta,LY2 64 618/Lometexol, Glamolec, CI-994, TNP-470, Hicamtina/Topotecan, PKC412, Valspodar/PSC833, Novantrona/Mitroxan-trona, Metaret/Suramina, Batimastat, E7070, BCH- 4556, CS-682, 9-AC5 AG3340, AG3433, Incel/VX-710, VX-853, ZDOlOlfISI641, ODN 698, TA 2516/Marmistat, BB2516/Marmistat, CDP845, D2163, PD183805, DX8951f, Lemonal DP 2202, FK 317,Picibanil/OK-432, AD 32/Valrubicina, derivado de metastron/estrôncio, Temodal/Temozolomida, Evacet/doxorubicina lipos-sômica, Yewtaxan/Paclitaxe1, Taxol/Paclitaxel, Xeload/Capecitabina, Furtulon/Doxifluridina, Ciclopax/paclitaxeloral, Taxóide oral, SPU-077/Cisplatina, HMR 1275/vFlavopiridol, CP-358 (774)/EGFR, CP-609 (754)/inibidor deoncogene RAS, BMS-18275 I/platina oral, UFT(Tegafur/Uracila), Ergamisol/Levamisol, melhorador de eniluracil/7 7 6C85/5FU, Campto/Levamisol, Camptosar/Irinotecano, Tumodex/Ralitrexed, Leustatina/Cladribina, Paxex/Paclitaxel, Doxil/doxorubicina lipossômica, Caelix/doxorubicina lipossômica,Fludara/Fludarabina, Farmarubicina/Epirubicina, DepoCyt, ZD1839, LU 7 9553/Bis-Naftalimida, LU 103793/Dolastaina,Caetix/ doxorubicina lipossômica, Gemzar/Gemcitabina, ZD0473/Anormed, YM 116, sementes de iodo, inibidores de CDK4CDK2, inibidores de PARP, D4809/Dexifosamida, Ifes/Mesnex/Ifosamida, Vumon/Teniposido, Paraplatina/Carboplatina,PIantinol/cisplatina, Vepeside/Etoposide, ZD 9331, Taxotere/Docetaxel, promedicamento de arabinosideo de guanina,análogo de Taxano, nitrosouréias, agentes alquilantes, taiscomo, melfelano e ciclofosfamida, Aminoglutetimida,Asparaginase, Bussulfano, Carboplatina, Clorambucil, HCl deCitarabina, Dactinomicina, HCl de Daunorubicina, Estra-mustina fosfato de sódio, Etoposideo (VP 16-213),Floxuridina, Fluorouracil (5-FU), Flutamida, Hidroxiuréia(hidroxicarbamida), Ifosfamida, Interferon Alfa-2a, Alfa-2b,Acetato de leuprolida (análogo ao fator de liberação deLHRH), Lomustina (CCNU), HCl de Mecloretamina (mostardanitrogenada), Mercaptopurina, Mesna, Mitotano (ο.ρ'-DDD),HCl de Mitoxantrona, Octreotido, Plicamicina, HCl deProcarbazina, Estreptozocina, Citrato de Tamoxifeno,Tioguanina, Tiotepa, sulfato de Vinblastina, Amsacrina (m-AMSA), Azacitidina, Ertropoietina, Hexametilmelamina (HMM),Merleucina 2, Mitoguazona (metil-GAG; metil glioxal bis-guanilidrazona; MGBG), Pentostatina (2'desoxicoformicina) ,Semustina (metil-CCNU), Teniposido (VM-26) e sulfato deVindesina porém, não dessa forma limitado.

O agente imunoterapêutico pode ser selecionado dogrupo consistindo em 3622W94, 4B5, ANA Ab, anti-FLK-2, anti-VEGF, ATRAGEN, AVASTINA (bevacizumab; Genentech) , BABS,BEC2, BEXXAR (tositumomab; GlaxoSmithKline) , C225, CAMPATH(alemtuzumab; Genzyme Corp.), CEACIDE, CMA 676, EMD-72000,ERBITUX (cetuximab; ImClone Systems, Inc.), Gliomab-H, GNI-250, HERCEPTINA (trastuzumab; Genentech), IDEC-Y2B8,ImmuRAIT-CEA, ior c5, ior egf.r3, ior t6, LDP-03,LymphoCide, MDX-Il, MDX-22, MDX-210, MDX-220, MDX-260, MDX-447, MELIMMUNE-If MELIMMUNE-2, Monofarm-C, NovoMAb-G2,Oncolim, OV103, Ovarex, Panorex, Pretarget, Quadramet,Ributaxina, RITUXANO (rituximab; Genentech), SMART IDlO Ab,SMART ABL 364 Ab, SMART M195, TNT e Z ENA PAX (daclizumab;Roche), porém não limitado aos mesmos.

A vacina contra o câncer pode ser selecionada dogrupo consistindo em vacinas contra o câncer antiidiopáticasEGF5, antigeno Gp75, vacina contra melanoma GMK, vacina degangliosídeo conjugado MGV, Her2/neu, Ovarex, M-Vax, O-Vax,L-Vax, teratopo STn-KHL, BLP25 (MUC-I), vacina idiotipicalipossômica, Melacina, vacinas de antigeno de peptideo,vacinas de toxina/antigeno, vacina à base de MVA, PACIS,vacina BCG, TA-HPV, TA-CIN, virus DISC e ImmuCist/TeraCis,porém não limitada às mesmas.

Medicamentos antialérgicos

0 ligante TLR7/8 e o oligonucleotídeo adaptador dainvenção podem ser usados em conjunto com medicamentosantialérgicos.

Os métodos convencionais para tratar ou preveniralergia envolveram o uso de medicamentos para alergia eterapias de dessensibilização. Algumas terapias de envolvi-mento para tratamento ou prevenção de alergia incluem o usode anticorpos anti-IgE de neutralização. Anti-histaminas eoutros medicamentos que bloqueiam os efeitos dos mediadoresquímicos de reação alérgica ajudam a regular a gravidade dossintomas alérgicos, porém não previnem a reação alérgica enão possuem efeito nas respostas alérgicas subseqüentes. Asterapias de dessensibilização são realizadas por forneci-mento de pequenas doses de um alergeno, geralmente porinjeção sob a pele, a fim de induzir uma resposta do tipoIgG contra o alergeno. Acredita-se que a presença deanticorpo IgG ajude a neutralizar a produção de mediadoresresultantes da indução dos anticorpos IgE. Inicialmente, oindivíduo é tratado com uma dose muito baixa de alergenospara evitar a indução de uma reação grave e a dose éligeiramente aumentada. Esse tipo de terapia é prejudicialporque o indivíduo recebe administração, na realidade, doscompostos que causam a resposta alérgica o que pode resultarem reações alérgicas graves.Os medicamentos para alergia incluem, porém nãoestão limitados às anti-histaminas, corticosteróides eindutores de prostaglandina. As anti-histaminas sãocompostos que contra-atacam a liberação da histamina porcélulas mastóides ou basófilos. Esses compostos são bemconhecidos na arte e geralmente usados para o tratamento daalergia. As anti-histaminas incluem, porém não são limitadasa acrivastina, astemizol, azatidina, azelastina, betatas-tina, bronfeniramina, buclizina, cetirizina, análogos decetirizina, clorfeniramina, clemastina, CS 560, cipro-eptadina, desloratadina, dexclorfeniramina, ebastina,epinastina, fexofenadina, HSR 609, hidroxizina, levocabas-tina, loratidina, metscopolamina, mizolastina, norastemizol,fenindamina, prometazina, pirilamina, terfenadina etranilast.

Corticosteróides incluem, porém não estão limitadosà metilprednisolona, prednisolona, prednisona, beclome-tasona, budesonido, dexametasona, flunisolido, propionato defluticasona e triamcinolona. Embora a dexametasona seja umcorticosteróide que possua ação antiinflamatória, ela não éregularmente usada no tratamento de alergia ou asma em umaforma inalada, uma vez que é altamente absorvida e possuiefeitos colaterais supressivos de longo prazo em uma doseeficaz. A dexametasona, contudo, pode ser empregada deacordo com a invenção para tratar alergia ou asma, uma vezque, quando administrada em combinação com a composição dainvenção, pode ser administrada em uma dose baixa parareduzir os efeitos colaterais. Alguns dos efeitos colateraisassociados ao corticosteróide incluem tosse, disfonia, aftaoral (candidiase) e em doses maiores, efeitos sistêmicos,tais como, supressão adrenal, intolerância à glicose,osteoporose, necrose asséptica do osso, formação decatarata, supressão do crescimento, hipertensão, fraquezamuscular, afinamento da pele e equimose. Barnes & Peterson(1993) Am Rev Respir Dis 148:S1-S26; e Kamada AK e outros(1996) Am J Respir Crit Care Med 153:1739-48.

Medicamentos antiasma

A combinação do ligante TLR 7/8 e do oligonucleo-tideo adaptador da invenção pode ser empregada em conjuntocom os medicamentos antiasma.

Os medicamentos para o tratamento da asma (isto é,medicamentos antiasma) são geralmente separados em duascategorias, medicamentos de liberação rápida e medicamentosde controle de longa duração. Os pacientes com asma tomam osmedicamentos de controle de longa duração em uma base diáriapara obter e manter o controle da asma persistente. Osmedicamentos de controle de longa duração incluem agentesantiinflamatórios, tais como, corticosteróides, cromolinasódio e nedocromila; broncodilatadores de ação longa, taiscomo, p2-agonistas de ação longa e metilxantinas e modifi-cadores de leucotrieno. Os medicamentos de liberação rápidaincluem β2 agonistas de ação curta, anticolinérgicos ecorticosteróides sistêmicos. Existem muitos efeitos colate-rais associados a cada um desses medicamentos e nenhumdesses medicamentos sozinho ou em combinação é capaz deprevenir ou tratar completamente a asma.Os medicamentos para asma incluem, porém não estãolimitados aos inibidores de PDE-4, broncodilatadores/p2agonistas, abridores de canal de K+, antagonistas de VLA-4,antagonistas de neurocina, inibidores de síntese detromboxano A2 (TXA2), xantinas, antagonistas de ácidoaraquidônico, inibidores de 5 lipoxigenase, antagonistas dereceptor TXA2, antagonistas de TXA2, inibidor das proteínasde ativação 5-lipox e inibidores da protease.

Broncodilatadores/p2 agonistas são uma classe decompostos que causa broncodilatação ou relaxamento dosmúsculos lisos. Os broncodilatadores/32 agonistas Incluem,porém não estão limitados ao salmeterol, salbutamol,albuterol, terbutalina, D2522/formoterol, fenoterol, bitol-terol, metilxantinas de pirbuerol e orciprenalina. Bronco-dilatadores e β2 agonistas de longa duração são compostosusados para prevenção de longo prazo dos sintomas além deterapias antiinflamatórias. Os β2 agonistas de longa duraçãoincluem, porém não estão limitados ao salmeterol e albuterol.Esses compostos são geralmente empregados em combinação comos corticosteróides e geralmente não são usados sem qualquerterapia inflamatória. Eles vêm sendo associados aos efeitoscolaterais, tais como, taquicardia, tremor muscularesqueletal, hipocalemia e prolongamento do intervalo QTc naoverdose.

Metilxantinas, incluindo, por exemplo, teofilina,vêm sendo usadas para controle de longa duração e prevençãodos sintomas. Esses compostos causam broncodilatação resul-tando da inibição da fosfodiesterase e provavelmenteantagonismo da adenosina. As toxinas agudas relacionadas àdose são um problema especifico com esses tipos decompostos. Como resultado, a concentração de soro de rotinadeve ser monitorada a fim de verificar a toxicidade e faixaterapêutica estreita que surgem das diferenças individuaisna limpeza metabólica. Os efeitos colaterais incluem taqui-cardia, taquiarritmias e vômitos, estimulação do sistemanervoso central, dor de cabeça, apoplexias, hematemese,hiperglicemia e hipocalemia. β2 agonistas de ação curtaincluem, porém não estão limitados ao albuterol, bitolterol,pirbuterol e terbutalina. Alguns desses efeitos adversosassociados à administração de β2 agonistas de curta açãoincluem taquicardia, tremor muscular esqueletal, hipo-calemia, ácido láctico aumentado, dor de cabeça e hiper-glicemia.

Cromolina sódio e nedocromila são usados comomedicamentos de controle de longa duração para prevenir demodo primário os sintomas da asma que surgem de exercíciosou sintomas alérgicos que surgem dos alergenos. Acredita-seque esses compostos bloqueiem reações precoces e tardias aosalergenos por interferência com a função do canal de cloro.Eles também estabilizam as membranas celulares mastóides einibem a ativação e liberação de mediadores das célulasinosineófilas e epiteliais. Um período de quatro a seissemanas de administração é geralmente necessário para seobter um benefício máximo.

Os anticolinérgicos são geralmente usados para oalívio do broncoespasmo agudo. Acredita-se que esses compos-tos funcionem por inibição competitiva dos receptorescolinérgicos muscarinicos. Os anticolinérgicos incluem,porém não estão limitados ao brometo de ipratrópio. Essescompostos revertem apenas o broncoespasmo mediado colinergi-camente e não modificam qualquer reação ao antigeno. Osefeitos colaterais incluem boca seca e secreções respira-tórias, respiração difícil aumentado em alguns indivíduos evisão turva se aspergidos nos olhos.

As composições da invenção podem também ser úteispara tratar a remodelagem das vias respiratórias. Aremodelagem das vias respiratórias resulta da proliferaçãodas células musculares lisas e/ou espessamento submucosalnas vias respiratórias e de forma final causa o estrei-tamento das vias respiratórias levando ao fluxo de arrestrito. As composições da invenção podem prevenir a remo-delagem adicional e possivelmente mesmo reduzir a formaçãode tecido resultante do processo de remodelagem.

Adjuvantes

Os ligantes TLR7/8 e oligonucleotídeos adaptadoresda invenção podem ser usados em combinação com outrosagentes, tais como, adjuvantes. Um adjuvante, conforme usadoaqui, se refere a uma substância que não um antigeno, umligante TLR7/8 e um oligonucleotídeo adaptador que melhora aativação da célula imune em resposta a um antigeno, porexemplo, uma resposta imune humoral e/ou acessória paramelhorar as respostas imunes específicas de antigeno. Osadjuvantes são empregados para melhorar a eficácia dasacinas, isto é, composições contendo antigenos usadas parainduzir a imunidade protetora contra o antigeno.

Os adjuvantes incluem, em geral, adjuvantes quecriam um efeito de depósito, adjuvantes de estimulação imunee adjuvantes que criam um efeito de depósito e estimulam osistema imune. Um adjuvante que cria um efeito de depósito,conforme usado aqui, é um adjuvante que faz com que oantigeno seja lentamente liberado no corpo, assim prolon-gando a exposição das células imunes ao antigeno. Essaclasse de adjuvantes inclui, porém não está limitada aoalume (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato dealumínio); formulações à base de emulsão incluindo óleomineral, óleo não mineral, emulsão de água em óleo ou óleoem água, emulsões de óleo em água, tais como, Seppic sérieISA de adjuvantes da Montanide (por exemplo, Montanide ISA720; AirLiquide, Paris, França); MF-59 (uma emulsão deesqualeno em água estabilizada com Span 85 e Tween 80;Chiron Corporation, Emeryville, Califórnia); e PROVAX (umaemulsão de óleo em água contendo um detergente estabilizantee um agente de formação de micela; IDEC PharmaceuticalsCorporation, San Diego, Califórnia).

Um adjuvante de estimulação imune é um adjuvanteque causa ativação de uma célula do sistema imune. Ele pode,por exemplo, fazer com que uma célula imune produza esecrete citocinas. Essa classe de adjuvantes inclui, porémnão está limitada às saponinas purificadas da casca daárvore Q. Saponaria, tal como QS21 (um glicolipídeo que eluina vigésima primeira máxima com fracionamento de HPLC; AquilBiopharmaceuticals, Inc., Worcester, Mass.); poli[di(car-boxilatofenóxi)fosfazeno (polímero PCPP; Virus ResearchInstitute, USA); derivados de lipopolissacarideos, taiscomo, lipideo de monofosforila A (MPL; Ribi ImmunoChemResearch, Inc., Hamilton, Mont.), dipeptídeo de muramila(MDP; Ribi) e dipeptídeo de treonil-muramila (t-MDP; Ribi);OM-17 4 (um dissacarídeo de glucosamina relacionado aolipideo A; OM Pharma SA, Meyrin, Suíça); e fator dealongamento de Leishmania (uma proteína de Leishmaniapurificada; Corixa Corporation, Seattle, Wash.). Essa classede adjuvantes também inclui CpG DNA.

Os adjuvantes que criam um efeito de depósito eestimulam o sistema imune são aqueles compostos que têmambas as funções identificadas acima. Essa classe deadjuvantes inclui, porém não está limitada aos ISCOMS(complexos de imunoestimulação que contêm saponinas mistu-radas, lipídeos e formam partículas do tamanho de vírus comporos que podem manter o antígeno; CSL, Melbourne,Austrália); SB-AS2 (sistema adjuvante número 2 da SmithKlineBeecham que é uma emulsão de óleo em água contendo MPL eQS21: SmithKline Beecham Biologicals [SBB], Rixensart,Bélgica); SB-AS4 (sistema adjuvante número 4 da SmithKlineque contém alume e MPL; SBB, Bélgica); copolímeros de bloconão iônicos que forma micelas, tais como, CRL 1005 (essescontém uma cadeia linear de polioxipropileno hidrófoboflanqueado por cadeias de polioxietileno; Vaxcel, Inc.,Norcross, Ga.); e Syntex Adjuvant Formulation (SAF, umaemulsão de óleo em água contendo Tween 80 e um copolímero debloco não iônico; Syntex Chemicals, Inc., Boulder, Colo.).

O adjuvante pode também ser um lipopeptídeo, talcomo, Pam3Cys, um polissacarídeo catiônico, tal como,quitosana, ou um peptídeo catiônico, tal como protamina.

Ci tocinas

A combinação de ligante TLR7/8 e oligonucleotideoadaptador da invenção pode também ser usada com citocinas.As citocinas são proteínas solúveis e glicoproteínas produ-zidas por muitos tipos de células que mediam as infecçõesinflamatórias e imunes. As citocinas mediam comunicaçãoentre células do sistema imune, atuando localmente, bem comosistemicamente para recrutar células e regular sua função eproliferação. As categorias das citocinas incluem mediadorese reguladores da imunidade inata, mediadores e reguladoresda. imunidade adaptiva e estimuladores da hematopoiese. Estãoincluídas entre as citocinas as interleucinas (por exemplo,IL-I, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-If IL-8, IL-9, IL-10,IL-Il, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, einterleucinas 19-32 (IL-19-IL-32), entre outros), quimio-cinas (por exemplo, IP-10, RANTES5 MIP-Iaf ΜΙΡ-1β, MIP-3a,MCP-I, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, I-TAC, e BCA-I, entreoutras), bem como outras citocinas incluindo interferons dotipo 1 (por exemplo, IFN-α e IFN-β) , interferon do tipo 2(por exemplo, IFN-γ) , fator de necrose tumoral alfa (TNF-α),fator transformador de crescimento β (TGF-β) e vários outrosfatores estimulantes de colônia (CSFs) incluindo GM-CSF5 G-CSF e M-CSF.Antígenos

Ά combinação de TLR7/8 e oligonucleotideo adapta-dor da invenção pode ser empregada com um antigeno,opcionalmente em uma formulação de vacina. Um "antigeno"conforme empregado aqui se refere a qualquer molécula capazde ser reconhecida por um receptor de antigeno de célula Tou receptor de antigeno de célula Β. 0 termo abrange,amplamente, qualquer tipo de molécula que seja reconhecidaem um sistema imune de hospedeiro como sendo estranha. Osantigenos incluem, geralmente, porém não estão limitados àscélulas, extratos de células, proteínas, polipeptideos,peptídeos, polissacarídeos, conjugados de polissacarídeo,miméticos de peptídeo e não peptídeo dos polissacarídeos eoutras moléculas, moléculas pequenas, lipídeos, lipopro-teínas, glicolipídeos, polissacarídeos, carboidratos, víruse extratos viróticos e organismos multicelulares, tais como,parasitas e alergenos. Com relação aos antígenos que sãoproteínas, polipeptideos ou peptídeos, tais antígenos podemincluir moléculas de ácido nucléico codificando taisantígenos. Os antígenos incluem, mais especificamente, porémnão estão limitados aos antígenos cancerígenos, que incluemcélulas cancerígenas e moléculas expressas em ou nas célulascancerígenas; antígenos microbianos, que incluem micróbios emoléculas expressas em ou nos micróbios e alergenos. Conse-quentemente, a invenção em determinadas concretizações provêvacinas para câncer, agentes infecciosos e alergenos.

Nas várias concretizações, o antigeno é um antigenomicrobiano, um antigeno cancerígeno ou um alergeno. Um"antígeno microbiano" conforme usado aqui é um antigeno deum microorganismo e inclui, porém não está limitado aosvírus, bactérias, parasitas e fungos. Tais antigenos incluemo microorganismo intacto, bem como isolados naturais efragmentos ou derivados dos mesmos e também compostos sinté-ticos que são idênticos ou semelhantes aos antigenos demicroorganismo naturais e induzem uma resposta imune especi-fica para aquele microorganismo. Um composto é semelhante aum antigeno de microorganismo natural se ele induzir umaresposta imune (humoral e/ou celular) em um antigeno demicroorganismo natural. Tais antigenos são usados rotineira-mente na técnica e são bem conhecidos dos versados natécnica comum. A invenção pretende englobar antigenos deri-vados de quaisquer agentes infecciosos, descritos aqui.

Conforme usados aqui, os termos "antigeno cancerí-geno" e "antigeno tumoral" são usados intercambiavelmentepara se referir a um composto, tal como um peptideo,proteína, lipoproteina ou glicoproteína, que está associadoa um tumor ou célula cancerígena e que é capaz de provocaruma resposta imune quanto expresso na superfície de umacélula apresentando antígeno no contexto de uma molécula docomplexo de histocompatibidade preponderante (MHC). Osantigenos cancerígenos que são diferencialmente expressospelas células cancerígenas, podem dessa forma ser exploradosde modo a alvejar as células cancerígenas. Os antigenoscancerígenos são antigenos que podem estimular em potencialaparentemente as respostas imunes específicas aparentementepara tumor. Alguns desses antigenos são codificados, emboranão necessariamente expressos por células normais. Essesantigenos podem ser caracterizados como aqueles que sãonormalmente silenciosos (isto é, não expressos) nas célulasnormais, aquelas que são expressas unicamente em determi-nados estágios de diferenciação e aquelas que são expressastemporalmente, tais como, antigenos embriônicos e fetais.Outros antigenos cancerígenos são codificados por genescelulares mutantes, tais como, oncogenes (por exemplo,oncogene ras ativado), genes supressores (por exemplo,mutante p53), proteínas de fusão resultantes de deleçõesinternas ou translocações cromossômicas. Ainda outrosantigenos cancerígenos podem ser codificados por genesviróticos, tais como aqueles transportados nas viroses detumor de RNA e DNA.

Antigenos cancerígenos podem ser expressos decélulas cancerígenas tanto por preparação dos extratosbrutos das células cancerígenas, por exemplo, conformedescrito em Cohen PA e outros (1994) Câncer Res 54:1055-8,por purificação parcial dos antigenos, por tecnologiarecombinante ou por síntese de novo de antigenos conhecidos.Os antigenos cancerígenos incluem, porém não estão limitadosaos antigenos que são expressos recombinantemente, umaporção imunogênica ou um tumor integral ou câncer ou célulados mesmos. Tais antigenos podem ser isolados ou preparadosrecombinantemente ou por qualquer outro meio conhecido naarte.

Exemplos de antigenos tumorais incluem MAGE, MART-1/Melan-Af gp 100, dipeptidil peptidase IV (DPPIV), proteínade ligação de adenosina desaminase (AD Abp), ciclofilina b,antigeno associado ao coloretal (CRC)- C017-1A/GA733,antigeno carcinoembriônico (CEA) e seus epitopos imunogê-nicos CAP-I e CAP-2, etv6, amll, antigeno especifico parapróstata (PSA) e seus epitopos imunogênicos PSA-1, PSA-2 ePSA-3, antigeno de membrana especifico da próstata (PSMA),receptor de célula T/cadeia de CD3-zeta, família MAGE deantígenos tumorais (por exemplo, MAGE-Al, MAGE-A2, MAGE-A3,MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-All, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4) , MAGE-Cl, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4,MAGE-C5), família GAGE de antígenos tumorais (por exemplo,GAGE-I, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7,GAGE-8, GAGE-9) , BAGE, RAGE, LAGE-I, NAG, GnT-V, MUM-1,CDK4, tirosinase, p53, família MUC, HER2/neu5 p21ras, RCAS1,α-fetoproteína, E-caderina, a-catenina, β-catenina e γ-catenina, pl20ctn, gplOO^61117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27,proteína polipose coli adenomatosa (APC), fodrina, Conexina37, Idiotipo Ig, pl5, gp75, gangliosídeos GM2 e GD2,produtos viróticos, tais como, proteínas do papilomavírushumano, família Smad de antígenos tumorais, Imp-1, PIA,antigeno nuclear codificado EBV (EEBNA)-I, glicogêniofosforilase cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-I e CT-7 e c-erbB-2. Esta lista não élimitada.

Um "alergeno" conforme usado aqui, é uma moléculacapaz de provocar uma resposta imune caracterizada porprodução de IgE. Um alergeno é também uma substância quepode induzir uma resposta alérgica ou asmática em umindivíduo suscetível. Assim, no contexto dessa invenção, otermo alergeno significa um tipo específico de antígeno quepode desencadear uma resposta alérgica que é medida poranticorpo IgE.

A lista de alergenos é enorme e pode incluempólens, venomas de insetos, poeira irritante aos animais,esporos de fungos e medicamentos (por exemplo, penicilina).

Exemplos de alergenos animais e vegetais incluem proteínasespecíficas para os gêneros que se seguem: Canis (Canisfamiliaris); Dermatophagoides (por exemplo, Dermatophagoidesfarinae); Felis (Felis domesticus); Ambrosia {Ambrosiaartemisiifolia); Lolium (por exemplo, Lolium perenne eLolium multiflorum); Cryptomeria (Cryptomeria japonica);Alternaria (Alternaria alternata); Alder; Alnus (Alnusgultinosa); Betula (Betula verrucosa); Quercus (Quercusalba); Olea (Olea europa); Artemisia (Artemisia vulgaris);Plantago (por exemplo, Plantago lanceolata); Parietaria (porexemplo, Parietaria officinalis e Parietaria judaica);Blattella (por exemplo, Blattella germanica); Apis (porexemplo, Apis multiflorum); Cupressus (por exemplo,Cupressus sempervirens, Cupressus arizonica e Cupressusmacrocarpa); Juniperus (por exemplo, · Juniperus sabinoidesrJuniperus virginiana, Juniperus communis, e Juniperusashei); Thuya (por exemplo, Thuya orientalis) ; Chamaecyparis(por exemplo, Chamaecyparis obtusa); Periplaneta (porexemplo, Periplaneta americana) ; Agropyron (por exemplo,Agropyron repens); Secale (por exemplo, Secale cereale) ;Triticum (por exemplo, Triticum aestivum); Dactylis (porexemplo, Dactylis glomerata); Festuca (por exemplo, Festucaelatior) ; Poa (por exemplo, Poa pratensis e Poa compressa) ;Avena (por exemplo, Avena sativa); Holcus (por exemplo,Holcus lanatus); Anthoxanthum (por exemplo, Anthoxanthumodoratum); Arrhenatherum (por exemplo, Arrhenatherumelatius); Agrostis (por exemplo, Agrostis alba); Phleum (porexemplo, Phleum pratense); Phalaris (por exemplo, Phalarisarundinacea); Paspalum (por exemplo, Paspalum notatum);Sorghum (por exemplo, Sorghum halepensis); e Bromus (porexemplo, Bromus inermis).

Anticorpos e ADCC

A combinação de ligante TLR7/8 e oligonucleotídeoadaptador da invenção também aumenta a atividade litiea dacélula exterminadora natural e citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC) . A ADCC pode ser realizadausando a combinação de um anticorpo especifico para um alvocelular, tal como, célula cancerígena, levando o sistemaimune do indivíduo a exterminar a célula tumoral. Os anti-corpos úteis no procedimento ADCC incluem anticorpos queinteragem com uma célula.no corpo. Muitos de tais anticorposespecíficos para alvos celulares foram descritos na técnicae muitos estão comercialmente disponíveis. Em uma concre-tização, o anticorpo é um anticorpo IgG.

Os anticorpos terapêuticos úteis na invenção podemser específicos para antígenos microbianos (por exemplo,antígenos bacterianos, viróticos, parasíticos ou de fungos),antígenos associados ao câncer ou tumor e antígenospróprios. Os anticorpos preferidos são aqueles que reco-nhecem e se ligam aos antigenos presentes sobre ou nacélula. Exemplos de anticorpos apropriados incluem, porémnão estão limitados a Rituxan™ (rituximab, anticorpo anti-CD20) , Herceptina (trastuzumab), Quadramet, Panorex, IDEC-Y2B8, BEC2, C225, Oncolym, SMART M195, ATRAGEN, Ovarex,Bexxar, LDP-03, ior t6, MDX-210, MDX-Il, MDX-22, OV103,3622W94, anti-VEGF, Zenapax, MDX-220, MDX-447, MELIMMUNE-2,MELIMMUNE-1, CEACIDE, Pretarget, NovoMAb-G2, TNT, Gliomab-H,GN1-250, EMD-72000, LymphoCide, CMA 676, Monopharm-C, 4B5,ior egf.r3, ior c5, BABS, anti-FLK-2, MDX-260, ANA Ab, SMARTIDlO Ab, SMART ABL 364 Ab, CC4 9 (niAb B72.3), ImmuRAIT-CEA,anticorpo anti-IL-4, um anticorpo anti-IL-5, um anticorpoanti-IL-9, um anticorpo anti-Ig, um anticorpo anti-IgE,anticorpos da Hepatite B derivados de soro, anticorpos daHepatite B recombinantes e semelhantes.

Outros anticorpos semelhantes, úteis para ainvenção incluem alerttuzumab (leucemia linfocitica crônicade célula Β), gentuzumab ozogamicina (leucemia mielòideaguda + CD33), hP67.6 (leucemia mielóide aguda + CD33),infliximab (doença dos intestinos inflamados e artritereumatóide), etanercept (artrite reumatóide), tositumomab,MDX-210, oregovomab, receptor mAb de anti-EGF, MDX-447,proteína de fator antitecido (TF), (Sunol); ior-c5, c5,edrecolomab, ibritumomab tiuxetano, mimético de mAb anti-idiotípico de epítopo de gangliosídeo GD3, anti-HLA-DrlOmAb, mAb humanizado anti-CD33, anti-CD52 humAb, anti-CDl mAb(ior t6) , MDX-22, celogovab, anti-17-1 A mAb, bevacizumab,daclizumab, anti-TAG-72 (MDX-220), mimético de mAb anti-idiotipico de proteoglicano de peso molecular alto (I-Mel-1) , mimético de mAb antiidiotipico de proteoglicano de pesomolecular alto (I-Mel-2), anti-CEA Ab, hmAbHll, proteínasantiDNA ou associadas ao DNA (histonas) mAb, Gliomab-H mAb,GNI-250 mAb, antiCD22, CMA 676), mAb humano antiidiotipicopara gangliosídeo GD2, ior egf/r3, mAb de glicoproteinaantiior c2, ior c5, anti-FLK-2/FLT-3 mAb, mAb biespecíficoantiGD-2, autoanticorpos antinucleares, anti-HLA-DR Ab,anti-CEA mAb, palivizumab, bevacizumab, alemtuzumab, BLyS-mAb, antiVEGF2, receptor antiTrail; B3 mAb, mAb BR96, câncerde mama; e mAb de Abx-Cbl.

Terapia com Imunoglobulina

Os agentes da invenção podem também ser usados comterapia de globulina normal e hiperimune. A terapia deglobulina imune normal utiliza um produto de anticorpo que épreparado de doadores de soro e de sangue normal e agrupados.Esse produto agrupado contém baixas titulações de anticorpopara uma ampla variedade de antígenos, tais como aqueles deagentes patogênicos infecciosos (por exemplo, bactéria,vírus, tais como, hepatite A, parvovírus, enterovírus,fungos e parasitas). Terapia de globulina hiperimune utilizaanticorpos que são preparados do soro de indivíduos quepossuem titulações altas de um anticorpo para um antígenoespecífico. Exemplos de globulinas hiperimunes incluemglobulina imune zoster (útil para prevenção de varicela emcrianças e recém-nascidos imunocomprometidos), imunoglobu-Iina da raiva humana (útil na profilaxia pós-exposição de umindivíduo mordido por um animal com raiva), globulina imuneda Hepatite B (útil na prevenção do vírus da Hepatite B,especialmente em um indivíduo exposto ao vírus) e globulinaimune RSV (útil no tratamento das infecções por vírussincicial respiratório).

Dosagem e Administração

O ligante e o oligonucleotídeo podem ser formula-dos em composições separadas que são usadas em conjunto paraobtenção de um efeito desejado. Por exemplo, um oligonu-cleotídeo adaptador e um ligante TLR7/8 podem ser misturadose administrados a um indivíduo ou colocados em contato comuma célula substancial e simultaneamente como uma combina-ção. Como outro exemplo, um oligonucleotídeo adaptador e umligante TLR7/8 podem ser administrados a um indivíduo oucolocados em contato com uma célula em momentos diferentes.Ainda como outro exemplo, um oligonucleotídeo adaptador e umligante TLR7/8 podem ser administrados a um indivíduo emsítios diferentes.

Conforme mencionado acima, o termo "quantidadeeficaz" se refere de modo geral à quantidade necessária ousuficiente para realizar um efeito biológico desejado.Combinado com os ensinamentos providos aqui, por escolhaentre os vários compostos ativos e fatores de pesagem, taiscomo, potência, biodisponibilidade relativa, peso corpóreodo paciente, gravidade dos efeitos colaterais adversos emodo preferido de administração, um regime de tratamentoprofilático ou terapêutico eficaz pode ser planejado, nãocausando toxicidade substancial e ainda sendo totalmenteeficaz para tratar o indivíduo específico. A quantidadeeficaz para qualquer aplicação específica pode variar,dependendo de fatores, tais como, a doença ou a condiçãosendo tratada, o oligonucleotídeo específico sendo adminis-trado, o tamanho do indivíduo ou a gravidade da doença oucondição. Um versado na técnica pode determinar, empírica-mente, a quantidade eficaz de um oligonucleotídeo adaptadorespecífico e ligante TLR7/8 e/ou antígeno e/ou agenteterapêutico, sem experimentação indevida sendo necessária.

As doses para os indivíduos descritas aqui, paradistribuição sistêmica ou local variam tipicamente de cercade 10 ng a 10 mg por administração, as quais, dependendo daaplicação, seriam fornecidas diária, semanal ou mensalmentee qualquer outra quantidade de vezes entre as mesmas ouconforme necessário. Mais tipicamente, as doses sistêmicasou locais variam de 1 μg a 1 mg por administração e maistipicamente de cerca de 10 μg a 100 μg, com 2-4 adminis-trações sendo em dias espaçados ou semanas espaçadas. Dosesmais altas podem ser necessárias para administração paren-teral. Em algumas modalidades, contudo, doses parenteraispara essas finalidades podem ser usadas em uma faixa de 5 a10.000 vezes mais altas que as doses típicas descritasacima.

Para qualquer composto descrito aqui, a quantidadeterapeuticamente eficaz pode ser determinada de modo ideal apartir de modelos animais. A dose aplicada pode ser ajustadacom base na biodisponibilidade relativa e potência docomposto administrado. O ajuste da dose para obter aeficácia máxima, com base nos métodos descritos acima eoutros métodos como são bem conhecidos na arte, está bemdentro das capacidades do versado na técnica comum.

Via de Administração

Para uso clinico, a combinação de ligante TLR7/8 ede oligonucleotideo adaptador da invenção pode seradministrada sozinha ou formulada como um complexo deliberação através de qualquer via de administração apro-priada, que é eficaz para obtenção do resultado terapêuticodesejado. As vias de administração incluem vias de adminis-tração enteral e parenteral. Exemplos de vias de adminis-tração enterais incluem, oral, gástrica, intestinal e retal.

Exemplos não limitantes de vias de administração parenteraisincluem intravenosa, intramuscular, subcutânea, interaperi-toneal, intratecal, injeção local, tópica, nasal, mucosal epulmonar.

Veículos de Liberação

O oligonucleotideo adaptador e um ligante TLR7/8e/ou o antigeno e/ou outros terapêuticos podem ser adminis-trados sozinhos (por exemplo, em salmoura ou tampão) ouusando qualquer veiculo de liberação conhecido na técnica.

Por exemplo, a combinação de ligante TLR7/8 eoligonucleotideo adaptador da invenção pode ser administradadiretamente ao indivíduo ou pode ser administrada emconjunto com um complexo de liberação de ácido nucléico. Umcomplexo de liberação de ácido nucléico significa umamolécula de ácido nucléico associada a (por exemplo, ligadaiônica ou covalentemente; ou encapsulada) um dispositivoalvo (por exemplo, uma molécula) que resulta em afinidade deligação mais alta com a célula alvo. Exemplos de complexosde liberação de ácido nucléico incluem ácidos nucléicosassociados a um esterol (por exemplo, colesterol), umlipideo (por exemplo, um lipideo catiônico, virossoma oulipossoma) ou um agente de libação especifico de célula alvo(por exemplo, um ligante reconhecido por receptor especificopara célula alvo). Complexos preferidos podem sersuficientemente estáveis in vivo para prevenir o desaco-plamento significativo antes da internalização pela célulaalvo. Contudo, o complexo pode ser clivável em condiçõesapropriadas dentro da célula, de modo que o oligonucleotideoé liberado em uma forma funcional.

Outros veículos de liberação que foram descritos epodem ser usados de acordo com a invenção incluem cocleados(Gould-Fogerite e outros, 1994, 1996); emulssomas (Vancott eoutros, 1998, Lowell e outros, 1997); ISCOMs (Mowat eoutros, 1993, Carlsson e outros, 1991, Hu e outros, 1998,Morein e outros, 1999) ; Iipossomas (Childers e outros, 1999,Michalek e outros, 1989, 1992, de Haan 1995a, 1995b);vetores bacterianos vivos (por exemplo, Salmonella,Escherichia coli, bacilos Calmette-Guerin, ShigellafLactobacillus) (Hone e outros, 1996, Pouwels e outros, 1998,Chatfield e outros, 1993, Stover e outros, 1991, Nugent eoutros, 1998); vetores virais vivos (por exemplo, vacínia,adenovírus, herpes simples) (Gallichan e outros, 1993, 1995,Moss . e outros, 1996, Nugent e outros, 1998, Flexner eoutros, 1988, Morrow e outros, 1999); microesferas (Gupta eoutros, 1998, Jones e outros, 1996, Maloy e outros, 1994,Moore e outros, 1995, 0'Hagan e outros, 1994, Eldridge eoutros, 1989); vacinas de ácido nucléico (Fynan e outros,1993, Kuklin e outros, 1997, Sasaki e outros, 1998, Okada eoutros, 1997, Ishii e outros, 1997); polímeros (por exemplo,carboximetiIcelulose, quitosana) (Hamajima e outros, 1998,Jabbal-Gill e outros, 1998); anéis poliméricos (Wyatt eoutros, 1998); proteossomas (Vancott e outros, 1998, Lowelle outros, 1988, 1996, 1997); fluoreto de sódio (Hashi eoutros, 1998); plantas transgênicas (Tacket e outros, 1998,Mason e outros, 1998, Haq e outros, 1995); Virossomas (Glucke outros, 1992, Mengiardi e outros, 1995, Cryz e outros,1998); partículas semelhantes a vírus (Jiang e outros, 1999,Leibl e outros, 1998). Outros veículos de liberação sãoconhecidos na técnica.

Composições Farmacêuticas

As combinações de ligante TLR7/8 e de oligonu-cleotídeos adaptadores da invenção podem ser formuladas comocomposições farmacêuticas compreendendo, adicionalmente, umveículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo farmaceuti-camente aceitável significa uma ou mais cargas sólida oulíquidas mais compatíveis, diluentes ou substâncias encapsu-lantes que são apropriadas para administração ao ser humanoou outro animal vertebrado. Um veículo é um ingredienteorgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qualo (s) ingrediente (s) ativos é(são) combinado9s) para facili-tar o efeito desejado. Os componentes de uma composiçãofarmacêutica são comisturados em uma maneira, tal que, nãoexiste interação que substancialmente prejudique a eficiên-cia farmacêutica desejada.

Para administração oral, os compostos (isto é,oligonucleotideo adaptador e um ligante TLR7/8, antigenose/ou outros agentes terapêuticos) podem ser formuladosprontamente por combinação do(s) composto(s) ativo(s) comveículos farmaceuticamente aceitáveis, bem conhecidos natécnica. Tais veículos permitem que os compostos da invençãosejam formulados como comprimidos, pílulas, drágeas,cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões esemelhantes, para ingestão oral por um indivíduo a sertratado. As preparações farmacêuticas para uso oral podemser obtidas como excipiente sólido, moagem opcional damistura resultante e processamento da mistura de grânulos,após adição de auxiliares apropriados, caso desejado, paraobter comprimidos ou núcleos de drágeas. Excipientes apro-priados são, especificamente, cargas, tais como, açúcares,incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol, prepa-rações de celulose, tais como, por exemplo, amido de milho,amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina,goma tragacanto, metil celulose, hidroxipropilmetil-celu-lose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirro-lidona (PVP). Caso desejado, os agentes de desintegraçãopodem ser adicionados, tais como, polivinil pirrolidonareticulada, ágar ou ácido algínico ou um sal dos mesmos, talcomo, alginato de sódio. Opcionalmente, as formulações oraispodem também ser formuladas em salmoura ou tampões paraneutralização das condições ácidas internas ou podem seradministradas sem quaisquer veículos.

Os núcleos das drágeas são providos com revesti-mentos apropriados. Para essa finalidade, soluções de açúcarconcentrado podem ser usadas, as quais opcionalmente podemconter goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, gelcarbopol, polietileno glicol e/ou dióxido de titânio,soluções laqueadoras e solventes orgânicos ou misturas desolventes. Os corantes ou pigmentos podem ser adicionadosaos comprimidos ou revestimentos das drágeas para identi-ficação ou para caracterizar combinações diferentes de dosesativas de composto.

As preparações farmacêuticas que podem ser empre-gadas oralmente incluem cápsulas de encaixe fabricadas degelatina, bem como cápsulas macias, vedadas, fabricadas degelatina e um plastificante, tal como, glicerol ou sorbitol.

As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes ativosem mistura com carga, tais como, lactose, ligantes, taiscomo, amidos e/ou lubrificantes tais como, talco ouestearato de magnésio e opcionalmente estabilizantes. Nascápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidosou suspensos nos líquidos apropriados, tais como, óleosgraxos, parafina líquida ou polietileno glicóis líquidos.

Além disso, podem se adicionados estabilizantes. Micro-esferas formuladas para administração oral podem também serusadas. Tais microesferas vêm sendo bem definidas na técnica.

Todas as formulações para administração oral estariam emdosagens apropriadas para tal administração.Para administração bucal, as composições podemtomar a forma de comprimidos ou pastilhas formulados de modoconvencional.

Os compostos podem ser administrados por inalaçãoao trato pulmonar, especialmente os brônquios e maisespecificamente para dentro dos alvéolos do pulmão, empre-gando dispositivos de inalação padrão. Os compostos podemser liberados na forma de uma apresentação em aerossol deembalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o emprego deum propelente apropriado, por exemplo, diclorodifluormetano,triclorofluormetano, diclorotetrafloretano, dióxido decarbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossolapropriado, a unidade de dosagem pode ser determinada pelaprovisão de uma válvula para liberação de uma quantidademedida. Um aparelho de inalação pode ser usado para liberaros compostos a um indivíduo. Um aparelho de inalação,conforme usado aqui, é qualquer dispositivo para adminis-tração de um aerossol, tal como, forma em pó seco doscompostos. Esse tipo de equipamento é bem conhecido natécnica e foi descrito em detalhes, tal como a descriçãoencontrada em Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 19a Edição, 1995, Mac Publishing Company, Easton,Pensilvânia, páginas 1676-1692. Muitas Patentes US tambémdescrevem os dispositivos de inalação, tal como a Patente USnúmero 6.116.237.

"Pó" conforme usado aqui, se refere a uma compo-sição que consiste em partículas sólidas finamente disper-sas. Preferivelmente, os compostos são de fluxo relativa-mente livre e capazes de serem dispersos em um dispositivode inalação e subseqüentemente inalados por um indivíduo, demodo que os compostos alcançam os pulmões para permitirpenetração nos alvéolos. Um "pó seco" se refere a umacomposição em pó que possui um teor de umidade, tal que, aspartículas são prontamente dispersáveis em um dispositivo deinalação para formar um aerossol. 0 teor de umidade geral-mente está abaixo de 10% em peso de água, e em algumasconcentrações está abaixo de 5% em peso e preferivelmentemenos de cerca de 3% em peso. 0 pó pode ser formulado compolímeros ou opcionalmente pode ser formulado com outrosmateriais, tais como, lipossomas, albumina e/ou outrosveículos.

A dosagem em aerossol e os sistemas de liberaçãopodem ser selecionados para uma aplicação terapêuticaespecífica por um versado na técnica, tal como descrito, porexemplo, em Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeuticand diagnostic agents to the respiratory tract," em CriticaiReviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313(1990), e em Moren, "Aerosol dosage forms and formulations,"em Aerosols in Medicine. Principies, Diagnosis and Therapy,Moren, e outros, Eds., Elsevier, Amsterdam, 1985.

Quando se deseja que os compostos sejam liberadossistemicamente, podem ser formulados para administraçãoparenteral por injeção, por exemplo, por injeção do bolo ouinfusão contínua. As formulações para injeção podem serapresentadas na forma de dosagem unitária, por exemplo, emampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com umpreservante adicionado. As composições podem tomar formas,tais como, de suspensões, soluções ou emulsões em veículosoleosos ou aquosos e podem conter agentes formuladores, taiscomo, agentes de suspensão, estabilização e/ou dispersão.

As formulações farmacêuticas para administraçãoparenteral incluem soluções aquosas dos compostos ativos naforma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões doscompostos ativos podem ser preparadas como suspensões deinjeção oleosas apropriadas. Solventes lipófilos ou veículosapropriados incluem óleos graxos, tais como, óleo de mamonaou ésteres de ácido graxo sintéticos, tais como, oleato deetila ou triglicerídeos ou lipossomas. Suspensões aquosaspara injeção podem conter substâncias que aumentam aviscosidade da suspensão, tais como, carboximetil celulosede sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensãopode conter também estabilizantes ou agentes apropriados queaumentam a solubilidade dos compostos para permitir apreparação de soluções altamente concentradas.

Alternativamente, os compostos ativos podem estarna forma de pó para constituição com um veículo apropriado,por exemplo, água isenta de pirogênio, estéril, antes douso.

Os compostos também podem ser formulados emcomposições retais ou vaginais, tais como, supositórios ouenemas de retenção, por exemplo, contendo bases desupositório convencionais, tais como, manteiga de cacau ououtros glicerídeos.Além das formulações descritas anteriormente, oscompostos também podem ser formulados como uma preparação dedeposito. Tais formulações de ação longa podem ser formu-ladas com materiais poliméricos ou hidrófobos apropriados(por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ouresinas de troca de ion ou com derivados fracamentesolúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel.

As composições farmacêuticas também podem incluirveículos de fase gel ou sólida apropriados ou excipientes.Exemplos de tais veículos ou excipientes incluem, porém nãoestão limitados ao carbonato de cálcio, fosfato de cálcio,vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina epolímeros, tais como, polietileno glicóis.

Formas de preparação farmacêutica líquida ou sólidaapropriadas são, por exemplo, soluções aquosas ou em salmourapara inalação, partículas de ouro microencapsuladas, enco-bertas ou revestidas, contidas em lipossomas, nebulizados,aerossóis, microesferas para implantação na pele ou secas emum objeto afiado para serem raspadas na pele. As composiçõesfarmacêuticas podem também incluir grânulos, pós, compri-midos, comprimidos revestidos, (micro)cápsulas, supositó-rios, xaropes, emulsões, suspensões, cremes, gotas oupreparações com liberação prolongada dos compostos ativos,em cuja preparação, os excipientes e aditivos e/ou auxi-liares, tais como, desintegrantes, ligantes, agentes derevestimento, agentes de intumescimento, lubrificantes,aromatizantes, adoçantes ou solubilizantes são usadosrotineiramente conforme descrito acima. As composiçõesfarmacêuticas são apropriadas para uso em uma variedade desistemas de liberação de medicamento. Para uma breve revisãodos métodos para liberação de medicamento, vide Langer R(1990) Science 249:1527-33, que é incorporado aqui comoreferência.

Os agentes da invenção e opcionalmente outrosagentes terapêuticos e/ou antigenos podem ser administradospropriamente (puros) ou na forma de um sal farmaceuticamenteaceitável. Quando usados na medicina, os sais seriamfarmaceuticamente aceitáveis, porém sais não faramceuti-camente aceitáveis podem ser convenientemente usados parapreparar sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Taissais incluem, porém não estão limitados aos preparados dosácidos que se seguem: clorídrico, bromídrico, sulfúrico,nítrico, fosfórico, maléico, acético, salicílico, p-toluenosulfônico, tartárico, cítrico, metano sulfônico, fórmico,malônico, succínico, naftaleno-2-sulfônico e benzenosulfônico. Também, tais sais podem ser preparados como saisde metal alcalino ou sais alcalino terrosos, tais como, saisde sódio, potássio ou cálcio do grupo ácido carboxílico.

Agentes de tamponamento apropriados incluem: ácidoacético e um sal (1-2% peso/volume); ácido cítrico e um sal(1-3% peso/volume); ácido bórico e um sal (0,5-2,5% peso/volume); e ácido fosfórico e um sal (0,8-2% peso/volume).Preservantes apropriados incluem cloreto de benzalcônio(0,003-0,03% peso/volume); clorobutanol (0,3-0,9% peso/volume); parabenos (0,01-0,25% peso/volume) e timerosal(0,004-0,02% peso/volume).As composições farmacêuticas da invenção contêmuma quantidade eficaz dos agentes da invenção eopcionalmente antigenos e/ou outros agentes terapêuticosopcionalmente incluídos em um veículo farmaceuticamenteaceitável. O termo veículo farmaceuticamente aceitávelsignifica um ou mais dentre carga líquida ou sólidacompatível, diluentes ou substâncias de encapsulamento quesão apropriadas para administração a um ser humano ou outroanimal vertebrado. O termo veículo indica um ingredienteorgânico ou inorgânico, natural ou sintético, com o qual oingrediente ativo é combinado para facilitar a aplicação. Oscomponentes das composições farmacêuticas são também capazesde serem misturados com os compostos da presente invenção eentre si, de um modo tal que não exista interação que possasubstancialmente prejudicar a eficiência farmacêuticadesejada.

Métodos de Classificação

A invenção ainda provê em outros aspectos, métodospara identificar os ligantes TLR7/8 e/ou oligonucleotídeosadaptadores. As etapas do método podem variar, dependendo doagente sendo identificado (isto é, ligante versus oligonu-cleotídeo) , se o ligante é um ligante TLR7, um TLR8 ou umligante TLR7/8, do tipo de células usadas no método esemelhantes.

Com base nos ensinamentos estabelecidos aqui, umligante TLR7 pode ser identificado por sua capacidade deestimular a sinalização de TLR7 sozinha, de estimular asinalização de TL8 (partindo de um nível de base) , napresença de um oligonucleotídeo adaptador e/ou por inibiçãoda estimulação de TLR7, na presença de um oligonucleotídeoadaptador. Um ligante TLR8 pode ser identificado pelasinalização de TLR8 aumentada (partindo do nível de baseacima) quando usado em combinação com um oligonucleotídeoadaptador. Um ligante que estimula ambos TLR7 e 8 (quandousado sozinho) pode ser identificado por qualquer combinaçãodessas atividades. Um oligonucleotídeo adaptador pode seridentificado por sua capacidade de inibir estimulação deTLR7 por um ligante TLR7, induzir estimulação de TLR8 por umligante TLR7 e/ou melhorar a estimulação de TLR8 de umligante TLR8.

Os métodos podem ser realizados in vivo ou invitro. Os ensaios in vitro são documentados nos Exemplos.Leituras apropriadas incluem, porém não estão limitadas aIL-12, TNF-alfa e/ou IFN-gama para estimulação de TLR8 eIFN-alfa para estimulação de TLR7. Os ensaios podem empregaralternativamente construções repórter possuindo genesrepórteres ligados aos elementos de regulação transcricionalque são sensíveis à sinalização de TLR7 e/ou TLR8 (porexemplo, elementos sensíveis ao NF-κΒ). Essas construçõessão descritas nos Exemplos. Os ensaios podem medir a supraou infra-regulação transcricional, supra ou infra-regulaçãode tradução, expressão da proteína e/ou secreção esemelhantes.

Como um exemplo, um ensaio de ligante TLR8 podeenvolver contato de uma célula expressando TLR8 (oupopulação de células) com um ligante de teste na presença eausência de um oligonucleotídeo adaptador. A célula preferi-velmente é uma que expressa TLR8 porém não TLR7 ou TLR9. Asinalização de TLR8 é medida de uma célula, em resposta aoligante de teste, na presença e ausência do oligonucleo-tídeo. Um ligante de teste possuindo um perfil de sinali-zação de TLR8 que é melhorado na presença do oligonucleo-tídeo, quando comparado à ausência do oligonucleotídeo, éentão identificado como um ligante TLR8. 0 ensaio podetambém incluir uma análise da sinalização de TLR7 usando umacélula expressando TLR7 que não expressa TLR8 ou TLR9. Essaúltima análise pode ser empregada para excluir a possibi-lidade de que o ligante seja um ligante TLR7 que comute parasinalização de TLR8, na presença do oligonucleotídeo.

Os resultados de um ensaio semelhante empregandoligantes conhecidos é mostrado na Figura 12. Ambas a loxori-bina e imunosina (ligantes específicos para TLR7) estimulama sinalização de TLR8, na presença de ODN 6056. Espera-seque os ligantes específicos de TLR7 putativos tenham umperfil qualitativamente semelhante. A sinalização de TLR8por R-84 8 (um ligante TLR7 e TLR8) é melhorada na presençade ODN 6056. Seria esperado que os ligantes TLR8 putativostivessem um perfil qualitativamente semelhante. A ribavirina,que não é tanto um ligante TLR7 nem um ligante TLR8, nãoestimula a sinalização de TLR8, na presença ou ausência deODN 6056, indicando a especificidade do ensaio para ligantesTLR7/8.

Um ensaio de oligonucleotídeo adaptador podeenvolver contato de uma célula expressando TLR8 (ou popu-lação de células) com um oligonucleotídeo de teste, napresença ou ausência de um ligante TLR7, TLR8 ou TLR7/8. Seo ligante for um ligante TLR7 (quando usado sozinho), oensaio pode medir a inibição da sinalização de TLR7 e/ousinalização de TLR8 induzida, quando o oligonucleotídeo éusado com o ligante. Se o ligante for um ligante TLR8(quando usado sozinho), o ensaio pode medir a sinalização deTLR8 melhorada, quando o oligonucleotídeo é usado com oligante, quando comparado ao efeito do ligante sozinho. Se oligante estimular ambos TLR7 e TLR8 (quando usado sozinho),o ensaio pode medir uma ou mais das leituras observadasacima. Os resultados do ensaio podem ser comparados aosensaios de controle positivos (por exemplo, ensaios usandoum oligonucleotídeo adaptador conhecido) e semelhantes. 0método pode também incluir um ensaio para determinar se ooligonucleotídeo é um ligante TLR7 e/ou TLR8 propriamente.

Esses métodos podem ser usados para identificar osligantes que, quando usados sozinhos, são fracamente estimu-ladores, porém quando combinados com oligonucleotídeos,possuem perfis de sinalização ovos e/ou melhorados.

A presente invenção é adicionalmente ilustradapelos Exemplos que se seguem, que de modo algum devem sertidos como limitantes.

EXEMPLOSMATERIAIS E MÉTODOS

Oligonucleotídeos e reagentes

Todos os oligonucleotídeos foram adquiridos daBiospring (Frankfurt, Alemanha) ou providos pela ColeyPharmaceutical GmbH (Langenfeld, Alemanha) , controladosquanto a identidade e pureza pela Coley Pharmaceutieal GmbHe possuíam níveis de endotoxina não deteetáveis (<0,1 EU/mL)medidos pelo ensaio de Limulus (BioWhittaker, Verviers,Bélgica). Os oligonucleotídeos foram suspensos em Tris-EDTAisento de endotoxina e estéril (Sigma, Deisenhofen, Alemanha),e armazenados e manuseados em condições assépticas paraprevenir contaminação microbiana e por endotoxina. Todas asdiluições foram realizadas usando Tris-EDTA isento deendotoxina. As seqüências de oligonucleotídeos são listadasnas Tabelas 1 e 2. Loxoribina (7-alil-7,8-diido-8-oxo-guano-sina) (Sigma) foi dissolvida primeiro em IN NaOH, diluída emmeio RPMI e o pH foi ajustado para 7,4 com IN HCl (19). R-848 (1-(2-hidróxi-2-metilpropil)-2-metil-lH-imidazo[4 , 5-c]quinolin-4-amina) foi comercializada sinteticamente pelaGLSynthesis (Worcester, MA, USA) e dissolveu em 10% DMSO. 7-Deaza-guanosina (ChemGenes, Wilmington, MA, USA) foidissolvida em IM em IN NaOH. Inosina (Sigma) foi dissolvidaem H2O. Todas as diluições foram realizadas em Tris-EDTAisento de endotoxina.

Ensaios de TLR

Células HEK293 estavelmente transfectadas expres-sando TLR9, TLR8 ou TLR7 humano foram descritas anterior-mente (16,20). Em resumo, as células HEK293 foramtransfectadas por eletroporação com vetores expressando orespectivo TLR humano e um plasmídeo repórter de 6 χ NF-κΒ-luciferase. Transfectantes estáveis (3 χ IO4 células/poço)foram incubados com loxoribina ou R-848 na ausência oupresença de ODN por 16 horas a 37 0C em um incubadorumedecido. Cada ponto de dados foi realizado em triplicata.As células foram lisadas e ensaiadas por atividade do geneluciferase (usando o kit BriteLite da Perkin-Elmer,Zaventem, Bélgica). Os índices de estimulação foram calcula-dos com referência à atividade do gene repórter do meio semadição de oligonucleotideo.

Purificação da Célula

Preparações de revestimento tamponadas de sangueperiférico dos doadores humanos saudáveis foram obtidas doBlood Bank da University of Düsseldorf (Alemanha) e PBMCforam purificados por centrifugação sobre Ficoll-Hypaque(Sigma). As células foram cultivadas em um incubadorumectado a 37 0C em meio suplementado de RPMI 1640 com 5%(v/v) de soro AB humano inativado (BioWhittaker) ou 10%(v/v) FCS inativado, aquecido, 2 mM de L-glutamina, 100 U/mLde penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina (todos daSigma).

Detecção de Citocina e Análise Citométrica de Fluxo

PBMC foram suspensos em uma concentração de 5 χIO6 células/mL e adicionados à placas de fundo redondo de 96poços (250 μL/poço). PBMC foram incubados com váriasconcentrações de ODN e/ou loxoribina e sobrenadantes dacultura (SN) foram coletados após os pontos de tempo indica-dos. Se não usados imediatamente, os SN são armazenados a -200C até serem necessários. Quantidades de citocinas nos SNforam avaliadas usando um kit ELISA disponível comercial-mente (para IL-12p40, da BD Biosciences, Heidelberg,Alemanha), HFN-γ e TNF-α (da Diaclone, Besancon, França) ouum ELISA doméstico para IFN-γ desenvolvido usando anticorposdisponíveis comercialmente (PBL, New Brunswick, NJ, USA) .

Para coloração intracelular, PBMC foram incubadosa 5 χ IO6 células/mL em placas de fundo redondo de 96 poços(250 μL/poço) com as quantidades indicadas de concentraçõesde oligonucleotídeos e/ou loxoribina e solução Brefeldin A(BD Biosciences) foi adicionada. PBMC foram incubados por 6horas. Para coloração de IFN-γ intracelular, as célulasforam incubadas com oligonucleotídeos e/ou loxoribina por 16horas, antes da adição da solução de Brefeldin A. As célulasforam colhidas e coloração intracelular realizada usandoreagente Intraprep de acordo com o protocolo do fabricante(Beckman-Coulter, Neuss, Alemanha). As células foram colori-das com anticorpos apropriados para identificação de mono-citos (CD14 + ) , células B (CD19+) e células NK (CD56+, CD3") .Os dados da citometria de fluxo foram obtidos em umFACSCalibur e foram analisados usando o programa decomputador CellQuest (ambos da BD Biosciences). Todos anti-corpos monoclonais (mAb) para análise citométrica de fluxoforam obtidos da BD Biosciences, exceto CDllc da Diaclone,CD14 da Immunotech (Marseille, França) e CD123 da Miltenyi(Bergisch Gladbach, Alemanha). Os monócitos humanos foramisolados de PBMC integral usando .o kit de isolamento dacélula CD14 conforme descrito pelo fabricante (Miltenyi) .Para determinar a pureza, as células foram coloridas com mAbpara a CDllc e CD14 e identificadas por citometria de fluxo.Em todos os experimentos, os monócitos tiveram mais de 95%de pureza. Os monócitos purificados (4 χ IO6 células/mL)foram incubados com concentrações crescentes de ODN por 24horas. PDC foram enriquecidas usando o kit de isolamentoBDCA-4pDC conforme descrito pelo fabricante (Miltenyi). Apurificação de PDC foi confirmada por coloração com mAb paraCD123 (da Miltenyi) , HLA-DR e CDllc (da BD Biosciences) . Apureza foi de aproximadamente 85%. As células (5 χ IO5células/mL, 250 μΐ,/ροςο) foram cultivadas por 24 horas comou sem oligonucleotideos e loxoribina. IFN-α ou IL-12p40 nosSN foram medidas conforme descrito acima.

RESULTADOS

Aperfeiçoamento Seletivo da Seqüência de SinalizaçãoMediada por TLR8 por Coincubação com Oligonucleotideo deHomopolimero

Células de HEK293 expressando hTLR8 estavelmente econstrução de repórter NF-KB-Iuciferase foram incubadas comR-848 (1-(2-hidróxi-2-metilpropil)-2-metil-lH-imidazo[4, 5-c]quinolin-4-amina) na presença ou ausência de oligonucleo-tideo. A influência da co-incubação com oliognucleotideosdiferentes na ativação de NF-κΒ mediada por TLR8 foi entãoanalisada.

Um ODN de homopolimero oligo(dT)i7 com uma estruturade fosforotioato, ODN 6056, foi identificado, o qual aumentoumarcantemente o nivel de ativação de NF-κΒ estimulada por R-848 (Figura 1B) . ODN 6059 sozinho não estimula a ativaçãoconsiderável de NF-κΒ (não mais que duas vezes acima dabase) nas concentrações até 25 μΜ em células expressandoTLR8 (dados não publicados). 0 efeito pareceu ser dependentede oligonucleotídeo, como nem todo os oligonucleotídeostestados melhoraram a sinalização de TLR8 igualmente bem(por exemplo, um heteropolimero não correlacionado (ODN1982) não influenciou fortemente a ativação de NF-κΒ por R-848).

A coincubação de R-848 com ODN 6056 não apenasaumentou a eficácia, porém também a potência da ativação deTLR8 significativamente. 0 EC50 de R-848 já foi fortementeaumentado na presença de 0,1 μΜ ODN 6056 (0, 1 μΜ ODN 6056:EC50 (R-848) = 4, 9 μΜ, média de três experimentos; EC50 (R-848) sozinho > 30 μΜ). Contudo, concentrações maiores de ODN6056 diminuíram mais o EC50 (1 μΜ ODN 6056: EC40 (R-848) =1,4 μΜ; 5 μΜ ODN:EC50 (4-848) = 0, 4 μΜ). Esse efeito foiespecífico para ODN 6056 como a diminuição de EC50 foiconsideravelmente menor para ODN 1982 (5 μΜ 1982:EC50 (R-848) = 19, 0 μΜ) . Em contraste com os efeitos estimuladoresem TLR8, a coincubação de ODN 6056 (ou ODN 1982) com oligante TLR8 CpG ODN 2006 em hTLR9 expressando célulasHEK293 não afetou a estimulação de NF-κΒ mediada por CpG(dados não publicados).

Os requisitos da seqüência em potencial para oefeito aperfeiçoado observado foram investigados e várioshomopolímeros de fosforotioato diferentes foram testados(Tabela 1). O oligo(dT)i7 (ODN 6056) tinha as propriedadesde aperfeiçoamento mais fortes, seguido por um oligo (dU)i7(SEQ ID NO: 11) e oligo (CiA)i7 (SEQ ID NO: 12). Significati-vamente, menos aperfeiçoamento foi detectado para um oligo(dC) i7 (SEQ ID NO: 13) e um oligo (dN)i5 aleatorizado. 0heteropolimero ODN 1982 mostrou atividade de aperfeiçoamentoapenas menor e um oligo(dG)24 (SEQ ID NO: 14) não melhorou aatividade, porém, ao invés disso, inibiu a estimulação deNF-κΒ mediada por R-848. A seqüência de ODN 6056 com umaestrutura de fosfodiéster não influenciou a estimulaçãomediada por TLR8. 0 comprimento do oligonucleotideo tambémparece ter tido influência: um oligo(dA)24 (SEQ ID NO: 15)mostrou menos efeitos sinergisticos com R-848 que ooligo (CiA)17 (SEQ ID NO: 12) mais curto.

Estimulação. das Células Expressando TLR8 por umLigante Específico para TLR 7 na Presença de um Oligo-nucleotideo de Homopolímero T

R-8 4 8 é um ligante para hTLR7, bem como hTLR8(16), considerando-se que a loxoribina (7-alil-7,8-diido-8oxo-guanosina) era conforme descrito como um ligante espe-cifico para TLR7 (18). Concentrações de até 10 mM deloxoribina não ativaram a sinalização de NF-κΒ nas célulasHEK2 93 transfectadas com hTLR8 ou hTLR9, porém ativaram asinalização mediada por hTLR7 (Figura 2A). Embora sendo umligante TLR7, a coincubação das células HEK293 expressandohTLR8 com loxoribina e oligonucleotideo ativou a sinalizaçãode NF-κΒ (Figura 2B). Esse efeito dependente da concentraçãofoi observado exclusivamente na presença de ODN 6056 porémnão na presença de ODN 1982 (Figura 2B) . Observações seme-lhantes foram feitas com outro ligante TLR7, 7-deaza-guanosina (18) . 7-Deaza-guanosina sozinha foi inativa sobreas células expressando hTLR8, em concentrações de até 5 mMna ausência de ODN 6056, porém estimulou a ativação de NF-κΒmediada por TLR8 na presença de ODN 6056. Inosina, umcomposto que pareceu ativar a sinalização de NF-κΒ nas•células HEK293 não especificamente (dados não publicados)foi também coincubada ODN 6056 nas células HEK293expressando hTLR8 (Figura 2C) . A ativação de NF-κΒ pelainosina, na presença de ODN6056 não foi alterada, emcomparação à ativação não especifica da inosina nasconcentrações de até 10 mM.

Um efeito semelhante é observado com 6-amino-9-benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol, um composto à base deadenosina. Quando empregado sozinho, esse composto é umligante TLR7 porém não um ligante TLR8 (Figuras 9A e 9B) .Quando usado na presença de um oligonucleotideo adaptadorpoli(dT)i7 ele é capaz de estimular a sinalização de TLR8(Figura 9B).

Inibição da Sinalização de TLR7 Independente da

Seqüência

Esses dados mostram que ligantes TLR7 de moléculapequena induzem sinalização de NF-κΒ dependente de TLR8, napresença de determinados oligonucleotideos. Não obstante,nas células HEK2 93 expressando TLR7 os efeitos foram opostos.Oligonucleotideos inibiram ativação de NF-κΒ mediada porTLR7 por ligantes específicos TLR7 e ligantes TLR7/8conforme mostrado nas Figuras IA, 3 e 9A. 0 efeito pareceuser não específico a seqüência, como todos os oligonucleo-tideos de fosforotioato testados até aqui inibiram aativação de hTLR7 (dados não publicados).Aperfeiçoamento de Sinalização de Ligante TLR8Empregando um Oligonucleotideo Adaptador de RNA

Os experimentos semelhantes foram realizadosusando R-848 como o ligante TLR7/8 e oligonucleotideosadaptadores com base em RNA. A Figura 10 mostra o efeito naestimulação de NF-κΒ nas células hTLR8-LUC-293 por umoligonucleotideo de seqüência mista e um oligonucleotídeopoli(rU) i8. 0 oligonucleotideo poli(rü)i8 (rU*rU*rU*rU*rU*rU* .rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*rU*; SEQ ID) NO: 5) usadosozinho sinaliza através de TLR8, conforme mostrado pelaativação leve de NF-κΒ com esse oligonucleotideo (Figura10) . O oligonucleotideo de RNA de seqüência mista (rG*rC*rC*rA*rC*rC*rG*rA*rG*rC*rC*rG*rA*rA*rG*rG*rC*rA*rC*rC; SEQ IDNO: 16) , quando usados sozinhos, não sinalizam através deTLR8.

Na Figura 11, células hTLR8-LUC-HEK293 foram incu-badas com quantidades crescentes de R-848 na presença tantode (a) TE e 50 μg/mL DOTAP ou 9b) 5 μΜ de ORN na presença de50 μg/mL DOTAP. A estimulação de NF-κΒ foi medida 16 horasmais tarde por determinação da atividade de luciferase. Osíndices de estimulação foram calculados com referência àbase na presença de meio sozinho. A Figura mostra que oefeito do oligonucleotídeo poli(rü)i8 na sinalização de TLR8é dramaticamente melhorado, quando o oligonucleotídeo écombinado com R-848 (Figura 11) . 0 oligonucleotídeo de RNAde seqüência mista, que não é um ligante TLR7 ou TLR8,também melhora a sinalização de TLR8 por R-848, conformemostrado na Figura 11. Os dados mostram que os oligonu-cleotídeos com base em RNA podem também funcionar comoadaptadores.

Coincubação de Loxoribina com Oligo (dT)17 ODNAltera o Perfil de Citocina Produzido por PBMC Humano

0 efeito de coincubação da loxoribina com ODN 6056e 1982 nas células imunes humanas foi investigado. Aincubação com loxoribina sozinha estimulou PBMC humano aproduzir IFN-α (Figura 4A). Contudo, a presença de concen-trações crescentes de ODN, IFN-α induzido por loxoribina foireduzido aos níveis de base. Embora o efeito tenha sidoobservado com ambos ODN, ODN 6056 pareceu ter um efeitosupressor mais forte.

A produção de outras citocinas foi também estu-dada. A loxoribina sozinha induziu apenas quantidades menoresde secreção de IL-12p40 do PBMC (Figura 4B). Em contraste,na presença de ODN 6056, IL-12p40 foi produzido em quanti-dades significativas, considerando-se que a mesma concen-tração de ODN 1982 em conjunto com loxoribina, não induziuIL-12p40 acima da base com meios sozinhos. Resultados seme-lhantes foram obtidos para IL-12p70 (dados não publicados) eIFN-γ (Figura 4C). A produção de TNF-α foi também estimuladaquando loxoribina e ODN 6056 foram coincubados. Contudo, aprodução de TNF-α foi também observada quando ODN 1982 foicoincubado com loxoribina, embora consideravelmente menosque a obtida por coincubação com ODN 6056. Nenhum dentre ODNou loxoribina induziu sozinho níveis significativos desecreção de TNF-α (Figura 4D).IL-12p40 e TNF-a São Produzidos por MonócitosQuando Coestimulados com Loxoribina e Oligo (dT) r? ODN

A combinação de loxoribina e ODN ativa célulasHEK293 expressando TLR8, porém suprime sinalização mediadapor TLR7. Foi. colocado como hipótese que as células imunesTLR8 positivas são a fonte primária para IL-12 e TNF-α epDCs positivas TLR7 são uma fonte primária de IFN-α. Acoloração FACS intracelular revelou que a maior parte dascélulas CD14+ produziram TNF-α mediante coincubação de PBMChumano com loxoribina e ODN 6056 (Figura 5A) . Loxoribinasozinha ou em combinação com ODN 1982 rendeu apenas algunsmonócitos positivos TNF. A porcentagem de monócitos posi-tivos IL-12 foi inferior àquela para TNF-α. Não obstante, oefeito sinergistico da combinação de loxoribina com ODN 6056foi também claramente detectável para IL-12 intracelular(Figura 5B) . Em nenhum desses experimentos, IL-12 intra-celular ou TNF-α seriam detectados nas células CD19+Bmediante estimulação com ODN e loxoribina (dados nãopublicados). A fonte celular de IFN-γ foi também investi-gada. A combinação de loxoribina com ODN estimulou níveis deIL-12 altos e estudos anteriores mostraram que IL-12 induzsecreção de IFN-γ nas células NK (21-23). Portanto, aprodução de NF-γ foi avaliada nas células NK humanas' (Figura6) . Na realidade, a produção de IFN-γ nas células NK poderiaser observada quando PBMC humano fosse coincubado comloxoribina e ODN 6056, embora nenhum dos estímulos sozinhosinduzissem produção de IFN-γ considerável, conforme jádemonstrado por ELISA de proteína IFN-γ dos sobrenadantes dePBMC humano.

Para demonstrar a estimulação mediada por TLRdireta dos monócitos em resposta a loxoribina e ODN 6056, osmonócitos de PBMC humanos foram purificados e incubados comloxoribina, na presença ou ausência de ODN 6056 ou 1982. Osmonócitos isolados produziram IL-12p40 (Figura 7A) ou TNF-a(dados não publicados) apenas em resposta à combinação deambos estímulos, loxoribina e ODN 6056.

Incubação de PBMC humano com compostos de imuno-modulação pequenos semelhantes a R-848 ou loxoribina induzi-ram a produção de IFN-α por pDCs (Figura 7B e (24, 25)).Portanto, o efeito supressivo de ODN 6056 na produção deIFN-α estimulada por loxoribina seria um resultado direto deinibição de sinalização mediada por TLR7 em pDCs. Parainvestigar essa possibilidade, os pDCs humanos foram isoladose estimulados com loxoribina, na presença tanto do homo-polímero de oligo(dT)17 ou heteropolímero ODN (Figura 7B) .pDC humano enriquecido produziu altas quantidades de IFN-αquando incubado com loxoribina sozinha. Em contraste, aprodução de IFN-α foi abolida quando coincubada com ODN 6056ou ODN 1982. Novamente, ao efeito supressor de ODN 6056pareceu ser mais forte que aquele do ODN 1982, uma vez queconcentrações de ODN inferiores seriam necessárias paraanular a produção de IFN-α.

A Figura 8 mostra os dados gerados usando ascélulas TLR8-LUC-293. Uma concentração constante de R-848(50 micromolar) e quantidades crescentes de ODN especificadoforam empregadas. Δ leitura de luciferase de R-848 sozinhafoi ajustada para 100% para padronização. Os resultados sãomostrados no painel esquerdo. Na Figura 8 o painel direitomostra o efeito do aumento do teor de T em um poli Coligonucleotideo de 1 micromolar 17 mer, na presença dequantidades crescentes de R-848. A atividade é melhoradamesmo com apenas duas timidinas e aumenta dramaticamente com6 ou mais timidinas.

DISCUSSÃO

Os presentes dados demonstram que a atividade dehTLR8 pode ser modulada pela presença de determinado ODN defosforotioato. HTLR8 está mais proximamente relacionado aohTLR7 (26), conforme refletido pela capacidade do compostoestimulador imune pequeno R-848 de ativar ambos hTLR7 ehTLR8(16). Contudo, hTLR7 é consideravelmente mais sensívelà estimulação com R-848 que hTLR8, uma vez que concentraçõesmenores de R-848 são necessárias para ativação de TLR7. Acoincubação de R848 com um oligo(dT)i7 de fosforotioatorendeu TLR8 mais sensível à estimulação com R848 e' aindainibiu a ativação de TLR7, a despeito do fato de que essehomopolímero T sozinho,■ não teve efeito considerável emrelação a cada um desses TLRs.

Para determinar se o homopolímero T influenciariaa ativação de TLR por outro estímulo, seus efeitos nos doisligantes TLR7, loxoribina e 7-deaza-guanosi.na, que nãoestimulam TLR8(18) foram estudados. Surpreendentemente, paraambos os ligantes, a presença de um oligo(dT)i7 conduziu auma comutação completa com ativação de NF-κΒ dependente deTLR7 a TLR8, com supressão da sinalização mediada por TLR7pelo oligo(dT)i7. É possível que TLR8 humano possa ter umaafinidade de ligação fraca com loxoribina, que provavelmentenão possa ser detectada nos ensaios biológicos disponíveis.

A presença de determinados oligonucleotídeos pode melhorar aafinidade de loxoribina para TLR8 por um mecanismo aindadesconhecido, de modo que a estimulação mediada porloxoribina de TLR8 em células estavelmente transfectadaspossa ser detectada.

A possibilidade de uma influência dos oligonucleo-tídeos em uma via de sinalização geral ou mecanismo deabsorção pode ser normalizada. Contudo, o fato de que ooligo (dT) i7 tem um modo de ação diferente nas célulasHEK293 transfectadas com hTLR7 (inibição da sinalização deNF-κΒ), hTLR9 (nenhum efeito) ou hTLR8 (melhora forte dasinalização) contrasta fortemente contra essa possibilidade.O efeito sinergístico observado não foi limitado às célulasexpressando TLR8 ectopicamente. TLR7 humano é principalmenteexpresso nas células de pDCs nas células B. Essas célulasnão expressam TLR8 considerando-se que TLR8 é expresso nascélulas mielóides (27-30). Na realidade, os efeitos siner-gísticos da loxoribina e ODN na produção de citocina (IL-12e TNF-α) foram medidos nas células imunes humanas comexpressão de TLR8 endógenos, tais como, monócitos. Emcontraste, a maior parte da loxoribina e IFN-α induzido porR-848 é produzida por ativação de TLR7 em pDC humano (nossosdados e (4, 24, 25)). A ativação da produção de IFN-α em pDCpor esses estímulos de TLR7 foi completamente suprimida porincubação com ODN de fosforotioato, consistente com osefeitos inibidores ou em pDC, em contraste com o efeitoestimulador seletivo da seqüência visto em TLR8. Acombinação de ODN e loxoribina não apenas conduziu a umacomutação de IFN-α derivado de pDC para IL-12 derivado demonócito e TNF-α, porém também para secreção de IFN-γ apartir de células NK. As células NK humanas não possuemexpressão de TLR7 e TLR8 (31), de modo que a estimulação deIFN-γ derivada de célula NK parece ser um efeito indireto,provavelmente mediado por IL-12(32). Tomada em conjunto, umaalteração completa do perfil de efeitos imunes mediados porloxoribina foi observada quando da adição simples dedeterminados oligonucleotideos. Adicionalmente, esses dadosapontam para um efeito algo dependente da seqüência com ODNde fosforotioato rico em T sendo o ODN mais eficiente quepode ser combinado com ligantes específicos de TLR7 paraativar TLR8.

Alguns relatos indicam que as células dendríticasmielóides e monócitos expressam ambos TLR7 e TLR8 no nívelde RNAm (27-29). Nenhum dado está disponível mostrando aexpressão da proteína TLR real nessas células. Nenhumaestimulação direta dos monócitos por loxoribina foi detectadanesses experimentos. Em contraste, apenas a combinação deloxoribina e oligonucleotídeo induziu a produção de citocinaderivada de monócito. Esses resultados contrastam com aexpressão funcional de TLR7 em monócitos e apontam para TLR8como o receptor alvejado pelo oligonucleotídeo e loxoribina.Adicionalmente, a loxoribina sozinha não induz quantidadessignificativas de IL-12, embora a produção de IL-12 em PBMChumano induzida por R-848 tenha sido reportada (29), o que éconsistente com a capacidade de R-848 de estimular ambosTLRs(16). É muito difícil uma distinção clara como aquela deTLR é ativada nas células que podem expressar ambos TLR7 eTLR8 com compostos estimulando ambos receptores. Ito eoutros (33) reportaram que mDC produz IL-12, porém não IFN-aquando estimulado com R-848. Em contraste, pDC não produzIL-12, porém produz IFN-a(25) mediante estimulação com R-848ou outros ligantes TLR indicando uma indução mediada porTLR8 de IL-12 em mDCs e indução mediada por TLR7 de IFN-α empDCs. Mesmo a coincubação de R-848 ou loxoribina comoligo(dT)i7 ODN não resultou na produção de IL-12 por pDChumano, sugerindo que esse sinal não é suficiente paraativar as vias adequadas em pDC.

É uma tentativa a postulação de um modelo ondedeterminados TLRs possam possuir um sítio regulador (possi-velmente alostérico) ao qual os oligonucleotídeos seriamligados e que funcione como moléculas efetoras. No caso deTLR7, os oligonucleotídeos de fosforotioato parecem agircomo antagonistas. Portanto, o oligonucleotídeo que se ligaao TLR7 pode inibir tanto a ligação própria de um liganteTLR7 ao seu bolso de ligação ou corrigir a sinalização ajusante, por exemplo, por agravamento das mudanças conforma-cionais corretas dentro do receptor. A ligação dos oliognu-cleotídeos ricos em T ao TLR8, por outro lado, pode funcionarcomo um ativador (alostérico) permitindo a ligação aumentadade R-848 ou outros ligantes de molécula pequena comoloxoribina ao bolso de ligação de TLR8 ativo ou sinalizaçãoa jusante aumentada. Caso possa haver dois domínios deligação envolvidos ou ligação de ligante de molécula pequenae efetor, ODN pode ocorrer no mesmo sítio, não podendo sercorrentemente determinado. Os melhoradores alostéricos sãoconhecidos para os receptores de várias famílias diferentes.Por exemplo, Knoflach e outros (34) reportou a identificaçãode duas classes de moléculas pequena que se comportam comomelhoradores alostéricos para o receptor de glutamatometabotrópico, um elemento da família do receptor acoplado àproteína G. A análise detalhada da estrutura do receptorlocalizou o sítio de ligação do melhorador dentro do domínioda transmembrana. Outros estudos mostram que moléculaspequenas podem atuar como melhoradores alostéricos para oreceptor acetilcolina muscarínico (35). Determinados 2-aminotiofenos atuam como melhoradores alostéricos do receptorde adenosina Al (36,37), por estabilização do complexoternário de ligante-receptor-proteína G e aumentando aassociação do receptor não ocupado e a proteína G (38) . Demodo interessante, Gao e outros (39) encontrou uma série dederivados de imidazoquinolina que atuam como melhoradoresalostéricos de ligação de agonista em receptores de adeno-sina A3. Recentemente, Rutz e outros (40) demonstrou bloqueiodireto de CpG ODN ligando à proteína de TLR9 purificadapelas moléculas pequenas coroquina e quinacrina usandoanálise de biossensor SPR. Suas verificações indicam ligaçãodireta dessas moléculas com o domínio extracelular de TLR9atuando como antagonistas da sinalização mediada por TLR9.Portanto, os oligonucleotideos descritos e moléculaspequenas podem se ligar diretamente ao TLR7 e 8. Estudos deligação empregando proteínas isoladas e respectivos ligantesde receptor forneceriam uma luz com relação ao mecanismo deação exato da combinação de ligantes TLR de molécula pequenae oligonucleotideos em TLR7 ou TLR8. Essas verificaçõespodem ter implicações importantes para o entendimento dosmecanismos de sinalização molecular dos TLRs, bem como parapesquisa farmacêutica e desenvolvimento de remédios. Foidemonstrado, de acordo com a invenção, que a atividade desinalização dos dois elementos da família de TLR, TLR8 eTLR7, pode ser manipulada pela presença ou ausência dedeterminados oligonucleotideos. Tomados em conjunto, essesresultados sugerem novos caminhos para modificar uma respostaimune usando loxoribina (ou outras moléculas pequenas) emcombinação com determinados oligonucleotideos. Quando dacombinação dessas moléculas, é possível alterar o perfil dacitocina do ligante de molécula pequena de TLR, por redire-cionamento de sua atividade de sinalização para um TLR20 diferente. Uma resposta imune alterada ou imposta seriabenéfica para o tratamento de várias doenças.

TABELA 1

SEQ ID NO: (ODN) SEQÜÊNCIA % DE ATIVIDADE DE R-84 83 6056 271 ± 1211 u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u*u 236 ± 1412 A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A* A 228 ± 3713 C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C*C 183 ± 5

10<table>table see original document page 143</column></row><table>

Tabela 1: Comparação dos efeitos sinergísticos de ODNdiferente na atividade de R-848Células HEK293 expressando hTLR8 e uma construçãorepórter NF-κΒ foram incubadas com 50 μΜ de R-848, naausência ou presença de 5 μΜ do ODN indicado. A estimulaçãode NF-κΒ por R-848, na ausência de ODN foi estabelecida com100% e o efeito na atividade de R-848 foi consequentementecalculado. Os valores representam a média (± SD) de 2-4experimentos. "N" representa A, C, G ou T em ordemaleatória, "*" ilustra uma estrutura de fosforotioato,ilustra uma estrutura de fosfodiéster.

TABELA 2

<table>table see original document page 143</column></row><table><table>table see original document page 144</column></row><table>

* indica uma ligação de fosforotioato

Referências

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Equivalentes

O relatório descritivo precedente é consideradocomo sendo suficiente para permitir que um versado natécnica pratique a invenção. A presente invenção não estálimitada em escopo aos exemplos providos, uma vez que osexemplos se destinam a ser uma ilustração simples de umaspecto da invenção e outras modalidades funcionalmenteequivalentes estão dentro do escopo da invenção. Váriasmodificações da invenção, além daquelas mostradas edescritas aqui, ficarão claras aos versados na técnica apartir da descrição precedente e se encontram dentro doescopo das reivindicações apensas. As vantagens da invençãonão estão necessariamente englobadas pelas modalidades dainvenção.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Coley Pharmaceutical Group, Inc.Coley Pharmaceutical GmbHJurk, MarionVollmer, JorgKrieg, Arthur MUhlmann, EugenNoll, Bernhard O

<120> MODULAÇÃO DE RESPOSTAS IMUNES MEDIADAS POR TLREMPREGANDO OLIGONUCLEOTÍDEOS ADAPTADORES

<130> C1041.7 005iw000

<140> Não classificado

<141> Com o mesmo

<150> US 60/720.981

<151> 27/09/2005

<160> 20

<170> PatentIn versão 3,3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<4 00> 1

cccttttttt tttcccc 17

<210> 2<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<400> 2

cccctttttt ttccccc 17<210> 3<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<400> 3

tttttttttt ttttttt

<210> 4<211> 20<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 4

tccaggactt ctctcaggtt

<210> 5<211> 18<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 5

UUUUUUUUUU UUUUUUUU

<210> 6<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 6

cccccttttt tcccccc

<210> 7<211> 17<212> DNA<213> seqüência artificial

<220>

<223> oligonucleotídeo sintético<400> 7

cccccctttt ccccccc

<210> 8<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotídeo sintético<400> 8

Cccccccttc ccccccc

<210> 9

<211> 16

<212 > DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotídeo sintético

<400> 9

tttttttttt ttttn

<210> 10<211> 15<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotídeo sintético<220>

<221> misc_feature<222> (1) .. (1)<223> η é

<400> 10ntttttttt ttttt<210> 11<211> 17

<212> RNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 11

uuuuuuuuuu uuuuuuu

<210> 12<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 12

aaaaaaaaaa aaaaaaa

<210> 13<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 13

cccccccccc CCCCCCC

<210> 14<211> 24<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 14

gggggggggg gggggggggg gggg

<210> 15<211> 24<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 15

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa

<210> 16<211> 20<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 16

gccaccgagc cgaaggcacc

<210> 17<211> 17<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<400> 17tttttttttt ttttttt

<210> 18<211> 10<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<400> 18tttttttttt

<210> 19<211> 12<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético<400> 19

tttttttttt tt 12

<210> 20<211> 14<212> DNA

<213> seqüência artificial<220>

<223> oligonucleotideo sintético

<400> 20tttttttttt tttt

14

Claims (42)

1. Uso, de um ligante de TLR7/8 e de umoligonucleotídeo adaptador, CARACTERIZADO pelo fato de que éna fabricação de um medicamento, para estimular uma respostaimune mediada por TLR 8, em um indivíduo que necessite domesmo.

2. Uso, de um oligonucleotídeo adaptador,CARACTERIZADO pelo fato de que é na fabricação de ummedicamento para redirecionar a resposta imune mediada porTLR7 para uma resposta imune mediada por TLR8 em umindivíduo experimentando uma resposta imune mediada porTLR7.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de- que o ligante de TLR 7/8 é umligante específico de TLR7.

4. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante específico de TLR7é uma guanosina substituída em C8.

5. Uso, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a guanosina substituída em C8é 7-alil-7,8-diidro-8-oxo-guanosina (Ioxoribina) , 7-tia-8-oxo-guanosina (imunosina), 8-mercaptoguanosina, 8-bromoguanosina, 8-metilguanosina, 8-oxo-7,8-diidroguanosina,C8-arilamino-2'-desoxiguanosina, C8-propinil-guanosina,ribonucleosídeos de guanina substituídos em C8 e N7, 7-metil-8-oxoguanosina, 8-aminoguanosina, 8-hidróxi 2'-desoxiguanosina, 7-deaza-8-guanosina substituída e 8-hidróxiguanosina.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 4,CARACTERIZADO pelo fato de que a guanosina substituída em C8é loxoribina.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante específico de TLR7é 7-deaza-guanosina.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 3,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante específico de TLR7é 6-amino-9-benzil-2-(3 hidróxi-propóxi)-9H purin-8-ol, ou-6-amino-9 benzil-2-butóxi-9H-purin-8-ol.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de TLR 7/8 é umligante específico de TLR8.

10. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de TLR 7/8 é um·ligante de TLR7 e um ligante de TLR8.

11. Uso, de acordo com a reivindicação 10,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de TLR7/8 é umaimidazoquinolina.

12. Uso, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que a imidazoquinolina é imidazo-quinolina amina, imidazopiridina amina, 6,7-cicloalquilimi-dazopiridina amina fundida, 1,2 imidazoquinolina aminaligada por ponte, R-848 (S-28463 ou resiquimod), 4-amino-2-etoximetil-α, a-dimetil-lH-imidazo [4,5-c]quinolinas-l-etanol,-1-(2-metilpropil)-lH-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amina (R-837ou imiquimod) ou S-27609.

13. Uso, de acordo com a reivindicação 11,CARACTERIZADO pelo fato de que a imidazoquinolina é R848.

14. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende um motivo de CpG não metilado.

15. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador não compreende um CpG não metilado.

16. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende 5' N-TTTTT-N 3', onde N équalquer nucleotideo.

17. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende 5' N-TTTTTT N 3', onde N équalquer nucleotideo.

18. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador é um homopolimero dT.

19. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideo adaptadorcompreende uma modificação na cadeia central defosforotioato.

20. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de TLR7/8 e ooligo-nucleotideo adaptador são formulados paraadministração separada.

21. Uso, de acordo com a reivindicação 1,CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante de TLR7/8 e ooligonucleotideo adaptador são conjugados um ao outro.

22. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideo adaptadoré um DNA.

23. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o oligonucleotideo adaptadoré um RNA.

24. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o medicamento é empregadocomo um antigeno.

25. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo possui umainfecção.

26. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo está comcâncer.

27. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2,CARACTERIZADO pelo fato de que o indivíduo possuialergia ou asma.

28. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende:um ligante específico de TLR 7, selecionado dogrupo consistindo em 6-amino-9-benzil-2-(3-hidróxi-propóxi)-9H-purin-8-ol e 6-amino-9-benzil-2-bütóxi-9H-purin-8-ol e umoligonucleotideo adaptador.

29. Composição, CARACTERIZADA pelo fato de quecompreende:um ligante especifico de TLR8 eum oligonucleotideo adaptador.

30. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 2 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende um motivo de CpG não metilado.

31. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador não compreende um CpG não metilado.

32. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende 5' N-TTTTT-N 3', onde N é qualquernucleotideo.

33. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende 5' N-TTTTTT-N 3', onde N é qualquernucleotideo.

34. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador é um homopolimero dT.

35. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador compreende pelo menos uma ligação internucleotideode fosforotioato.

36. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 2 9, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador é um DNA.

37. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador é um RNA.

38. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que o oligonucleotideoadaptador e o ligante especifico de TLR 7 ou o liganteespecifico de TLR 8 são conjugados um ao outro.

39. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende, adicional-mente, um antigeno.

40. Composição, de acordo com a reivindicação 28ou 29, CARACTERIZADA pelo fato de que a composição é umapreparação farmacêutica.

41. Método, para identificação de um ligante deTLR8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:contato da célula expressando TLR8 com um ligantede teste, na presença e na ausência de um oligonucleotideoadaptador, emedição da estimulação da célula expressando TLR8,em resposta ao ligante de teste na presença e na ausência dooligonucleotideo adaptador,onde um ligante de TLR8 é identificado por umaestimulação aumentada na presença do oligonucleotideo adap-tador.

42. Método, para identificar um adaptador deoligonucleotideo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:contato de uma célula expressando TLR8 com umligante de TLR7, na presença e na ausência de umoligonucleotideo adaptador de teste, emedição da estimulação da célula expressando TLR8em resposta ao ligante de TLR7 na presença e na ausência dooligonucleotideo adaptador de teste.onde um oligonucleotideo adaptador é identificadopor estimulação aumentada da célula expressando TLR8 napresença de um oligonucleotideo adaptador.