KR20150127206A - 나노입자-기재 조성물 - Google Patents

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게오르그 스타리
알렉산다르 필립 라도빅-모레노
파멜라 에이. 바스토
마이클 엔. 스턴바크
로버트 랭거
오미드 씨. 파로허저드
울리히 본 안드리안
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프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지
메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

본원에서 제공되는 것은 불활성화된 병원체 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 상기 아주반트-적재 나노입자는 불활성화된 병원체에 결합되어 있는 신규 조성물이다. 이러한 조성물은 특히 대상체의 점막에 투여될 경우, 특정 병원체에 의해 야기되는 질환을 예방 및/또는 치료하는 데에 유용하다.
[대표도]
도 6a

Description

나노입자-기재 조성물{NANOPARTICLE-BASED COMPOSITIONS}
[우선권 주장]
본 출원은 2013년 3월 14일자 U.S. 특허 출원 제61/783,439호의 우선권을 주장하는 바, 그의 전체 내용이 의거 참조로써 개재된다.
[연방 후원 연구에 관한 진술]
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)에 의해 교부되는 NIH/RO1 AI069259 및 NIH/RO1 AI072252하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 있어서 소정의 권리를 가진다.
[기술 분야]
본 발명은 나노입자를 포함하는 조성물 및 아주반트 조성물에 관한 것이다.
점막(mucosal membrane)은 신체의 가장 큰 기관 중 하나로써, 위장관로, 비뇨생식기로 및 기도의 라이닝을 포함한다. 신체 내에 위치되어 있기는 하지만, 이러한 점막들은 실제로는 외부 환경과 전신성 환경으로 알려져 있는 무균인 내부 신체 공강 사이의 물리적 장벽이다. 따라서, 점막의 중요한 기능은 무균인 신체 공강 외부로 침습성 병원체를 유지하는 것이다. 실제로, 박테리아, 바이러스, 기생충 및 진균을 포함한 거의 대부분의 인간 병원체들이 점막 표면에서 감염을 개시한다 (문헌 [Ogra et al., Clin Microbiol Rev. 14(2):430-45, 2001]).
점막 면역 반응의 자극이 점막 및 전신성 환경 모두에서 보호성 B 세포 및 T 세포의 생성을 초래함으로써 병원체가 내부 신체 공강으로 진입하기 전에 감염이 중지될 수 있기 때문에, 점막 면역은 중요하다 (예컨대 문헌 [McCluskie et al., Microbes Infect. 1(9):685-98; 1999]; [Rosenthal et al., Semin Immunol. 9(5):303-14, 1997] 참조). 그의 중요한 역할에도 불구하고, 매우 적은 수의 백신들이 점막 면역 시스템을 특이적 표적으로 하고 있다.
예방접종은 수동형 또는 능동형 중 어느 하나일 수 있다. 통상적으로, 능동형 예방접종은 차후 항체-분비 B 세포 또는 항원-특이적 이펙터 및 기억 T 세포로 이어지는 항원-특이적 미접촉 림프구의 활성화를 초래하는 내인성 면역 반응을 도출하는 1종 이상의 외래 분자에 대한 개체 면역 시스템의 노출을 수반한다. 이와 같은 접근법은 때때로 동일한 항원 물질에 대한 갱신 노출에 의해 부스팅될 수 있는 오래-지속되는 보호 면역을 초래할 수 있다. 능동형 예방접종에 있어서의 성공적인 면역 반응의 장기지속 가능성은 사전형성된 항체 또는 항원-특이적 이펙터 림프구가 수용자에게 주사되며 빠른 보호를 제공할 수 있으나 통상적으로 지속 면역을 확립하지는 못하는 수동형 예방접종에 비해 대부분의 임상 환경에서 이와 같은 전략을 더 바람직한 것이 되게 하고 있다.
본 개시는 적어도 부분적으로 불활성화된 병원체에 결합된 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하는 신규 조성물의 개발을 바탕으로 한다. 예를 들면, 상기 신규 조성물은 불활성화된 병원체, 예를 들면 박테리아 예컨대 클라미디아 트라코마티스 ( Chlamydia trachomatis ), 프란시셀라 툴라렌시스 ( Francisella tularensis), 미코박테리움 투베르쿨 로시스 (Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae ), 리스테리아 모노사이토게네스 (Listeria monocytogenes ), 비브리오 콜레라( Vibrio cholera), 쉬겔라 손네 이(Shigella sonnei ), 쉬겔라 플렉스네리 ( Shigella flexneri ) 또는 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium ), 또는 바이러스 예컨대 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 또는 C형 간염 바이러스, 그리고 톨-유사(Toll-like) 수용체 효능제, 예컨대 이미다조퀴놀린 레시퀴모드 (R-848), 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 엔도솜 막 표적화 작용제, 예컨대 엔도-포터(Endo-Porter) 펩티드와 같은 1종 이상의 아주반트가 적재되어 있는 1종 이상의 중합체성 나노입자를 포함한다. 상기 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체에 의해 형성될 수 있다. 1종 이상의 아주반트-적재 나노입자는 불활성화된 병원체 각각에 결합된다. 이러한 조성물은 특히 대상체의 점막에 투여되는 경우, 특정 병원체에 의해 야기되는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위한 백신으로 유용하다.
본원에서 제공되는 것은 또한 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 흡입, 예컨대 폐 또는 기관지, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로에 의한 점막 투여를 통하여 본원에서 기술되는 신규 백신 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 병원체, 예컨대 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이다.
일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 표면 하전되며, 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체상 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드와 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다.
예를 들면, 1종 이상의 R848-적재 중합체성 나노입자에 결합된 불활성화된 클라미디아 트라코마티스를 포함하는 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물이 제조되었으며, 마우스 모델에서 평가되었다. 불활성화된 클라미디아 트라코마티스 단독은 면역 관용(immune tolerance)을 유도하지만, 신규 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물은 점막 경로를 통하여 예를 들면 비내 또는 자궁내로 투여되는 경우 이후의 클라미디아 트라코마티스 감염을 예방하는 데에 있어서 효과적이었다. 현재 클라미디아 트라코마티스 감염에 대한 인간에서의 사용에 가용한 백신은 존재하지 않는다. 따라서, 이러한 신규 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물은 인간에서의 클라미디아 트라코마티스 감염에 대한 유망한 신규 예방 및 치료용 백신이다.
일반적으로, 일 측면에서, 본 개시는 그를 필요로 하는 대상체에서 1종 이상의 상이한 유형의 병원체, 예컨대 클라미디아 트라코마티스 또는 프란시셀라 툴라 렌시스에 대한 점막 면역 반응을 자극하는 방법을 특징으로 한다. 상기 방법은 불활성화된 형태의 병원체 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 병원체에 결합되어 있는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
이러한 방법에서, 병원체는 박테리아, 바이러스, 기생충 및/또는 진균일 수 있으며, 조성물은 1종 이상의 점막 경로, 예컨대 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 및/또는 요로 경로를 통하여 대상체에게 투여될 수 있다.
이러한 방법의 일부 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함할 수 있고/거나, 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 톨-유사 수용체 효능제, 예컨대 R-848, 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체와 같은 생분해성 중합체로 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 1종 이상의 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 및/또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드와 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 것은 악티노미세스 ( Actinomyces ), 아나바에나(Anabaena), 바실루스 (Bacillus), 박테로이데스 ( Bacteroides ), 브델로비브리오 (Bdellovibrio), 보르데텔라 ( Bordetella ), 보렐리아 ( Borrelia ), 브루셀 라( Brucella ), 캄필로박터 (Campylobacter), 카울로박터 ( Caulobacter ), 클라미디아( Chlamydia ), 클로로비움( Chlorobium ), 크로마티움 ( Chromatium ), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움 ( Corynebacterium ), 사이토파가 ( Cytophaga ), 데이노코쿠스(Deinococcus), 엔테로코쿠스 ( Enterococcus ), 에스케리 키아 ( Escherichia ), 프란시셀라 ( Francisella ), 할로박테 리움(Halobacterium), 헬리오박터 ( Heliobacter ), 해모필루스 ( Haemophilus ), 하이포미크로비움 (Hyphomicrobium), 레지오넬라( Legionella ), 렙트스피로시스 ( Leptspirosis ), 리스테리아 ( Listeria ), 메 닝고코쿠스(Meningococcus) A, B 및 C, 메타노박테리움 ( Methanobacterium ), 미크로코쿠스(Micrococcus), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라스마( Mycoplasma ), 믹소코쿠스 ( Myxococcus ), 네이세리아 ( Neisseria ), 니트로박터 (Nitrobacter), 오스실라 토리아 ( Oscillatoria ), 프로클로론 ( Prochloron ), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스( Pseudomonas ), 포도스피릴룸 ( Phodospirillum ), 리케 차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라( Shigella ), 스피릴룸 ( Spirillum ), 스피로카에타(Spirochaeta), 스타필루코쿠스 (Staphylococcus), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus), 스트렙토미세스 ( Streptomyces ), 술폴로부스 ( Sulfolobus ), 서모플라스마 (Thermoplasma), 티오바실루스 ( Thiobacillus ), 트레포네마( Treponema ), 비브리오(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia)로 구성되는 군에서 선택되는 박테리아에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이다. 일부 실시양태에서는, 클라미디아 트라코마티스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 것은 아데노비리다에(Adenoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 아르테리바이러스(Arterivirus), 아스트로비리다에(Astroviridae), 바큘로비리다에(Baculoviridae), 바드나바이러스(Badnavirus), 바마비리다에(Bamaviridae), 비마비리다에(Bimaviridae), 브로모비리다에(Bromoviridae), 부니야비리다에(Bunyaviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 카필로바이러스(Capillovirus), 카를라바이러스(Carlavirus), 카울리모바이러스(Caulimovirus), 시르코비리다에(Circoviridae), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모비리다에(Comoviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 코르티코비리다에(Corticoviridae), 시스토비리다에(Cystoviridae), 델타바이러스(Deltavirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 플라비비리다에(Flaviviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 하이포비리다에(Hypoviridae), 이리도비리다에(Iridoviridae), 레비비리다에(Leviviridae), 리포트릭스비리다에(Lipothrixviridae), 마이크로비리다에(Microviridae), 오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 파필로마비리다에(Papillomaviridae), 파포바비리다에(Papovaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 폴리오마비리다에(Polyomaviridae), 폭스비리다에(Poxviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 랍도비리다에(Rhabdoviridae), 토가비리다에(Togaviridae) 및 토티비리다에(Totiviridae)로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이다. 일부 실시양태에서는, 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, SARS 코로나바이러스(coronavirus)에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 노로바이러스(Noroviruse)에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서는, 인간 면역결핍 바이러스에 대한 대상체에서의 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
또 다른 일반적인 측면에서, 본 개시는 1종 이상 상이한 유형의 불활성화된 병원체, 예를 들면 클라미디아 트라코마티스 또는 프란시셀라 툴라렌시스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물에서, 불활성화된 병원체는 불활성화된 박테리아, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 기생충 및/또는 불활성화된 진균일 수 있다. 예를 들면, 불활성화된 병원체는 클라미디아 트라코마티스 , 프란시셀라 툴라렌시스, 미코박테리움 투베르쿨 로시스 , 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 , 리스테리아 모 노사이토게네스 , 비브리오 콜레라, 쉬겔라 손네이 , 쉬겔라 플렉스네리 및/또는 살모넬라 티피무리움으로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 박테리아일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 1종 이상 상이한 유형의 불활성화된 병원체, 예를 들면 클라미디아 트라코마티스 또는 프란시셀라 툴라렌시스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자로 구성되거나 본질적으로 그것으로 구성되며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되어 있다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 톨-유사 수용체 효능제는 R848 또는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드일 수 있다.
다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합된다.
상기 조성물은 예를 들면 본원에서 더욱 상세하게 기술될 바와 같은 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 악티노미세스 , 아나바에나 , 바실루스 , 박테로이데스 , 브델로비브리오 , 보르데텔라 , 보렐리아 , 브루셀라, 캄필로박터 , 카울로박터 , 클라미디아, 클로로비움, 크로마티움, 클로스트리디움, 코리네박테리움 , 사이토파가 , 데이노코쿠스, 엔테로코쿠스 , 에스케리 키아 , 프란시셀라 , 할로박테리움 , 헬리오박터 , 해모필루스 , 하이포미크로비움 , 레지오넬라, 렙트스피로시스, 리스테리아 , 메닝고코쿠스 A, B 및 C, 메타노박테리움 , 미크로코쿠스, 미코박테리움, 미코플라스마, 믹소코쿠스 , 네이세리아 , 니트로박터 , 오스실라 토리아 , 프로클로론 , 프로테우스, 슈도모나스, 포도스피릴룸 , 리케차, 살모넬라, 쉬겔라, 스피릴룸 , 스피로카에타 , 스타필루코쿠스 , 스트렙토코쿠스 , 스트렙토미세스 , 술폴로부스 , 서 모플라스마 , 티오바실루스 , 트레포네마, 비브리오 및 예르시니아로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 박테리아를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 클라미디아 트라코마티스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨로시스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 아데노비리다에, 아레나비리다에, 아르테리바이러스, 아스트로비리다에, 바큘로비리다에, 바드나바이러스, 바마비리다에, 비마비리다에, 브로모비리다에, 부니야비리다에, 칼리시비리다에, 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카울리모바이러스, 시르코비리다에, 클로스테로바이러스, 코모비리다에, 코로나비리다에, 코르티코비리다에, 시스토비리다에, 델타바이러스, 디안토바이러스, 에나모바이러스, 플라비비리다에, 필로비리다에, 플라비비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 하이포비리다에, 이리도비리다에, 레비비리다에, 리포트릭스비리다에, 마이크로비리다에, 오르소믹소비리다에, 파필로마비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에, 파르보비리다에, 피코르나비리다에, 폴리오마비리다에, 폭스비리다에, 레오비리다에, 레트로비리다에, 랍도비리다에, 토가비리다에 및 토티비리다에로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 SARS 코로나바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 노로바이러스를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에서 개시되는 조성물은 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 클라미디아 트라코마티스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 R848이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 클라미디아 트라코마티스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 R848이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 프란시셀 라 툴라렌시스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 프란시셀라 툴라렌시스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨 로시스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 모노포스포릴 지질 A이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV); 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 R848이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 인간 호흡기 세포융합 바이러스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 SARS 코로나바이러스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 SARS 코로나바이러스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 SARS 코로나바이러스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 SARS 코로나바이러스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 SARS 코로나바이러스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 노로바이러스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 노로바이러스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 노로바이러스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 노로바이러스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 노로바이러스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시는 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스; 및 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스에 결합되어 있는 조성물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 엔도솜 막 및/또는 톨-유사 수용체 효능제를 표적으로 하는 아주반트를 포함한다. 예를 들면, 상기 아주반트는 R848, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 및 모노포스포릴 지질 A 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 모노포스포릴 지질 A이다. 다양한 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 생분해성 중합체, 예컨대 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체로 제조될 수 있다. 특정 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스에 결합된다. 다른 실시양태에서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 링커, 예를 들면 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드 중 1종 이상과 같은 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스에 결합된다. 상기 조성물은 예를 들면 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통한 점막 투여에 적합한 형태로 설계될 수 있다. 일부 실시양태에서는, 본원에서 기술되는 조성물을 투여하는 것에 의한, 대상체에서의 인간 면역결핍 바이러스에 대한 점막 면역 반응의 자극 방법이 제공된다.
본원에서 사용될 때의 "병원체"는 그의 숙주에서 질환을 야기하는 감염 인자이다. 병원체는 박테리아, 바이러스, 기생충, 진균 또는 기타 미생물성 감염 인자일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "나노입자"는 예컨대 50 내지 500 nm 사이인 직경을 가지는 500 nm 내지 0.5 nm 미만까지 사이 범위의 입자이다.
본원에서 사용될 때, "아주반트"라는 용어는 면역학적 아주반트를 지칭한다. 그것은 병원체에 대한 면역 시스템의 반응을 강화 또는 촉진함으로써 대상체에서 면역 반응 또는 일련의 면역 반응들을 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 아주반트는 예를 들면 데포(depot)를 형성하거나 (조성물의 반감기를 연장함), 추가적인 T-세포 도움을 제공하거나, 및/또는 시토카인 생성을 자극하는 것에 의해 조성물의 효과를 촉진할 수 있다.
본원에서 사용될 때, "대상체"는 동물, 예컨대 포유동물, 예컨대 인간, 원숭이, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼 또는 마우스이다.
본원에서 사용될 때, "치료"는 예방적 또는 치료적일 수 있다. 예방적 치료는 감염성 병원체로부터의 질환 발생의 위험성이 있는 대상체를 치료하는 데에 사용될 수 있다. 풍토성 감염 질환 지역으로 여행을 하거나 거기에 살고 있는 개체들은 특정 감염성 병원체의 위험성이 있으며, 그에 대한 예방적 예방접종의 후보인 것으로 간주될 수 있다. 백신을 사용한 치료적 치료는 걸려있는 병원체에 대한 대상체의 면역 반응을 개시하거나 강화하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서 일반적으로 사용될 때, "유효량"은 치료되는 대상체에서 보호 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 백신의 실제 유효량은 이용되는 구체적인 병원체 및 아주반트, 제제화되는 구체적인 백신 조성물, 투여 양식, 그리고 예방접종되는 대상체의 연령, 체중, 상태는 물론, 투여 경로 및 질환 또는 장애에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 사용될 때, "면역자극성"은 물질이 면역 시스템에 대한 자극 효과를 가지고 있음을 의미한다. 그와 같은 물질은 시토카인 분비, 항체 생성, NK 세포 활성화 및 T 세포 증식과 같은 면역 반응의 다양한 측면들을 표시하는 표준 검정을 사용하여 용이하게 식별될 수 있다. 예를 들면 WO 97/28259호; WO 98/16247호; WO 99/11275호; 문헌 [Krieg et al. (1995) Nature 374:546-549]; [Yamamoto et al. (1992) J. Immunol. 148:4072-76]; [Ballas et al. (1996) J. Immunol. 157:1840-45]; [Klinman et al. (1997) J. Immunol. 158:3635-39]; [Sato et al. (1996) Science 273:352-354]; [Pisetsky (1996) J. Immunol. 156:421-423]; [Shimada et al. (1986) Jpn. J. Cancer Res. 77:808-816]; [Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156:4570-75]; [Roman et al. (1997) Nat. Med. 3:849-854]; [Lipford et al. (1997a) Eur. J. Immunol. 27:2340-44]; WO 98/55495호 및 WO 00/61151호를 참조하라. 적절하게, 이들 및 기타 방법들이 면역자극성 뉴클레오티드, 면역 자극성인 단리 핵산과 같은 면역자극성 물질들을 식별, 시험 및/또는 확인하는 데에 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "커플링하다" 또는 "커플링된" 또는 "커플" (등)은 일 실재물 (예를 들면 잔기)을 또 다른 것과 화학적으로 결합시키는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 커플링은 공유의 것으로써, 2개 잔기 사이의 공유 결합의 존재라는 맥락에서 커플링이 이루어진다는 것을 의미한다. 비-공유 실시양태에서, 비-공유 커플링은 비제한적으로 전하 상호작용, 친화성 상호작용, 금속 배위, 물리적 흡착, 숙주-게스트 상호작용, 소수성 상호작용, TT 적층 상호작용, 수소 결합 상호작용, 반 데르 발스 상호작용, 자기 상호작용, 정전기적 상호작용, 쌍극자-쌍극자 상호작용 및/또는 이들의 조합을 포함한 비-공유 상호작용에 의해 매개된다. 소정 실시양태에서는, 캡슐화가 커플링의 형태이다.
본원에서 사용될 때, "캡슐화하다"는 합성 나노입자 내에 봉입하는 것, 바람직하게는 합성 나노입자 내에 완전히 봉입하는 것을 의미한다. 캡슐화되는 물질의 대부분 또는 전체가 합성 나노입자 외부의 국소적 환경에 노출되지 않는다. 캡슐화는 물질의 대부분 또는 전체가 합성 나노입자의 표면상에 위치하며 합성 나노입자 외부의 국소적 환경에 노출된 물질이 이탈되는 흡착과는 구별된다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 보편적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 등가인 방법 및 물질들이 본 발명의 실시 또는 시험시 사용될 수 있기는 하지만, 적합한 방법 및 물질은 하기하는 것이다. 본원에서 언급되는 모든 공개, 특허 출원, 특허 및 기타 참고문헌들은 그 전체가 참조로써 개재된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선하게 된다. 또한, 물질, 방법 및 실시예들은 단지 예시적인 것으로써, 제한하고자 하는 것이 아니다.
본 발명의 기타 특징 및 장점들은 하기의 상세한 설명 및 청구범위에서 드러나게 될 것이다.
도 1a는 차후의 살아 있는 클라미디아 접종에 대한 강화된 감수성을 초래한 UV-불활성화 Ct (UV-Ct)를 사용한 자궁내 면역화를 보여주는 점도표로써, UV-Ct에 의해 면역 관용이 유도됨을 표시한다.
도 1b는 아주반트의 공동-투여가 UV-Ct 유도 면역 관용을 극복하지 못한다는 것을 보여주는 점도표이다.
도 1c-1d는 UV-Ct 유도 면역 관용이 FoxP3+ Treg 세포에 의해 매개된다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 1e는 항-CD25 모노클로날 항체를 사용한 처리가 UV-Ct 유도 면역 관용을 극복한다는 것을 보여주는 점도표로써, CD4+ FoxP3+ Treg 세포가 UV-Ct 유도 면역 관용을 매개함에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 표시한다.
도 1f는 IL-10 결핍이 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용을 무효화한다는 것을 보여주는 점도표로써, Treg-분비 IL-10이 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인해준다.
도 2a는 표면 전하-스위칭 합성 아주반트 입자 (cSAP)가 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합하는 것을 예시하는 개략도이다.
도 2b는 불활성화된 클라미디아 트라코마티스의 표면에 대한 R848-적재 나노입자의 결합을 보여주는 냉동-TEM (냉동 투과 전자 현미경) 영상이다.
도 2c는 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 대한 나노입자의 결합을 확인해주는 동적 광 산란 그래프이다.
도 2d-2e는 7.4 및 6.0의 pH에서의 알렉사 플루어 488 표지된 cSAP 또는 PLH 기가 결핍되어 있는 대조 입자 (SAP) 중 어느 하나와의 백라이트-염색 UV-Ct의 결합을 보여주는 일련의 유동 세포측정법 그래프 및 상응하는 히스토그램이다.
도 2f는 UV-Ct-cSAP을 포함하는 백신 조성물을 사용한 면역화가 차후의 살아 있는 클라미디아 접종에 대하여 마우스를 보호한다는 것을 보여주는 점도표이다.
도 2g는 UV-Ct에의 결합 전의 R848-적재 cSAP의 적정 또는 중화가 백신 조성물의 면역 보호 특성을 변화시키지 않는다는 것을 보여주는 점도표이다.
도 2h는 UV-Ct-cSAP을 포함하는 백신 조성물에 의한 IgG 유도를 보여주는 점도표이다. 데이터는 2회 개별 실험의 것을 합쳤다. n.d. = 검출되지 않음.
도 3a-3d는 신규 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물에 의해 자극 되는 보호 면역이 CD4+ T 세포에 의해 매개된다는 것을 보여주는 일련의 점도표이다.
도 4a는 UV-불활성화된 클라미디아 (UV-Ct)를 사용하여 면역화된 마우스 또는 비감염 대조 마우스 (미접촉)와 비교하였을 때, 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP) 또는 감염성 클라미디아 (Ct)를 사용하여 접종된 마우스의 림프절에 상당히 더 많은 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD4+ T 세포가 존재한다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 4b는 Ct 또는 UV-Ct-cSAP을 사용하여 면역화된 마우스에서의 클라미디아-특이적 CD90.1+ CD4+ T 세포의 수가 비감염 마우스 또는 UV-Ct를 사용하여 면역화된 마우스에서의 것을 크게 초과한다는 것을 보여주는 일련의 유동 세포측정법 그래프로써, Ct 및 UV-Ct-cSAP은 클라미디아-특이적 CD4+ T 세포 증식을 유도하나, UV-Ct는 그렇지 않다는 것을 표시한다.
도 4c는 UV-Ct를 사용하여 면역화된 마우스 또는 비감염 대조 마우스와 비교하였을 때, Ct 또는 UV-Ct-cSAP을 사용하여 면역화된 마우스에서 3종 전체 시토카인 (TNF-α, IFN-γ 및 IL-2)을 생성시키는 CD90.1+ CD4+ T 세포의 수가 상당히 더 많다는 것을 보여주는 일련의 파이 차트이다.
도 5a는 F4/80+ CD103- 대식세포는 높은 수준의 CD11b 및 CX3CR1을 발현하나, 낮은 수준의 CD11c를 발현하며; F4/80- CD103- 수지상 세포는 높은 수준의 CD11c, CD11b 및 CX3CR1을 발현하고; F4/80- CD103+ 수지상 세포는 낮은 수준의 CD11b 및 CX3CR1을 발현하나, 높은 수준의 CD11c를 발현한다는 것을 보여주는 일련의 유동 세포측정법 그래프이다.
도 5b 및 5c는 CD103- 수지상 세포가 자궁 (5b) 및 림프절 (5c) 모두에서 F4/80+ 대식세포 및 CD103+ 수지상 세포에 비해 상당히 더 높은 클라미디아 부하를 가진다는 것을 보여주는 일련의 점도표로써, CD103- 수지상 세포가 클라미디 아를 인식하고 제시하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 표시한다.
도 5d 및 5e는 감염성 클라미디아 (Ct) 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용하여 면역화된 마우스의 자궁으로부터 단리된 CD103- 수지상 세포는 시험관내 (5d) 및 생체내 (5e) 모두에서 클라미디아-특이적 CD90.1+ CD4+ 트랜스제닉 T 세포 (NR1 세포)의 증식을 유도하나, 다른 항원 제시 세포들은 그렇지 않다는 것을 보여주는 일련의 막대 그래프이다.
도 5f는 CD103+ 수지상 세포가 UV-Ct 면역화 후 FoxP3+ CD25+ NR1 세포의 수를 증가시킨다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6a는 신규 백신 조성물 또는 감염성 클라미디아를 사용한 자궁내 면역화는 면역화 후 6개월 동안 차후의 생식기 클라미디아 감염에 대하여 보호를 초래하나, 불활성화된 클라미디아는 그렇지 않다는 것을 보여주는 점도표이다.
도 6b는 신규 백신 조성물을 사용한 비내 면역화는 차후의 생식기 클라미디아 감염에 대하여 보호 면역을 초래하나, 피하 면역화는 그렇지 않다는 것을 보여주는 점도표로써, 신규 백신 조성물에 의해 점막-횡단 보호 면역이 유도된다는 것을 표시한다.
도 6c는 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD4+ T 세포의 자궁으로 돌아가는 조직이 자궁내 또는 비내 면역화에 의해서는 유도되나, 피하 면역화에 의해서는 그렇지 않다는 것을 보여주는 일련의 유동 세포측정법 그래프이다.
도 6d는 자궁내 (i.u.) 또는 비내 (i.n) 경로 중 어느 하나에 의한 UV-Ct-cSAP을 사용한 면역화는 생식기 점막 및 폐에서의 보호성 NR1 세포의 동원 및 보유를 유도하나, 피하 (s.c.) 경로에 의해서는 그렇지 않다는 것을 보여주는 일련의 막대 그래프이다. 간, 림프절, 비장 또는 혈액 중 NR1 세포의 수는 상이한 면역화 경로들 간에 유사하다.
도 7a는 실시예 5의 실험 프로토콜을 보여주는 개략도이다.
도 7b-7c는 α4 인테그린을 효율적으로 차단하는 것이 자궁에서의 T 세포 축적은 방지하지만 (7c), 비장에서의 NR1 세포의 수에는 효과가 없다는 것 (7b)을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7d는 비장에 존재하는 전신성 NR1 세포가 α4 항체 주사에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7e는 NR1 세포의 축적이 IgG를 사용하여 처리된 Gr.1 마우스 및 클라미디아 접종 후에만 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.3 마우스에서는 관찰되나, 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.2 마우스에서는 예방접종 및 접종 후 모두에서 관찰되지 않음을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7f는 클라미디아 접종 후에만 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.3 마우스 (자궁-체류 기억 T 세포는 함유하나 추가적으로 동원되는 순환성 기억 세포는 함유하지 않는 군)가 미접촉 대조 마우스, 및 면역화 및 접종 후 모두에 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.2 마우스에 비해 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호되었음을 보여주는 점도표이다.
도 8a는 실시예 6의 부생 실험 프로토콜을 보여주는 개략도이다.
도 8b-8c는 군 A 마우스의 양 배우체는 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호되나 (8b); 군 B 마우스에서는 면역화된 배우체 (CD45.2)만이 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호되며, 다른 배우체 (CD45.1)는 그렇지 않음 (8c)을 보여주는 점도표이다.
도 8d-8e는 보호되지 않은 마우스에 비해 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호된 마우스에 더 많은 NR-1 세포가 존재한다는 것을 보여주는 막대 그래프이다.
도 8f-8g는 UV-Ct를 사용한 면역화가 부생 시점과 관계가 없는 면역 관용을 유도한다는 것을 보여주는 점도표이다.
도 9a는 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스가 프란시셀라 툴라렌시스의 약독화된 LVS 균주에 의한 차후의 접종에 대하여 완전히 보호된다는 것을 보여주는 선 그래프이다.
도 9b는 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스가 프란시셀라 툴라렌시스의 완전히 병독성인 SchuS4 균주에 의한 차후의 접종에 대하여 부분적으로 보호된다는 것을 보여주는 선 그래프이다.
도 9c-9d는 복강내 경로에 의해서는 UV-LVS-cSAP을 사용한 면역화 후 프란시셀라 툴라렌시스의 약독화된 LVS 균주를 사용한 차후의 접종에 대한 완전한 보호가 수득되나 (9c), 피하 경로에 의해서는 그렇지 않다는 것 (9d)을 보여주는 선 그래프이다.
도 9e-9f는 유도되는 IgG (9e) 및 IgM (9f) 항체의 농도가 살아 있는 LVS-감염 마우스에서에 비해 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스에서 더 높다는 것을 보여주는 선 그래프이다.
모든 도면에 있어서, * = p<0.05, ** = p<0.01, *** = p<0.001.
본 개시는 적어도 부분적으로 불활성화된 병원체에 결합된 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자를 포함하는 신규 백신 조성물의 개발을 바탕으로 한다. 예를 들면, 상기 신규 백신 조성물은 불활성화된 병원체, 예를 들면 박테리아 예컨대 클라미디아 트라코마티스 , 프란시셀라 툴라렌시스 , 미코박테리움 투베르쿨 로시스 , 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 , 리 스테리아 모노사이토게네스 , 비브리오 콜레라, 쉬겔라 손네이 , 쉬겔라 플렉스네리 또는 살모넬라 티피무리움, 또는 바이러스 예컨대 인플루엔자 바이러스, 인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스, 그리고 톨-유사 수용체 효능제, 예컨대 이미다조퀴놀린 레시퀴모드 (R-848), 모노포스포릴 지질 A 또는 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 엔도솜 막 표적화 작용제, 예컨대 엔도-포터 펩티드와 같은 아주반트가 적재되어 있는 1종 이상의 중합체성 나노입자를 포함한다. 상기 1종 이상의 아주반트-적재 나노입자는 불활성화된 병원체 각각에 결합된다. 이러한 백신 조성물은 특히 대상체의 점막에 투여되는 경우, 특정 병원체에 의해 야기되는 질환을 예방 및/또는 치료하는 데에 유용하다.
본원에서 개시되는 백신 조성물은 예컨대 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 전체 병원체 각각에 결합되어 있는 1종 이상의 아주반트-적재 나노입자를 포함한다. 이와 같은 결합 메카니즘은 정전기적 인력, 공유 커플링 또는 소수성 상호작용일 수 있다. 상기 아주반트는 수지상 세포를 표적으로 하는 분자, 예를 들면 톨-유사 수용체 효능제, 예컨대 TLR7/TLR8의 강력한 합성 효능제로 인식되어 있는 R-848, 또는 TLR-9의 면역자극성 효능제인 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드, 또는 TLR-4의 면역자극성 효능제인 모노포스포릴 지질 A, 또는 엔도솜 막을 표적으로 하는 작용제, 예를 들면 엔도-포터 펩티드일 수 있다.
오늘날 가용한 거의 대부분의 백신들이 전신성 면역 시스템을 표적으로 함으로써, 병원체가 점막 장벽을 횡단하여 보통 무균인 전신성 환경에 진입한 후에 질환 진행을 차단하고 있다. 본원에서 개시되는 백신 조성물은 점막을 표적으로 하여 면역화되는 대상체의 점막 면역을 자극함으로써, 백신에 포함되는 불활성화된 병원체의 활성 형태에 의한 감염으로부터 대상체를 보호할 수 있다. 이러한 백신 조성물은 병원체의 최초 집락화 및 복제를 예방하는 것, 또는 더 이상의 감염 진행을 차단하는 것 중 어느 하나에 의해 면역 보호를 달성한다. 따라서, 이러한 백신 조성물은 예방용 및 치료용 모두이다.
불활성화된 병원체
본원에서 사용될 때의 "병원체"는 그의 숙주에서 질환을 야기하는 감염 인자이다. 병원체는 박테리아, 바이러스, 기생충, 진균 또는 기타 미생물성 감염 인자일 수 있다. 병원체에 대한 많은 백신들이 살아있거나 약독화된 미생물을 포함한다. 그러나, 특히 면역-훼손 수용자에게 투여될 경우, 살아있거나 약독화된 백신은 때로는 감염성 병리를 야기할 수 있다. 다른 백신은 1종 이상의 병원체 용해물 정제 성분, 예컨대 1종 이상의 표면 탄수화물 또는 재조합 병원체-유래 단백질을 이용한다. 그러나, 이와 같은 유형의 백신에서는, 병원성 항원의 부분적인 제시로 인하여 불완전한 보호가 나타날 수 있다. 백신에 포함되지 않는 병원성 항원들 역시 면역화되는 개체에서 감염성 병리를 야기할 수 있다.
본원에서 개시되는 백신 조성물은 1종 이상의 불활성화된 전체 병원체, 예를 들면 불활성화된 박테리아, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 기생충 또는 불활성화된 진균을 포함한다. 본원에서 개시되는 백신 조성물의 수용자는 특정 병원체의 전체 범위의 병원성 항원을 제시받으며, 그에 따라 그 병원체에 대한 완전한 면역 보호를 획득한다.
전체 병원체는 관련 기술분야에 알려져 있는 물리적 또는 화학적 처리, 예를 들면 UV 광, 승온, 고정, 이온화 방사선, 파라포름알데히드, 포르말린, 히드록실아민, 페놀, 폴리소르베이트 등에의 노출에 의해 불활성화될 수 있다. 불활성화 방법의 유형은 전체 병원체의 면역원성을 유지한다는 관점에서 선택될 수 있다.
박테리아 병원체는 탄저병, 박테리아성 수막염, 보툴리눔독소증, 브루셀라증, 묘소병, 콜레라, 디프테리아, 유행성 발진티푸스, 임질, 농가진, 나병 (한센병), 리스테리아증, 류마티스열, 노카르디아증, 백일해 (백일 기침), 페스트, 폐렴구균성 폐렴, 앵무새병, Q열, 록키산 홍반열 (RMSF), 살모넬라증, 성홍열, 이질, 매독, 파상풍, 트라코마, 결핵, 야토병, 장티푸스, 발진티푸스 및 요로 감염과 같은 박테리아성 질환을 야기한다.
본원에서 개시되는 백신 조성물에서는 1종 이상의 불활성화된 전체 박테리아가 병원체로 사용될 수 있는데, 하기의 박테리아 속들 중 어느 것에서 유래할 수 있다: 악 티노미세스 , 아나바에나 , 바실루스 (예컨대 바실루스 안트라시스 (Bacillus anthracis )), 박테로이데스 , 브델로비브리오 , 보르데텔라 , 보렐리아 , 브루셀라, 캄필로박터 , 카울로박터 , 클라미디아, 클로로비움, 크로마티움 , 클로스트리디움, 코리네박테리움 , 사이토파가 , 데이노코쿠스, 엔테로코쿠스 , 에스케리 키아 , 프 란시셀라 (예컨대 프란시셀라 툴라렌시스), 할로박테리움 , 헬리오박터 , 해모필루스 (예컨대 해모필루스 인플루엔자( Hemophilus influenza) 유형 B), 하이포미크로비움 , 레지오넬라, 렙트스피로시스 , 리스테리아, 메닝고코쿠스 A, B 및 C, 메타노박테리움 , 미크로코쿠스, 미코박테리움 (예컨대 미코박테리움 투베르쿨 로시스), 미코플라스마, 믹소코쿠스 , 네이세리아 , 니트로박터 , 오스실라 토리 아, 프로클로론 , 프로테우스, 슈도모나스 (예컨대 슈도모나스 뉴모니아 (Pseudomonas pneumonia)), 포도스피릴룸 , 리케차, 살모넬라, 쉬겔라, 스피릴룸 , 스피로카에타 , 스타필루코쿠스 , 스 트렙토코쿠스 (예컨대 스트렙토코쿠스 뉴모니아에), 스트렙토미세스 , 술폴로부스 , 서모플 라스마, 티오바실루스 , 트레포네마, 비브리오 (예컨대 비브리오 콜레라) 및 예르시니아.
바이러스 병원체는 AIDS, AIDS-관련 복합증, 수두, 감기-인플루엔자 (플루), 뎅기열, 족구병, 간염, 단순 헤르페스, HPY, 라사열, 홍역, 볼거리, 회색질척수염, 광견병, SARS, 천연두, 바이러스성 뇌염, 바이러스성 위장염, 바이러스성 수막염, 바이러스성 폐렴, 웨스트 나일병 및 황열과 같은 바이러스성 질환들을 야기한다.
본원에서 개시되는 백신 조성물에서는 1종 이상의 불활성화된 바이러스가 병원체로 사용될 수 있는데, 하기 바이러스 과들 중 어느 것에서 유래할 수 있다: 아데노비리다에, 아레나비리다에, 아르테리바이러스, 아스트로비리다에, 바큘로비리다에, 바드나바이러스, 바마비리다에, 비마비리다에, 브로모비리다에, 부니야비리다에, 칼리시비리다에, 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카울리모바이러스, 시르코비리다에, 클로스테로바이러스, 코모비리다에, 코로나비리다에 (예컨대 코로나바이러스, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 바이러스), 코르티코비리다에, 시스토비리다에, 델타바이러스, 디안토바이러스, 에나모바이러스, 플라비비리다에, 필로비리다에 (예컨대 마르부르크 바이러스 및 에볼라 바이러스 (예컨대 자이르, 레스톤, 아이보리 코스트 또는 수단 주)), 플라비비리다에 (예컨대 C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스 1, 뎅기 바이러스 2, 뎅기 바이러스 3 및 뎅기 바이러스 4), 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에 (예컨대 인간 헤르페스 바이러스 I, 3, 4, S, 및 6, 및 사이토메갈로바이러스), 하이포비리다에, 이리도비리다에, 레비비리다에, 리포트릭스비리다에, 마이크로비리다에, 오르소믹소비리다에 (예컨대 인플루엔자 바이러스 A 및 B 및 C), 파필로마비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에 (예컨대 홍역, 볼거리 및 인간 호흡기 세포융합 바이러스), 파르보비리다에, 피코르나비리다에 (예컨대 폴리오바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스 및 압토바이러스), 폴리오마비리다에, 폭스비리다에 (예컨대 우두 및 천연두 바이러스), 레오비리다에 (예컨대 로타바이러스), 레트로비리다에 (예컨대 렌티바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 HIV I 및 HIV 2), 랍도비리다에 (예를 들면 광견병 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스 등), 토가비리다에 (예를 들면 루벨라 바이러스, 뎅기 바이러스 등) 및 토티비리다에.
바이러스-기재 백신은 바이러스-유사 입자, 또는 항원성 바이러스 단백질을 함유하는 슈도유형 바이러스, 예컨대 RSV, HIV 또는 노로바이러스를 사용하여 제조될 수도 있다.
기생성 병원체는 아프리카 트리파노소마증, 아메바증, 회충증, 바베시아증, 샤가스병, 간흡충증, 와포자충증, 낭미충증, 열두조충증, 메디나충증, 포충증, 요충증, 간질증, 비대흡충증, 사상충증, 자유-생활 아메바 감염, 편모충증, 턱구충증, 왜소조충증, 포자충증, 칼라-아자르, 리슈만편모충증, 말라리아, 요코가와흡충증, 구더기증, 회선사상충증, 이감염증, 요충 감염, 옴, 주혈흡충증, 조충증, 개회충증, 톡소포자충증, 선모충증(Trichinellosis), 선모충증(Trichinosis), 편충증, 질편모충증 및 파동편모충증과 같은 기생성 질환들을 야기한다.
본원에서 개시되는 백신 조성물에서는 1종 이상의 불활성화된 기생충이 병원체로 사용될 수 있는데, 하기에서 유래할 수 있다: 예를 들면 아스카리스 룸브리코이데스 ( Ascaris lumbricoides ), 바베시아 미크로티 ( Babesia microti ), 바베시아 둔카니 ( Babesia duncani ), 브루지아 말라이이 (Brugia malayi ), 브루지아 티모리 ( Brugia timori ), 클로노르키스 시넨시스 ( Clonorchis sinensis ), 크립토스포리듐( Cryptosporidium ), 디필로보트리움 ( Diphyllobothrium ), 드라쿤큘루스 메디넨시스 (Dracunculus medinensis ), 에키노코쿠스 그라눌로수스 ( Echinococcus granulosus ), 엔트아메바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica ), 엔테로비우스 베르미큘라리스 ( Enterobius vermicularis), 파씨올라 헤파티카 ( Fasciola hepatica), 파씨올라 기간티카 ( Fasciola gigantica ), 파씨올롭시스 부스키 (Fasciolopsis buski ), 가르디아 람블리카 ( Gardia lamblia ), 그나토스토마 ( Gnathostoma ), 히메놀레피스 (Hymenolepis), 이소스포라 벨리 ( Isospora belli ), 레이쉬마니아 ( Leishmania ), 만소넬라(Mansonella), 메타고니무스 ( Metagonimus ), 나에글레리아 포울레리 ( Naegleria fowleri ), 온코세르카 볼불루스 ( Onchocerca volvulus ), 플라스모듐 잘시파룸(Plasmodium Jalciparum ), 사르콥테스 스카비에이 ( Sarcoptes scabiei ), 쉬 스토소마 만소니 ( Schistosoma mansoni ), 타에니아 솔리움 ( Taenia solium ), 톡소카라 ( Toxocara ), 톡소플라스마 곤디이 (Toxoplasma gondii ), 트리키넬라 스피랄리스 ( Trichinella spiralis ), 트리큐리스 트리키우라 ( Trichuris trichiura ), 트리코모나스 바기날리스 ( Trichomonas vaginalis ), 트리파노소마 브루세이 ( Trypanosoma brucei ), 트리파노소마 크루지 ( Trypanosoma cruzi ), 톡소플라스마 곤디 이(Toxoplasma gondii ), 트리코모나스 바기날리스 ( Trichomonas vaginalis ) 또는 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti).
병원성 진균은 숙주에서 아스페르길루스증, 분아균증, 칸디다증, 콕시디오이데스진균증, 크립토코쿠스증, 히스토플라스마증 및 족부 백선과 같은 진균성 질환들을 야기한다. 본원에서 개시되는 백신 조성물에서는 1종 이상의 불활성화된 진균이 병원체로 사용될 수 있는데, 진균 속들, 예컨대 아스페르길루 스( Aspergillus ), 블라스토미세스 ( Blastomyces ), 칸디 다( Candida ), 콕시디오이데스 ( Coccidioides ), 크립토코쿠 스( Cryptococcus ), 히드토플라스마 ( Histoplasma ), 뉴모시스티스 ( Pneumocystis ), 스 타키보트리 스(Stachybotrys), 트리코피톤(Trichophyton)에서 유래할 수 있다.
중합체성 나노입자
본원에서 개시되는 백신 및 아주반트 조성물은 1종 이상의 아주반트-적재 나노입자 또는 나노캐리어를 포함한다. 상기 나노입자를 형성하는 중합체는 임의의 생분해성 또는 비-생분해성인 합성 또는 천연 중합체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 중합체는 생분해성 중합체이다. 유용한 생분해성 중합체의 예에는 폴리락트산 (PLA), 폴리(글리콜산) (PGA) 또는 폴리(락트산-co-글리콜산) (PLGA)이 포함된다. 이러한 중합체들은 확립되어 있는 안전성 기록을 가지고 있어서, 인간 대상체에서 사용될 수 있다 (문헌 [Jiang, et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 57(3):391-410, 2005]; [Aguado and Lambert, Immunobiology, 184(2-3):113-25, 1992]; [Bramwell, et al., Adv. Drug Deliv. Rev., 57(9):1247-65, 2005]). 기타 양친매성 폴리(아미노산) 나노입자, 양친매성 다당류 나노입자 또는 폴리이온 나노입자들이 본원에서 개시되는 백신 조성물에 사용될 수 있다 (문헌 [Akagi et al., Adv Polym Sci. 247:31-64, 2012] 참조).
전기한 중합체들은 단독으로, 또는 물리적 혼합물로서, 또는 공중합체를 형성시키는 것에 의해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 나노입자는 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체; PLGA-PEG 이블록 공중합체, 및 PLA의 혼합물에 의해 형성된다. 이러한 공중합체들은 표준 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들면, 공중합체 PLGA-PLH-PEG는 블록 말단-그래프팅 전략을 사용하여 합성될 수 있다.
선형 구조의 PLGA-PLH-PEG는 장기간의 순환 및 전하-매개 표적화에 부합하는 몇 가지 특징들을 나노입자에 제공할 수 있다. 첫 번째로, PLH 분절은 산성 조건하에서 양으로 하전되어 나노입자 표면상에 전체적으로 양인 전위를 산출함으로써, 음으로 하전되어 있는 병원체와의 상호작용을 촉진하여 강한 다가의 정전기적으로 매개되는 결합을 생성시킨다. 두 번째로, PLGA 분절은 산성 pH에서 PLH의 불안정화하는 힘을 가지지 않으면서도 고체인 코어 매트릭스를 형성할 수 있다. 세 번째로, PLH 분절은 통상적인 제제화 조건하에서의 그의 본질적인 친수성은 물론, 상대적인 친수성으로 인하여 우선적으로 표면으로 부상하게 되는 PEG와의 그의 밀접한 결합으로 인하여, 중합체 자가-조립 동안 나노입자 표면 부근으로 부상한다. 이는 중요한데, 그것이 나노입자 표면의 양이온 전하를 증가시키기 때문이다. 세 번째로, 중합체의 말초 말단에 PEG 부분을 가지는 것은 생리학적 pH에서의 나노입자 콜로이드 안정성 및 순환 시간을 촉진한다 (문헌 [Radovic-Moreno, et al., ACS Nano 6:4279-4287, 2012]; [Gref et al., Science 263:1600-1603, 1994]).
일부 실시양태에서는, 천연 중합체가 사용될 수 있다. 천연 중합체의 예에는 알기네이트 및 기타 다당류, 콜라겐, 알부민 및 기타 친수성 단백질, 제인 및 기타 프롤라민 및 소수성 단백질, 이들의 공중합체 및 혼합물이 포함된다. 일반적으로, 이러한 물질들은 효소 가수분해 또는 생체 내에서의 물에의 노출, 표면 또는 벌크 침식 중 어느 하나에 의해 분해된다.
다른 적합한 생분해성 중합체에는 폴리(히드록시산), 예컨대 락트산 및 글리콜산의 중합체 및 공중합체, 폴리무수물, 폴리(오르소)에스테르, 폴리에스테르, 폴리우레탄, 폴리(부트산), 폴리(발레르산), 폴리(카프로락톤), 폴리(히드록시알카노에이트) 및 폴리(락티드-co-카프로락톤)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 중합체는 친수성이거나 소수성인 생체결합성 중합체일 수 있다. 친수성 중합체에는 카르보폴(CARBOPOL)™ (노베온(Noveon) 사에 의해 제조되는 고분자량의 가교결합된 아크릴산-기재 중합체), 폴리카르보필, 셀룰로스 에스테르 및 덱스트란이 포함된다.
이러한 중합체들은 미주리 세인트루이스 소재 시그마 케미칼(Sigma Chemical) Co. 사: 펜실베이니아 워렌튼 소재 폴리사이언시즈(Polysciences) 사; 위스콘신 밀워키 소재 알드리치(Aldrich) 사; 뉴욕 롱콘코마 소재 플루카(Fluka) 사; 및 캘리포니아 리치몬드 소재 바이오래드(BioRad) 사와 같은 공급처로부터 입수될 수 있거나, 또는 표준 기술을 사용하여 이들 또는 다른 공급처로부터 입수된 단량체로부터 합성될 수 있다.
매우 다양한 중합체 및 그로부터의 중합체 매트릭스의 형성 방법들이 통상적으로 알려져 있다. 일반적으로, 중합체 매트릭스는 1종 이상의 중합체를 포함한다. 중합체는 천연 또는 비천연 (합성) 중합체일 수 있다. 중합체는 단일중합체, 또는 2종 이상의 단량체를 포함하는 공중합체일 수 있다. 서열 면에서, 공중합체는 랜덤, 블록이거나, 또는 랜덤 및 블록 서열의 조합을 포함할 수 있다. 통상적으로, 본 발명에 따른 중합체는 유기 중합체이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 중합체의 예에는 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트 (예컨대 폴리(1,3-디옥산-2온)), 폴리무수물 (예컨대 폴리(세바크산 무수물)), 폴리프로필푸마레이트, 폴리아미드 (예컨대 폴리카프로락탐), 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르 (예컨대 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 폴리락티드-co-글리콜리드, 폴리카프로락톤, 폴리히드록시산 (예컨대 폴리(β-히드록시알카노에이트))), 폴리(오르소에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알콜, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 및 폴리아민, 폴리리신, 폴리리신-PEG 공중합체, 및 폴리(에틸렌이민), 폴리(에틸렌 이민)-PEG 공중합체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시양태에서, 본 발명에 따른 중합체에는 비제한적으로 폴리에스테르 (예컨대 폴리락트산, 폴리(락트산-co-글리콜산), 폴리카프로락톤, 폴리발레로락톤, 폴리(1,3-디옥산-2온)); 폴리무수물 (예컨대 폴리(세바크산 무수물)); 폴리에테르 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜); 폴리우레탄; 폴리메타크릴레이트; 폴리아크릴레이트; 및 폴리시아노아크릴레이트를 포함하여, U.S. 식품의약국(Food and Drug Administration) (FDA)에 의해 21 C.F.R. § 177.2600하에 인간에서의 용도로 승인되어 있는 중합체들이 포함된다.
일부 실시양태에서, 중합체는 친수성일 수 있다. 예를 들면, 중합체는 음이온성 기 (예컨대 포스페이트 기, 술페이트 기, 카르복실레이트 기); 양이온성 기 (예컨대 4차 아민 기); 또는 극성 기 (예컨대 히드록실 기, 티올 기, 아민 기)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 소수성일 수 있다. 중합체의 친수성 또는 소수성의 선택은 합성 나노입자 내에 도입되는 (예컨대 커플링되는) 물질의 특성에 영향을 줄 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 1종 이상의 잔기 및/또는 관능기에 의해 변형될 수 있다. 다양한 잔기 또는 관능기들이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 탄수화물, 및/또는 다당류에서 유래하는 비고리형 폴리아세탈에 의해 변형될 수 있다 (문헌 [Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301]). 특정 실시양태는 그레프(Gref) 등의 US 특허 제5,543,158호 또는 본 안드리안(Von Andrian) 등의 WO 공개 WO2009/051837호의 일반적인 교시를 사용하여 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 지질 또는 지방산 기에 의해 변형될 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 부티르산, 카프로산, 카프릴산, 카프르산, 라우르산, 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 또는 리그노세르산 중 1종 이상일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지방산 기는 팔미톨레산, 올레산, 박센산, 리놀레산, 알파-리놀레산, 감마-리놀레산, 아라키돈산, 가돌레산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 또는 에루크산 중 1종 이상일 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 락트산 및 글리콜산 단위를 포함하는 공중합체, 예컨대 본원에서 집합적으로 "PLGA"로 지칭되는 폴리(락트산-co-글리콜산) 및 폴리(락티드-co-글리콜리드); 그리고 본원에서 "PGA"로 지칭되는 글리콜산 단위를 포함하는 단일 중합체, 및 본원에서 집합적으로 "PLA"로 지칭되는 락트산 단위를 포함하는 단일 중합체, 예컨대 폴리-L-락트산, 폴리-D-락트산, 폴리-D,L-락트산, 폴리-L-락티드, 폴리-D-락티드, 및 폴리-D,L-락티드를 포함한 폴리에스테르일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대표적인 폴리에스테르에는 예를 들면 폴리히드록시산; PEG 공중합체 및 락티드와 글리콜리드의 공중합체 (예컨대 PLA-PEG 공중합체, PGA-PEG 공중합체, PLGA-PEG 공중합체 및 이들의 유도체)가 포함된다. 일부 실시양태에서, 폴리에스테르에는 예를 들면 폴리(카프로락톤), 폴리(카프로락톤)-PEG 공중합체, 폴리(L-락티드-co-L-리신), 폴리(세린 에스테르), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산], 및 이들의 유도체가 포함된다. PLGA의 분해 속도는 락트산; 글리콜산 비를 변경하는 것에 의해 조정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명에 따라 사용될 PLGA는 대략 85:15, 대략 75:25, 대략 60:40, 대략 50:50, 대략 40:60, 대략 25:75 또는 대략 15:85의 락트산:글리콜산 비를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 1종 이상의 아크릴 중합체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 아크릴 중합체에는 예를 들면 아크릴산 및 메타크릴산 공중합체, 메틸 메타크릴레이트 공중합체, 에톡시에틸 메타크릴레이트, 시아노에틸 메타크릴레이트, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 메타크릴산 알킬아미드 공중합체, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(메타크릴산 무수물), 메틸 메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 공중합체, 폴리아크릴아미드, 아미노알킬 메타크릴레이트 공중합체, 글리시딜 메타크릴레이트 공중합체, 폴리시아노아크릴레이트, 및 전기한 중합체들 중 1종 이상을 포함하는 조합이 포함된다. 아크릴 중합체는 낮은 함량의 4차 암모늄 기를 가지는 아크릴산 및 메타크릴산 에스테르의 완전히 중합된 공중합체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 양이온성 중합체일 수 있다. 일반적으로, 양이온성 중합체는 핵산 (예컨대 DNA 또는 그의 유도체)의 음으로 하전된 가닥을 응축 및/또는 보호할 수 있다. 폴리(리신) (문헌 [Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97]; 및 [Kabanov et al., 1995, Bioconjugate Chem., 6:7]), 폴리(에틸렌 이민) (문헌 [PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297]), 및 폴리(아미도아민) 수지상체 (문헌 [Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897]; [Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703]; 및 [Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372])와 같은 아민-함유 중합체들은 생리학적 pH에서 양으로 하전되어 핵산과 이온 쌍을 형성함으로써, 다양한 세포주에서 형질감염을 매개한다.
일부 실시양태에서, 중합체는 양이온성 측쇄를 보유하는 분해가능 폴리에스테르일 수 있다 (문헌 [Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658]; [Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010]; [Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250]; [Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633]; 및 [Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399]). 이러한 폴리에스테르의 예에는 폴리(L-락티드-co-L-리신) (문헌 [Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc, 115:11010]), 폴리(세린 에스테르) (문헌 [Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399]), 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) (문헌 [Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658]; 및 [Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633]), 및 폴리(4-히드록시-L-프롤린 에스테르) (문헌 [Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658]; 및 [Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc, 121:5633])가 포함된다.
이들 및 기타 중합체들의 특성, 그리고 이들의 제조 방법에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있다 (예를 들면 U.S. 특허 6,123,727호; 5,804,178호; 5,770,417호; 5,736,372호; 5,716,404호; 6,095,148호; 5,837,752호; 5,902,599호; 5,696,175호; 5,514,378호; 5,512,600호; 5,399,665호; 5,019,379호; 5,010,167호; 4,806,621호; 4,638,045호; 및 4,946,929호; 문헌 [Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:9480]; [Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc, 123:2460]; [Langer, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94]; [Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7]; 및 [Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181] 참조). 더 일반적으로는, 적합한 특정 중합체의 다양한 합성 방법들이 문헌 [Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980]; [Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004]; [Contemporary Polymer Chemistry by Allcock et al., Prentice-Hall, 1981]; [Deming et al., 1997, Nature, 390:386]; 및 U.S. 특허 6,506,577호, 6,632,922호, 6,686,446호 및 6,818,732호에 기술되어 있다.
일부 실시양태에서, 중합체는 선형 또는 분지형 중합체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 수지상체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 실질적으로 서로 가교-결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 실질적으로 가교-결합이 없을 수 있다. 일부 실시양태에서, 중합체는 가교-결합 단계에 적용되지 않고도 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 합성 나노입자는 전기 및 기타 중합체들 중 어느 것의 블록 공중합체, 그래프트 공중합체, 블렌드, 혼합물 및/또는 첨가생성물을 포함할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 통상의 기술자라면, 본원에서 열거되는 중합체들이 본 발명에 따라 사용될 수 있는 중합체의 포괄적이 아닌 대표적인 목록을 나타낸다는 것을 알고 있을 것이다.
일부 실시양태에서, 합성 나노입자는 임의적으로 1종 이상의 양친매성인 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 물질은 증가된 안정성, 향상된 균일성 또는 증가된 점도를 가지는 합성 나노입자의 생성을 촉진할 수 있다. 일부 실시양태에서, 양친매성 물질은 지질 막 (예컨대 지질 이중층, 지질 단층 등)의 내부 표면과 결합될 수 있다. 관련 기술분야에 알려져 있는 많은 양친매성 물질들이 본 발명에 따른 합성 나노입자의 제조에 사용하기에 적합하다. 그와 같은 양친매성 물질에는 포스포글리세리드; 포스파티딜콜린; 디팔미토일 포스파티딜콜린 (DPPC); 디올레일포스파티딜 에탄올아민 (DOPE); 디올레일옥시프로필트리에틸암모늄 (DOTMA); 디올레오일포스파티딜콜린; 콜레스테롤; 콜레스테롤 에스테르; 디아실글리세롤; 디아실글리세롤숙시네이트; 디포스파티딜 글리세롤 (DPPG); 헥산데칸올; 지방 알콜 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르; 표면 활성 지방산, 예컨대 팔미트산 또는 올레산; 지방산; 지방산 모노글리세리드; 지방산 디글리세리드; 지방산 아미드; 소르비탄 트리올레에이트 (스판(Span)®85) 글리코콜레이트; 소르비탄 모노라우레이트 (스판®20); 폴리소르베이트 20 (트윈(Tween)®20); 폴리소르베이트 60 (트윈®60); 폴리소르베이트 65 (트윈®65); 폴리소르베이트 80 (트윈®80); 폴리소르베이트 85 (트윈®85); 폴리옥시에틸렌 모노스테아레이트; 서팩틴(surfactin); 폴록사머; 소르비탄 지방산 에스테르 예컨대 소르비탄 트리올레에이트; 레시틴; 리소레시틴; 포스파티딜세린; 포스파티딜이노시톨; 스핑고마이엘린; 포스파티딜에탄올아민 (세팔린); 카르디오리핀; 포스파티드산; 세레브로시드; 디세틸포스페이트; 디팔미토일포스파티딜글리세롤; 스테아릴아민; 도데실아민; 헥사데실-아민; 아세틸 팔미테이트; 글리세롤 리시놀레에이트; 헥사데실 스테레이트; 이소프로필 미리스테이트; 틸록사폴; 폴리(에틸렌 글리콜)5000-포스파티딜에탄올아민; 폴리(에틸렌 글리콜)400-모노스테아레이트; 인지질; 고도의 계면활성제 특성을 가지는 합성 및/또는 천연 세제; 데옥시콜레이트; 시클로덱스트린; 무질서염(chaotropic salt); 이온 쌍형성 작용제; 및 이들의 조합이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 양친매성 물질 성분은 상이한 양친매성 물질들의 혼합물일 수 있다. 통상의 기술자라면, 이것이 계면활성제 활성을 가지는 물질들의 포괄적이 아닌 대표적인 목록이라는 것을 알고 있을 것이다. 어떠한 양친매성 물질도 본 발명에 따라 사용될 합성 나노입자의 생성에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 합성 나노입자는 임의적으로 1종 이상의 탄수화물을 포함할 수 있다. 탄수화물은 천연 또는 합성의 것일 수 있다. 탄수화물은 유도체화된 천연 탄수화물일 수 있다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 비제한적으로 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 리보스, 락토스, 수크로스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 만노스, 크실로스, 아라비노스, 글루코론산, 갈락토론산, 만누론산, 글루코사민, 갈락토사민, 및 뉴람산을 포함한 단당류 또는 이당류를 포함한다. 특정 실시양태에서, 탄수화물은 비제한적으로 풀룰란, 셀룰로스, 미세결정질 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 (HPMC), 히드록시셀룰로스 (HC), 메틸셀룰로스 (MC), 덱스트란, 시클로덱스트란, 글리코겐, 히드록시에틸전분, 카라기난, 글리콘, 아밀로스, 키토산, N,O-카르복실메틸키토산, 알긴 및 알긴산, 전분, 키틴, 이눌린, 곤약, 글루코만난, 푸스툴란, 헤파린, 히아루론산, 쿠르들란 및 크산탄을 포함한 다당류이다. 실시양태에서, 본 발명의 합성 나노입자는 다당류와 같은 탄수화물을 포함하지 않는다 (또는 명확하게 배제한다). 특정 실시양태에서, 탄수화물은 비제한적으로 만니톨, 소르비톨, 크실리톨, 에리트리톨, 말티톨 및 락티톨을 포함한 당 알콜과 같은 탄수화물 유도체를 포함할 수 있다.
아주반트
본원에서 개시되는 백신 및 아주반트 조성물은 아주반트-적재 나노입자를 포함한다. 1종 이상의 아주반트가 나노입자에 캡슐화 또는 다르게 포획될 수 있거나, 또는 나노입자의 표면과 결합될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "아주반트"라는 용어는 면역학적 아주반트를 지칭한다. 그것은 병원체에 대한 면역 시스템의 반응을 강화 또는 촉진함으로써 대상체에서 면역 반응 또는 일련의 면역 반응들을 유도할 수 있는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 아주반트는 예를 들면 데포를 형성하거나 (백신의 반감기를 연장함), 추가적인 T-세포 도움을 제공하거나, 및/또는 시토카인 생성을 자극하는 것에 의해 백신 조성물의 효과를 촉진할 수 있다.
수지상 세포는 신체에서 가장 강력한 항원-제시 세포로써, 병원성 항원에 결합하는 것에 의해 모든 병원체-특이적 면역 반응을 개시하는 것을 담당한다. 수지상 세포는 또한 화학주성 신호를 통하여 조우하는 병원체의 특성에 관하여 T 세포와 소통함으로써, 적정한 T 세포 반응을 유도한다. 따라서, 수지상 세포를 표적으로 하는 것은 병원성 항원의 전달 및 제시를 강화하고, 예방접종에 의해 유도되는 면역 반응의 특성을 조절할 수 있다.
조우하는 상이한 유형의 병원체들에 반응하여, 수지상 세포는 상이한 표면 수용체들을 이용하여 노출되는 병원성 항원에 결합한다. 이동 동안, 수지상 세포는 그것이 식세포 능력을 상실하고 림프절에서 T-세포와의 증가된 소통 능력을 발현하는 성숙 과정을 겪는다. 이와 같은 성숙 과정은 톨-유사 수용체 족 (TLR)의 구성원과 같은 패턴 인식 수용체를 통한 병원체-결합 분자 패턴 (PAMP) 분자들로부터의 신호전달에 따라 달라진다. PAMP는 수지상 세포 표면상의 TLR을 표적으로 하여 내부에 신호를 전달함으로써, 수지상 세포 항원 흡수, 성숙 및 T-세포 자극 능력을 강력하게 증가시킨다. 따라서, TLR 효능제는 강력한 수지상 세포 활성화인자로써, 본원에서 기술되는 백신 조성물에 포함될 수 있는데, 예를 들면 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 (박테리아), 이중-가닥 RNA (바이러스), 지질다당류 (박테리아), 펩티도글리칸 (박테리아), 지질아라비노만닌 (박테리아), 지모산 (효모), 미코플라스마 지질단백질 예컨대 MALP-2 (박테리아), 플라젤린 (박테리아), 폴리(이노신산-시티딜산) (박테리아), 지질타이코산 (박테리아) 또는 이미다조퀴놀린 (합성)이다.
R848 (레시퀴모드)은 이미다조퀴놀린의 구아노신 유도체로써, TLR7 및 TLR8에 대한 효능제이다. R848은 수지상 세포 및 B 세포를 활성화하여 T 헬퍼 1 (Th1) 세포 면역 및 항체 생성에 최적인 시토카인들을 생성시키는 효과적인 아주반트이다. 따라서, R848은 체액 및 세포 매개 면역 반응 모두를 증대하기 위하여 본원에서 개시되는 백신 조성물에 아주반트로서 포함될 수 있다. 이와 같은 아주반트의 사용 방법에 대해서는 하기 실시예에서 상세하게 기술된다.
TLR9는 CpG 모티프를 함유하는 합성 올리고데옥시뉴클레오티드에 의해 모방될 수 있는 미생물 DNA의 특징인 비메틸화 CpG 모티프를 특이적으로 인식한다. CpG DNA 또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드에 의한 TLR9 자극은 대식세포, 수지상 세포 및 B 세포의 활성화, 그리고 시토카인, 케모카인 및 이뮤노글로불린의 생성으로 이어지는 세포내 신호전달을 촉발한다. 이어서, 수지상 세포에 의해 생성된 시토카인, 예컨대 IL-12가 미접촉 T 세포의 Th1 및 세포독성 T-세포 (CTL)로의 분화를 유도한다. 연구 결과, 백신 아주반트로서의 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 다양한 바이러스, 박테리아 및 기생충 질환, 예를 들면 B형 간염에 대한 면역 보호를 강화할 수 있는 것으로 나타났다 (문헌 [Krieg et al., Proc Am Thorac Soc. 4(3):289-94, 2007]; [Schmidt et al., Nat. Biotechnol. 25(8):825-6, 2007]). 따라서, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드는 체액 및 세포 매개 면역 반응 모두를 증대하기 위하여 본원에서 개시되는 백신 조성물에 아주반트로서 포함될 수 있다.
그람-음성 박테리아 세포 벽 구성요소 지질다당류 (LPS)의 생물학적으로 활성인 부분인 지질 A는 강한 면역자극 특성을 가지고 있는 것으로 알려져 있어서, 면역 반응을 촉진하기 위한 아주반트로 평가받고 있다. TLR4가 지질 A의 신호전달 수용체로 확인되어 있다. 모노포스포릴 지질 A (MPLA)는 살모넬라 민네소 타(Salmonella Minnesota) LPS의 지질 A 부분을 포함한다. LPS 및 MPLA는 유사한 시토카인 프로파일을 유도하나, MPLA가 덜 독성이다. MPLA를 다른 면역자극제와 조합하는 것은 효과적인 면역 반응을 도출하는 것을 촉진할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 톨-유사 수용체 (TLR)-9에 대한 리간드, 예컨대 CpG를 포함하는 면역자극성 DNA 분자를 도입하는데, 이는 유형 I 인터페론 분비를 유도하고, 증가된 항체 생성 및 세포독성 T 세포 반응으로 이어지는 T 및 B 세포 활성화를 자극한다 (문헌 [Krieg et al., CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B cell activation. Nature. 1995. 374:546-549]; [Chu et al., CpG oligodeoxynucleotides act as adjuvants that switch on T helper 1 (Th1) immunity. J. Exp. Med. 1997. 186:1623-1631]; [Lipford et al., CpG-containing synthetic oligonucleotides promote B and cytotoxic T cell responses to protein antigen: a new class of vaccine adjuvants. Eur. J. Immunol. 1997. 27:2340-2344]; [Roman et al., "Immunostimulatory DNA sequences function as T helper-1-promoting adjuvants," Nat. Med. 1997. 3:849-854]; [Davis et al., CpG DNA is a potent enhancer of specific immunity in mice immunized with recombinant hepatitis B surface antigen. J. Immunol. 1998. 160:870-876]; [Lipford et al., "Bacterial DNA as immune cell activator," Trends Microbiol. 1998. 6:496-500]; 크리그(Krieg) 등의 US 특허 6,207,646호; 투크(Tuck) 등의 US 특허 7,223,398호; 반 네스트(Van Nest) 등의 US 특허 7,250,403호; 또는 크리그 등의 US 특허 7,566,703호).
수지상 세포를 표적으로 하는 분자에는 또한 수지상 세포의 표면에 나타나는 항원결정인자를 인식하여 거기에 결합하는 모노클로날 또는 다클론 항체 또는 그의 단편이 포함될 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포 표면 항원결정인자인 렉틴 DEC-205가 마우스에서 항-DEC205 재조합 항체에 의해 표적이 된 바 있는데, 항체의 중쇄에 결합된 항원에 대한 체액성 및 세포성 반응 모두가 증대되었었다 (문헌 [Hawiger, et al., J. Exp. Med., 194(6):769-79, 2001]; [Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 196(12):1627-38, 2002]; [Bonifaz, et al., J. Exp. Med., 199(6):815-24, 2004]). 만노스-특이적 렉틴 (만노스 수용체) 및 IgG Fc 수용체를 포함한 다양한 다른 세포내이입 수용체들도 이와 같은 방식으로 표적화된 바 있는데, 유사한 항원 제시 효율의 강화가 있었다. 표적화될 수 있는 다른 적합한 수용체에는 DC-SIGN, 33D1, SIGLEC-H, DCIR, CD11c, 열 충격 단백질 수용체, 및 스캐빈저 수용체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
렉틴 DEC-205와 같은 백신을 수지상 세포에 대하여 표적화하는 데에 사용되는 많은 수용체들이 면역원성 펩티드가 형성되어 MHC 클래스 II 분자 (CD4 T 세포 및 항체 반응에 필요함)에 적재되는 후기 엔도솜(late endosome)으로 항원을 전달하는 특성을 가지고 있다 (문헌 [Mellman, Adv. Exp. Med. Biol. 560:63-7, 2005]; [Mellman and Steinman, Cell 106(3):255-8, 2001]). 그러나, 효과적인 예방접종은 종종 세포질에서 항원이 제시되는 경우에만 이루어지는 CD8 세포독성 T 세포 반응의 생성을 필요로 한다. 수지상 세포는 외인성 항원이 세포내이입 소포를 이탈하여 세포질에 진입한 후 거기에서 프로테오솜에 의해 펩티드들로 절단되고 소포체로 내수송되어 새롭게 합성되는 MHC 클래스 I 분자 (CD8 T 세포의 자극에 필요함)에 적재되는 교차-제시(cross-presentation)에 의해 이와 같은 기능을 수행한다. 교차 제시의 효율은 항원 흡수 동안의 엔도솜-리소솜 막의 제한된 붕괴에 의해 인위적으로 강화될 수 있다. 따라서, 엔도솜 막 붕괴 작용제는 효과적인 아주반트로 기능할 수 있는데, 예를 들면 소형 분자 약물, 펩티드, 엘라스틴을 포함한 폴리펩티드, 및 세포내 pH 또는 소포 막을 붕괴시키는 합성 작용제들이 포함될 수 있다. 특정 실시양태에서, 엔도솜-붕괴 작용제는 낮은 pH에서 활성화되는 양친매성의 세공-형성 펩티드, 예컨대 엔도-포터 펩티드 (엔도-포터; 진툴스(GeneTools) 사, 오리건 필로마스 소재)이다 (문헌 [Summerton, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1058:1-14, 2005]). 따라서, 엔도-포터 펩티드는 병원성 항원의 교차-제시를 증대하기 위하여 본원에서 개시되는 백신 조성물에 아주반트로서 포함될 수 있다.
다양한 아주반트들이 예를 들면 PCT WO2012/068295호에 기술되어 있다. 그와 같은 아주반트에는 패턴 인식 수용체의 자극인자, 예컨대 RIG-1 및 NOD-유사 수용체 (NLR), 무기 염, 예컨대 알룸, 에스케리키아 콜리 , 살모넬라 민네소타 , 살모넬라 티피무리움 또는 쉬겔라 플렉스네리와 같은 장내박테리아의 모노포스포릴 지질 (MPL) A 또는 구체적으로 MPL® (AS04)와 조합된 알룸, 상기-언급된 박테리아들의 개별적인 MPL A, 사포닌, 예컨대 QS-21, 퀼(Quil)-A, 이스콤(ISCOM), 이스코매트릭스(ISCOMATRIX)™, 에멀션 예컨대 MF59™, 몬타니드(Montanide)® ISA 51 및 ISA 720, AS02 (QS21+스쿠알렌+MPL®), 리포솜 및 리포솜 제제 예컨대 AS01, 합성 또는 특이적 제조 마이크로입자 및 마이크로캐리어 예컨대 고노레아에 , 클라미디아 트라 코마티스 등의 박테리아-유래 외막 소포 (OMV), 또는 키토산 입자, 데포-형성 작용제, 예컨대 플루로닉(Pluronic)® 블록 공중합체, 특히 변형되거나 제조된 펩티드, 예컨대 뮤라밀 디펩티드, 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트, 예컨대 RC529, 또는 단백질, 예컨대 박테리아 유독소 또는 독소 단편이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기에서 언급된 톨-유사 수용체들 이외에도, 비제한적으로 톨-유사 수용체 (TLR), 특히 TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9 및/또는 이들의 조합을 포함한 패턴 인식 수용체들 (PRR)에 대한 효능제가 아주반트에 포함될 수 있다. 다른 실시양태에서, 아주반트는 톨-유사 수용체 3에 대한 효능제, 톨-유사 수용체 7 및 8에 대한 효능제, 또는 톨-유사 수용체 9에 대한 효능제; 아데닌 유도체 예컨대 US 특허 6,329,381호 (스미토모 파마슈티칼 컴패니(Sumitomo Pharmaceutical Company) 사)에 개시되어 있는 것들; 면역자극성 DNA; 또는 면역자극성 RNA를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 톨-유사 수용체 (TLR) 7 & 8에 대한 효능제 ("TLR 7/8 효능제")인 화합물을 아주반트로서 도입한다. 이용되는 것은 비제한적으로 이미다조퀴놀린 아민, 이미다조피리딘 아민, 6,7-융합 시클로알킬이미다조피리딘 아민, 및 1,2-가교 이미다조퀴놀린 아민을 포함하여, 토마이(Tomai) 등의 U.S. 특허 6,696,076호에 개시되어 있는 TLR 7/8 효능제 화합물들이다.
구체적인 실시양태에서, 아주반트는 표면 분자 CD40에 대한 효능제일 수 있다. 특정 실시양태에서, 관용보다는 면역을 자극하기 위하여, 본 발명의 조성물은 DC 성숙 (미접촉 T 세포의 프라이밍(priming)에 필요함), 및 항체 면역 반응을 촉진하는 유형 I 인터페론과 같은 시토카인의 생성을 촉진하는 아주반트를 도입한다. 실시양태에서, 아주반트에는 또한 면역자극성 RNA 분자, 예컨대 비제한적으로 dsRNA 또는 폴리 I:C (TLR3 자극제), 및/또는 문헌 [F. Heil et al., "Species-Specific Recognition of Single-Stranded RNA via Toll-like Receptor 7 and 8" Science 303(5663), 1526-1529 (2004)]; J. 볼메르(Vollmer) 등의 "Immune modulation by chemically modified ribonucleosides and oligoribonucleotides"인 WO 2008033432 A2호; A. 포르스박(Forsbach) 등의 "Immunostimulatory oligoribonucleotides containing specific sequence motif(s) and targeting the Toll-like receptor 8 pathway"인 WO 2007062107 A2호; E. 울만(Uhlmann) 등의 "Modified oligoribonucleotide analogs with enhanced immunostimulatory activity"인 U.S. 특허 출원 공개 US 2006/0241076호; G. 립포드 등의 "Immunostimulatory viral RNA oligonucleotides and use for treating cancer and infections"인 WO 2005097993 A2호; G. 립포드 등의 "Immunostimulatory G,U-containing oligoribonucleotides, compositions, and screening methods"인 WO 2003086280 A2호에 개시되어 있는 것들이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 TLR-4 효능제, 예컨대 박테리아 지질다당류 (LPS), VSV-G 및/또는 HMGB-1일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 비제한적으로 US 특허 6,130,082호, 6,585,980호 및 7,192,725호에 개시되어 있는 것들을 포함한 TLR-5 효능제, 예컨대 플라젤린, 또는 그의 일부 또는 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아주반트는 괴사 세포에서 방출되는 전염증성 자극원 (예컨대 우레이트 결정)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 보체 단계반응의 활성화된 구성요소 (예컨대 CD21, CD35 등)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 면역 복합체의 활성화된 구성요소일 수 있다. 아주반트에는 또한 CD21 또는 CD35에 결합하는 분자와 같은 보체 수용체 효능제가 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 보체 수용체 효능제는 합성 나노입자의 내인성 보체 옵소닌화를 유도한다. 일부 실시양태에서, 아주반트는 세포에 의해 방출되며 세포-세포 상호작용, 소통 및 다른 세포의 거동에 대한 특정 효과를 가지는 소형 단백질 또는 생물학적 인자 (5 kD-20 kD 범위)인 시토카인이다. 일부 실시양태에서, 상기 시토카인 수용체 효능제는 소형 분자, 항체, 융합 단백질 또는 압타머이다.
다양한 실시양태에서, 아주반트 투여분 중 적어도 일부는 합성 나노입자에 커플링될 수 있는데, 예를 들면 아주반트의 전체 투여분이 합성 나노입자에 커플링될 수 있다. 다른 실시양태에서, 아주반트 투여분 중 적어도 일부는 합성 나노입자에 커플링되지 않는다. 특정 실시양태에서, 아주반트의 투여분은 2종 이상 유형의 아주반트를 포함한다. 비제한적으로 예를 들면, 상이한 TLR 수용체들에 작용하는 아주반트들이 조합될 수 있다. 예로써, 실시양태에서, TLR 7/8 효능제는 TLR 9 효능제와 조합될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, TLR 7/8 효능제가 TLR 4 효능제와 조합될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, TLR 9 효능제가 TLR 3 효능제와 조합될 수 있다.
일부 다른 실시양태에서, 아주반트에는 하기 중 1종 이상이 포함될 수 있다: 글리코지질 알파-갈락토실세라미드; 오일 에멀션 (예컨대 프로인트 아주반트(Freund's adjuvant)); 사포닌 제제; 바이로솜 및 바이러스-유사 입자; 비제한적으로 지질다당류 (LPS)와 같은 탄수화물을 포함한 박테리아 및 미생물 유도체; 면역자극성 올리고뉴클레오티드; ADP-리보실화 독소 및 해독된 유도체; 알룸; BCG; 무기질-함유 조성물 (예컨대 무기 염, 예컨대 알루미늄염 및 칼슘염, 히드록시드, 포스페이트, 술페이트 등); 생체결합제 및/또는 점막결합제; 마이크로입자; 리포솜; 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르 제제; 폴리포스파젠; 뮤라밀 펩티드; 이미다조퀴놀론 화합물; 및 표면 활성 물질 (예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀션, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) 및 디니트로페놀).
아주반트에는 또한 면역조절인자 예컨대 시토카인, 인터류킨 (예컨대 IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 등), 인터페론 (예컨대 인터페론-γ), 대식세포 집락 자극 인자, 및 종양 괴사 인자; 그리고 공동-자극 분자, 예컨대 B7 족의 것들이 포함될 수 있다.
아주반트 -적재 나노입자의 조립 방법
많은 알려져 있는 과정들이 아주반트-적재 나노입자를 형성시키는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아주반트-적재 나노입자는 용매 증발 기술에 의해 형성될 수 있다 (문헌 [Mathiowitz, et al., J. Scanning Microscopy 4:329, 1990]; [Beck et al., Fertil. Steril. 31:545, 1979]; [Benita, et al., J. Pharm. Sci., 73:1721, 1984]; 및 U.S. 특허 제3,960,757호에 기술되어 있는 바와 같음). 1종 이상의 중합체가 메틸렌 클로라이드와 같은 휘발성 유기 용매에 용해된다. 아주반트가 용액에 첨가될 수 있으며, 혼합물은 폴리(비닐 알콜)과 같은 표면 활성제를 함유하는 수용액 중에 현탁된다. 생성되는 에멀션은 대부분의 유기 용매가 증발되어 고체 나노입자를 남길 때까지 교반된다.
다른 예에서, 아주반트-적재 나노입자는 중합체가 용매에 용해되고, 아주반트의 미세입자가 중합체 용액 중에 혼합 또는 용해된 후, 혼합물이 중합체에 대한 강한 비-용매에 부어짐으로써 우호 조건하에서 자발적으로 중합체 마이크로구체를 생성시키는 것으로써, 중합체가 입자에 의해 코팅되거나 입자가 중합체 중에 분산되는 것 중 어느 하나인, 상 반전(phase inversion)을 사용하여 형성될 수 있다.
특정 아주반트는 예컨대 흡착에 의해 나노입자에 비-공유로 커플링될 수 있다. 예를 들면, 나노입자 표면에의 핵산의 흡착은 염 형성에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 방법을 사용할 때, 나노입자는 나노입자에 전하를 도입하는 물질을 나노입자가 포함하게 하는 방식으로 제조된다. 종종, 나노입자 제조시의 음으로 하전된 핵산을 흡착하는 데에 사용되는 하전된 계면활성제, 예컨대 양이온계 계면활성제의 사용이면, 나노입자에 표면 전하를 제공하는 데에 충분하다. 하전된 나노입자를 핵산의 용액과 접촉시키는 것이 핵산의 흡착을 야기한다. 이와 같은 방법에 대해서는 오하겐(O'Hagen) 등의 국제 특허 출원 공개 WO 00/06123호의 특허 출원에 기술되어 있다.
일부 아주반트는 나노입자에 의해 캡슐화될 수 있다. 예를 들어, 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드와 같은 핵산의 캡슐화는 수성 완충제에 핵산을 용해시킨 다음 이 용액을 사용하여 단일 또는 이중 에멀션 과정에서 자가-조립에 의해 나노입자를 형성시키는 것에 의해 수행될 수 있다. 이와 같은 과정에 대해서는 문헌 [Tse, et al International Journal of Pharmaceutics, 370 (1-2), 33 (2009)]에 기술되어 있다. 또한, 비제한적으로 문헌 [C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247-289 (2006)]; [K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) and Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties and Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Delivery 1:321-333 (2004)]; [C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymeric nanoparticles" Nanomedicine 2:8-21 (2006)]의 것을 포함한 다양한 방법들을 사용하여, 다양한 물질들이 합성 나노입자에 캡슐화될 수 있다.
비제한적으로 2003년 10월 14일자 공고 엉거(Unger)의 미국 특허 6,632,671호; 문헌 [H. Martimprey et al., "Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids: Oligonucleotides and siRNA" European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics 71:490-504 (2009)]; 또는 [P. Malyala, et al., "Enhancing the therapeutic efficacy of CpG oligonucleotides using biodegradable microparticles" Advanced Drug Delivery Reviews 61:218-225 (2009)]에 개시되어 있는 방법들을 포함하여, 합성 나노입자에 핵산과 같은 물질을 캡슐화하는 데에 적합한 다른 방법들이 사용될 수 있다.
공유 커플링은 다양한 방법들에 의해, 예를 들면 문헌 [Bioconjugate Techniques, 2nd edition, Elsevier (2008) by Hermanson]에 기술되어 있는 바와 같이 수행될 수 있다. 아민 관능기를 보유하는 중합체 또는 나노입자에 핵산을 커플링하는 데에 유용한 한 가지 방법은 1-(3-디메틸아미노)프로필-3-에틸카르보디이미드 메티오디드 (EDC) 및 이미다졸을 사용하여 핵산의 5' 포스페이트를 활성화한 다음, 활성화된 핵산을 아민 치환된 중합체 또는 나노입자와 반응시키는 것이다 (문헌 [Shabarova et al., FEBS Letters, 154 288, (1983)]). 이와 같은 과정의 개략도를 표면 아민 관능화된 나노입자의 경우로 하기에 나타낸다.
Figure pct00001
특정 실시양태에서는, 공유 링커를 통하여 공유 커플링이 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 공유 링커는 아미드 링커, 디술피드 링커, 티오에테르 링커, 히드라존 링커, 히드라지드 링커, 이민 또는 옥심 링커, 우레아 또는 티오우레아 링커, 아미딘 링커, 아민 링커 및 술폰아미드 링커일 수 있거나, 그것을 포함할 수 있다.
아미드 링커는 일 요소상 아민의 나노입자와 같은 두 번째 요소의 카르복실산 기와의 사이의 아미드 결합을 통하여 형성된다. 링커의 아미드 결합은 적합하게 보호된 아미노산 또는 항원 또는 아주반트, 및 활성화된 카르복실산 예컨대 N-히드록시숙신이미드-활성화 에스테르를 사용한 통상적인 아미드 결합 형성 반응들 중 어느 것을 사용하여 이루어질 수 있다.
디술피드 링커는 예를 들면 R1-S-S-R2 형태인, 2개 황 원자 사이의 디술피드 (S-S) 결합의 형성을 통하여 형성된다. 디술피드 결합은 티올/메르캅탄 기를 함유하는 요소상에 또 다른 활성화된 티올 기를 가지는 티올/메르캅탄 기 (-SH)를 함유하는 항원 또는 아주반트의 활성화된 티올 기를 함유하는 요소와의 티올 교환에 의해 형성될 수 있다.
첫 번째 요소에 결합되어 있는 아지드의 두 번째 요소에 결합되어 있는 말단 알킨과의 1,3-쌍극성 고리첨가 반응에 의해, 트리아졸 링커, 예컨대 R1 및 R2가 임의의 화학 잔기일 수 있는
Figure pct00002
형태의 1,2,3-트리아졸이 형성될 수 있다. 상기 1,3-쌍극성 고리첨가 반응은 촉매가 있거나 없이, 바람직하게는 Cu(I)-촉매를 사용하여 수행됨으로써, 1,2,3-트리아졸 관능기를 통하여 2개 요소를 연결한다. 이와 같은 화학에 대해서는 문헌 [Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002)] 및 [Meldal, et al., Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015]에 기술되어 있는데, 종종 "클릭 반응(click reaction)" 또는 CuAAC로 지칭된다.
티오에테르 링커는 예를 들면 R1-S-R2 형태인 황-탄소 (티오에테르) 결합의 형성에 의해 만들어진다. 티오에테르는 일 구성요소 예컨대 요소상 티올/메르캅탄 (-SH) 기의 두 번째 요소상 할로겐화물 또는 에폭시드과 같은 알킬화 기에 의한 알킬화에 의해 형성될 수 있다. 티오에테르 링커는 또한 일 요소상 티올/메르캅탄 기의 마이클 수용체로서의 말레이미드 기를 함유하는 중합체와 같은 두 번째 요소상 전자-결핍 알켄 기에 대한 마이클 첨가(Michael addition)에 의해 형성될 수 있다. 또 다른 방식으로, 티오에테르 링커는 일 요소상 티올/메르캅탄 기의 중합체 또는 나노입자와 같은 두 번째 요소상 알켄 기와의 라디칼 티올-엔 반응에 의해 형성될 수 있다.
히드라존 링커는 일 요소상 히드라지드 기의 두 번째 요소상 알데히드/케톤 기와의 반응에 의해 형성된다.
히드라지드 링커는 일 요소상 히드라진 기의 두 번째 요소상 카르복실산 기와의 반응에 의해 형성된다. 그와 같은 반응은 일반적으로 활성화 반응물을 사용하여 카르복실산이 활성화되는 아미드 결합의 형성과 유사한 화학을 사용하여 수행된다.
이민 또는 옥심 링커는 일 요소상 아민 또는 N-알콕시아민 (또는 아미노옥시) 기의 두 번째 요소상 알데히드 또는 케톤 기와의 반응에 의해 형성된다.
우레아 또는 티오우레아 링커는 일 요소상 아민 기의 두 번째 요소상 이소시아네이트 또는 티오이소시아네이트 기와의 반응에 의해 형성된다.
아미딘 링커는 일 요소상 아민 기의 두 번째 요소상 이미도에스테르 기와의 반응에 의해 형성된다.
아민 링커는 일 요소상 아민 기의 두 번째 요소상 알킬화 기 예컨대 할로겐화물, 에폭시드 또는 술포네이트 에스테르 기와의 알킬화 반응에 의해 형성된다. 대안적으로, 아민 링커는 나트륨 시아노보로히드리드 또는 나트륨 트리아세톡시보로히드리드와 같은 적합한 환원성 반응물을 사용한 일 요소상 아민 기의 두 번째 요소상 알데히드 또는 케톤 기와의 환원성 아민화에 의해 형성될 수도 있다.
술폰아미드 링커는 일 요소상 아민 기의 두 번째 요소상 술포닐 할로겐화물 (예컨대 술포닐 클로라이드) 기와의 반응에 의해 형성된다.
다양한 아주반트들이 비-공유 커플링 방법을 통하여 커플링될 수도 있다. 예를 들어, 음으로 하전된 아주반트는 정전기적 흡착을 통하여 양으로 하전된 캐리어에 커플링될 수 있다. 금속 리간드를 함유하는 아주반트가 금속-리간드 착물을 통하여 금속 복합체를 함유하는 캐리어에 커플링될 수도 있다.
특정 실시양태에서, 아주반트는 합성 나노입자의 조립 전에 중합체, 예를 들면 폴리락트산-블록-폴리에틸렌 글리콜에 결합될 수 있거나, 또는 합성 나노입자가 그 표면상의 반응성 또는 활성화가능 기를 사용하여 형성될 수 있다. 후자의 경우, 아주반트는 합성 나노입자의 표면에 의해 제공되는 결합 화학에 부합하는 기를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 실시양태에서는, 적합한 링커를 사용하여 바이러스-유사 입자 (VLP) 또는 리포솜에 펩티드 아주반트가 결합될 수 있다.
특정 실시양태에서, 링커는 문헌 [Hermanson 2008]에 기술되어 있는 바와 같은 단일이관능성 또는 이종이관능성 반응물일 수 있다. 예를 들면, 표면상에 카르복실 기를 함유하는 VLP 또는 리포솜 합성 나노입자가 EDC의 존재하에 단일이관능성 링커인 아디픽 디히드라지드 (ADH)로 처리됨으로써, ADH 링커를 가지는 상응 합성 나노입자를 형성할 수 있다. 생성되는 ADH 연결 합성 나노입자는 이후 NC상 ADH 링커의 타 말단을 통하여 산 기를 함유하는 펩티드 항원과 접합됨으로써, 상응하는 VLP 또는 리포솜 펩티드 접합체를 생성한다.
결합 메카니즘
1종 이상의 아주반트-적재 나노입자는 비제한적으로 정전기적 인력, 직접적이거나 링커를 통하는 공유 커플링, 또는 소수성 상호작용을 포함한 다양한 결합 메카니즘을 통하여 각 불활성화된 병원체에 결합될 수 있다.
일부 실시양태에서는, 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체가 아주반트-적재 나노입자에 결합된다. 대부분의 원생동물, 박테리아 및 바이러스는 생리학적 pH에서 음의 표면 전하를 가진다 (문헌 [Robert A. Freitas Jr., Nanomedicine, Volume IIA: Biocompatibility, Landes Bioscience, Georgetown, TX, 2003]). 예를 들어, 그람-음성 박테리아는 그의 표면에 강한 음의 전하를 부여하는 지질다당류로 구성되는 외부 막을 가지고 있다. 거의 모든 그람-양성 박테리아 세포 벽은 음으로 하전된 타이코산이 풍부한 두꺼운 펩티도글리칸 층으로 이루어져 있다 (문헌 [Knox, et al., Bacteriol. Rev. 37(2):215, 1973]). 양이온성 나노입자가 정전기적 인력을 통하여 이러한 음으로 하전된 병원체들을 효과적으로 표적화하는 데에 사용될 수 있다 (문헌 [Liu et al., Nature Nanotechnology 4, 457-463, 2009]).
일부 실시양태에서, PLGA-PLH-PEG에 의해 형성되는 나노입자는 그의 표면상에 충분히 강한 양이온 전하를 가지고 있어서, 정전기적 인력을 통하여 음으로 하전된 불활성화 병원체에 결합할 수 있다.
일부 실시양태에서, 불화성화된 병원체는 나노입자 표면상에 접합된 링커를 통하여 아주반트-적재 나노입자에 결합될 수 있다. 상기 링커는 불활성화된 병원체의 표면 항원에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체, 예컨대 이. 콜리 O157 표면 항원을 표적으로 하는 모노클로날 항체일 수 있다 (문헌 [Zhao et al., Proc Natl Acad Sci USA. 101(42):15027-32, 2004]). 링커는 불활성화된 병원체의 표면 표적에 특이적으로 결합하는 압타머, 예컨대 높은 친화성 및 특이성으로 병독성 균주인 엠. 투베르쿨로시스 (H37Rv)에 결합하는 압타머 NK2일 수 있다 (문헌 [Chen et al., Biochem Biophys Res Commun. 8;357(3):743-8, 2007]). 링커는 불활성화된 병원체의 표면 표적에 특이적으로 결합하는 항생제, 예컨대 반코마이신일 수 있다 (문헌 [Kell et al., ACS Nano 2:1777-1788, 2008]). 링커는 불활성화된 병원체의 표면 다당류에 특이적으로 결합하는 렉틴, 예컨대 에이치. 파이로리(H. pylori) 균주의 탄수화물 수용체에 결합하는 울렉스 유로파에우스(Ulex Europaeus) 응집소 I (UEA I) 또는 콘코나발린 A (Con A) 렉틴일 수 있다 (문헌 [Umamaheshwari et al., J Drug Target. 11(7):415-23, 2003]). 링커는 또한 불활성화된 병원체의 표면 표적에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드, 예컨대 스시(Sushi) 1일 수 있다 (문헌 [Leptihn et al., BMC Biol 7:22, 2009]). 본원에서 기술되는 다른 링커들이 사용될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 불활성화된 병원체는 서로 고도로 특이적인 비-공유 상호작용을 형성하는 결합 상대물들의 쌍을 통하여 아주반트-적재 나노입자에 결합된다. 적합한 결합 쌍에 대해서는 관련 기술분야에 잘 알려져 있는데, 예를 들면 바이오틴과 아비딘, 바이오틴과 스트렙타비딘, 바이오틴과 뉴트라비딘, 글루타치온-S-트랜스퍼라제와 글루타치온, 말토스-결합 단백질과 아밀라제, 및 말토스-결합 단백질과 말토스이다.
백신 조성물의 사용 방법
본원에서 개시되는 백신 조성물은 대상체에서 백신에 함유되어 있는 특정 병원체에 의한 차후의 감염에 대하여 면역 보호를 제공하는 예방용 백신으로서 유용하다. 예를 들면, 상기 병원체는 박테리아 예컨대 클라미디아 트라코마티스 , 프란시셀라 툴라렌시스 , 미코박테리움 투베르쿨 로시스 , 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 , 리스테리아 모노사이토게네스 , 비브 리오 콜레라, 쉬겔라 손네이 , 쉬겔라 플렉스네리 및/또는 살모넬라 티피무리움; 또는 바이러스 예컨대 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), C형 간염 바이러스일 수 있다. 감염성 병원체로부터의 질환이 발생할 위험성이 있는 대상체는 본원에서 개시되는 백신 조성물을 사용하여 예방적으로 치료될 수 있다. 풍토성 감염 질환 지역으로 여행을 하거나 거기에 살고 있는 개체들은 특정 감염성 병원체의 위험성이 있으며, 그에 대한 예방적 예방접종의 후보인 것으로 간주될 수 있다. 예방적 치료는 특정 질환과 특정 위험 인자, 예컨대 지리적 위치 또는 작업 환경 사이에 알려져 있는 연관성이 존재하는 어떠한 수의 병원체-관련 질환에도 적용될 수 있다.
백신 조성물은 또한 걸려있는 병원체에 대한 대상체의 면역 반응을 개시하거나 강화하는 데에 사용될 수 있는 치료용 백신으로서 유용하다. 감염성 병원체에 걸려있는 대상체는 본원에서 개시되는 백신 조성물을 사용하여 치료적으로 치료될 수 있다.
T-세포 매개 점막 면역 반응을 도출하는 이러한 백신 조성물의 능력은 본 조성물을 박테리아, 바이러스, 기생충, 진균, 또는 점막을 통하여 대상체에 진입하는 기타 미생물 병원체에 의해 야기되는 감염성 질환을 예방 및 치료하는 데에 특히 유용하게 한다.
예방 또는 치료 면역 반응의 바람직한 결과는 질환에 따라, 관련 기술분야에 잘 알려져 있는 원리에 따라 가변적일 수 있다. 예를 들면, 병원체에 대한 면역 반응은 병원체의 집락화 및 복제를 억제 또는 예방함으로써 보호 면역 및 임의 질환 증상의 제거 또는 감소를 수행할 수 있다. 그러나, 병원체에 대한 백신은 그것이 증상의 수, 중증도 또는 기간을 감소시키는 경우; 그것이 증상을 가지는 군집 중 개체의 수를 감소시키는 경우; 또는 심지어는 그것이 단순히 감염성 병원체의 투과를 감소시키는 경우에도, 효과적인 것으로 간주될 수 있다. 치료는 단일 투여로 수행되거나, 간격을 두고 반복될 수 있다. 적절한 투약량은 통상의 기술자에 의해 이해되는 다양한 파라미터들, 예컨대 백신 조성물 자체, 투여 경로, 또는 예방접종되는 대상체의 상태 (체중, 연령 등)에 따라 달라진다.
투여
일반적으로, 백신은 비제한적으로 하기를 포함한 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다: 경구, 흡입 (비, 기관지 또는 폐), 정맥내, 복강내, 근육내, 경피, 피하, 국소, 설하, 질 또는 직장 수단.
본원에서 개시되는 감염 예방 또는 치료용 백신 조성물 및 방법은 경구/소화관, 기도 또는 비뇨생식기로에 대한 점막 투여를 통할 때 특히 효과적이다. 예를 들면, 백신 조성물은 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 기관지, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로를 통하여 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신 조성물은 비내 예방접종에 의해 투여될 수 있다. 비내 예방접종 방법에는 면역화될 개체의 비강인두에 대한 액적, 스프레이 또는 건조 분말화된 형태의 백신, 예컨대 분무되거나 에어로졸화되는 백신 조성물의 투여가 포함된다. 대안적인 투여 경로에는 질내 및 직장내 투여가 포함되는데, 직장 또는 질 투여를 위한 좌약이 이용될 수 있다. 백신 조성물은 질 경로에 의해 투여될 수 있으며, 에멀션화제, 카르보폴®과 같은 중합체, 그리고 기타 질 크림 및 좌약의 알려져 있는 안정화제들을 포함한 제약상 허용되는 질 투여용 부형제들이 사용될 수 있다. 백신 조성물은 직장 경로에 의해 투여될 수 있는데, 직장 좌약 형성용으로 관련 기술분야에 알려져 있는 왁스 및 중합체들이 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, 백신 조성물은 경구로, 또는 다른 위장관 경로를 통하여 투여될 수 있다. 경구 투여용 위 내성 캡슐 및 과립과 같은 장 제제들이 그와 같은 투여에 적합하다.
직접 점막에 대하여 백신 조성물을 표적화하는 것은 점막 면역을 유도하는 백신 조성물의 능력을 크게 촉진한다. 점막 면역은 그것이 점막 장벽을 횡단하기 전의 병원체에 의한 감염에 대한 보호에 필수적이다. 또한, 비내 예방접종과 같은 일 경로를 통한 점막 예방접종은 그 점막 부위에서뿐만 아니라, 생식기 점막과 같은 원거리 점막 부위에서의 점막 면역도 유도할 수 있다 (문헌 [Mestecky, Journal of Clinical Immunology, 7:265-276, 1987]). 점막 면역 반응을 유도하는 데에 있어서의 그의 우수성 이외에도, 점막 예방접종의 또 다른 매력적인 장점이 우수한 전신성 면역도 유도하는 그의 능력에 기인한다. 점막 면역은 또한 특히 강력한 면역을 지속하기 위하여 부스팅을 필요로 하는 경우에, 고통스러운 주사 및 환자에 대한 부정적인 관련 효과를 회피한다.
백신 조성물의 투여는 유효량의 백신이 그의 표적에 도달하는 것을 가능케 하는 어떠한 허용가능한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 점막 투여용으로 적절한 침투제가 백신 조성물에 포함될 수 있는데, 예를 들면 세제, 담즙산염 또는 푸시드산 유도체이다. 선택되는 구체적인 양식은 구체적인 조성물, 치료되는 대상체 상태의 중증도, 및 대상체에서 효과적인 면역 반응을 유도하는 데에 요구되는 투약량과 같은 인자들에 따라 달라지게 된다. 본원에서 일반적으로 사용될 때, "유효량"은 치료되는 대상체에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양이다. 백신의 실제 유효량은 이용되는 구체적인 병원체 및 아주반트, 제제화되는 구체적인 백신 조성물, 투여 양식, 그리고 예방접종되는 개체의 연령, 체중, 상태는 물론, 투여 경로 및 질환 또는 장애에 따라 달라질 수 있다.
[ 실시예 ]
하기 실시예에서 본 발명이 추가적으로 기술되는 바, 청구범위에서 기술되는 본 발명의 영역을 제한하는 것은 아니다.
실시예 1. 불활성화된 클라미디아 트라코마티스 를 사용한 면역화는 조절성 T 세포-매개 면역 관용을 유도한다
클라미디아 속의 박테리아는 안구의 다혈증, 생식기 및 호흡기 질환, 예컨대 결막염 및 트라코마 실명(blinding trachoma), 비-임균성 요도염, 자궁경부염, 골반 염증 질환, 자궁외 임신, 난관 요인 불임 및 간질 폐렴을 야기한다 (문헌 [Igietseme et al., Expert Review of Vaccines 10:1585-1596, 2011]). 클라미디 아 트라코마티스 (이후 "클라미디아" 또는 "Ct")는 감염성인 기본 소체 (EB)와 대사상 활성인 망상체 (RB) 사이에서 그의 생활 주기가 변경되는 절대성 세포내 병원체이다. 클라미디아 트라코마티스 감염에 대하여 인간에서 사용하는 데에 가용한 백신은 현재 존재하지 않는다 (문헌 [Igietseme et al, Expert Review of Vaccines 10:1585-1596, 2011]).
불활성화된 클라미디아를 기재로 하는 백신을 먼저 그의 면역 보호 효과에 대하여 조사하였다. 살아 있는 병원성 클라미디아 기본 소체를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화하였다. 맥코이(McCoy) 세포를 감염시켜 활성 증식 클라미디아를 배제하는 것에 의해 불활성화된 클라미디아 박테리아를 단리하였다.
감염성 또는 UV-불활성화 클라미디아를 사용하여 마우스를 자궁내로 면역화하였다. 자궁내 접종을 비-수술 배아 전달 장치 (NSET, 파라 텍스(Para Techs) 사)를 사용하여 첨부 지침에 따라 수행하였다. 마우스를 간단하게 구속하고, 하나의 소형 플라스틱 "스페큘럼(speculum)"을 질에 삽입하였다. 이는 자궁경부를 횡단하는 클라미디아 박테리아 10-20 μl의 정밀한 전달을 위하여 특수 마이크로피펫 팁 (일반적인 피펫상의)이 위치되는 것을 가능케 하였다.
면역화 4주 후, 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스에 살아 있는 클라미디아 106 감염 단위 (IFU)를 자궁내로 접종하였다. 6일 후, 모든 접종 마우스로부터 자궁을 수확하고, 자궁으로부터 RNA 샘플을 제조하였다. 정량 PCR (qPCR)을 수행하여, 마우스 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로제나제 (GAPDH)의 양에 대비한 클라미디아 16s RNA의 양을 검출 및 측정하였다. 4회 독립 실험의 각 마우스에 대하여 클라미디아 16s rRNA의 표준화된 양을 계산하여, 도 1a에 클라미디아 부하로 나타내었다. 감염성 클라미디아를 사용한 자궁내 면역화는 살아 있는 클라미 디아에 의한 차후의 자궁내 접종에 대하여 감소된 클라미디아 부하 및 면역 보호를 초래하였다 (도 1a). 그러나, UV-불활성화된 클라미디아 (UV-Ct)를 사용한 자궁내 면역화는 차후의 살아 있는 클라미디아 접종에 대하여 강화된 감수성을 초래함으로써, UV-불활성화된 클라미디아에 의해 면역 관용이 유도되었음을 표시하였다 (도 1a). 이는 불활성화된 박테리아 단독이 보호를 유도하지 않고, 대신 오히려 면역 관용을 유도한다는 것을 암시한다.
다음에, 상이한 유형의 아주반트들을 UV-불활성화된 클라미디아와 공동-투여하여, 그것이 불활성화된 클라미디아에 의해 유도되는 면역 관용을 극복할 수 있는지를 관찰하였다. 감염성 클라미디아, UV-불활성화 클라미디아, 또는 하기 아주반트들 중 1종을 동반한 UV-불활성화 클라미디아를 사용하여, 마우스를 자궁내로 면역화하였다: 알루미늄 히드록시드 (알룸); 이미퀴모드 (IMQ); 또는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티 유형 C (CpG). 면역화 4주 후, 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스에 자궁내 또는 피하 중 어느 하나로 상기한 바와 같이 살아 있는 클라미디아를 접종하였다. 접종 후 6일차에 qPCR에 의해 클라미디아 부하를 측정하고, 대표적인 실험의 데이터를 도 1b에 나타내었다. UV-불활성화 클라미디아를 사용한 자궁내 면역화는 역시 면역 관용을 초래하였으며, 아주반트의 공동-투여는 면역 관용 효과를 극복하지 못하였다 (도 1b). UV-불활성화 클라미디아를 사용한 피하 면역화는 알룸, IMQ 또는 CpG와 공동-투여된 경우에도 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호 또는 관용을 제공하지 않았다 (도 1b).
클라미디아-특이적 TCR 트랜스제닉 마우스를 사용하여, 면역 관용을 매개하는 구체적인 T 세포 유형을 조사하였다. 야생형 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포 (NR1 세포)를 CD90.2+ 숙주 마우스에 전달하였다. 1일 후, 감염성 또는 UV-불활성화 클라미디아 106 IFU를 사용하여 수용자 마우스를 자궁내로 접종하였다. 감염 후 4일차에, 배출 림프절을 수확하여, 유동 세포측정법을 위한 세포를 준비하였다. 전달된 CD90.1+ CD4+ T 세포를 조절성 T (Treg) 세포의 마커인 세포내 FoxP3 발현에 대하여 분석하였다. UV-Ct 면역화 후 자궁 및 배출 LN에서 FoxP3-발현 CD25high NR1 세포의 상당한 증가가 관찰되었다 (도 1c-1d). 이러한 FoxP3+ 세포들은 증식이 아니라 전환에 의해 생성된 것인데, FACS에 의해 단리된 eGFP- NR1 세포의 전달이 유사한 수의 Treg를 산출하였기 때문이다 (도 1c-1d). 이러한 데이터는 UV-Ct 면역화가 FoxP3+ Treg의 유도로 이어짐으로써, 이와 같은 백신 접근법이 비효과적이며 면역 관용을 유도하는 이유를 설명할 수 있다는 것을 암시한다.
CD25는 마우스의 CD4+ FoxP3+ Treg 세포에 대한 확립되어 있는 마커이다. Treg가 관용의 원인이 되는지를 확인하기 위하여, UV-Ct를 사용하여 미리 예방접종된 마우스에서의 클라미디아 접종 3일 전 및 후에, 항-CD25 모노클로날 항체 처리에 의해 Treg 세포를 고갈시켰다. 상기한 바와 같이 클라미디아 부하를 조사하였다. 구체적으로, UV-불활성화 클라미디아 106 IFU를 사용하여 마우스를 자궁내로 면역화하였다. 4주 후, 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스에 감염성 클라미디아 106 IFU를 접종하였다. 접종 3일 전 및 접종 3일 후에, 항-CD25 단일클혼 항체 (PC61.5) 또는 대조 IgG (500 mg)를 사용하여 면역화된 마우스를 처리하였다. 접종 후 6일차에, qPCR에 의해 클라미디아 부하를 측정하였다. Treg의 고갈이 대조 IgG-처리 마우스 대비 생식기로에서의 클라미디아 농도를 감소시킴으로써 (도 1e), CD4+ FoxP3+ Treg 세포가 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용을 매개하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 표시하였다.
활성화될 경우, Treg 세포는 다량의 인터류킨-10 (IL-10)을 분비한다. 따라서, 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용에서의 IL-10의 역할을 조사하였다. 감염성 또는 UV-불활성화 클라미디아를 사용하여, 야생형 또는 IL-10-/- 마우스를 자궁내로 면역화하였다. 살아 있는 클라미디아를 접종한 후, 상기한 바와 같이 클라미디아 부하의 측정을 수행하였다. IL-10 결핍이 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용을 무효화함으로써 (도 1f), Treg-분비 IL-10이 불활성화된 클라미디아 유도 면역 관용에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인해 주었다.
이러한 결과는 UV-Ct 예방접종이 IL-10-의존성인 방식의 클라미디아-특이적 CD4+ Treg의 유도를 통하여 관용을 자극한다는 것을 표시한다.
실시예 2. 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물의 생성 및 평가
아주반트-적재 나노입자에 결합된 UV-불활성화 클라미디아를 포함하는 백신 조성물을 제조하여 평가하였다. 백신 조성물에 포함될 수 있는 적합한 아주반트의 예로는 TLR7 효능제 R848을 사용하였다. R848을 PLA에 공유로 연결시키고, 생리학적 pH 7.4에서 약간 음으로 하전되고 표면 페길화되어 있는(PEGylated) 나노입자에 조립하였다. pH를 6으로 낮추어 표면-스위칭(surface-switching) 메카니즘을 활성화함으로써, 나노입자의 양의 표면 전하 및 이후의 음으로 하전된 클라미디아에의 결합을 초래하였다 (도 2a).
중합체 합성
폴리(L-히스티딘) (PLH)은 중간의 20개의 히스티딘 잔기와 함께 N-말단 리신 및 C-말단 시스테인을 함유하도록 (N- 내지 C-말단 서열: KH20C) 젠스크립트(GenScript) 사 (뉴저지 피스카타웨이 소재)에서 맞춤 합성하였다. 이 KH20C 펩티드 (0.01 mmol)을 수중에서 0.01 mmol의 오르소피리딜-변형 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (mPEG-OPSS, 앨라배마 아랍 소재 라이산 바이오(Laysan BIo) 사에서 구매)와 혼합함으로써, PLH-PEG 이블록 공중합체를 생성시키고, 이것을 슬라이드-A-라이저(Slide-A-Lyzer) 2,000 MWCO 투석 카세트 (서모 사이언티필(Thermo Scientific) 사)를 사용한 투석에 의해 정제한 후, 건조 생성물로 동결건조하였다.
별도로, 0.67의 고유 점도를 가지는 5 μmol의 폴리(락트산-co-글리콜산)-COOH (PLGA-COOH) (락텔 압소버블스(LACTEL Absorbables) 사에서 구매)를 2 mL의 디클로로메탄 중 0.246 mmol의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 (EDC) 및 0.295 mmol의 N-히드록시숙신이미드 (NHS)에 의해 활성화하였다. -20 ℃ 메탄올에 의해 PLGA-NHS를 침전시킨 후, 진공에서 50 ℃로 건조하였다. 다음에, 건조된 PLGA-NHS (104.9 mg)를 DMSO 중에서의 24시간 이상 동안의 반응에 의해 24.8 mg의 PLH-PEG 이블록 공중합체 (상기한 바와 같이 함성됨)에 커플링시킴으로써, PLGA-PLH-PEG 삼블록 공중합체를 생성시켰다. 상기 PLGA-PEG 이블록 공중합체는 베링거 잉겔하임(Boehringer Ingelheim) GmbH 사로부터 구매하였다.
개환 중합에 의해 R848-PLA (폴리락트산)을 합성하였다. R-848 (100 mg, 3.18×10-4 몰, 인비보겐(InVivogen) 사), D/L 락티드 (5.6 mg, 3.89×10-2 몰, 시그마 알드리치 사) 및 무수 나트륨 술페이트 (4.0 gm)를 진공하에서 50 ℃로 8시간 동안 건조한 후, 이어서 톨루엔 (100 mL)을 첨가하였다. 반응물을 120 ℃로 설정된 오일 배스에서 교반한 다음, 주석 에틸헥사노에이트 (75 mg, 60 μL)를 첨가하였다. 다음에, 아르곤하에서 16시간 동안 가열을 계속하였다. 물 및 이어서 추가적으로 톨루엔 (200 mL)을 첨가함으로써 반응을 중지시켰다. 다음에, 상기 톨루엔 용액을 5 % 염산을 함유하는 10 % 나트륨 클로라이드 용액 (200 mL) 후 이어서 포화 나트륨 비카르보네이트 (200 mL)로 다시 세척하였다. 상기 용액을 마그네슘 술페이트 상에서 건조하고, 여과한 후, 진공하에서 증발시킴으로써, 3.59 그램의 폴리락트산-R-848 접합체를 생성시켰다. 중합체 중 일부를 염기 중에서 가수분해하고, HPLC에 의해 R-848 함량에 대하여 조사하였다. HPLC 반응을 R-848 농도의 표준 곡선에 비교하는 것에 의해, 상기 중합체가 중합체 그램 당 5.6 mg의 R-848을 함유한다는 것이 확인되었다. 중합체의 분자량은 GPC에 의해 약 27,000인 것으로 확인되었다 (US 특허 출원 공개 제20110268805호 참조).
R848-적재 중합체성 나노입자 제조
전기한 바와 같이 중합체-함유 유기 상을 수성 상에 에멀션화함으로써, R848-적재 나노입자를 제조하였다 (문헌 [Kamaly et al., Chem. Soc. Rev., 41:2971-3010, 2012]). 하기 3종의 중합체를 혼합함으로써 유기 상을 제조하였다: (1) 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체 (40 중량%), (2) PLGA-PEG 이블록 공중합체 (20 중량%), 및 (3) 폴리(락트산)-R848 접합체 (PLA-R848) (40 중량%). 상기 PLGA-PEG 공중합체는 유기 상의 안정성을 향상시키기 위하여 첨가하였다. 생분해성 중합체와의 활성 성분의 접합체를 형성시키는 것은 캡슐화를 향상시키고, PLGA- 또는 PLA-기재 나노입자로부터의 활성 성분의 방출을 조절한다 (문헌 [Kolishetti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 107:17939-17944, 2010]).
백신 제제화
통상적인 제제화에서, 5.33 mg의 PLH-함유 중합체를 2.66 mg의 PLGA-PEG 및 5.33 mg의 R848-PLA 접합체와 함께 400 μL의 15/85 DMSO/에틸 아세테이트 용액 중에서 혼합하는 것에 의해, 클라미디아 박테리아에 결합하도록 설계된 나노입자를 제조하였다. 8.0 mg의 PLGA-PEG 및 5.33 mg의 R848-PLA 만을 사용하여 유사한 방식으로 양으로 하전되지 않은 대조 나노입자를 제제화하였다. R848-PLA를 함유하지 않는 나노입자용으로는, 동일한 양의 PLGA를 사용하였다 (0.67의 고유 점도, 락텔 압소버블스 사). 상기 중합체-함유 유기 용액을 프로브 팁(probe tip) 초음파처리장치 (미소닉스 소니케이터(Misonix Sonicator) 사 S-4000, 뉴욕 파밍데일 소재)를 사용하여 40 % 진폭의 연속 모드로 30초 동안 2 mL의 순수한 물에 초음파처리한 다음, 퓸(fume) 후드에서 자석 교반하에 8 mL의 순수한 물에 희석하였다. 2시간 이상 동안 용매를 증발시키면서, 그 시점에 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-4 100,000 NMWL 컷오프 필터 (밀리포어(Millipore) 사, 매사추세츠 빌레리카 소재)를 사용한 반복적인 한외여과에 의해 나노입자를 수집 및 정제하였다.
상기 중합체성 나노입자 (40 중량%의 PLGA-PLH-PEG, 40 중량%의 PLA-R848, 20 중량%의 PLGA-PEG) (0.67 mg/투여분)를 pH 6.0의 희석 염 용액 중에서 UV-불활성화 클라미디아 투여분 당 107 IFU로 인큐베이팅하였다. 이와 같은 pH에서, 나노입자는 양의 표면 전하 (제타 전위 20.7±1.0 mV)를 산출함으로써, 음으로 하전된 UV-불활성화 박테리아의 표면 (제타 전위 -12.9±0.6 mV)에 결합하여 원하는 클라미디아-나노입자 접합체를 형성할 수 있다 (도 2a). 대조 제제로는, (1) PLGA-PEG (60 중량%) 및 (2) PLA-R848 접합체 (40 중량%)를 함유하는 제제를 제조하고, 상기와 동일한 단계로 처리하였다.
원자력 현미경법에 의해, 불활성화된 클라미디아에 대한 R848-적재 나노입자 ("전하-스위칭 합성 아주반트 입자" (cSAP)로도 지칭됨)의 결합을 조사하였다. 도 2b는 낮은 pH 조건, 예컨대 pH 6에서의 불활성화된 클라미디아 트라코마티스의 표면에 대한 R848-적재 나노입자의 결합을 보여주는 냉동-TEM (냉동 투과 전자 현미경) 영상이다. 동적 광 산란은 UV-Ct 또는 cSAP 단독에 비교한 UV-Ct-cSAP 구성체의 크기 차이를 밝히는 것에 의해 불활성화된 클라미디아 박테리아에 대한 R848-적재 나노입자의 결합을 확인해준다 (도 2c).
백라이트(BacLight) 염색 키트를 사용하여 UV 불활성화된 클라미디아 (UV-Ct)를 염색한 다음, 알렉사 플루어(Alexa Fluor) 488 표지된 cSAP 또는 PLH 기가 결핍되어 있는 대조 입자 (SAP)와 함께 7.4 및 6.0의 pH에서 인큐베이팅하였다. 유동 세포측정법을 사용하여, UV-Ct와 cSAP 또는 SAP 사이의 결합을 조사하였다. UV-Ct는 pH 7.4에서가 아닌 pH 6에서만 cSAP에 결합한다 (도 2d-2e).
백신 조성물의 평가
R848-적재 나노입자에 결합된 UV-불활성화 클라미디아를 포함하는 백신 조성물의 면역 보호 효과를 조사하였다. 마우스를 106 IFU의 감염성 클라미디아, 또는 UV-불활성화 클라미디아 (UV-Ct), R848-적재 나노입자에 결합된 UV-Ct, 빈 나노입자에 결합된 UV-Ct 또는 R848과 혼합된 UV-Ct를 포함하는 백신 조성물을 사용하여 자궁내로 면역화하였다. 면역화 4주 후, 106 IFU의 살아 있는 클라미디아를 사용하여 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하였다. 접종 후 6일차에, qPCR에 의해 클라미디아 부하를 측정하였다. R848-적재 나노입자에 결합된 UV-불활성화 클라미디아를 포함하는 백신 조성물을 사용한 면역화는 차후의 살아 있는 클라미디아 접종으로부터 마우스를 보호하나, 다른 조성물들은 그렇지 않다 (도 2f). 특정 조건에서는, UV-불활성화 클라미디아에 결합시키기 전에 나트륨 히드록시드 (NaOH)를 사용하여 R848-적재 나노입자를 중화하였다. 일부 다른 조건에서는, UV-불활성화 클라미디아에 결합시키기 전에 1:10 또는 1:100 배로 R848-적재 나노입자를 희석하였다. UV-불활성화 클라미디아에의 결합 전의 R848-적재 나노입자의 1:10 적정 또는 중화는 백신 조성물의 면역 보호 특성을 변화시키지 않는다 (도 2g).
ELISA에 의해, 살아 있는 클라미디아, UV-불활성화된 클라미디아, 및 UV-Ct-cSAP에 의한 혈청 중 항-클라미디아 IgG의 유도를 조사하였다. 데이터를 개별 마우스로부터의 혈청에서의 광학 밀도 (OD)로서 도 2h에 나타내었다. UV-Ct-cSAP은 살아 있는 클라미디아와 유사한 수준으로 마우스에서 IgG를 유도할 수 있었다 (도 2h).
실시예 3. 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물 유도 보호 면역은 CD4 + T 세포에 의해 매개된다
보호 면역을 매개하는 이펙터 세포를 조사하기 위하여, C57BL/6 야생형, DHLMP2a-/- (항체-결핍), μMt (B 세포-결핍), CD8-/-, MHC 클래스 II-/- (CD4+ T 세포에 의한 항원 인식 결핍) 및 RAG-2-/- 마우스 (T 및 B 림프구 결핍)를 UV-불활성화 클라미디아에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 신규 백신 조성물로 면역화하고, 1개월 후 생식기로에 감염성 클라미디아를 접종하였다. DHLMP2a-/- (항체-결핍), μMt (B 세포-결핍) 및 CD8-/- 마우스 에서는 차후의 클라미디아 감염에 대한 보호 면역이 보존되었으나; MHC 클래스 II-/- (CD4+ T 세포에 의한 항원 인식 결핍) 및 RAG-2-/- (T 및 B 림프구 결핍) 마우스에서는 상실되었다 (도 3a-3c). 이러한 발견은 CD4+ T 세포가 UV-불활성화 클라미디아에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 신규 백신 조성물에 의해 자극되는 보호 면역을 매개하는 데에 있어서 중요한 역할을 할 수도 있다는 것을 표시한다.
CD4+ T 세포가 신규 백신 조성물에 의해 자극되는 보호 면역을 매개한다는 것을 확인하기 위하여, 감염성 클라미디아 (Ct), UV-불활성화 클라미디아 (UV-Ct), 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)으로 마우스를 면역화하였다. 4주 후, 면역화된 마우스 또는 대조 마우스로부터 CD4+ 또는 CD8+ T 세포, 또는 T-세포 고갈 림프구를 단리하여, 미접촉 마우스로 전달하였다. 전달 1일 후 수용자 마우스에 106 IFU의 살아 있는 클라미디아를 접종하고, 접종 6일 후에 이들 마우스로부터의 자궁을 수확하였다. 상기 실시예 1에 기술되어 있는 바와 같이, 클라미디아 부하를 조사하였다.
감염성 클라미디아 또는 신규 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스로부터 수득된 CD4+ T 세포가 전달된 수용자 마우스에서는 차후의 클라미디아 접종에 대한 보호 면역이 관찰되었으나, 다른 수용자 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 3d). 불활성화된 클라미디아 단독을 사용하여 면역화되었던 마우스로부터의 CD4+ T 세포의 전달은 차후의 클라미디아 접종에 대한 강화된 감수성을 부여함으로써, 면역 관용 역시 CD4+ T 세포에 따라 달라진다는 것을 확인해 주었다 (도 3d). 따라서, 도 3d는 보호 면역이 CD8+ T 세포 또는 다른 림프구가 아닌 CD4+ T 세포에 의해 매개된다는 것을 보여준다.
클라미디아-특이적 T 세포 수용체 (TCR) 트랜스제닉 마우스를 사용하여, 신규 백신 조성물에 의한 클라미디아-특이적 CD4+ T 세포의 유도를 조사하였다. 형광 염료인 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 (CFSE)를 사용하여 야생형 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포 (NR1 세포)를 표지한 후, 면역화 1일 전에 CD90.2 숙주 마우스로 전달하였다. 106 IFU의 감염성 클라미디아 (Ct), UV-불활성화 클라미디아 (UV-Ct), 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용하여 수용자 마우스를 자궁내로 접종하였다. 접종 후 4일차에, 수용자 마우스로부터 배출 림프절 및 자궁을 수확하여, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 림프절 및 자궁에서의 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD4+ T 세포의 절대 수를 계수하였다. UV-불활성화된 클라미디아를 사용하여 접종된 마우스와 비교하였을 때, 감염성 클라미디아 또는 신규 백신 조성물을 사용하여 접종된 마우스의 자궁 및 배출 LN에서 상당히 더 많은 NR1 세포가 축적되었다 (도 4a).
유동 세포측정법에 의해, CFSE 희석에 있어서의 림프절로부터의 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD90.1+ CD4+ T 세포의 증식을 분석하였다. CD90.1+ CD4+ T 세포는 비감염 마우스에의 전달 후 높은 CFSE 수준을 유지함으로써, 해당 CD90.1+ CD4+ T 세포가 감염 부재시에는 증식하지 않음을 보여주었다 (도 4b). UV-불활성화 클라미디아 (UV-Ct)로 감염된 마우스는 대조 마우스와 유사한 수준의 클라미디아-특이적 CD4+ T 세포를 가짐으로써, 해당 마우스에서도 역시 클라 미디아-특이적 CD4+ T의 자극이 없음을 표시한다 (도 4b). 반면, 감염성 클라미디아 (Ct) 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용하여 접종된 마우스에서의 CD90.1+ CD4+ T 세포의 수는 비감염 대조 마우스 또는 UV-Ct를 사용하여 접종된 마우스에서의 것을 크게 초과하였다 (도 4b). 이러한 발견은 신규 백신 조성물이 살아 있는 클라미디아와 유사한 방식으로 클라미디아-특이적 CD4+ T 세포 증식을 유도한다는 것을 표시한다.
면역화 후 4일차에, 림프절로부터 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포를 단리하여, 시험관 내에서 T 세포 자극인자인 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 이오노마이신에 의해 재-자극한 후, 세포내 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2 생성에 대하여 염색하였다. UV-불활성화 클라미디아를 사용하여 면역화된 마우스 또는 대조 마우스와 비교하였을 때, 신규 백신 조성물 또는 감염성 클라미디아를 사용하여 면역화된 마우스에서 3종 전체 시토카인을 생성시키는 CD90.1+ CD4+ T 세포의 수가 상당히 더 많아서 (도 4c), 신규 백신 조성물이 살아 있는 클라미디아와 유사한 방식으로 활성인 클라미디아-특이적 T 세포 반응을 유도한다는 것을 표시하였다.
이러한 데이터는 UV-Ct-cSAP을 사용한 예방접종이 자궁 및 배출 LN (도 4a)에서의 NR1 세포 증식 (도 4b) 및 축적을 초래하며, 이는 살아 있는 클라미디아를 사용하여 감염된 마우스와 구별되지 않게 시토카인인 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2를 생성시킨다는 것을 보여주었다 (도 4c). 따라서, 불활성화된 박테리아에 대한 아주반트의 직접적인 연결은 차후의 박테리아 감염에 대하여 점막을 보호하는 다-기능성 항원-특이적 세포 면역 반응을 촉진한다.
실시예 4. 자궁의 CD103 - 수지상 세포는 클라미디아 -특이적 T 세포를 유도한다
CD45+ MHC-II+ 항원 제시 세포를 F4/80 및 CD103 발현에 따라 F4/80+ CD103- 대식세포, F4/80- CD103- 수지상 세포 및 F4/80- CD103+ 수지상 세포의 3개 하위세트로 분류하고, CD11c, CD11b 및 CX3CR1 발현에 대하여 분석하였다. F4/80+ CD103- 대식세포는 높은 CD11b 및 CX3CR1 발현을 나타내었으나, 낮은 CD11c 발현을 나타내었으며; F4/80- CD103- 수지상 세포는 높은 CD11c, CD11b 및 CX3CR1 발현을 나타내었고; F4/80- CD103+ 수지상 세포는 낮은 CD11b 및 CX3CR1 발현을 나타내었으나, 높은 CD11c 발현을 나타내었다 (도 5a).
마우스에 감염성 (Ct), UV-불활성화 (UV-Ct) 클라미디아 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 자궁내로 접종하였다. 감염 18 또는 24시간 후, 자궁 또는 림프절로부터 CD45+ MHC-II+ 세포를 단리하여, 형광-활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 그의 CD103 및 F4/80 발현에 따라 분류하였다. 분류된 항원-제시 세포 1,000개 당 qPCR에 의해 클라미디아 부하를 측정하였다. 단리된 자궁의 CD326+ 상피 세포 (EC)를 양성 대조로 사용하였다. CD103- 수지상 세포는 자궁 (도 5b) 및 림프절 (도 5c) 모두에서 F4/80+ 대식세포 및 CD103+ 수지상 세포에 비해 상당히 더 높은 클라미디아 부하를 가짐으로써, CD103- 수지상 세포가 클라미디아를 인식하고 제시하는 데에 있어서 중요한 역할을 한다는 것을 표시한다.
클라미디아-특이적 CD4+ 트랜스제닉 T 세포 (NR1 세포)를 CFSE로 표지한 후, 감염성 클라미디아 (Ct), UV-불활성화 (UV-Ct) 클라미디아 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용하여 자궁내로 접종된 마우스의 자궁으로부터 단리된 F4/80+ 대식세포, CD103- 수지상 세포 또는 CD103+ 수지상 세포와 함께 3일 동안 공동-배양하였다. CFSE 희석에 의해 클라미디아-특이적 CD4+ 트랜스제닉 T 세포의 증식을 측정하였다. 감염성 클라미디아를 사용하여 면역화된 마우스의 자궁으로부터 단리된 CD103- 수지상 세포는 시험관 내에서 클라미디아-특이적 CD4+ 트랜스제닉 T 세포의 증식을 유도하였으나, 다른 항원 제시 세포들은 그렇지 않았다 (도 5d). 다음에, 생체 내에서 클라미디아-특이적 CD4+ 트랜스제닉 T 세포에 대한 CD103- 수지상 세포의 효과를 조사하였다. 야생형 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포를 CFSE로 표지하여, CD90.2 숙주 마우스로 전달하였다. 1일 후, 수용자 마우스의 우측 발바닥에 감염성 클라미디아 (Ct), UV-불활성화 (UV-Ct) 클라미디아 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용하여 면역화된 마우스의 자궁으로부터 단리된 단리 F4/80+ 대식세포, CD103- 수지상 세포 또는 CD103+ 수지상 세포를 주사하였다. 세포 주사 3일 후에, 좌측 및 우측 오금 림프절을 CFSE-희석 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포에 대하여 분석하였다. 역시, 살아 있는 Ct 또는 UV-Ct-cSAP을 사용하여 면역화된 마우스의 자궁으로부터 단리된 CD103- 수지상 세포는 우측 오금 림프절에서 클라미디아-특이적 CD4+ 트랜스제닉 T 세포의 증식을 유도하였으나, 다른 항원 제시 세포들은 그렇지 않았다 (도 5e). 따라서, 자궁의 CD103- 수지상 세포는 시험관내 및 생체내 모두에서 클라미디아-특이적 T 세포의 증식을 유도한다.
이러한 데이터는 살아 있는 클라미디아 감염- 또는 UV-Ct-cSAP 면역화 마우스로부터 분류된 CD103- 수지상 세포가 CFSE 희석에 의해 측정되는 바와 같이 시험관 내 및 생체 내에서 NR1 세포의 증식을 자극한다는 것을 보여주었다 (도 5d-5e). CD103+ 수지상 세포는 UV-Ct 면역화 후에만 (도 5d) FoxP3+ CD25+ NR1 세포의 수를 증가시키는 것에 의해 상당한 NR1 증식을 촉진할 수 있었다 (도 5f). 이러한 결과들은 합쳐서 클라미디아 감염 또는 UV-Ct-cSAP 면역화 후, 생식기 점막으로부터의 CD103- 수지상 세포가 클라미디아 항원과 소통하여 클라미디아-특이적 CD4+ T 세포를 직접적으로 활성화함으로써 보호 면역을 촉진한다는 것을 나타낸다. 반대로, UV-Ct는 CD103- 수지상 세포 군집에 의해 효율적으로 흡수되지 않으며, 오히려 Treg의 유도로 이어짐으로써 생식기 점막에서의 보호와 관용 사이의 균형에 영향을 줄 수 있는 CD103+ 수지상 세포에서 그것이 발견된다.
실시예 5. 클라미디아 트라코마티스 백신 조성물에 의해 유도되는 점막-횡단 보호 면역
신규 백신 조성물에 의해 유도되는 보호 면역의 기간을 평가하였다. 무처리, 감염성 또는 불활성화 클라미디아, 또는 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용한 자궁내 면역화 6개월 후, 살아 있는 클라미디아를 자궁내로 마우스에 접종하였다. 상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 클라미디아 부하를 측정하였다. 신규 백신 조성물 또는 감염성 클라미디아를 사용한 자궁내 면역화는 면역화 후 적어도 6개월 동안 차후의 생식기 클라미디아 감염에 대하여 보호를 초래함으로써 (도 6a) 장기 면역의 존재를 표시하였으나, 불활성화된 클라미디아는 그렇지 않았다.
상이한 백신 투여 경로에 대해서도 시험하였다. 또 다른 점막 경계면인 비내 점막을 통하거나 통상적인 경로인 피하에 의한 것 중 어느 하나로 신규 백신 조성물을 투여하였다. 비내 접종의 경우, 마우스를 마취하고, 백신 조성물의 액적을 그것이 흡입될 때까지 그의 콧구멍에 위치시켰다. 피하 접종의 경우에는, 꼬리 또는 옆구리 기저의 피부 아래에 백신 조성물을 투여하였다. 면역화 4주 후, 감염성 클라미디아를 자궁내로 마우스에 접종하고, 클라미디아 부하를 측정하였다. 신규 백신 조성물 (UV-Ct-cSAP)을 사용한 비내 면역화는 차후의 생식기 클라미디아 감염에 대하여 보호 면역을 초래하였으나, 피하는 그렇지 않았다 (도 6b). 따라서, 신규 백신 조성물에 의해 점막-횡단 보호 면역이 유도되었다.
다음에, 야생형 CD90.1+ 트랜스제닉 CD4+ T 세포 (NR1)를 CD90.2 숙주 마우스로 전달하고, 1일 후, UV-Ct-cSAP을 사용하여 자궁내 (i.u.), 비내 (i.n.) 또는 피하 (s.c.)로 그것을 면역화하였다. 면역화 후 7일차에, 자궁을 수확하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD4+ T 세포의 절대 수를 계수하였다. 클라미디아-특이적 트랜스제닉 CD4+ T 세포는 자궁내 또는 비내에 의해서는 생식기 점막 조직으로 이동하였으나, 피하 면역화에 의해서는 그렇지 않았다 (도 6c).
비내 면역화 및 피하 면역화 후의 클라미디아-특이적 T 세포 반응들 사이의 양적 및/또는 질적 차이를 조사하였다. 자궁-체류 기억 세포는 면역화 후 폐에서 각인될 수 있으며, 이후 생식기로와 소통하고, 거기에서 보호를 매개한다. 이와 같은 가설을 시험하기 위하여, 마우스에 NR1 세포를 주사한 다음, 신규 백신 조성물 UV-Ct-cSAP을 사용하여 상이한 경로들에 의해 면역화하였다. 예방접종 7 및 30일 후, 몇 개의 기관에서 NR1 세포의 수를 정량하였다. 순환성 NR1 세포의 유도 (예컨대 혈액, 비장에서의 것)는 물론, 림프절 및 간에서의 NR1 세포의 수도 상이한 투여 경로들 사이에 유사하였다 (도 6d).
반대로, 자궁내 면역화는 생식기 점막에서의 가장 높은 수준의 NR1 동원 및 보유로 이어진 반면, 피하 예방접종은 어떠한 NR1 보유로도 이어지지 않았다 (도 6d). 흥미롭게도, 상당한 수의 NR1 세포가 비내 면역화 30일 후에도 자궁 내에 존재하였다 (도 6d). 폐의 NR1 세포의 수는 비내 및 자궁내 예방접종에서 자궁의 NR1 세포의 수와 반대되었다 (도 6d). 이러한 데이터는 자궁내 또는 비내 경로 중 어느 하나에 의한 면역화이면 생식기 점막에서의 보호성 NR1 세포의 동원 및 보유를 유도하는 데에 충분하다는 것을 보여준다.
점막 체류 및 순환 기억 T 세포의 기능을 분석하기 위하여, 마우스에 정맥내로 NR1 세포를 주사한 다음, UV-Ct-cSAP을 사용하여 비내로 예방접종하였다. 이렇게 면역화된 마우스를 3개 군으로 분할하여, 하기하는 바와 같이 항-알파-4 인테그린 (α4) 모노클로날 항체 (mAb) 및/또는 대조 IgG 중 어느 하나로 처리하였다. 면역화 9일 후 (D9)에, 살아 있는 클라미디아를 사용하여 자궁내로 3개 군 전체의 마우스를 접종하였다. 제1 군의 마우스 (Gr.1)는 3일차부터 11일차까지 (D3-11) 대조 IgG를 사용하여 정맥내로 처리하였다. 제2 군의 마우스 (Gr.2)는 D3-11 동안 항-α4 mAb를 사용하여 처리함으로써 클라미디아-특이적 T 세포의 이동을 완전히 차단하였다. 제3 군의 마우스 (Gr.3)는 D3-9 동안 대조 IgG를 사용하여 처리함으로써 조직 체류 기억 T 세포가 생식기 조직으로 소통하는 것을 가능케 한 다음, 클라미디 아 접종 후 D9-11 동안 항-α4 mAb를 사용하여 처리함으로써 T 세포의 추가적인 동원을 차단하였다. α4 인테그린을 효율적으로 차단하는 것은 자궁에서의 T 세포 축적을 방지하지만 (도 7c), 비장에서의 NR1 세포의 수에는 효과가 없었다 (도 7b). 비장에 존재하는 전신성 NR1 세포는 α4 항체 주사에 의해 영향을 받지 않았다 (도 7d).
도 7e는 NR1 세포의 축적이 IgG를 사용하여 처리된 Gr.1 마우스 및 클라미디아 접종 후에만 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.3 마우스에서는 관찰되었으나, 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.2 마우스에서는 예방접종 및 접종 후 모두에서 관찰되지 않았음을 보여준다. 도 7f는 클라미디아 접종 후에만 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.3 마우스 (자궁-체류 기억 T 세포는 함유하나 추가적으로 동원되는 순환성 기억 세포는 함유하지 않는 군)가 미접촉 대조 마우스, 및 면역화 및 접종 후 모두에 항-α4 mAb를 사용하여 처리된 Gr.2 마우스에 비해 생식기 클라미디아 접종에 대하여 더 크게 보호되었음을 보여준다.
실시예 6. 원거리 점막 표면에서의 면역화에 의해 체류 점막 기억 T 세포가 유도되어 차후 박테리아 접종에 대한 보호를 제공한다
차후의 박테리아 접종에 대한 백신-유도 보호에서의 체류 점막 기억 T 세포 및 동원된 순환성 기억 T 세포의 역할을 시험하기 위하여, 부생(parabiotic) 마우스의 쌍을 생성시킨 후, 도 8a에 나타낸 바와 같이 면역화하였다. 부생 배우체들 중 1종 (CD45.2)은 부생 전 (군 B) 또는 후 (군 A) 중 어느 하나에 UV-Ct-cSAP 또는 UV-Ct를 사용하여 비내로 면역화한 반면, 다른 배우체 (CD45.1)는 면역화하지 않았다. 부생 2주 후, 림프구의 키메라현상은 45 %를 초과하였다 (데이터 미도시). 어느 것이 나중에 이루어지는지에 관계없이, 부생 또는 면역화 2주 후에 양 배우체에 살아 있는 클라미디아를 접종하였다. qPCR에 의해, 각 마우스 자궁에서의 클라 미디아 박테리아의 농도를 측정하였다. 군 A 마우스의 양 배우체는 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호되었다 (도 8b).
UV-Ct-cSAP을 사용한 면역화 전에 2마리의 마우스가 혈액 순환을 공유하는 경우, 면역화에 의해 유도되는 점막 체류 기억 세포는 양 배우체의 자궁으로 소통하여, 양 마우스에 대한 차후의 박테리아 접종에 대하여 보호를 제공할 수 있다. 군 B 마우스의 경우, 면역화된 배우체 (CD45.2)만이 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호되었으며, 다른 배우체 (CD45.1)는 그렇지 않았다 (도 8c). NR-1 세포의 수는 보호되지 않은 마우스와 비교하였을 때, 차후의 생식기 클라미디아 접종에 대하여 보호된 마우스에서 더 높았다 (도 8d-8e). 중요한 것으로써, UV-Ct를 사용한 자궁내 면역화는 면역 관용을 유도하였으며, 그것은 부생 시점과 관계가 없었다 (도 8f-8g).
이러한 데이터는 체류 점막 기억 T 세포가 원거리 점막 표면에서의 본원에서 기술되는 백신 조성물을 사용한 면역화에 의해 유도될 수 있으며, 차후의 박테리아 접종에 대하여 보호를 제공할 수 있다는 것을 암시한다. 반면, 변형되지 않은 UV-Ct를 사용한 면역화는 면역 관용에 영향을 주는 순환성 Treg를 유도한다. 합쳐서, 이들 데이터는 본원에서 기술되는 클라미디아 백신 조성물을 사용하여 점막-횡단 면역이 달성될 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 7. 프란시셀라 툴라렌시스 백신 조성물의 생성 및 평가
프란시셀라 툴라렌시스는 고도로 병독성이며 야토병을 야기하는 그람-음성 세포내 박테리아가다. 어떻게 어디에서 박테리아가 신체에 진입하는지에 따라 몇 가지 유형의 야토병이 존재한다. 궤양선성 야토병이 가장 일반적인 종류의 야토병으로써, 감염 부위 - 보통 곤충 또는 동물에 물린 자국 -에 피부 궤양이 형성된다. 폐렴성 야토병은 전형적인 폐렴의 징후 및 증상을 야기하며, 치명적일 수 있다. 그의 낮은 감염 유발량, 에어로졸에 의한 확산의 용이성 및 높은 병독성으로 인하여, 프란시셀라 툴라렌시스는 페스트, 천연두 및 에볼라와 같은 다른 잠재적인 생물테러 요인들과 함께 미국 정부에 의해 클래스 A 선별 요인으로 분류되어 있다. 하기 2종의 상이한 프란시셀라 툴라렌시스 실험실 균주가 존재한다: 약독화 균주 LVS 및 완전히 병독성인 균주 SchuS4. LVS는 50년 이상 전에 박테리아의 철저한 시험관내 계대에 의해 생성된 것으로써, 살아 있는 백신으로 사용되어 왔다. 심각한 부정적인 부작용, 불완전한 면역 및 불확실한 면역원 특성이 LVS를 이상적인 백신이 되지 못하게 하고 있다.
살아 있는 LVS 박테리아를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화하였다. 인간 태생신(embryonic kidney) (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 박테리아를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 LVS 박테리아를 단리하였다. R848-적재 나노입자를 제조하고, 실시예 2에서 기술된 바와 같이 UV-불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스 (UV-LVS)에 결합시켰다. UV-불활성화된 LVS에 결합된 R848-적재 나노입자 (UV-LVS-cSAP)를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하였다. 대조 마우스에는 살아 있는 LVS 또는 대조 입자들 (cSAP, UV-LVS, UV-LVS+SAP)을 비내로 투여하였다. 4주 후, 치명적인 투여량의 살아 있는 LVS를 사용하여 비내로 면역화된 마우스 및 대조 마우스를 접종하고, 21일 동안 해당 마우스의 생존을 관찰하였다. 도 9a는 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스가 프란시셀라 툴라렌시스의 약독화된 LVS 균주에 의한 차후의 접종에 대하여 완전히 보호된다는 것을 보여준다.
프란시셀라 툴라렌시스의 완전히 병독성인 SchuS4 균주에 의한 차후의 접종에 대하여 백신 조성물에 의해 제공되는 보호를 조사하였다. 마우스를 UV-LVS-cSAP을 사용하여 비내로 면역화하거나, 또는 살아 있는 LVS 또는 대조 입자들 (UV-LVS 또는 UV-LVS+SAP)로 처리하였다. 2주 간격으로, 동일 조성물을 사용한 2회의 추가접종 면역화 또는 처리를 수행하였다. 4주 후, 완전히 병독성인 SchuS4 균주를 사용하여 면역화된 마우스 및 대조 마우스를 비내로 접종하고, 30일 동안 해당 마우스의 생존을 관찰하였다. 도 9b는 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스가 프란시셀라 툴라렌시스의 완전히 병독성인 SchuS4 균주에 의한 차후의 접종에 대하여 부분적으로 보호된다는 것을 보여준다.
보호 면역에 대한 투여 경로의 효과를 연구하였다. UV-LVS-cSAP, 살아 있는 LVS 또는 UV-LVS+SAP을 사용하여 피하 또는 복강내 중 어느 하나로 마우스를 처리하였다. 4주 후, 치명적인 투여량의 살아 있는 LVS를 사용하여 비내로 면역화된 마우스 및 대조 마우스를 접종하고, 21일 동안 해당 마우스의 생존을 관찰하였다. 복강내 경로에 의해서는 UV-LVS-cSAP을 사용한 면역화 후 LVS를 사용한 차후의 접종에 대한 완전한 보호가 수득되었으나 (도 9c), 피하 경로에 의해서는 그렇지 않았다 (도 9d).
UV-LVS-cSAP 면역화 4주 후, IgG 및 IgM 항체의 유도를 연구하였다. 유도되는 IgG (도 9e) 및 IgM (도 9f) 항체의 농도는 살아 있는 LVS-감염 마우스에서에 비해 UV-LVS-cSAP-면역화된 마우스에서 더 높았다. 대조 입자들 (UV-LVS+SAP 또는 UV-LVS)을 사용한 처리는 IgG 또는 IgM 항체의 증가를 유도하지 않았다 (도 9e-9f).
이러한 데이터는 본원에서 기술되는 프란시셀라 툴라렌시스 백신 조성물을 사용한 면역화가 차후의 프란시셀라 툴라렌시스 접종에 대하여 보호성이라는 것을 암시한다.
실시예 8. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 백신 조성물의 생성 및 평가
스트렙토코쿠스 뉴모니아에 또는 뉴모코쿠스(pneumococcus)는 그람-양성의 알파-용혈 내기성 혐기 박테리아가다. 중요한 인간 병원성 박테리아인 뉴모코쿠스는 폐렴의 주 원인으로써, 거의 50 %의 폐렴 사례에서 단리될 수 있다. 그 명칭에도 불구하고, 뉴모코쿠스는 급성 굴염, 중이염, 수막염, 세균혈증, 패혈증, 골수염, 패혈성 관절염, 심장내막염, 복막염, 심작막염, 연조직염 및 뇌 농양을 포함하여, 폐렴이 아닌 다른 많은 유형의 뉴코코쿠스 감염들을 야기할 수 있다.
살아 있는 뉴모코쿠스 박테리아를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 박테리아를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 뉴모코쿠스 박테리아를 단리한다.
R848-적재 나노입자를 제조하여, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 뉴모코쿠스에 결합시킨다. UV-불활성화 뉴모코쿠스에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다. 1개월 후, 살아 있는 뉴모코쿠스를 사용하여 뉴모코쿠스 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 뉴모코쿠스 16s RNA의 qPCR에 의해, 뉴모코쿠스 부하를 측정한다. 뉴모코쿠스 부하가 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, 뉴모코쿠스 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 9. 메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 백신 조성물의 생성 및 평가
메티실린-내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus ) (MRSA)는 자연 선택의 과정을 통하여 페니실린 (메티실린, 디클록사실린, 나프실린, 옥사실린 등) 및 세팔로스포린을 포함한 베타-락탐 항생제들에 대한 내성을 발현시킨 임의의 스타필로코쿠스 아우레우스 균주이다. 이러한 항생제들에 내성일 수 없는 균주는 메티실린-민감성 스타필로코쿠스 아우레우스, 또는 MSSA로 분류된다. 이와 같은 항생제 내성의 발현이 항생제 내성을 가지고 있지 않은 스타필로코쿠스 아우 레우스 균주에 비해 박테리아를 더 본질적으로 독성이 되도록 하는 것은 아니나, 내성은 MRSA 감염을 표준 유형의 항생제들을 사용하여 치료하기가 더 어렵게 되도록 하며, 그에 따라 더 위험하다.
스타필로코쿠스 아우레우스는 가장 흔하게는 콧구멍, 기타 기도, 개방된 상처, 정맥내 카테터 또는 요로를 집락화한다. 건강한 개체는 수주 내지 수년 범위의 기간 동안 무증상으로 MRSA를 보유할 수 있다. 훼손된 면역 시스템을 가지는 환자는 상당히 더 큰 증상성 이차 감염의 위험성이 있다. MRSA는 개방된 상처, 침습성 장치 및 약해진 면역 시스템을 가지고 있는 환자가 일반 대중에 비해 더 큰 감염 위험에 처해 있는 병원, 감옥 및 요양원에서 특히 문제가 되고 있다.
살아 있는 MRSA를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 박테리아를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 MRSA를 단리한다.
R848-적재 나노입자를 제조하여, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 MRSA에 결합시킨다. UV-불활성화 MRSA에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다. 1개월 후, 살아 있는 MRSA를 사용하여 MRSA 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 MRSA 16s RNA의 qPCR에 의해, MRSA 부하를 측정한다. MRSA 부하가 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, MRSA 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 10. 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물의 생성 및 평가
인플루엔자 A 바이러스는 오르소믹소비리다에 과 바이러스의 속으로써, 조류 및 포유동물에서 인플루엔자를 야기할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스의 일부 단리물은 가정용 가금류 및 인간 모두에서 심각한 질환을 야기한다. 야생 수생 조류로부터 가정용 가금류로의 인플루엔자 A 바이러스의 전파는 범유행성 인간 인플루엔자의 촉발 및 발생을 야기할 수 있다.
살아 있는 인플루엔자 A 바이러스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 인플루엔자 A 바이러스를 단리한다.
R848-적재 나노입자를 제조하여, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 인플루엔자 A 바이러스에 결합시킨다. UV-불활성화 인플루엔자 A 바이러스에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다. 1개월 후, 살아 있는 인플루엔자 A 바이러스를 사용하여 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 혈액 샘플로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 인플루엔자 A 바이러스 RNA의 qPCR에 의해, 인플루엔자 A 바이러스 부하를 측정한다. 인플루엔자 A 바이러스 부하가 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, 인플루엔자 A 바이러스 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 11. 인간 호흡기 세포융합 바이러스 ( RSV ) 백신 조성물의 생성 및 평가
인간 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV)는 기도 감염을 야기하는 바이러스이다. RSV는 파라믹소비리다에 과의 음-센스(negative-sense) 단일-가닥 RNA 바이러스로써, 홍역 및 볼거리를 야기하는 것들과 같은 일반적인 호흡기 바이러스들이 거기에 포함된다. RSV는 파라믹소바이러스 아과 뉴모비리나에(Pneumovirinae)의 구성원이다. 그것은 유아기 및 유년기 동안의 하기도 감염 및 병원 방문의 주 원인이다. 미국에서는, 그의 첫 RSV 시즌 동안 60 %의 유아가 감염되며, 2-3세 연령까지 거의 모든 어린이가 바이러스에 감염되게 된다. RSV에 감염된 환자들 중 약 2-3 %가 입원을 요하는 세기관지염이 발현된다.
살아 있는 RSV 바이러스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 RSV 바이러스를 단리한다. RSV 백신은 항원성 RSV 단백질을 함유하는 바이러스-유사 입자 또는 슈도유형 바이러스를 사용하여 제조될 수도 있다.
R848-적재 나노입자를 제조하여, 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 RSV에 결합시킨다. UV-불활성화 RSV에 결합된 R848-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다. 1개월 후, 살아 있는 RSV를 사용하여 RSV 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 RSV 16s RNA의 qPCR에 의해, RSV 부하를 측정한다. RSV 부하가 면역화되지 않은 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, RSV 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 12. SARS 코로나바이러스 백신 조성물의 생성 및 평가
중증 급성 호흡기 증후군 (SARS)은 SARS 코로나바이러스 (SARS-CoV)에 의해 야기되는 인수공통 기원의 바이러스성 호흡기 질환이다. 세계 보건 기구에 따르면, 2002년 11월과 2003년 7월 사이에, 남부 중국에서의 SARS의 촉발은 약 9.6 %의 치사율로 다수의 국가에서 775명의 사망을 야기하였다. 초기 증상은 독감과 유사하며, 열, 근육통, 기면증, 기침, 인두통 및 기타 비특이적 증상들을 포함할 수 있다.
살아 있는 SARS-CoV 바이러스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 SARS-CoV 바이러스를 단리한다.
US 2012/0213812호에 기술되어 있는 바와 같은 단일 또는 이중 에멀션 과정을 사용하여 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 유형 C를 나노입자에 캡슐화하는 것에 의해, CpG-적재 나노입자를 합성한다. 캡슐화는 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드 유형 C를 수성 완충제에 용해시킨 다음, 이 용액을 사용하여 단일 또는 이중 에멀션 과정에서 실시예 2에 기술되어 있는 전하-스위칭 공중합체와 함께 자가-조립에 의해 나노입자를 형성시키는 것에 의해 수행된다. 다음에, CpG-적재 나노입자를 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 SARS-CoV에 결합시킨다. UV-불활성화 SARS-CoV에 결합된 CpG-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다.
1개월 후, 살아 있는 SARS-CoV를 사용하여 SARS-CoV 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 SARS-CoV 16s RNA의 qPCR에 의해, SARS-CoV 부하를 측정한다. SARS-CoV 부하가 면역화되지 않은 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, SARS-CoV 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 13. 노로바이러스 백신 조성물의 생성 및 평가
노로바이러스는 칼리시비리다에 과의 유전적으로 다양한 단일-가닥 RNA 비-외피보유 바이러스 속이다. 상기 바이러스는 분변 오염된 식품 또는 물에 의해; 사람-대-사람 접촉에 의해; 그리고 바이러스의 에어로졸화 및 이후의 표면 오염을 통하여 전파된다. 노로바이러스는 인간에서의 바이러스성 위창자염의 가장 흔한 원인으로써, 모든 연령의 사람들에게 영향을 준다. 속에서 알려져 있는 바이러스들은 모두 노르워크(Norwalk) 바이러스로 지칭되는 단일 종의 변종 균주인 것으로 생각되고 있다. 이 종은 전 세계 유행성 비박테리아 위창자염 촉발의 대략 90 %를 야기하며, 미국에서의 전체 식품매개 위창자염 촉발 중 50 %의 원인이 될 수 있다. 노로바이러스 감염은 구역, 강력한 구토, 물설사 및 복통, 그리고 일부 경우에서는 미각 상실을 특징으로 한다. 일반적인 기면, 쇠약, 근육통, 두통 및 저-등급의 열이 발생할 수 있다.
살아 있는 노로바이러스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 노로바이러스를 단리한다.
실시예 12에 기술되어 있는 바와 같이 CpG-적재 나노입자를 합성한다. 다음에, CpG-적재 나노입자를 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 노로바이러스에 결합시킨다. UV-불활성화 노로바이러스에 결합된 CpG-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다.
1개월 후, 살아 있는 노로바이러스를 사용하여 노로바이러스 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 노로바이러스 16s RNA의 qPCR에 의해, 노로바이러스 부하를 측정한다. 노로바이러스 부하가 면역화되지 않은 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, 노로바이러스 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 14. 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 백신 조성물의 생성 및 평가
인간 면역결핍 바이러스 (HIV)는 면역 시스템의 진행성 부전이 생명을 위협하는 기회성 감염 및 암이 번성하는 것을 가능케 하는 인간에서의 이상인 후천성 면역결핍 증후군 (AIDS)을 야기하는 렌티바이러스이다. HIV에 의한 감염은 혈액, 정액, 질액, 예비-사정액 또는 모유의 전달에 의해 이루어진다. 이러한 체액들 내에서, HIV는 자유 바이러스 입자 및 감염된 면역 세포 내의 바이러스 모두로 존재한다. HIV는 헬퍼 T 세포 (구체적으로 CD4+ T 세포), 대식세포 및 수지상 세포와 같은 인간 면역 시스템의 필수 세포를 감염시켜, 이들 세포를 사멸시킨다.
HIV 바이러스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 HIV 바이러스를 단리한다.
단일 또는 이중 에멀션 과정을 사용하여 나노입자에 MPLA를 캡슐화하는 것에 의해, 모노포스포릴 지질 A (MPLA)-적재 나노입자를 합성한다. 다음에, MPLA-적재 나노입자를 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 HIV에 결합시킨다. UV-불활성화 HIV에 결합된 MPLA-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다.
1개월 후, 살아 있는 HIV를 사용하여 HIV 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 HIV 16s RNA의 qPCR에 의해, HIV 부하를 측정한다. HIV 부하가 면역화되지 않은 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, HIV 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
실시예 15. 결핵 백신 조성물의 생성 및 평가
결핵 (TB)은 마이코박테리아의 다양한 균주, 보통은 미코박테리움 투베르쿨로시스에 의해 야기되는 감염성 질환이다. 결핵은 통상적으로는 폐를 공격하나, 다른 신체 부분에 영향을 줄 수도 있다. 그것은 활성인 TB 감염에 걸린 사람이 기침을 하거나, 재채기를 하거나, 또는 달리 공기를 통하여 호흡기 액을 전파할 때 공기를 통하여 확산된다. 대부분의 감염은 잠재성 결핵으로 알려져 있는 증상들을 가지지 않는다. 잠재성 감염의 약 10분의 1이 궁극적으로 치료되지 않고 방치될 경우 감염자의 50 %를 초과하여 사망시키는 활성의 질환으로 진행된다. 활성 TB 감염의 전통적인 증상은 혈흔 가래, 열, 야간 발한 및 체중 손실을 동반한 만성적인 기침이다. 다른 기관의 감염은 광범위한 증상들을 야기한다. 치료가 어려우며, 오랜 시간 기간 동안의 다수 항생제의 투여를 필요로 한다. 다중 약물-내성 결핵 (MDR-TB) 감염에서는, 항생제 내성이 점증하는 문제가 되고 있다.
미코박테리움 투베르쿨 로시스를 30분 동안의 UV 광에의 노출에 의해 불활성화한다. 인간 태생신 (HEK) 293 세포를 감염시켜 활성 증식 바이러스를 배제하는 것에 의해, 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨로시스를 단리한다.
실시예 14에 기술되어 있는 바와 같이 모노포스포릴 지질 A (MPLA)-적재 나노입자를 합성한다. 다음에, MPLA-적재 나노입자를 실시예 2에 기술되어 있는 바와 같이 UV-불활성화 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 결합시킨다. UV-불활성화 미코박테리움 투베르쿨 로시스에 결합된 MPLA-적재 나노입자를 포함하는 백신 조성물을 비내로 마우스에 투여하고, 실시예 2에 기술되어 있는 방법에 의해 평가한다.
1개월 후, 살아 있는 미코박테리움 투베르쿨 로시스를 사용하여 미코박테리움 투베르쿨로시스 백신 조성물로 면역화된 마우스 및 미접촉 대조 마우스를 접종하고, 마우스 조직으로부터 RNA 샘플을 제조한다. 마우스 GAPDH에 표준화된 미코박테리움 투베르쿨 로시스 16s RNA의 qPCR에 의해, 미코박테리움 투베르쿨 로시스 부하를 측정한다. 미코박테리움 투베르쿨 로시스 부하가 면역화되지 않은 대조 마우스에서에 비해 백신 조성물을 사용하여 면역화된 마우스에서 더 낮은 경우, 미코박테리움 투베르쿨로시스 백신 조성물은 효과적인 것으로 확인된다.
기타 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 연계되어 기술되기는 하였지만, 전기한 상세한 설명은 예시하고자 하는 것으로써, 첨부된 청구범위의 영역에 의해 한정되는 본 발명의 영역을 제한하지는 않는다는 것이 이해되어야 한다. 기타 측면, 장점 및 변형들은 하기하는 청구범위의 영역에 속한다.

Claims (79)

  1. 불활성화된 형태의 병원체, 및
    1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자
    를 포함하며 여기서 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 병원체에 결합되어 있는 조성물을, 병원체에 대한 점막 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 병원체에 대한 점막 면역 반응을 자극하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 병원체가 박테리아, 바이러스, 기생충 또는 진균인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 조성물이 점막 경로를 통하여 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 점막 경로가 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 R848인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 생분해성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 생분해성 중합체가 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 링커를 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 링커가 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
  14. 불활성화된 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 및
    1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자
    를 포함하며 여기서 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합되어 있는 조성물을, 클라미디아 트라코마티스에 대한 점막 면역 반응의 자극을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 클라미디아 트라코마티스에 대한 점막 면역 반응을 자극하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 조성물이 점막 경로를 통하여 대상체에게 투여되는 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 점막 경로가 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로에서 선택되는 것인 방법.
  17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 방법.
  18. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 R848인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드인 방법.
  21. 제14항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 생분해성 중합체를 포함하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 생분해성 중합체가 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체인 방법.
  23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 방법.
  24. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 링커를 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 링커가 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 것인 방법.
  26. 불활성화된 병원체; 및
    1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자
    를 포함하며, 여기서 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 결합 메카니즘을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되어 있는 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 박테리아, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 기생충 또는 불활성화된 진균인 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 불활성화된 병원체가 클라미디아 트라코마티스, 미코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에(Streptococcus pneumoniae), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 쉬겔라 손네이(Shigella sonnei), 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)으로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 박테리아인 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 조성물.
  30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 R848인 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드인 조성물.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 생분해성 중합체를 포함하는 것인 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 생분해성 중합체가 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체인 조성물.
  35. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 조성물.
  36. 제26항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 링커를 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 조성물.
  37. 제36항에 있어서, 링커가 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  38. 제26항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 점막 투여에 적합한 형태인 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로에 의한 투여에 적합한 형태인 조성물.
  40. 불활성화된 클라미디아 트라코마티스; 및
    1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자
    를 포함하며, 여기서 상기 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자는 각각 불활성화된 클라미디아 트라코마티스에 결합되어 있는 조성물.
  41. 제40항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 조성물.
  42. 제40항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 R848인 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 톨-유사 수용체 효능제가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드인 조성물.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 생분해성 중합체를 포함하는 것인 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 생분해성 중합체가 폴리(락트산-co-글리콜산)-블록-폴리(L-히스티딘)-블록-폴리(에틸렌 글리콜) (PLGA-PLH-PEG) 삼블록 공중합체인 조성물.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 정전기적 인력을 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 조성물.
  48. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 링커를 통하여 불활성화된 병원체에 결합되는 것인 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 링커가 모노클로날 항체, 압타머, 항생제, 렉틴, 또는 불활성화된 병원체의 표면 분자에 특이적으로 결합하는 항미생물 펩티드로 구성되는 군에서 선택되는 것인 조성물.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 점막 투여에 적합한 형태인 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 안구, 비내, 경구, 협측, 설하, 편도, 폐, 위, 장, 직장, 질 또는 요로 경로에 의한 투여에 적합한 형태인 조성물.
  52. 제26항에 있어서, 불활성화된 병원체가 악티노미세스(Actinomyces), 아나바에나(Anabaena), 바실루스(Bacillus), 박테로이데스(Bacteroides), 브델로비브리오(Bdellovibrio), 보르데텔라(Bordetella), 보렐리아(Borrelia), 브루셀라(Brucella), 캄필로박터(Campylobacter), 카울로박터(Caulobacter), 클라미디아(Chlamydia), 클로로비움(Chlorobium), 크로마티움(Chromatium), 클로스트리디움(Clostridium), 코리네박테리움(Corynebacterium), 사이토파가(Cytophaga), 데이노코쿠스(Deinococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 에스케리키아(Escherichia), 프란시셀라(Francisella), 할로박테리움(Halobacterium), 헬리오박터(Heliobacter), 해모필루스(Haemophilus), 하이포미크로비움(Hyphomicrobium), 레지오넬라(Legionella), 렙트스피로시스(Leptspirosis), 리스테리아(Listeria), 메닝고코쿠스(Meningococcus) A, B 및 C, 메타노박테리움(Methanobacterium), 미크로코쿠스(Micrococcus), 미코박테리움(Mycobacterium), 미코플라스마(Mycoplasma), 믹소코쿠스(Myxococcus), 네이세리아(Neisseria), 니트로박터(Nitrobacter), 오스실라토리아(Oscillatoria), 프로클로론(Prochloron), 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas), 포도스피릴룸(Phodospirillum), 리케차(Rickettsia), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 스피릴룸(Spirillum), 스피로카에타(Spirochaeta), 스타필루코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 스트렙토미세스(Streptomyces), 술폴로부스(Sulfolobus), 서모플라스마(Thermoplasma), 티오바실루스(Thiobacillus), 트레포네마(Treponema), 비브리오(Vibrio) 및 예르시니아(Yersinia)로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 박테리아인 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 클라미디아 트라코마티스인 조성물.
  54. 제52항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 프란시셀라 툴라렌시스(Francisella tularensis)인 조성물.
  55. 제52항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 미코박테리움 투베르쿨로시스인 조성물.
  56. 제26항에 있어서, 불활성화된 병원체가 아데노비리다에(Adenoviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae), 아르테리바이러스(Arterivirus), 아스트로비리다에(Astroviridae), 바큘로비리다에(Baculoviridae), 바드나바이러스(Badnavirus), 바마비리다에(Bamaviridae), 비마비리다에(Bimaviridae), 브로모비리다에(Bromoviridae), 부니야비리다에(Bunyaviridae), 칼리시비리다에(Caliciviridae), 카필로바이러스(Capillovirus), 카를라바이러스(Carlavirus), 카울리모바이러스(Caulimovirus), 시르코비리다에(Circoviridae), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모비리다에(Comoviridae), 코로나비리다에(Coronaviridae), 코르티코비리다에(Corticoviridae), 시스토비리다에(Cystoviridae), 델타바이러스(Deltavirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 플라비비리다에(Flaviviridae), 필로비리다에(Filoviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 헤파드나비리다에(Hepadnaviridae), 헤르페스비리다에(Herpesviridae), 하이포비리다에(Hypoviridae), 이리도비리다에(Iridoviridae), 레비비리다에(Leviviridae), 리포트릭스비리다에(Lipothrixviridae), 마이크로비리다에(Microviridae), 오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 파필로마비리다에(Papillomaviridae), 파포바비리다에(Papovaviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 파르보비리다에(Parvoviridae), 피코르나비리다에(Picornaviridae), 폴리오마비리다에(Polyomaviridae), 폭스비리다에(Poxviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 랍도비리다에(Rhabdoviridae), 토가비리다에(Togaviridae) 및 토티비리다에(Totiviridae)로 구성되는 군에서 선택되는 불활성화된 바이러스인 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 인간 호흡기 세포융합 바이러스인 조성물.
  58. 제56항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 SARS 코로나바이러스인 조성물.
  59. 제56항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 노로바이러스(Norovirus)인 조성물.
  60. 제56항에 있어서, 불활성화된 병원체가 불활성화된 인간 면역결핍 바이러스인 조성물.
  61. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 조성물.
  62. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 조성물.
  63. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 R848을 포함하는 것인 조성물.
  64. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 것인 조성물.
  65. 제52항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 것인 조성물.
  66. 제1항에 있어서, 병원체가 악티노미세스, 아나바에나, 바실루스, 박테로이데스, 브델로비브리오, 보르데텔라, 보렐리아, 브루셀라, 캄필로박터, 카울로박터, 클라미디아, 클로로비움, 크로마티움, 클로스트리디움, 코리네박테리움, 사이토파가, 데이노코쿠스, 엔테로코쿠스, 에스케리키아, 프란시셀라, 할로박테리움, 헬리오박터, 해모필루스, 하이포미크로비움, 레지오넬라, 렙트스피로시스, 리스테리아, 메닝고코쿠스 A, B 및 C, 메타노박테리움, 미크로코쿠스, 미코박테리움, 미코플라스마, 믹소코쿠스, 네이세리아, 니트로박터, 오스실라토리아, 프로클로론, 프로테우스, 슈도모나스, 포도스피릴룸, 리케차, 살모넬라, 쉬겔라, 스피릴룸, 스피로카에타, 스타필루코쿠스, 스트렙토코쿠스, 스트렙토미세스, 술폴로부스, 서모플라스마, 티오바실루스, 트레포네마, 비브리오 및 예르시니아로 구성되는 군에서 선택되는 박테리아인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 병원체가 클라미디아 트라코마티스인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 병원체가 프란시셀라 툴라렌시스인 방법.
  69. 제66항에 있어서, 병원체가 미코박테리움 투베르쿨로시스인 방법.
  70. 제1항에 있어서, 병원체가 아데노비리다에, 아레나비리다에, 아르테리바이러스, 아스트로비리다에, 바큘로비리다에, 바드나바이러스, 바마비리다에, 비마비리다에, 브로모비리다에, 부니야비리다에, 칼리시비리다에, 카필로바이러스, 카를라바이러스, 카울리모바이러스, 시르코비리다에, 클로스테로바이러스, 코모비리다에, 코로나비리다에, 코르티코비리다에, 시스토비리다에, 델타바이러스, 디안토바이러스, 에나모바이러스, 플라비비리다에, 필로비리다에, 플라비비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 하이포비리다에, 이리도비리다에, 레비비리다에, 리포트릭스비리다에, 마이크로비리다에, 오르소믹소비리다에, 파필로마비리다에, 파포바비리다에, 파라믹소비리다에, 파르보비리다에, 피코르나비리다에, 폴리오마비리다에, 폭스비리다에, 레오비리다에, 레트로비리다에, 랍도비리다에, 토가비리다에 및 토티비리다에로 구성되는 군에서 선택되는 바이러스인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 병원체가 인간 호흡기 세포융합 바이러스인 방법.
  72. 제70항에 있어서, 병원체가 SARS 코로나바이러스인 방법.
  73. 제70항에 있어서, 병원체가 노로바이러스인 방법.
  74. 제70항에 있어서, 병원체가 인간 면역결핍 바이러스인 방법.
  75. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 엔도솜 막을 표적으로 하는 아주반트를 포함하는 것인 방법.
  76. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 톨-유사 수용체 효능제를 포함하는 것인 방법.
  77. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 R848을 포함하는 것인 방법.
  78. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 비메틸화 CpG 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
  79. 제66항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 아주반트-적재 중합체성 나노입자가 모노포스포릴 지질 A를 포함하는 것인 방법.
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