CN110114072A - 聚合物纳米颗粒 - Google Patents

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polymer
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S·哈班达
V·舒克拉
D·库夫
H·思恩赫
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Abstract

本发明涉及包含细胞因子或编码细胞因子的核酸的聚合物纳米颗粒、包含相同细胞因子或编码细胞因子的核酸的药物组合物以及治疗某些疾病的方法，所述方法包括向需要的个体施用这些聚合物纳米颗粒。

Description

聚合物纳米颗粒
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月2日递交的美国临时申请号为62/416,574的优先权，上述申请的全部内容在此通过引用的方式并入本文。
技术领域
本发明涉及纳米技术领域，尤其是利用可生物降解的聚合物纳米颗粒进行治疗剂传递的纳米技术领域。
背景技术
癌症是最具毁灭性的疾病之一，其包括多种遗传变异和细胞异常。这些复杂性和异质性促进癌细胞侵略性的生长，导致病人出现显著的发病曲线和死亡率(Das,M.et al.(2009)Ligand-based targeted therapy for cancer tissue(癌症组织的基于配体的靶向治疗)，Expert Opin.Drug Deliv.6,285–304；Mohanty,C.et al.(2011)Receptormediated tumor targeting:an emerging approach for cancer therapy(受体介导的肿瘤靶向：一种癌症治疗的整合疗法).Curr.Drug Deliv.8,45–58)。
免疫治疗方法，特别是PD-1/PD-L1阻断，改善了某些人类癌症的治疗，支持逃避免疫破坏对癌症进展很重要的前提。然而，许多癌症(至少部分地)对免疫疗法没有反应，这是由于促炎性肿瘤微环境的抑制造成的。
多种癌症的标志是避免免疫破坏的能力(Hanahan D.et al.,2011Cell Volume144,Issue 5pages 646–674)。实际上，癌症通常被渗透入对肿瘤抗原识别无效的免疫细胞，并且反过来又被用于促进促肿瘤发生的微环境(Balkwell F.et al.2005Cancer Cell7(3),pages 211-217)。然而，有趣的是，免疫细胞浸润在所谓的“热”肿瘤中的存在与对细胞毒性剂、抗肿瘤疫苗和免疫检查点抑制剂改善的反应性相关(Topalian S.et al.,2015Cancer Cell,(4),pages 450-461)。这些发现强调了使用能有效识别并破坏癌细胞的细胞浸润重新编程“热”和“冷”肿瘤微环境的潜在重要性。
已经发现TNF是诱导肿瘤坏死的内毒素诱导因子(Carswell E.A.et al.,PNAS,1975Proc.Nat.Acad.Sci.Vol.72,No.9,pages3666-3670)。从那以后，TNF一直是最广泛研究的细胞因子之一，部分基于一种发现，即，它能够调节促炎反应，细胞分化和细胞死亡(Brenner D.et al.,2015Nat.Rev.Immunol.Issue 15,pages362-374)。此外，已经研究了重组人TNF作为抗癌剂的有效性，但是一些研究者已经发现全身性副作用，例如发烧，疲劳和低血压，使得其进一步发展被排除(Spriggs D.R.et al.,1988J Natl Cancer Inst 80(13),pages 1039-1044.；Sherman M.L.et al.,1988JCO February vol.6no.2,pages344-350)。
作为一种改善全身毒性的方法，TNF已被欧洲批准用于治疗局部晚期软组织肉瘤患者的隔离肢体灌注给药(Jakob J.et al.,2016Cancer doi:10.1002/cncr.29991)。用于临床开发TNF的另一种尝试方法涉及在放射性和化学诱导型启动子(TNFerade)的控制下肿瘤内递送编码TNF的腺病毒载体(Hallahan D.et al.,1995Nature Medicine 1pages 786–791)。在TNFerade联合放疗的早期试验中，在转移性黑素瘤，软组织肉瘤和局部晚期食管癌患者中观察到显著的临床活性(Weichselbaum R.et al.,2009Cancer Gene Therapy 16,pages 609–619；doi:10.1038/cgt.2009.37)。在患有胰腺癌、直肠癌和头颈癌的患者中也观察到抗肿瘤活性(同上)。然而，局部晚期胰腺癌患者的TNFerade III期试验未能证明其对存活率的改善有帮助(Herman J.M.et al.,2013JCO vol.31no.7,pages 886-894)，促使赞助者停止发展该试剂。
TNF是治疗人类癌症的有效药物；然而，需要开发另外的方法以限制全身性副作用的方式利用TNF的抗肿瘤活性。
发明内容
本发明的一个方面提供了一种组合物，其包含：聚合物纳米颗粒，该聚合物纳米颗粒包含嵌段共聚物，所述嵌段共聚物包含聚(乳酸)(PLA)和聚(乙二醇)(PEG)；并且所述组合物还包含具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列或其部分的TNF-α蛋白质。在各种实施方案中，TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO：9的序列或其部分至少70％-99％同源性的氨基酸序列。在各种实施方案中，TNF-α蛋白包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列或与SEQ ID NO：10的序列具有至少50％-99％(例如，至少70％)同源性的序列，或其一部分。
本发明的一个方面提供一种组合物，其包含：聚合物纳米颗粒，其包含含有PLA和PEG的嵌段共聚物，并且所述组合物包含一种分离的核酸，所述分离的核酸包括序列SEQ IDNO：11或其部分。在各种实施方案中，分离的核酸包含与SEQ ID NO：11的序列具有至少70-99％同源性的氨基酸序列或其一部分。例如，分离的核酸序列编码SEQ ID NO：9或SEQ IDNO：10的序列。
该组合物的各种实施方案中，聚合物纳米颗粒包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)(PLA-PEG)二-嵌段共聚物。
在所述组合物的各种实施方案中，所述聚合物纳米颗粒包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG))四嵌段共聚物在各种实施方案的所述组合物，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在所述组合物的各种实施方案中，所述聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物和PLA共轭所组成。例如，所属共轭是一种化学的共轭。
在所述组合物的各种实施方案中，PLA的分子量在大约10,000和大约100,000道尔顿之间。例如，PLA的分子量大约为10,000；20,000；30,000；40,000；50,000；60,000；70,000；80,000；90,000，或者100,000道尔顿。在进一步的实施方案中，PLA的分子量大约为12,000道尔顿(即，12kDA)或者大约72,000道尔顿(即，72kDA)。
在所述组合物的各种的实施方案中，TNF-α蛋白，或其一部分，包含一个与SEQ IDNo：9至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者99％相同的氨基酸序列或其中的一部分。在各种实施方案中TNF-α蛋白，或其一部分，包含一个与SEQ ID NO:10至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者99％一致的氨基酸序列或者其中的一部分。
在所述组合物的各种实施方案中，所述分离的核酸包含SEQ ID No：11的序列或者其一部分。在所述组合物的各种实施方案中，编码TNF-α蛋白的分离的核酸，或其一部分，包含一个与SEQ ID No：9至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者99％相同的氨基酸序列或者其一部分。在所述组合物的各种实施方案中，编码TNF-α蛋白的分离的核酸，或其一部分，包含一个与SEQ ID No：10至少有70％，75％，80％，85％，90％，95％，或者99％相同的氨基酸序列或者其一部分。
在各种实施方案中，所述组合物进一步包含一个阳离子的肽。在各种实施方案中，所述组合物进一步包含一个穿透细胞的肽。在各种实施方案中，所述组合物进一步包含一个阳性穿透细胞的肽。在各种实施方案中，所述肽包含一个氨基酸序列，这个氨基酸序列是从由SEQ ID NOs:1，2，3，4，5，6，7，8和聚精氨酸组成的基团中选择出来的。例如，所述聚精氨酸包含至少大约2-20个精氨酸。在各种实施方案中，所述聚精氨酸包含至少大约2，5，7或者9个精氨酸。
在各种实施方案中，所述组合物进一步包含一个C-环化的聚阳性肽。例如，所述C-环化的聚阳性肽包含SEQ ID No：8的氨基酸序列或者其一部分。
在所述组合物的各种实施方案中，所述穿透细胞的或者阳离子的肽和所述分离的核酸形成复合物。
在各种实施方案中，所述组合物进一步包含一种化学治疗剂或者一种靶向抗癌试剂，这种化学治疗剂或者靶向抗癌试剂是从由阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米组成的组或其组合中选出来的。
本发明的一个方面提供一种药物组合物，这种药物组合物包含：聚合物纳米颗粒包含一种包含聚(乳酸)(PLA)和聚(乙二醇)(PEG)的嵌段共聚物；和一种TNF-α蛋白包含与SEQ ID No：9序列至少有70％相同的氨基酸序列，或者其一部分，或者一种分离的核酸包含SEQ ID No：11的序列或者编码TNF-蛋白包含与SEQ ID No：9或者10序列至少有70％相同的氨基酸序列，或者其一部分，用于治疗一种疾病，这种疾病是从由癌，自身免疫性疾病，炎性疾病，紊乱的新陈代谢功能，发育的异常，心血管疾病，肝脏疾病，肠的疾病，传染性疾病，内分泌病和神经系统紊乱的组合中选取出来的。
在该组合物的各种实施方案中，聚合物纳米颗粒由基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)(PLA-PEG)二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在该组合物的各种实施方案中，聚合物纳米颗粒由基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成的聚合物形成。在各种实施方案中，聚合物纳米颗粒包含表5中所述的四嵌段共聚物。
在该组合物的各种实施方案中，聚合物纳米颗粒进一步包含附着于聚合物纳米颗粒外部的靶向部分，其中靶向部分是抗体、肽或适体。在各种实施例中，靶向部分包括免疫球蛋白分子、scFv、单克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、人源化抗体、f ab片段、Fab片段、F(ab’)2、fv和二硫键合的Fv。
本发明的一个方面提供了一种聚合物纳米颗粒，该聚合物由基本上由聚乳酸-聚乙二醇-ppg-聚乙二醇四嵌段共聚物或聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成，其中聚合物纳米颗粒装载有细胞因子或其一部分，或为细胞因子或其一部分编码的分离核酸。在本发明的各种实施方案中，细胞因子与SEQ ID No:9或其一部分的序列具有至少70％同源性。在本发明的各种实施方案中，细胞因子与SEQ ID No:10或其一部分的序列具有至少70％同源性。在该方法的各种实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID No:9或SEQ ID No:10的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性。
在各种实施方案中，分离的核酸与阳离子的细胞穿透肽复合。例如，阳离子细胞穿透肽选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组成的组。
本发明的一个方面提供了一种治疗有需要的受试者癌症的方法，包括向受试者投与治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)由包含聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物的聚合物形成的聚合物纳米颗粒；和b)包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸。例如，所分离的核酸包含SEQ ID No:11的核酸序列。
在所述方法的各种实施例中，所述药物组合物进一步包含化疗剂或靶向抗癌剂，所述靶向抗癌剂选自阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米的组成的组中或其组合。
在该方法的各种实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性结肠癌、胰腺癌或血液学恶性肿瘤。例如，癌症包括PD-1难治性肿瘤。
在该方法的各种实施方案中，氨基酸序列与SEQ ID No:9的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性。
本发明的一个方面提供了一种诱导细胞中TNF表达的方法，包括使细胞与由包含聚乳酸-聚乙二醇-二嵌段共聚物的聚合物形成的有效量的聚合物纳米颗粒接触；其中聚合物纳米颗粒包含编码TNF-α蛋白的分离核酸，这里的的氨基酸序列与SEQ ID No:9或其一部分的序列具有同源性。例如，所分离的核酸包含SEQ ID No:11的核酸序列。
在该方法的各种实施方案中，TNF-α蛋白质或其部分包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在所述方法的各种实施方案中，所分离的核酸编码TNF-α蛋白或其部分，包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在该方法的各种实施方案中，分离的核酸与阳离子细胞穿透肽复合。例如，阳离子细胞穿透肽选自SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组成的组。
在该方法的各种实施方案中，纳米颗粒由基本上由聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在该方法的各种实施方案中，纳米颗粒由基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在该方法的各种实施方案中，聚合物纳米颗粒包含表5中发现的四嵌段共聚物。在本文所提供方法的各种实施例中，聚乳酸的分子量在约10000道尔顿和约100000道尔顿之间。例如，聚乳酸的分子量约为10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000或100000道尔顿。在又一实施方案中，聚乳酸的分子量约为12000道尔顿(即12kDa)或约72000道尔顿(即72kDa)。
在本文提供的任何组成或方法的各种实施方案中，纳米颗粒由包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物和TNF-α蛋白或编码TNF-α蛋白的分离核酸形成。在一个实施方案中，纳米颗粒在一段时间内释放蛋白质或分离的核酸。在又一实施方案中，时间段为至少1天到20天。在该方法的各种实施方案中，时间周期约为5天到10天。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分，并被包括以进一步说明本发明的各个方面。
图1(A、B、C和D)是一组表征本文所述纳米复合物和纳米颗粒的显微照片和图形。
图1A是显示不同纳米颗粒的流体动力学直径(纳米；nm)的表。在非生理缓冲液(PBS pH7.4)中使用动态光散射(DLS)测定每个纳米颗粒的水动力直径。
图1B是肽-PDNA纳米复合物和纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)图像。成像的纳米颗粒包括肽-PDNA纳米复合物(NC)、无负载聚合物纳米颗粒(NP)、PDNA负载聚合物纳米颗粒(PDNPs)和PLA-PEG纳米颗粒(PPD-NPs)。刻度为100nm。
图1C是一组显示当血清挑战时纳米流体动力学直径的曲线图。水动力直径由DLS(nm)测定。
图1D是显示纳米颗粒在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中释放动力学的图。该图显示了以小时为单位(横坐标；小时)的pDNA负载聚合物纳米颗粒(PDNPs)和聚乳酸-聚乙二醇纳米粒(PPD-NPs)释放的DNA(纵坐标)的荧光百分比。
图2(A、B和C)显示了NC-GFP和PPD-GFP NP随着时间的推移的疗效和毒性。
图2A显示了在10％血清中用NC-GFP(柱A)、PD-GFP(柱B)和PP-GFP(柱C)转染后MCF-7细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达。细胞表达GFP的百分比与随天数(横坐标)的分析。对NC-GFP、PD-GFP和PPD-GFP的GFP时间动力学表达模式进行了为期6天的研究。
图2B是一组显微照片，显示了经PPD-GFP纳米颗粒处理的MCF-7细胞随时间(即24小时、48小时、72小时和96小时后)的GFP表达模式的定性分析。
图2C是一张分析MCF-7细胞经NC-GFP和PPD-GFP转染后随时间变化的细胞毒性的图，与仅用脂质体2000TM(Lipofectamine 2000TM)处理的细胞毒性相比。图中显示了用NC-GFP(B柱)、PPD-GFP/NPs(C柱)和脂质体(D柱)转染后的活细胞百分比(纵坐标)。未感染细胞的数据显示在A柱。
图3(A、B和C)显示了编码MDA-MB-231细胞中的编码质粒DNA(pE425-TNFα)的抗肿瘤蛋白的产生、表达和功能效应。
图3A是质粒DNA和阳离子肽静电相互作用形成纳米复合物的示意图。得到的纳米复合物一旦与血清相互作用就变得不稳定和聚集。
图3B是图3A与PLA-PEG嵌段共聚物的纳米颗粒包封形成稳定的阳离子肽质粒DNA纳米颗粒的图。
图3C是显示24、48、72和96小时PPD-GFP/NPs或PPD-TNF-α治疗后细胞存活率(纵坐标)的图。对照细胞未感染。
图4(A、B和C)显示了编码质粒DNA(pE425-TNFα)的抗肿瘤蛋白在MCF-7细胞中的表达和功能效应。
图4A是一张显示PPD-TNF-α处理细胞膜联蛋白V阳性MCF-7细胞(纵坐标)随时间(横坐标)变化百分比的图。数据显示24、48和72小时后凋亡的MCF-7细胞的膜联蛋白V染色。
图4B是一组显微照片，显示在不同时间间隔(24小时、48小时和72小时)用PPD-TNFα/NPs处理MCF-7细胞后，对TNF-α和半胱天冬酶-3进行免疫细胞化学分析。
图4C是半胱天冬酶-3蛋白在表达TNF-α的MCF-7细胞中表达的Western blot的照片，该细胞由包裹NC-TNFα和PPD-TNF-α的TNF-αpDNA转染。免疫染色显示24小时、48小时和72小时后PPD-TNFα转染细胞中存在TNF-α和半胱天冬酶-3。
图5是一张图，显示了经腹腔给予一次剂量的带有不同PDNA-TNF-α浓度(0.6mg/kg、1.2mg/kg、1.8mg/kg或2.4mg/kg)的PPD-TNF-α纳米颗粒的BALB/C小鼠(每组5只小鼠)组的体重变化百分比(纵坐标)。
图6(a和b)显示了在EAT耐受同基因的BALB/C小鼠上处理质粒DNA(pDNA-TNFα)、肽-pDNA纳米复合物(pDNA-TNFα)和聚乳酸-聚乙二醇-肽-pDNA纳米粒(PPD-TNFα)后的体内肿瘤回归效果。在第1、5、9、13、17、21天，用生理盐水(对照)、pDNA-TNFα_1.2mg/kg、NC-TNFα_1.2mg/kg、PPD-TNFα_0.6mg/kg、PPD-TNFα_1.2mg/kg腹腔给药，初始肿瘤体积为50mm3。每个数据点代表平均肿瘤大小±扫描电镜(n＝6)。
图6A是一张显示BALB-C小鼠腹腔注射不同纳米粒后肿瘤大小(纵坐标)随时间(横坐标)变化的图：肽-pDNA纳米复合物(NC-TNFα)；pDNA-TNFα–pDNA-TNFα_1.2mg/kg；PPD-TNFα_a–PPD-TNFα_0.6mg/kg(ip)；和PPD-TNFα_b–PPD-TNFα1.2mg/kg(IP)。
图6B显示了图6A的BALB-C小鼠腹腔注射不同纳米粒后肿瘤大小(纵坐标)随时间变化的扩展视图图。
图7(A和B)显示了BALB-C小鼠的肿瘤大小和肿瘤体积，在EAT耐受同基因的BALB/C小鼠上经肿瘤内给予质粒DNA(pDNA-TNFα)、肽-pDNA纳米复合物(NC-TNFα)和聚乳酸-聚乙二醇-肽-pDNA纳米颗粒(PPD-TNFα)。在第1、5、9、13、17、21天，用生理盐水(ctrl)、pDNA-TNFα1.2mg/kg，NC-TNFα1.2mg/kg，PPD-TNFα0.6mg/kg，PPD-TNFα1.2mg/kg腹腔注射荷瘤小鼠，初始肿瘤体积为50mm3。每个数据点代表平均肿瘤大小±扫描电镜(n＝6)。
图7A是显示BALB-C小鼠肿瘤大小(纵坐标)随时间变化(横坐标)的图，其经肿瘤内给予不同的纳米粒。
图7B显示图7A中BALB-C小鼠经肿瘤内给予不同纳米粒后随时间的肿瘤体积(纵坐标)。
图8是一组来自小鼠受试者的苏木精和伊红肿瘤组织的显微照片，这些受试者在腹膜内或肿瘤内给药质粒、纳米复合物或本文所述的纳米颗粒。
图9A是在最后一次IP注射或IT注射的第三天，用pDNA-TNFα1.2mg/kg,NC-TNFα1.2mg/kg,PPD-TNFα0.6mg/kg,PPD-TNFα1.2mg/kg处理的切除肿瘤组织中的TNFα和caspase-3蛋白的荧光激活细胞分类(FACS)分析图。
图9B是用pDNA-TNFα1.2mg/kg,NC-TNFα1.2mg/kg,PPD-TNFα0.6mg/kg和PPD-TNFα1.2mg/kg处理的苏木精和伊红(H&E)染色肿瘤组织的高倍显微照片。在PPD-TNFα1.2mg/kg治疗的肿瘤中，与在对照中用点圆(左边第五列)表示的完整核相比，在点圆(左边第四列)表示的注射中发现了支离破碎的核以及一些凋亡体。
图10是显示非生理缓冲液(PBS pH7.4)中TNF DNA释放曲线比较的线图。仅为自由DNA；PLA 12KDa-PEG-PPG-PEG TNF-DNA纳米颗粒；PLA 12KDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒；PLA 72KDa-PEG-PPG-PEG TNF DNA纳米颗粒，和PLA 72KDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒释放的DNA(纵坐标)的荧光百分比的时间函数的时间函数(天；横坐标)。
图11是显示非生理缓冲液(PBS pH7.4)中TNF DNA释放曲线比较的线图。释放的DNA(纵坐标)的荧光百分比显示为两种不同纳米颗粒的时间函数：PLA 12KDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒；和PLA 72KDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒。
具体实施方式
本文提供用于驱动肿瘤细胞中炎性细胞因子表达的双纳米颗粒或双纳米颗粒(DNP)系统。DNP系统由一个双嵌段聚合物NP组成，它包围着一个较小的阳离子纳米复合物。数据表明，高分子NP在肿瘤细胞内释放出阳离子纳米复合物。反过来，阳离子纳米复合物进入细胞核并诱导外源基因的表达，例如表达细胞因子的基因。在各种实施方案中，基于其多向性炎症和抗癌活性使用TNF。实施例表明，DNP系统在促进肿瘤细胞中细胞因子(如肿瘤坏死因子)的表达方面是非常有效的。数据表明，在小鼠模型中，DNP具有诱导肿瘤细胞凋亡的作用。这些DNP能够通过选择性表达炎性细胞因子来促进抗肿瘤免疫。总之，数据表明，这种方法在没有毒性的情况下具有很高的抗肿瘤活性。实施例进一步表明，该DNP系统广泛适用于促进免疫识别和破坏的细胞因子。
由于缺乏有效的传递系统，在体内生长的肿瘤中表达外源基因的治疗策略已被大大削弱(Yin H.等,2014《自然评论》遗传学,15,541-555页；Amer M.H.,2014Mol CellTher.2014；2:27,1-19页；Collins M.et al.,2015Proc.Biol.Sci.22；282(1821):20143003.doi:10.1098/rspb.2014.3003)。其中一个主要挑战是向肿瘤细胞提供足够水平的阳离子DNA复合物，从而显著影响肿瘤表型(Kircheis R.et al.,2002Cancer GeneTher.9(8),673-680页)。为了部分解决这一障碍，已经开发了具有高分子量聚乳酸的新型聚合物纳米颗粒，用于向肿瘤细胞系统输送肽货物(Kumar M.等,2014ISRN纳米科技卷2014(2014),文章ID 939378,12页；Hasegawa M.等,2015Clin Cancer Res.21(10),2338-2347页.doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-3000.Epub2015年2月23日)。此外，为了有效地传递DNA，开发了一种线性的短组氨酸和半胱氨酸修饰的精氨酸(HCR)肽，维持DNA凝聚，赋予内质逃逸特性并指导核定位(Mann A.等，2014Mol.Pharmaceutics，11(3)，第683-696页)。
实施例表明，利用新的HCR肽可以成功地制备阳离子肽DNA纳米复合物(NCs)。此外，这些约80纳米NC成功地封装在约200纳米聚合的NP中，以避免NC在血浆中的降解。血浆中纳米颗粒的降解是基因传递系统的一个重要障碍(Yin H等,2014《自然评论》遗传学，15,541–555页；Amer M.H.等,2014Mol Cell Ther.2014；2:27,1-19页；2015Proc.Biol.Sci.22；282(1821):20143003.doi:10.1098/rspb.2014.3003)。
本文的实施例中使用了用于基因传递的“纳米颗粒中的纳米颗粒”或双NP系统。在评估该系统的有效性时，将绿色荧光蛋白(GFP)基因作为原型模型，产生NP/NCs。事实上，数据表明，用NP/GFP-NCs治疗MCF-7细胞与GFP表达相关，表明HCR-肽-DNA NC在驱动外源性GFP基因方面发挥作用。将聚合物-阿霉素纳米颗粒(约80纳米)封装到2500纳米二氧化硅微粒中，用于将阿霉素输送到肿瘤中(Xu R.等人，2016自然生物技术34，第414-418页)。因此，这种“纳米颗粒中的纳米颗粒”比约200纳米NP/NCs大，为DNA以及某些抗癌剂进入肿瘤细胞提供了双纳米颗粒的潜力。
DNA载体传递的另一个障碍通常是需要实现肿瘤细胞群的高转染或转导效率，以产生显著的治疗效果。这种障碍可以通过分泌蛋白的表达来规避，特别适用于肿瘤微环境的重编程。在这方面，肿瘤坏死因子是一种多效性细胞因子，可促进免疫监测并直接杀死癌细胞(Brenner D.等人，2015年《自然评论》免疫学15，第362-374页)。尽管肿瘤坏死因子有望作为抗肿瘤药物，但系统性肿瘤坏死因子诱导的毒性阻止了这种细胞因子的临床发展，而不是肉瘤的孤立肢体灌注(Jakob J.等人，2016年癌症doi:10.1002/cncr.29991)。然而，值得注意的是，肿瘤内注射TNFerade在治疗多种人类癌症方面具有活性(Weichselbaum R.等人，2009年《癌症基因治疗》16，第609-619页)，这支持了一个前提，即在避免全身毒性的同时，将TNF输送到肿瘤的系统可能是一个有效的治疗肿瘤的方法。因此，构建了表达pE425-TNF载体的双NP/NCs。pE425启动子通过活性氧激活肿瘤细胞对辐射和化疗的反应(同上)。此外，pE425启动子在ROS水平升高的癌细胞中被选择性激活(Gorrini C.等人，2013年nat rev drug discov.12月12日(12)：931-947)，TNF的生产进一步推动了ROS在自动感应过程中的生产(Blaser H，2016Trends Cell Biol 26(4)，第249-261页)。因此，pE425肿瘤坏死因子载体特别适合肿瘤中肿瘤坏死因子的诱导。埃利希乳腺肿瘤的全身NP/TNF-NC治疗与肿瘤坏死因子的产生、诱导凋亡和抑制生长有关。有趣的是，在肿瘤内注射NP/TNF-NCs时也观察到了类似的效果，这表明这种双NP系统可以系统地或直接进入肿瘤。此外，更重要的是，NP/TNF-NCs几乎没有引起任何全身毒性。
本文报道的双NP/NC系统在癌症治疗中具有一定的潜在优势。例如，NP/TNF NCs可与放射和/或化学疗法结合进行全身或局部施用(Weichselbaum R.等人，2009年癌症基因治疗16，第609-619页)。此外，NP/TNF-NCs治疗肿瘤可用于免疫微环境的重建。这样，NP/TNF-NCs可以将“冷”变为“热”肿瘤，并与免疫检查点抑制剂结合。这种双NP系统也可用于重组肿瘤免疫监测程序，在pE425启动子的控制下结合编码细胞因子的基因，如IL-12等。
本发明提供了一种包含载有细胞因子(例如，TNF)的纳米颗粒(在本文中也称为“NPs”)的组合物。肿瘤坏死因子与肿瘤细胞坏死有关。抑制肿瘤坏死因子蛋白的活性可降低癌细胞的存活和增殖。这些纳米颗粒可促进细胞因子(如肿瘤坏死因子)向癌细胞胞内空间的输送。因此，本发明提供了通过施用包含含有诱导肿瘤坏死的肽或多核苷酸的纳米颗粒的组合物来治疗疾病(例如癌症)的方法。这里还提供了制备该组合物的方法。
纳米颗粒(在本文中也称为“NPs”)可制成纳米胶囊或纳米球。纳米颗粒中的蛋白质负载可通过吸附过程或封装过程进行(Spada等人，2011；聚合物纳米颗粒的蛋白质输送；世界科学、工程和技术学院：76)。纳米颗粒通过被动和主动靶向两种方法，可以提高癌细胞药物的细胞内浓度，同时避免对正常细胞的毒性。当纳米颗粒与特定受体结合并进入细胞时，它们通常通过受体介导的内吞作用被内体包裹，从而绕过对P-糖蛋白的识别，P-糖蛋白是主要的耐药机制之一(Cho等人，2008年，癌症药物输送治疗纳米颗粒，Clin.癌症研究，2008，14:1310-1316)。纳米颗粒通过光学和吞噬作用从人体中去除(Sosnik等人，2008；聚合物纳米载体：药物技术优化的新努力；生物医学工程的最新专利，1:43-59)。基于纳米载体的系统可用于有效的药物释放，其优点是提高细胞内渗透性、局部释放、保护药物免受过早降解、控制药代动力学和药物组织分布、降低剂量要求和成本效益(Farokhzad OC等；靶向纳米颗粒APTAmer生物结合物用于体内癌症化疗。Proc.Natl.Acad.Sci.美国2006103(16)：6315–20；Fonseca C等人，紫杉醇载PLGA纳米颗粒：制备、理化特性和体外抗肿瘤活性。控制释放杂志，2002；83(2)：273–86；Hood等人，纳米医学，2011，6(7)：1257-1272)。
纳米颗粒的吸收与它们的小尺寸成正比。由于其体积小，聚合物纳米颗粒被发现可逃避网状内皮系统(Res)的识别和吸收，因此可在血液中循环较长时间(Borchard等人，1996，Pharm.Res.7:1055-1058)。纳米颗粒也能在病理部位渗出，如实体肿瘤的渗漏血管系统，提供了一种被动的靶向机制。由于纳米结构的表面积越大，溶解速度越快，通常表现出较高的等离子体浓度和曲线下面积(AUC)。较低的粒径有助于逃避宿主防御机制，增加血液循环时间。纳米颗粒大小影响药物释放。较大的颗粒会使药物缓慢地扩散到系统中。较小的颗粒提供较大的表面积，但会导致药物快速释放。在纳米颗粒分散体的储存和运输过程中，较小的颗粒易于聚集。因此，需要在纳米颗粒的小尺寸和最大稳定性之间进行折衷。药物输送系统中使用的纳米颗粒的大小应足够大，以防止它们快速泄漏到毛细血管中，但应足够小，以避免被固定巨噬细胞捕获，这些巨噬细胞滞留在网状内皮系统中，如肝脏和脾脏。
除了它们的尺寸外，纳米颗粒的表面特性也是决定循环过程中寿命和命运的重要因素。理想情况下，纳米粒应具有亲水表面，以逃避巨噬细胞捕获。由具有亲水和疏水结构域的嵌段共聚物形成的纳米颗粒符合这些标准。受控的聚合物降解还可以增加向患病状态输送药剂的水平。聚合物降解也会受到粒径的影响。体外降解率随着粒径的增加而增加(生物聚合物纳米颗粒；Sundar等人，2010，先进材料科学与技术；doi:10.1088/1468-6996/11/1/014104)。
聚乳酸(PLA)已被美国食品和药物管理局批准用于组织工程、医疗材料和药物载体，聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)为本领域已知的药物输送系统。US2006/0165987A1描述了一种隐身聚合物可生物降解纳米球，包括聚(酯)-聚(乙烯)多嵌段共聚物和任选组件，用于赋予纳米球刚度和并入医药化合物。US2008/0081075A1公开了一种新型混合胶束结构，具有功能性内芯和亲水性外壳，由接枝高分子和一个或多个嵌段共聚物自组装而成。US2010/0004398A1描述了具有相间区域的壳/芯结构的聚合物纳米颗粒及其制备方法。
在各种实施方案中，本发明还包括与治疗分子(例如，编码TNF-α蛋白的分离核酸)相互作用以形成稳定的纳米复合物和/或用作细胞穿透肽的阳离子分子。在各种实施方案中，阳离子分子细胞包含包含渗透肽或蛋白质转导域。在各种实施方案中，阳离子分子是促进治疗剂(例如，DNA和载体)向细胞核转导的阳离子肽。
表1.阳离子分子是细胞穿透肽的实施例
本领域普通技术人员知道这里所描述的发明可以经历不同的变化和修饰，而不仅仅包括这里所具体描述的。应当被理解的是这里所描述的发明包括所有这些变化和修饰。本发明还包括本说明书所涉及或者指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，单独地或者作为一个整体，并且包括所述步骤或者特征的任意两个或者更多个的结合或者全部结合。
定义
为了方便起见，在进一步地描述的所述本发明之前，本发明说明书、实施例和所附权利要求书所使用的某些术语在此整理。这些定义应该依据本发明所公开的其他部分进行阅读并可以被本发明所属技术领域的普通技术人员所理解。除非另有定义，这里使用的所有科技用语与本发明所属领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。除非在具体的情况下明确限定，本发明说明书中所使用的术语如下定义。
“一个”、“一种”、“所述”物品指的是一个或者一个以上(即，至少一个)语法对象所述的物品。
这里所使用的术语“包含”、“包括”、“含有”、“具有”、“其特征在于”及其在语法上相等的词语指的是开放式包含，指可能包括其他元素。其不应被理解为“只由此组成”。
如这里所使用的，术语“由…组成”及其语法上相等的术语不包括任何在权利要求中没有特别指出的成分、步骤或者组分。
如这里所使用的，术语“大约”或者“大概”通常指在给定数值或者范围的20％范围内，更优选地在10％范围内，并且最优选的在5％范围内。
如这里所使用的术语“可生物降解的”指的是聚合结构的酶解或者非酶裂解或者降解作用。
术语“阳离子”是指在相应的环境条件下具有净正电荷或正δ电位的任何试剂，组合物，分子或材料。在各种实施方案中，本文描述的纳米颗粒包括阳离子聚合物，肽，蛋白质载体或脂质。
术语“细胞穿透”是指通过细胞的细胞膜(即，进入细胞质)转运的肽，蛋白质，片段或变体。细胞穿透肽或蛋白质可以是大分子(例如免疫球蛋白)的一部分。在各种实施方案中，细胞穿透肽，蛋白质，其片段或变体可有效地将纳米颗粒，治疗剂/纳米颗粒和/或复合物/纳米颗粒运输到细胞的细胞质中，而无需载体或共轭物的帮助。在一些实施方案中，抗体，其片段或变体与治疗剂和/或纳米颗粒接触，结合或共轭。
如在这里使用的术语“纳米颗粒”是指直径在10nm至1000nm范围内的颗粒，其中直径是指具有与颗粒相同体积的理想球体的直径。术语“纳米颗粒(nanoparticle)”可互换地用作“纳米颗粒(nanoparticles)”。在一些情况下，颗粒的直径在约1-1000nm、10-500nm、20-300nm的范围内。在不同的实施方案中，直径为约30-120nm。
在某些情况下，可能存在一群颗粒。如本文所述，纳米颗粒的直径是特定群体中分布的平均值。
如在这里使用的术语“聚合物”，其具有在本领域中使用的普通含义，即包含通过共价键连接的一个或多个重复单元(单体)的分子结构。重复单元可以全部相同，或者在一些情况下，聚合物中可存在多于一种类型的重复单元。
术语“核酸”是指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)，其变体和衍生物。
如这里所使用的，术语“治疗剂”和“药物”可以互换使用，并且不仅仅包括本身具有药学上或者生物学活性的化合物或者种类，还包括含有一种或者一种以上这些活性化合物或者种类的材料，及其结合、修饰和药理学上的活性片段及其抗体衍生物。
“靶向部分”或者“靶向剂”指的是与靶细胞表面选择性结合的分子。例如，所述靶向部分可以是能够与特定种类的细胞中发现的细胞表面受体相结合的配体，或者能够与相对其他细胞，在靶细胞上以更高频率表达的细胞表面受体相结合的配体。
如这里所使用的术语“复合的”是指在允许形成核酸-肽复合物的条件下将本文提供的分离的核酸与本文提供的阳离子细胞穿透肽一起放置。术语“复合物”是指与阳离子细胞穿透肽共轭的本文提供的分离的核酸。允许形成核酸-肽复合物的条件的非限制性实例在下面的实施例13中列出。
所述靶向剂或者治疗剂可以是一种肽或者蛋白质。“蛋白质”和“肽”是本领域内已知的术语，并且，如这里所使用的，这些术语具有本领域常规含义。一般来说，肽是长度小于大约100个氨基酸的氨基酸序列，但是也可以包括高达300个氨基酸。蛋白质通常被认为到是至少具有100个氨基酸的分子。所述氨基酸可以是D-构型或者L-构型。蛋白质可以是，例如，蛋白质药物、抗体、重组抗体、重组蛋白、酶等等。在一些情况下，肽或者蛋白质的一个或者一个以上氨基酸可以被修饰，例如，通过添加化学部分进行修饰，例如，碳水化合物基团、磷酸基、法呢基基团、异法尼基基团、脂肪酸基团、适于结合或者功能化的连接体，或者进行其他修饰，例如，环化作用、次生-环化作用和其他大量的能够赋予所述肽和蛋白质更有利的性质的其他修饰。在其他情况下，所述肽或者蛋白质的一个或者一个以上氨基酸可以被一个或者一个以上非自然存在的氨基酸所取代。所述肽或者蛋白质可以选自组合文库，例如噬菌体文库、酵母文库、或者体外组合文库。
如这里所使用的，术语“抗体”指的是任意结合给定抗原氨基酸序列的分子，或通过二级或者三级结构相似性而对给定抗原具有结合亲和性的分子，所述抗原与来自任意物种的包含免疫球蛋白可变区的分子显示相似或者更大的结合亲和性。术语“抗体”包括，但不局限于有两个重链和两个轻链组成的天然抗体；来源于轻链、重链或者二者之中的片段的结合分子、可变区片段、只有重链或者轻链的抗体、或者这些结构域的任意工程学结合，无论是单特异性或者双特异性的，无论是否与第二诊断剂或者治疗剂部分(例如显象剂或者化学治疗分子)相结合。该术语包括但不局限于免疫球蛋白可变区衍生的结合部分，无论来源于鼠、大鼠、兔、山羊、羊驼、骆驼、人或者其他任何脊椎动物。本术语涉及任意这种免疫球蛋白可变区结合部分，无论其发现方法是什么(杂交衍生、人源化产生、噬菌体衍生、酵母衍生、组合显示衍生、或者其他任意本领域内已知的类似的衍生方法)、或者生产方法是什么(细菌、酵母、哺乳动物细胞培养、或者转基因动物、或者本领域内已知的其他任意类似的方法)。
如这里所使用的术语“结合”、“治疗结合”或者“药学上结合”指的是两个或者更多治疗剂的联合给药(例如，共同传递)。
术语“细胞因子”是由一个细胞群释放并作为细胞间介质作用于另一个细胞群的蛋白质的通称。这些细胞因子的例子是淋巴因子、单因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，如人类生长激素、N-甲氧基人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-)和肿瘤坏死因子β(TNF-)；苗勒管抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子。神经生长因子，如NGFα(NGF-)；血小板生长因子；胎盘生长因子；转化生长因子，如TGFα(TGF-)和TGFβ(TGF-)；胰岛素样生长因子-1和-11；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素α(IFN-)、干扰素β(IFN-)和干扰素γ(IFN-)等干扰素。；集落刺激因子(csf)，如巨噬细胞csf(m-csf)；粒细胞巨噬细胞csf(gm-csf)；粒细胞csf(g-csf)；白细胞介素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-33；以及其他多肽因子，包括LIF和试剂盒配体(KL)。如本文所用，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养的蛋白质和天然序列细胞因子的生物活性当量。
术语“TNF”或“TNF-α”是指肿瘤坏死因子。TNF的生物学效应首先由Carswel等人描述，1979PNAS 72:3666页,作为内毒素诱导的血清中存在的一个因素，并导致某些类型的肿瘤坏死。最近，重组产生的人类肿瘤坏死因子也被证明是一种有效的抗癌剂(Pannica等人，(Nature(London)(1984)312:724-729)，Shirai等人，(Nature(London)(1985)313:803)，Wang等人，(Science(1985)，228:149)。另见美国专利号8835610，其全部并入本文中。
术语“人TNF-α”(在这里缩写为TNF-α)包括二聚细胞因子蛋白。该术语包括包含三种17.5kd TNF-蛋白质的同源三聚体蛋白质。术语人“TNF-α”旨在包括可通过标准重组表达方法制备的重组人TNF-α。人肿瘤坏死因子(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列如表2所示。编码TNF-α的整个载体的核酸序列(SEQ ID NO:10)和氨基酸序列(SEQ ID NO:11)也显示在表2中；显示的是在各种实施方案中封装到纳米颗粒中的整个载体的序列。TNFα由EGR1启动子(PE425)衍生。
表2:TNF-α编码载体的核苷酸序列和氨基酸序列及人TNF-α的氨基酸序列
如这里所使用的术语“药学上可接受的”指的是实体医学判断范围中适合于与热血动物(例如，哺乳动物或者人)组织相接触，而不产生过度毒性、刺激性过敏反应及其他复杂问题，具有合理的利益/风险比例的化合物、材料、组合物和/或剂量形式。
包括一个或者一个以上治疗剂的聚合物纳米颗粒的“治疗有效量”是指在联合治疗疾病之后足够提供所述疾病临床可见的现象或者症状可见的或者临床显著改善的量。
如这里所使用的术语“患者”或者“病人”指的是患有癌症或者直接或者间接与癌相关的异常的动物，或者为癌症所困的动物。患者的实施例包括哺乳动物，例如，人、猿、猴子、家犬、牛、马、猪、羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在一个实施方案中，患者是人，例如，患有、或者有风险患有或者由潜在的可能患有癌症的人。
如这里所使用的术语“治疗”或者“疗法”包括能够缓解、减少或者减轻患者至少一个症状，或者延缓疾病进程的治疗方法。例如，治疗可以是使疾病的一个或者一些症状消失或者完全根除疾病，例如，癌。在本发明所公开的内容中，所述术语“治疗”还表示防止和/或减少疾病恶化风险。如这里所使用的术语“预防”、“防止”或者“避免”包括预防至少一个与被预防的状态、疾病或者异常有关的、或者由其引起的症状。
如本文所用，当提及癌症患者或肿瘤时，术语“难治性”对治疗剂意味着该癌症或肿瘤由于与治疗剂接触而具有治疗剂的先天性或实现对治疗剂的效果的抵抗。另一种说法是，癌症抵抗与特定治疗剂相关的普通护理标准。在一些实施例中，本文所述的治疗癌症的方法包含PD-1难治性肿瘤。
如本文所用，术语“载体”意在指能够运输与其相连的另一种核酸的核酸分子。一种载体是“质粒”，它是指一个环状的双链DNA环，附加的DNA片段可以连接到该环中。另一种类型的载体是病毒载体，其中附加的DNA片段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有复制细菌起源的细菌载体和非游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)可在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与之相关的基因的表达。这些载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称“表达载体”)。一般来说，在重组DNA技术中实用的表达载体通常以质粒的形式存在。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括具有等效功能的其他表现载体形式，例如病毒载体(例如复制缺陷逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
术语“可操作连接”是指并列，其中所述部件处于允许它们以预期方式工作的关系中。将“可操作连接”到编码序列的控制序列以在与控制序列兼容的条件下实现编码序列的表达的方式连接。“可操作连接”序列包括与感兴趣的基因相邻的表达控制序列和在反式或远距离作用以控制感兴趣的基因的表达控制序列。本文所用术语“表达控制序列”是指影响其所连接的编码序列的表达和处理所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，如剪接和多聚腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即Kozak一致序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白质分泌的序列。这类控制序列的性质因宿主有机体而异；在原核生物中，这类控制序列一般包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这类控制序列一般包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包括其存在对于表达和处理至关重要的组件，并且还可以包括其存在有利的其他组件，例如，先导序列和融合伙伴序列。
聚合物纳米颗粒
本文提供用于递送一种或多种疗法(例如细胞因子或编码细胞因子的质粒或DNA)的可生物降解聚合物纳米颗粒。
因此，在一个方面，本文提供包含细胞因子或其部分或编码细胞因子或其部分的分离核酸的聚合物纳米颗粒。
在另一个方面，本文提供包含包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白质的聚合物纳米颗粒，或编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的TNF-α蛋白质的分离核酸或其一部分。
在一个实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒包含包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物。聚乳酸(PLA)是一种疏水性聚合物，是合成聚合物纳米颗粒的首选聚合物。然而，聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)的嵌段共聚物也可以使用。疏水性聚合物也可以是生物衍生的或生物聚合物。所用聚乳酸的分子量一般在约2000g/mol到80000g/mol的范围内，因此，在一个实施例中，所用聚乳酸的分子量在约10000g/mol到80000g/mol的范围内，聚乳酸的平均分子量也可以是约70000g/mol。
PEG是用于形成聚合物纳米颗粒的聚合物的另一优选组分，因为它具有亲水性、抗巨噬细胞吞噬作用和抗免疫识别能力。聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PEG-PPG-PEG)等嵌段共聚物是可用于本发明中的亲水性或亲水性疏水性共聚物。嵌段共聚物可以有两个、三个、四个或更多个不同的嵌段。
如本文所用，1g/摩尔相当于1“道尔顿”(即，当提及聚合物的分子量时，道尔顿和g/摩尔可以互换)。此处所用的“千道尔顿”是指1000道尔顿。
在又一实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)(PLA-PEG)二嵌段共聚物。
在又一实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。在各种实施方案中，纳米颗粒包含NanoProTM，所述NanoProTM是一种可生物降解、长血循环、隐形、四嵌段聚合物纳米颗粒平台(Nanoprotagen Inc.；马萨诸塞州)。PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物是由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物与聚乳酸的化学偶联而成的。
包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物的纳米颗粒的合成和表征在PCT公开号为WO2013/160773的申请中进行了描述，其全部内容以引用方式并入本文中。包含聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒被证明是安全、稳定和无毒的。用于形成该四嵌段共聚物的过程包括共价地将PEG-PPG-PEG连接到聚乳酸(PLA)基质，从而使嵌段共聚物成为基质的一部分，即纳米颗粒输送系统(参见实施例21)。这可以防止从乳化剂中浸到介质中。
在一些实施方案中，亲水性疏水嵌段共聚物(例如，PEG-PPG-PEG)的平均分子量(Mn)通常在1000到20000g/mol的范围内。在另一实施方案中，亲水性疏水嵌段共聚物的平均分子量(Mn)约为4000g/mol到15000g/mol。在某些情况下，亲水性疏水嵌段共聚物的平均分子量(Mn)为4400g/mol、8400g/mol或14600g/mol。
本发明的嵌段共聚物基本上可以由一段聚乳酸(PLA)和一段聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PEG-PPG-PEG)组成。
由嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PLA-PEG-PPG-PEG)形成本发明的特定可生物降解聚合物纳米颗粒。
本发明的另一种特殊的可生物降解聚合物纳米颗粒由嵌段共聚物聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇-聚乳酸(PLA-PEG-PPG-PEG-PLA)形成。
本发明的可生物降解聚合物可以通过共价键用亲水疏水嵌段共聚物对聚乳酸进行化学改性而形成。
在各种实施方案中，本发明的可生物降解聚合物纳米颗粒具有在约30-300纳米、约100-300纳米或约100-250纳米或至少约100纳米范围内的尺寸。
在各种实施方案中，本发明的可生物降解聚合物纳米颗粒具有在约30-120纳米、约120-200纳米或约200-260纳米或至少约260纳米范围内的尺寸。
在一个实施方案中，本发明的可生物降解聚合物基本上不含乳化剂，或者可以包含约0.5％到5％重量的外部乳化剂。
在一个实施方案中，本发明的可生物降解聚合物纳米颗粒为PLA-PEG-PPG-PEG，聚乳酸(lactic acid)嵌段的平均分子量约为60000g/mol，PEG-PPG-PEG嵌段的平均分子量约为8400或14600g/mol，外部乳化剂的重量约为0.5％至5％。
在另一实施方案中，本发明的可生物降解聚合物纳米颗粒为PLA-PEG-PPG-PEG，且聚乳酸(lactic acid)嵌段的平均分子量小于或等于约16000g/mol，PEG-PPG-PEG嵌段的平均分子量为约8400g/mol或约14600g/mol，其中所述组合物为基本上不含乳化剂。
在一个实施方案中，本发明的可生物降解聚合物纳米颗粒为PLA-PEG-PPG-PEG，聚乳酸(lactic acid)嵌段的平均分子量约为72000g/mol(或72kda)，PEG-PPG-PEG嵌段的平均重量约为8400或14600g/mol，外部乳化剂的重量约为0.5％至5％。
在另一实施方案中，本发明可生物降解聚合物纳米颗粒为PLA-PEG-PPG-PEG，且聚乳酸(lactic acid)嵌段的平均分子量小于或等于约12000g/mol(或12kda)，PEG-PPG-PEG嵌段的平均重量为约8400g/mol或约14600g/mol，其中阳离子基本上不含乳化剂。
在聚合物纳米颗粒的一个实施方案中，TNF-α蛋白或其一部分包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，分离的核酸编码TNF-α蛋白或其部分，它包含一个氨基酸序列，该氨基酸序列与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性。
在另一实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒进一步包含阳离子肽。
在又一实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒进一步包含细胞穿透肽。
在另一实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒进一步包含阳离子细胞穿透肽。在一个实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽包含选自SEQ ID Nos:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组的氨基酸序列组成的集合。这些肽的进一步描述见表1。
在具体实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒进一步包含C-环化多阳离子肽(SEQ ID No:8)。
在另一实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽和分离的核酸(例如，编码TNF-α蛋白的分离核酸)形成复合物。
在另一方面，本文提供由基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物或聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成的聚合物纳米颗粒，其中聚合物纳米颗粒装载有细胞因子或其一部分，或为细胞因子编码的分离核酸，或其一部分。
在一个实施方案中，细胞因子与SEQ ID No:9之序列至少70％相同。
在另一实施方案中，分离的核酸与阳离子细胞穿透肽复合(即形成复合物)。
在又一实施方案中，阳离子细胞穿透肽选自SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组成的组。
在另一方面，本文提供了一种复合物，其包括
a)编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的TNF-α蛋白或其一部分的分离核酸；及
b)阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽。
在一个实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽包含选自SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸的氨基酸序列组成的组。
在具体实施方案中，阳离子细胞穿透肽包含C-环化多阳离子肽(SEQ ID Nos:8)。
在一个实施方案中，肽和核酸之间的复合物通过静电相互作用形成。在又一实施方案中，以约5到15的电荷比或Z(±)或约10.0的电荷比制备络合物，其中电荷比是核酸的磷酸(PO4-)基团中肽的氨基氮(NH3+)的比率。
双聚合物纳米颗粒的制备
本文提供制备包含一种或多种疗法的聚合物纳米颗粒的方法/工艺。所得到的聚合物纳米颗粒不仅无毒、安全、可生物降解，而且在体内稳定，具有很高的储存稳定性，可以安全地用于医药领域的纳米载体系统或药物输送系统。事实上，本文所提供的聚合物纳米颗粒可提高可交付药物或治疗剂的体内半衰期。
本文还提供一种在可生物降解聚合物纳米颗粒上有效地加载细胞因子(或编码细胞因子的遗传材料(例如，DNA))以形成有效且有针对性的药物传递系统的工艺，所述药物传递系统可防止活性剂的过早降解，并且具有很强的用于癌症治疗的潜力。
具体来说，本文提供了一种有效地加载包含TNF-α或遗传材料(例如DNA)的肽的工艺，所述遗传材料编码TNF-α在可生物降解的聚合物纳米颗粒上以形成有效的靶向药物输送纳米颗粒系统。
肽-核酸复合物的制备
在一个方面，本文提供一种制备复合物的方法，所述复合物包括
a)编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的TNF-α蛋白或其一部分的分离核酸；及
b)阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽，包含以下步骤：
i)制备核酸储备溶液；
ii)制备肽储备溶液；和
iii)旋涡震荡时将核酸储备溶液加入肽储备溶液中。
在一个实施方案中，以约20-40ng/l的浓度制备核酸储备溶液。
在另一实施方案中，将核酸储备溶液逐滴添加到肽储备溶液中。
在一个实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸的氨基酸序列组成的组。
在具体实施方案中，阳离子细胞穿透肽包含C-环化多阳离子肽(SEQ ID NO:8)。
在一个实施方案中，肽和核酸之间的复合物通过静电相互作用形成。在又一实施方案中，以约5到15的电荷比或Z(±)或约10.0的电荷比制备络合物，其中，电荷比是核酸的磷酸(PO4-)基团中肽的氨基氮(NH3+)的比率。
在一个实施方案中，由此方法产生的复合物是单分散的复合物。
这些复合物的尺寸(例如，范围约为30到150纳米)可以用透射电子显微镜测量。在适当实施方案中，本文提供的复合物的直径将在直径约50nm到100nm之间或在约70nm到90nm之间。在又一实施方案中，本文提供的复合物的直径约为80nm。
在一个实施方案中，复合物具有介于约+15mV和+35mV之间的zeta电位。在又一实施方案中，该复合物具有约+35mV的zeta电位。
聚合物纳米颗粒的制备
在另一方面，本文提供了制备包含复合物的聚合物纳米颗粒的方法，所述复合物包括
a)编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列的TNF-α蛋白或其一部分的分离核酸；及
b)阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽，包含以下步骤：
i)将嵌段共聚物溶解在溶剂中形成嵌段共聚物溶液；以及
ii)将所述配合物添加到所述嵌段共聚物溶液中以形成包含所述配合物和所述嵌段共聚物的溶液。
在一个实施方案中，嵌段共聚物是聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物。
在一个实施方案中，嵌段共聚物是聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物。
在一个实施方案中，以约2mg/m至10mg/ml的浓度制备步骤i)的嵌段共聚物溶液。在另一实施方案中，以约6mg/ml的浓度制备步骤i)的嵌段共聚物溶液。
在一个实施方案中，该工艺进一步包含步骤iii)将步骤ii)的溶液添加到包含表面活性剂的溶液中。在又一实施方案中，搅拌步骤ii)产生的溶液，直到形成稳定的纳米颗粒。
在各种实施方案中，聚合物纳米颗粒可在膨胀或收缩时采用非球形结构。
各种实施方案中的纳米颗粒本质上是两亲性的。
可计算纳米颗粒的zeta电位和pdi(多分散指数)(见美国专利号9149426)。
聚合物纳米颗粒的尺寸(例如，范围约为100至350纳米)可使用透射电子显微镜测量。在适当的实施方案中，本文提供的聚合物纳米颗粒的直径将在直径约100到350nm之间，或在直径约100到300nm之间，或在约100到250nm之间。在又一实施例中，本文提供的聚合物纳米颗粒的直径约为100nm、110nm、120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、240nm或250nm。
在一个实施方案中，包含复合物的聚合物纳米颗粒具有介于-50mV和-10mV之间的zeta电位。在又一实施方案中，该复合物具有约-30mV的zeta电位。
本文提供聚合物纳米颗粒形成的具体方法以及在药物组合物中的用途，以供参考。这些过程和使用可通过本领域技术人员明显可见的各种方法来实施。
组合物
本文还提供了一种包含用于医药和其他领域的可生物降解聚合物纳米颗粒的组合物，所述领域使用载体系统或纳米颗粒的贮存器或仓库。本发明的纳米颗粒可广泛用于预后、治疗、诊断或治疗性成分中。适宜地，本发明的纳米颗粒用于药物及药剂递送(例如，在肿瘤细胞内)，以及用于人类及动物之疾病诊断及医学成像。因此，本发明提供使用进一步包含如本文所述的治疗剂的纳米颗粒治疗疾病的方法。本发明的纳米颗粒也可用于其他应用中作为生物传感器，作为固定化酶等的试剂，例如需要储库或仓库的化学或生物反应。
因此，在一个方面，本文提供的组合物包含
a)包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒；和
b)细胞因子或其部分或编码细胞因子或其部分的分离核酸。
在另一方面，本文提供的组合物包含
a)包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒；和
b)包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸。
在一个实施方案中，聚合物纳米颗粒包含聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)二嵌段共聚物。
在一个实施方案中，聚合物纳米颗粒包含聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
在又一实施方案中，PLA-PEG-PPG-PEG四嵌段共聚物是由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物与PLA的化学共轭形成的。
在一个实施方案中，聚乳酸的分子量在约10000道尔顿和约100000道尔顿之间。
在一个实施方案中，TNF-α蛋白或其部分包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在另一实施方案中，编码TNF-α蛋白或其部分的分离核酸，包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，本文提供的组合物进一步包含阳离子肽。
在另一实施方案中，本文提供的组合物进一步包含细胞穿透肽。
在另一实施方案中，本文提供的组合物进一步包含阳离子细胞穿透肽。
在一个实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽包含选自SEQ ID NOs:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组的氨基酸序列。
在具体实施例方案中，本文提供的组合物进一步包含C-环化多阳离子肽(SEQ IDNO:8)。
在另一实施方案中，阳离子、细胞穿透或阳离子细胞穿透肽和分离的核酸(例如，编码TNF-α蛋白的分离核酸)形成复合物。
在一个实施方案中，本文所提供的组合物进一步包含化疗剂或靶向抗癌剂，所述靶向抗癌剂选自阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米的集合或其组合。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物包含
a)包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒；和
b)包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸，
用于治疗癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、代谢性紊乱、发育性紊乱、心血管疾病、肝病、肠道疾病、传染病、内分泌疾病和神经系统疾病。
在本文提供的组合物的一个实施方案中，聚合物纳米颗粒由基本上由聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在一个实施方案中，本文提供的组合物由基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在本文所提供的组合物的一个实施方案中，聚合物纳米颗粒进一步包含附着于聚合物纳米颗粒外部的靶向部分，其中靶向部分是抗体、肽或适配体。
例如，适宜的医药组合物或配方可含有约0.1％至约99.9％、较佳约1％至约60％的活性成分。例如，用于肠内或肠外给药的药物制剂是单位剂量形式的制剂，例如糖衣片、片剂、胶囊或栓剂或安瓿。如果未另行说明，则以已知的方式制备，例如通过常规混合、造粒、糖衣、溶解或冻干工艺制备。应了解，由于可通过投与多个剂量单位来达到所需的有效量，每种剂型的单个剂量中所含的组合伙伴的单位含量本身不必构成有效量。
作为活性成分，所述药物组合物可含有本发明的一种或多种纳米颗粒与一种或多种药学上可接受的载体(赋形剂)组合。在制备本发明的组合物时，活性成分通常与赋形剂混合，由赋形剂稀释或以例如胶囊、袋、纸或其他容器的形式封闭在所述载体内。当赋形剂用作稀释剂时，它可以是固体、半固体或液体材料，用作活性成分的载体、载体或介质。因此，所述组合物可以是药片、药丸、粉末、含片、小袋、药囊、药剂、悬浮液、乳剂、溶液、糖浆、气溶胶(固体或液体介质)、软膏(例如，含有高达10重量％的活性化合物)、软胶囊和硬胶囊、栓剂、无菌注射溶液的形式。以及无菌包装粉末。
适宜赋形剂的一些实施例包括乳糖(例如乳糖一水合物)、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉(例如淀粉乙醇酸钠)、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、胶质二氧化硅、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(例如聚维酮)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素和羟丙基纤维素。配方还可包括：滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等润滑剂；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；甲基和丙基羟基苯甲酸盐等防腐剂；甜味剂；调味剂。
本发明的化合物和组成可以通过口服或注射的液体形式包括水溶液、适当调味的糖浆、水性或油悬浮液，以及含有食用油(如棉籽油、芝麻油、椰子油或花生油)的调味乳剂，以及药水以及类似的药物载体。
治疗方法
本发明提供一种治疗有需要的个体的疾病的方法，包括向该个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)包含包含包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒；和
b)细胞因子或其部分或编码细胞因子或其部分的分离核酸。
在一个方面，本文提供治疗有需要的个体的疾病的方法，其包括向所述个体施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包括
a)由包含聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物的聚合物形成的聚合物纳米颗粒；和
b)包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸。
在本文提供的方法的一个实施方案中，分离的核酸与阳离子细胞穿透肽复合。
在本文所提供方法的一个实施方案中，阳离子细胞穿透肽选自SEQ ID Nos:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组成的组。
在本文所提供方法的一个实施方案中，所述药物组合物进一步包含化疗剂或靶向抗癌剂，所述靶向抗癌剂选自以下组：阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米。
在本文所提供方法的一个实施方案中，所述疾病是癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、代谢性紊乱、发育性紊乱、心血管疾病、肝病、肠道疾病、传染病、内分泌疾病和神经系统疾病。
在另一个实施方案中，疾病是癌症。
在又一实施方案中，癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性结肠癌、胰腺癌或血液学恶性肿瘤。
在另一实施方案中，癌症包含PD-1难治性肿瘤。
在不受任何特定理论限制的情况下，我们设想检查点抑制剂，如PD-1、PDl-1、CTLA-4、OX-40、4-1BB，与能够增加肿瘤微环境中细胞因子浓度的药剂结合时，其效果可能会更好。因此，全身性递送治疗剂(例如，肿瘤坏死因子DNA或肿瘤坏死因子蛋白)可显著增加肿瘤微环境中治疗剂的局部浓度，从而吸引该区域的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，从而通过增强例如PD-1或其他检查点抑制剂治疗效果来敏化细胞。例如，全身输送治疗剂(如TNFDNA)可能会使PD-1难治性肿瘤的治疗敏感。
在本文提供的方法的一个实施方案中，纳米颗粒由基本上由聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在本文所提供方法的一个实施方案中，纳米颗粒由基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在一个方面，本文提供诱导细胞中TNF表达的方法，包括使细胞与由包含聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物的聚合物形成的有效量的聚合物纳米颗粒接触；其中聚合物纳米颗粒包含编码TNF-α蛋白的分离核酸，TNF-α蛋白包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分。
在本文提供的方法的一个实施方案中，分离的核酸与阳离子细胞穿透肽复合。
在又一实施方案中，阳离子细胞穿透肽选自SEQ ID No:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸组成的组。
在一个实施方案中，聚合物纳米颗粒基本上由聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在一个实施方案中，聚合物纳米颗粒基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
在本文提供的任何方法的一个实施方案中，TNF-α蛋白或其一部分包含与SEQ IDNo:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
在本文提供的任何方法的另一实施方案中，分离的核酸编码TNF-α蛋白或其部分，所述TNF-α蛋白或其部分包含与SEQ ID No:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
本文所提供的药物组合物的给药不仅可在缓解、延缓症状进展或抑制症状方面产生有益效果，而且与之相比，例如，不使用本文所述的聚合物纳米颗粒系统或通过任何其他常规方法递送所述药剂，还可产生进一步令人吃惊的有益效果，例如副作用更少、反应更持久、生活质量提高或发病率降低。
本文提供的聚合物纳米颗粒的有效剂量可根据所用的特定蛋白质、核酸和或其他治疗剂、给药方式、所治疗的病况和所治疗病况的严重性而变化。因此，聚合物纳米颗粒的剂量方案是根据包括给药途径和患者的肾和肝功能在内的各种因素来选择的。
包含药物组合的聚合物纳米颗粒
本文所述聚合物纳米颗粒可用于递送药物组合。例如，可通过本文公开的双纳米颗粒系统递送的药物组合包含化疗药物和编码细胞因子(例如，包含TNF-α的肽或编码TNF-α的遗传材料)的细胞因子或遗传材料。
在一个方面，本文提供了一种聚合物纳米颗粒，其包含
a)包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9序列具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸；及
b)一种或多种化疗药物或靶向抗癌药物。
在一个实施方案中，化学治疗剂或靶向抗癌剂，选自阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米。
尽管已参考其某些实施方案对主题进行了相当详细的描述，但其他实施方案是可能的。因此，所附权利要求书的精神和范围不应限于对其中所含具体实施方案的描述。
实施例
现在将用工作实施例解释公开的内容，其目的是解释公开的工作，而不是在本公开的范围上加以任何的限制。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员对本开工内容通常理解的含义是相同的。尽管与本文所述方法和材料类似或等效的方法和材料可用于所公开方法和组合物的实践中，但本文描述了示例性方法、装置和材料。
实施例1：GFP表达的流式细胞术分析
以表达绿色荧光蛋白的报告质粒DNA(pEGFP N3)为复合物，分析了纳米复合物和纳米颗粒的转染效率。分别在0.5、1、2、3、4、5、6天的不同时间点，分析用NC-GFP、PD-GFP和PPD-GFP转染MCF-7细胞。在这里，细胞被胰蛋白酶化(100μl的0.25％胰蛋白酶)，并用冰凉的1X PBS洗涤，然后重新悬浮在200μl的1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。采用ARIA III流式细胞仪(加利福尼亚州圣何塞)进行测量。在488nm的激发下观察到绿色荧光蛋白的表达，每例获得50000个事件。数据显示了三个独立实验的平均值。
实施例2：细胞活力
用噻唑蓝四唑溴化铵(MTT)法测定了纳米复合物和纳米颗粒的毒性效应。人乳腺腺癌细胞系MCF-7细胞以每孔6000个细胞的96孔板形式接种。24小时后，细胞用NC-GFP、PPD-GFP和Lipofectamine 2000TM处理，pDNA浓度为8μg，处理4小时。转染后1、2、3和4天测定细胞活力。简言之，向每个孔中添加一体积(50μl)的MTT试剂(0.5mg/ml)。将培养板在37℃下培养15分钟，以实现细胞溶解。将含有MTT试剂的介质小心地从孔中倒出，这样晶体就不会被分离出来。孵育后，将100μl MTT清洁剂缓冲液(10％SDS的0.5ml和10ml异丙醇中的0.06ml 12N HCl)添加到每个孔中，轻轻摇动30分钟使晶体溶解。在550和670nm处进行吸光度分析(以消除碎片)。存活率计算如下：
绘制两个独立实验的平均值的图，并且每个处理都重复四次实验。
用不同的制剂转染后，细胞在50μL放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液中裂解，并用1％β-巯基乙醇重新悬浮在50μL2X十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲液中。将样品煮沸5分钟，并在12％SDS-PAGE电泳凝胶上分离(每道20μL)。电泳后，使用湿转移细胞系统(Bio-Rad；Hercules，CA)将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore；Billerica，MA)上。膜在含有5％脱脂牛奶的PBS中被封住两小时。用一级抗体、兔抗人肿瘤坏死因子α和兔抗人caspase-3(1:2000稀释，abcam；剑桥，英国)分别在4℃孵育过夜，检测肿瘤坏死因子-α和caspase-3的表达。丢弃一级抗体溶液，用含有二级抗体酶辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(1:1000稀释度，ABCAM)的溶液培养膜两小时。TNF-α蛋白和caspase-3蛋白通过增强化学发光检测(ELC，Thermo ScientificTM Pierce；Lenexa，KS)。一种抗甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology；达拉斯，德克萨斯州)被用作蛋白质负载控制。
实施例4：膜联蛋白V染色
通过膜联蛋白V染色(Thermo ScientificTM Pierce)分析TNF-α编码质粒DNA对细胞的功能影响。人乳腺腺癌mda-mb-231细胞用TNF-α-pDNA载体PPD-TNF-α纳米粒转染。24、48和72小时后，用1X PBS洗涤处理细胞，并在胰蛋白酶化后收集。胰蛋白酶化细胞以每分钟600转(rpm)的速度离心10分钟。将细胞颗粒重新悬浮在膜联蛋白V缓冲液中，并用荧光素异硫氰酸盐(FITC)标记膜联蛋白V和碘化丙烷(PI)染色15分钟。用ARIA III流式细胞仪(Thermo ScientificTM Pierce)分析培养后的细胞。
实施例5：免疫细胞化学
采用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)研究了MDA-MB-231细胞的基因表达及其体外功能效应。对于clsm观察，细胞以每盘1x105细胞的密度接种在35毫米(mm)的μ培养皿中。37℃孵育24小时后，用PPD-TNF-α转染细胞。12小时后，去除培养基并添加新鲜培养基。24、48和72小时后，去除培养基，用1X PBS洗涤细胞三次。此后，用TNF-α一级抗体或caspase-3一级抗体培养细胞1小时，然后用FITC和5(cy5)荧光团标记二级抗体培养细胞1小时。然后用PBS清洗细胞，用Hoechst 33258染料(Thermo ScientificTM Pierce)染色细胞核。然后用200μl 1X PBS培养细胞，进行CLSM观察。
实例6：活体内研究
雌性同基因BALB/C小鼠，10-12周龄(～22-25克体重)用于体内分析。根据国际实验室动物护理协会(AAALACI)指南的评估和认可协会，受试者保持在无病原体的条件下，并在任何测试前接受4天的驯化。动物得到了人道的照顾，并随意提供食物和水。所有动物实验和研究方案均在印度医学院(AIIMS)新德里按照机构指南进行，并由委员会批准，目的是控制和监督印度新德里政府的动物实验。
实施例7：埃利希腹水肿瘤(EAT)模型
小鼠腹腔内的埃利希腹水肿瘤细胞以腹水的形式通过连续每周的通道维持。成指数增长的食肉细胞被采集、清洗并重新悬浮在PBS中。在每名受试者右后腿大腿皮下注射一定量的埃利希腹水肿瘤细胞(约1.8x 106细胞/小鼠)。
实施例8：最大耐受剂量(MTD)研究
在健康雌性同基因BALB/C小鼠腹腔内单次(IP)输送PPD-TNFα纳米粒研究MTD。5组5只同基因BALB/C小鼠单次IP注射不同PDNA-TNF-α浓度的PPD-TNFα纳米粒(每剂0.6mg/kg、1.2mg/kg、1.8mg/kg和2.4mg/kg PDNA)。使用PBS作为对照。每天测定小鼠存活率和体重变化，持续15天。MTD的定义是，给药后一周内，允许体重中位数为对照组的15％，不会因毒性作用而死亡，也不会引起一般体征的显著变化。体重减轻超过20％的动物被处死，因为这一数量级的变化往往表明是致命的毒性。
实施例9：体内肿瘤回归分析
在皮下埃利希腹水肿瘤回归分析模型中，当同基因BALB/C小鼠的肿瘤体积达到约50mm3时开始治疗，这一天指定为第0天。第0天，将这些小鼠随机分为5组(n＝6)。治疗开始时间为肿瘤植入后第1天(肿瘤体积约为50mm3)，持续50天。在第1天、第5天、第9天、第13天、第17天和第21天，用裸质粒DNA(pDNA-TNF-α)、肽质粒DNA纳米复合物(NC-TNF-α)和聚合物肽质粒DNA纳米颗粒(PPD-TNF-α)腹腔或肿瘤内(it)给药小鼠。比较两种pDNA剂量(0.6mg/kg和1.2mg/kg)的PPD-TNF-α纳米粒。在浓度为14μg的pDNA下检测裸pDNA TNFα和NC-TNF-α。对照组小鼠仅给予PBS。每周用血管卡尺测量两次肿瘤大小。肿瘤体积按公式(lx w2)/2计算，其中L肿瘤最长直径，W为肿瘤最短直径。在最后一次给药的第三天，从所有小鼠身上采集血液样本，用于测量血细胞计数、丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆红素、血尿素氮(BUN)和肌酐。每组处死一只小鼠，取肿瘤、心脏、肝脏、肾脏、脾脏和肺部进行组织病理学评价。
实施例10：组织学分析
取治疗小鼠的心脏、肺、肝、脾、肾、肿瘤等组织标本进行组织病理学分析。将样品嵌入石蜡中，然后制备5微米(μm，微米)尺寸的切片。这些切片用苏木精-伊红(H&E)染色，并用显微镜进行分析。
实施例11：肿瘤切片的荧光激活细胞分类(FACS)分析
对处死小鼠的肿瘤切片进行抗肿瘤蛋白TNF-α和凋亡级联蛋白caspase-3的分析。将肿瘤切片切碎，用溶解缓冲液处理5分钟。然后将处理后的切片在手动均质机中均质5分钟。对均质肿瘤切片进行离心分离，收集每个样本的上清液。提取的上清液用抗TNF-α和caspase-3的荧光抗体孵育30分钟。处理后的上清液用facs分析其各自的抗肿瘤蛋白。
实施例12：肽序列CR5H7R4C的产生
合成了C-环化聚阳离子肽CR5H7R4C(氨基酸序列CRRRRRHHHHHHHRRRRC；>95％纯度)(G L生物科技有限公司；中国上海市)。将肽以5mg/ml的浓度溶解在去离子水中，并分成小份储存在-80℃下，以避免反复冻融。质粒pEGFP-N3(Clontech；Mountain View，CA)和pE425TNF-α使用Geneute HP无内毒素质粒Maxiprep试剂盒(Sigma Aldrich；St.Louis，MO)纯化。设计合成了一种75千道尔顿聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物。见Kumar等人。癌症研究，2014 74(12)：3271-3281。获得了TNF-α、caspase-3和gapdh的一级和二级抗体(英国剑桥Abcam Pvt有限公司)。除非另有说明，否则使用的所有化学品均从西格玛·奥尔德里奇(密苏里州圣路易斯市)购买。
实施例13：肽质粒DNA复合物(纳米复合物)的制备
肽-pDNA纳米复合物(NC)是在静电作用的基础上制备的，DNA中每个磷酸(PO4-)的肽的氨基氮(NH3+)的比例被指定为电荷比(Z(±))。将存储的pDNA稀释到20-40ng/μl的浓度，并在旋涡震荡的同时将其逐滴添加到等量的适当肽稀释液中。在本例中，以10.0的电荷比z(±)制备纳米复合物。
实施例14：聚乳酸-聚乙二醇-肽-PDNA纳米粒的制备
采用双乳液蒸发法制备了聚乳酸-聚乙二醇-肽-pDNA纳米粒。聚合物溶液和表面活性剂的制备方法如下：a)将PEG-PLA嵌段共聚物以6mg/ml的浓度溶于乙腈中；b)将倍体F-127以3mg/ml的浓度溶于去离子水中，连续搅拌制备表面活性剂溶液。如前所述制备了一批新的肽pDNA纳米复合物，然后与聚乳酸-聚乙二醇溶液轻轻混合，然后缓慢地添加到表面活性剂水溶液中。将该溶液连续搅拌约12小时，形成稳定的纳米颗粒溶液。这些N/Ps分三组制备：i)仅聚合物N/Ps(NP)，ii)聚合物-pDNA N/Ps(PD)，iii)聚合物-肽-pDNA N/Ps(PPD)。N/Ps材料在-80℃下保存，用pE425-TNFα质粒代替报告质粒DNA制备PPD纳米粒，研究质粒DNA负载纳米粒的抗肿瘤作用。用报告质粒DNA(pEGFP-N3)制备了NC-GFP、PD-GFP和PPD-GFP纳米复合物和纳米颗粒。利用编码质粒DNA的抗肿瘤蛋白TNF-α(pE425TNFα；ClontechLaboratories有限公司，加利福尼亚)制备的纳米复合物和纳米颗粒为NC-TNF-α、PD-TNF-α和PPD-TNF-α。
实施例15：生物物理学特征
使用Zetasizer纳米ZS系统(马尔文仪器；英国，马尔文)在25℃下以173°的固定角度测量纳米复合物和聚合物纳米颗粒的尺寸和zeta电位。每个样品至少记录三个读数。还分析了复制品。用透射发射显微镜(TEM)对纳米复合物和纳米颗粒的形貌进行了成像。通过在生理缓冲液(1X-PBS)中培养纳米粒，分析了纳米粒中pDNA的释放模式。每1小时离心一次溶液，收集上清液并分析是否存在pDNA。然后，颗粒再次悬浮在PBS中。用10微克每微升(μg/μl)肝素处理上清液10分钟，然后用溴化乙锭(EtBr)排除分析。
实施例16：体内转染
MCF-7和MDA-MB-231细胞在DulbCo改性EAG培养基(DMEM)中，在37℃和含5％二氧化碳的加湿培养箱中培养，该培养基中添加10％(V/V)胎牛血清(Life Technologies/Thermo ScientificTM Pierce；雷内克萨，KS)。细胞以24孔板型接种，达到70％的合流率后24小时进行体外实验。以10.0的电荷比制备纳米复合物，并孵育1小时。将100微升(μL)纳米复合物(2μg的pDNA/孔)加入300μL无血清培养基(OptiMEM//Thermo ScientificTM Pierce；雷内克萨，KS)中。将纳米颗粒(PD-GFP和PP-GFP)以浓度为2微克(μg)、4μg和8μg的浓度添加到细胞中。为了研究血清对转染效率的影响，在10％血清中加入纳米颗粒和纳米复合物(在8μg pDNA/孔)。将样品培养12小时，然后抽吸含有纳米颗粒和纳米复合物的培养基。用1XPBS(pH7.4)冲洗细胞并补充完整的生长培养基。
实施例17新型双NP/NCs的产生
对编码细胞因子的载体进行系统性给药是肿瘤内免疫微环境重新编程的一种潜在方法。然而，该领域因缺乏有效的传递系统而受到限制(Yin H等人，2014年《自然评论》遗传学第15期，第541-555页；Amer M.H.，2014年《分子细胞疗法》。2014年；2:27，第1-19页；Collins M.等人，2015年，Proc.Biol.Sci.22；282(1821)：20143003。doi:10.1098/rspb.2014.3003)。为了解决这一障碍，实例开发了一个双系统，其中包括一个外聚合物聚乳酸-聚乙二醇纳米颗粒(NP)，它围绕着一个含有肽DNA载体纳米复合物(NC)的阳离子颗粒。NC的组氨酸和半胱氨酸修饰的精氨酸肽(HCR)成分被设计用于维持DNA凝聚和细胞内释放的平衡(Mann A.等人，2014年，分子药理学，11(3)，第683-696页)。
采用聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物(分子量75kDa)通过纳米沉淀法制备了三组纳米颗粒：i)无负载聚合物纳米颗粒(NP)、ii)负载pDNA的聚合物纳米颗粒(PDNP)和iii)肽-DNA纳米复合物负载聚合物纳米颗粒(NP/NCS)。见Shi J.等人，2013，J.Bio Eng.，7:25；第1-10页。将这三组纳米颗粒与肽-pDNA纳米复合物(NC)进行了生物物理、体外和体内特性的比较。在去离子水和血清中分析合成的纳米复合物和纳米颗粒的流体动力学直径和多分散性指数值(参见图1A和图1B)。肽-PDNA纳米复合物(NC)为单分散体，粒径范围为80±4nm，而pDNA聚合物纳米颗粒的粒径是去离子水中的两倍以上(250±7nm)。用Zetasizer纳米ZS系统测定了聚乳酸-聚乙二醇NP的zeta电位为-30mV。然而，肽-pDNA纳米复合物(NC)的zeta电位为+25mV。
聚合物纳米颗粒的透射电子显微图如图1B所示，图像显示纳米颗粒呈球形。在血清存在下，NC显示为200至700nm范围内的多分散尺寸，这表明纳米复合物的聚集和失稳。PLA-PEG纳米颗粒(PPDNP)含有肽-pDNA纳米复合物，即使在存在血清时也观察到其大小稳定，没有任何聚集(见图1C)。对聚合物pDNA(PD)和聚合物肽pDNA(PPD)纳米粒的pDNA加载效率进行了评价。pDNA在PDNP和PPDNP中的加载效率分别约为40％和60％。
在不受任何特定理论或作用机制限制的情况下，我们设想在聚乳酸-聚乙二醇纳米颗粒中观察到的较小的pDNA负载量可能是由于带负电荷的聚乳酸-聚乙二醇和pDNA的排斥作用，而肽-pDNA纳米复合物带正电荷，因此以较高的比例被封装在带负电荷的PLA-PEG聚合物纳米颗粒中。
实施例18聚合物纳米颗粒中肽-DNA的释放动力学
在生理条件下(1X-PBS)，使用EtBr排除分析法分析PDNP和PPDNP的pDNA释放动力学。约60％的pDNA在3小时内从PD纳米粒中释放出来，而ppd则逐渐释放pDNA，在12小时、24小时和48小时内分别pDNA累计释放30％、45％和60％(图1D)。我们观察到聚乳酸-聚乙二醇-肽-pDNA纳米粒(PPD)释放pDNA的机制分为两个阶段，即爆发释放阶段和控制释放阶段。在爆发释放阶段，在最初的四个小时内释放了20％，这与肽-pDNA纳米复合物被吸附或通过弱键附着在纳米颗粒表面相对应。在控制释放阶段，观察到PPD纳米颗粒在长达48小时的时间内逐渐释放PDNA，这可能是由于高分子量聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物的缓慢降解造成的。在不受任何特定理论或作用机制限制的情况下，可以将这一观察结果外推到细胞系统中pDNA的表达模式，从而pDNA的持续释放越多，在体外条件下的表达越长越高。在PDNP的情况下，由于pDNA和PLA-PEG纳米颗粒的负电荷之间的排斥作用，可以观察到pDNA比PPDNP释放更快的现象，即在3小时内达到60％。pDNA与阳离子肽缩合形成纳米复合物，从而减小了pDNA的尺寸并掩盖了pDNA的电荷，这导致了NC在(PPDNP)中的较高负载。
因此，数据表明，在生理条件下，HCR-DNA复合物从双NP/NCS释放持续48小时以上，支持外源基因传递的潜力。
实施例19肽-GFP cDNA复合物的细胞内表达
为了评估外源基因的细胞内表达，用绿色荧光蛋白(GFP)cDNA生成HCR肽复合物(图2A)。观察到MCF-7细胞暴露于NP/GFP-NCS，这导致96小时内GFP表达逐渐增加(图2B)。此外，值得注意的是，NP/GFP-NC对细胞活力几乎没有任何影响，这一发现与在脂质体存在下转染GFP-NC形成对比(见图2C)。
实施例20产生NP/NCS作为体外诱导肿瘤坏死因子表达和凋亡的模型。
构建了一个表达载体，其中人TNF cDNA由一个源自EGR1基因的活性氧(ROS)诱导启动子(pE425)驱动(Weichselbaum R.等人，2009年，癌症基因治疗，16，第609-619页)。对于模型系统，生成了含有与pE425TNF cDNA(TNF-NC)连接的HCR肽的NCS(图3A)。然后将TNF-NC封装在PLA-PEG NP(NP/TNF-NC)中(图3B)。明显地，用NP/TNF-NCS处理MCF-7细胞与TNF跨膜(21kDa)和可溶性(17kDa)蛋白的表达相关(图3B)。与NP/GFP-NC相比，NP/TNF-NC治疗可有效诱导细胞死亡(图3C)。同时进行蛋白质印迹分析。数据显示caspase-3蛋白在TNFα表达细胞中表达，这些细胞被封装了NC-TNFα和PPD-TNFα的TNFαpDNA转染。免疫细胞染色数据显示24小时、48小时和72小时后PPD-TNFα转染细胞中存在TNFα和caspase-3。膜联蛋白V染色数据分析显示MCF-7细胞对NP/TNF NC有反应，从而使细胞直接凋亡(图4A)。与这些数据一致，还观察到诱导细胞内TNF表达与caspase-3裂解的激活有关，caspase-3裂解的激活是通过免疫细胞化学分析(图4B)和免疫印迹分析(图4C)测定的。
实施例21 NP/TNF-NCs体内抗肿瘤活性
首先通过腹腔注射给药(IP)分析BALB/C小鼠对NP/TNF-NC的耐受性。数据表明，0.6和1.2mg/kg的单次NP/TNF-NC剂量耐受性良好，没有明显的体重减轻或其他明显的毒性迹象(图5)。相反，剂量为1.8mg/kg的NP/TNF-NC与第7天恢复时的体重减轻>10％有关(图5)。
基于这些数据，分析了NP/TNF-NC对已建立的埃利希乳腺肿瘤小鼠的作用。值得注意的是，以0.6和1.2mg/kg x 6的剂量多次给予NP/TNF-NC与抑制肿瘤生长有关(图6A)。此外，第50天可检测到肿瘤再生(图6B)。为了进行比较，还分析了肿瘤内(IT)给药的效果。当以0.6mg/kg x 6的剂量在肿瘤内给药NP/TNF NC时观察到生长抑制效应(图7A)。此外，观察到，将IT剂量增加到1.2mg/kg x 6可导致持续到第50天的肿瘤消退(图7A和图7B)。值得注意的是，没有证据表明与NP/TNF-NC治疗与器官毒性或血液化学异常相关(图8和表3和表4)。
表3治疗小鼠血样的血液学参数
表4治疗后的小鼠血样生化参数
此外，还进行了NP/TNF NC治疗的小鼠的肿瘤切片分析。与对照组相比，NP/TNF NC治疗组小鼠的肿瘤中发现凋亡体的存在增加(图9A)。此外，更重要的是，IP和IT给药NP/TNF-NC导致肿瘤溶解物中TNF表达显著增加，这与caspase-3的激活有关(图9B)。在不受任何特定理论或作用机制限制的情况下，本文设想NP/TNF-NC在全身或肿瘤内给药时可有效治疗埃利希乳腺肿瘤。
实施例22：聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物形成的聚合物纳 米颗粒的制备和表征(在PCT出版物WO2013/160773中也有描述)
聚乳酸(分子量～45000-72000g/mol)，PEG-PPG-PEG(表1)和组织培养试剂可从Sigma Aldrich(密苏里州圣路易斯)获得。除非另有说明，所有试剂均为分析级或以上，并在收到时使用。细胞系来自印度NCCS Pune。
聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇嵌段共聚物的制备
将平均分子量为60000g/mol的5gm聚乳酸(PLA)溶解于250ml圆底烧瓶中的100mlCH2Cl2(二氯甲烷)中。向该溶液中添加0.7g聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇聚合物(分子量范围为1100-12500Mn)。将溶液在0℃下搅拌10-12小时。在此反应混合物中，添加5ml 1％N,N-二环己基碳二酰胺(DCC)溶液，然后在-4℃至0℃/低温下缓慢添加5ml 0.1％4-二甲氨基吡啶(DMAP)。将反应混合物搅拌24小时，然后用二乙醚沉淀聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇嵌段共聚物，并用Whatman 1号滤纸过滤。如此获得的聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇嵌段共聚物沉淀物在低真空下干燥，并在2℃到8℃下储存，直到进一步使用。
聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇纳米颗粒的制备
采用乳液沉淀法制备了聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇纳米颗粒。将通过上述方法获得的100mg聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇共聚物分别溶解于有机溶剂中，例如乙腈、二甲基甲酰胺(DMF)或二氯甲烷，得到聚合物溶液。
通过将该聚合物溶液滴入20毫升蒸馏水的水相中制备纳米颗粒。将溶液在室温下磁搅拌10至12小时，以允许残留溶剂蒸发并稳定纳米颗粒。然后以25000转/分的速度离心10分钟收集纳米颗粒，并用蒸馏水洗涤三次。将纳米颗粒进一步冻干并在2℃至8℃下储存，直到进一步使用。
聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇嵌段共聚物的聚合物纳米颗粒的表征
如透射电子显微镜图像所示，通过上述方法获得的纳米颗粒的形状基本上是球形的。透射电镜图允许的粒径测定范围，约为30至120纳米。用动态光散射(DLS)仪测量了纳米颗粒的水动力半径，测量范围为110-120纳米。
利用不同分子量的嵌段共聚物、聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇获得了聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇纳米颗粒的核磁共振谱。在光谱中，化学位移约为5.1的质子代表聚乳酸的酯质子，化学位移约为3.5的质子代表PEG-PPG-PEG的醚质子。在光谱中两个质子的存在证实了聚乳酸与聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇的结合。
实施例23：四嵌段纳米颗粒中肽-pEGR-1-TNF DNA的制备与表征
制备了包含聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物并封装了肽-pEGR-1-TNF DNA的聚合物纳米颗粒，并对其进行了表征。表5显示了使用具有两种不同聚乳酸分子量的四嵌段纳米颗粒的纳米颗粒尺寸和聚分散指数数据。
非生理性pH7.4PBS缓冲液中TNF DNA释放曲线的比较表明，制备的每一个四嵌段纳米颗粒是DNA逐渐释放的有效载体(图10)。
采用两种不同的纳米粒对非生理性pH7.4PBS缓冲液中的TNF DNA释放情况进行了进一步的分析比较。具体地说，分析了从PLA 12kDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒和PLA 72kDa-PEG-PPG-PEG肽-TNF DNA纳米颗粒每日释放的TNF-DNA(图11)。与使用二嵌段(PLA-PEG)纳米颗粒(如实施例18中所述，100％的DNA释放在120小时或约5天内完成)每日释放的TNF-DNA相比，这里的数据表明，四嵌段(PLA-PEG-PPG-PEG)纳米颗粒在10天内释放了100％的TNF-DNA(见图10和11)，因此使用四嵌段纳米颗粒的DNA释放更为平缓。
表5：载有聚合物纳米颗粒的PDI和DNA的颗粒尺寸

Claims (35)

1.一种组合物，包含
a)聚合物纳米颗粒，其包含一种包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物；和
b)一种包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性或其一部分序列的氨基酸序列的TNF-α蛋白，或包含SEQ ID No:11的序列的分离核酸，或编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性或其一部分序列的氨基酸序列的TNF-α蛋白。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中聚合物纳米颗粒包含聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)二嵌段共聚物。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中聚合物纳米颗粒包含聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中PLA-PEG-PPG-PEG四嵌段共聚物由PEG-PPG-PEG三嵌段共聚物与PLA化学结合而成。
5.根据权利要求1～4中任一权利要求所述的组合物，其中聚乳酸之分子量在约10000道尔顿至约100000道尔顿之间。
6.根据权利要求1～5中任一权利要求所述的组合物，其中所述TNF-α蛋白或其部分，包含与SEQ ID No:9或SEQ ID No:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1～5中任一权利要求所述的组合物，其中所述分离核酸包含SEQ IDNo:11的序列，或所述分离核酸编码所述TNF-α蛋白或其一部分，所述TNF-α蛋白或其一部分包含与SEQ ID No:9或SEQ ID No:10具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任何一权利要求所述的组合物，进一步包含阳离子肽。
9.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含细胞穿透肽。
10.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含阳离子细胞穿透肽。
11.根据权利要求8-10中任一权利要求所述的组合物，其中所述肽包含选自SEQ IDNo:1、2、3、4、5、6、7、8和聚精氨酸的组的氨基酸序列。
12.根据权利要求1-7中任一权利要求所述的组合物，其进一步包含C-环化聚阳离子肽(SEQ ID NO:8)。
13.根据权利要求8-12中任一权利要求所述的组合物，其中所述细胞渗透肽或阳离子肽与所分离的核酸形成复合物。
14.根据权利要求1中所述的组合物，进一步包含化学治疗剂或选自由阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米的集合的靶向抗癌剂。
15.一种药物组合物，其包含
a)聚合物纳米颗粒，其包含一种包含聚乳酸(PLA)和聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物；和
b)一种包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性或其一部分序列的氨基酸序列的TNF-α蛋白，或包含SEQ ID No:11的序列的分离核酸，或编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性或其一部分序列相同的氨基酸序列的TNF-α蛋白，
用于治疗一种疾病，所述疾病选自包含癌症、自身免疫性疾病、炎症性疾病、代谢性紊乱、发育性紊乱、心血管疾病、肝病、肠道疾病、传染病、内分泌疾病和神经系统紊乱的组合。
16.根据权利要求1，2和5到15中任意一项所述的组合物，其中聚合物纳米颗粒基本由聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
17.根据权利要求1到15中任一权利要求所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
18.根据权利要求1-17中任一权利要求所述的组合物，其中所述聚合物纳米颗粒进一步包含附着于所述聚合物纳米颗粒外部的靶向部分，且其中所述靶向部分是一种抗体、肽或适配体。
19.一种聚合物纳米颗粒，基本上由聚乳酸-聚乙二醇-聚丙二醇-聚乙二醇四嵌段共聚物或聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物组成的聚合物形成，其中所述聚合物纳米颗粒装载有细胞因子或其一部分，或为细胞因子或其一部分编码的分离核酸。
20.根据权利要求19所述的聚合物纳米颗粒，其中所述细胞因子与SEQ ID No:9具有至少70％同源性。
21.根据权利要求19或20所述的聚合物纳米颗粒，其中分离的核酸与阳离子细胞穿透肽复合。
22.根据权利要求21所述的聚合物纳米颗粒，其中所述阳离子细胞穿透肽系选自由SEQID No:1、2、3、4、5、6、7、8及聚精氨酸组成之组。
23.根据权利要求1到22中任一权利要求所述的聚合物纳米颗粒，其中所述聚合物纳米颗粒包含如表5所述的四嵌段共聚物。
24.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，包括向受试者给予治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含
a)由包含聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物的聚合物形成的聚合物纳米颗粒；和
b)包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白，或编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸。
25.根据权利要求24中所述的方法，其中药物组合物进一步包含化学治疗剂或选自由阿霉素，柔红霉素，地西他滨，依立替康，SN-38，阿糖胞苷，多昔紫彬，雷公藤内酯，格尔德霉素，17-AAG，5-氟尿嘧啶，奥沙利铂卡铂，泰索帝(taxotere)，氨甲蝶呤，紫杉醇，茚并异喹啉，硼替佐米的组成的靶向抗癌剂。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中癌症是乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、转移性结肠癌、胰腺癌或血液学恶性肿瘤。
27.根据权利要求24-26中任一权利要求所述的方法，其中癌症包含PD-1难治愈的肿瘤。
28.一种诱导细胞中TNF表达的方法，包括使细胞与由包含聚乳酸-聚乙二醇二嵌段共聚物的聚合物形成的有效量的聚合物纳米颗粒接触；其中聚合物纳米颗粒包含编码包含与SEQ ID No:9具有至少70％同源性的氨基酸序列或其一部分的TNF-α蛋白的分离核酸。
29.根据权利要求24-28中任一权利要求中所述的方法，其中TNF-α蛋白或其一部分，包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
30.根据权利要求24-28中任一权利要求中所述的方法，其中分离核酸编码TNF-α蛋白或其一部分，所述TNF-α蛋白或其一部分包含与SEQ ID NO:9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同源性的氨基酸序列。
31.根据权利要求24-30中任一权利要求中所述的方法，其中所述的分离核酸与阳离子细胞穿透肽复合。
32.根据权利要求31所述的方法，其中阳离子细胞穿透肽选自由SEQ ID No:1,2,3,4,5,6,7,8和聚精氨酸组成的组。
33.根据权利要求24-32中任一权利要求所述的方法，其中聚合物纳米颗粒基本由聚乳酸-聚乙二醇(PLA-PEG)二嵌段共聚物组成的聚合物形成。
34.根据权利要求24-32中任一权利要求所述的方法，其中所述聚合物纳米颗粒基本上由聚(乳酸)-聚(乙二醇)-聚(丙二醇)-聚(乙二醇)(PLA-PEG-PPG-PEG)四嵌段共聚物组成的聚合物形成。
35.根据权利要求34中所述的方法，其中所述聚合物纳米颗粒包含如表5所述的四嵌段共聚物。
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