JP2019537600A - ポリマーナノ粒子 - Google Patents

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Abstract

本発明は、サイトカインまたはサイトカインをコードする核酸を含むポリマーナノ粒子、それを含む医薬組成物、ならびに、ある特定の疾患を治療する方法であって、これらのポリマーナノ粒子をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。本発明の一態様は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分とを含む組成物を提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１１月２日に出願された米国仮出願番号第６２／４１６，５７４号の利益を主張しており、その内容は、その全体が本明細書中に援用される。
分野
本発明は、ナノテクノロジーの分野、特に、治療剤の送達のための生分解性ポリマーナノ粒子の使用に関する。
背景
がんは最も破壊的な疾患の１つであり、それは各種の遺伝子変化および細胞異常を伴う。この複雑性および異質性は、患者において顕著な羅病率および死亡率をもたらすがん細胞の急激な増殖を促進する（Das, M.ら（２００９年）Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opin. Drug Deliv.、６巻、２８５〜３０４頁、Mohanty, C.ら（２０１１年）Receptor mediated tumor targeting: an emerging approach for cancer therapy. Curr. Drug Deliv.８巻、４５〜５８頁）。
免疫療法アプローチ、特にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断は、ある特定のヒトがんの治療を改善し、免疫破壊の回避ががん進行に重要であるという根拠を裏付けている。しかしながら、多くのがんは、少なくとも一部では、炎症誘発性の腫瘍微小環境の抑制により、免疫療法に応答しない。
様々ながんの特徴は、免疫破壊を回避する能力である（Hanahan D.ら、２０１１年、Cell、１４４巻、５号、６４６〜６７４頁）。実際、がんに、しばしば、腫瘍抗原の認識において効果がない免疫細胞が浸潤し、次に腫瘍形成性の微小環境を促進するために利用される（Balkwell F．ら、２００５年、Cancer Cell、７巻（３号）、２１１〜２１７頁）。しかしながら、興味深いことに、「熱い」腫瘍と呼ばれるものにおける免疫細胞浸潤物の存在は、細胞毒性剤、抗腫瘍ワクチンおよび免疫チェックポイント阻害剤に対する応答性の改善と関連する（Topalian S．ら、２０１５年、Cancer Cell、（４巻）、４５０〜４６１頁）。これらの知見は、がん細胞の認識および破壊に効果的である免疫浸潤物を有する「熱い」および「冷たい」腫瘍の微小環境を再プログラムすることの潜在的重要性を強調するものであった。
ＴＮＦは、腫瘍の壊死を誘導するエンドトキシン誘導因子として発見された（Carswell E.A.ら、PNAS、１９７５年、Proc. Nat. Acad. Sci.、７２巻、９号、３６６６〜３６７０頁）。それ以来、ＴＮＦは、それが炎症誘発性応答、細胞分化および細胞死を調節するという知見に一部基づき、最も精力的に研究されたサイトカインの１つである（Brenner D．ら、２０１５年、Nat. Rev. Immunol.１５巻、３６２〜３７４頁）。更に、抗がん剤としての組換えヒトＴＮＦの有効性が試験されているが、一部の研究者は、熱、疲労および低血圧などの全身性の副作用を見出し、その更なる開発が断念された（Spriggs D.R.ら、１９８８年、J Natl Cancer Inst、８０巻（１３号）、１０３９〜１０４４頁、Sherman M.L.ら、１９８８年、JCO、２月、６巻、２号、３４４〜３５０頁）。
全身性の毒性を改善する方法として、ＴＮＦは欧州において、局所的に進行した極度軟部組織肉腫の患者の治療において、分離式肢灌流による投与が承認されている（Jakob J.ら、２０１６年、Cancer、doi: 10.1002/cncr.29991）。ＴＮＦの臨床開発のために試みられた別のアプローチは、放射線および化学物質誘導性プロモーター（ＴＮＦｅｒａｄｅ）の制御下のＴＮＦをコードするアデノウイルスベクターの腫瘍内送達を含んだ（Hallahan D．ら、１９９５年、Nature Medicine、１巻、７８６〜７９１頁）。放射線治療と組み合わせたＴＮＦｅｒａｄｅの初期試験において、転移性黒色腫、軟部組織肉腫および局所的に進行した食道がんの患者において、顕著な臨床活性が観察された（Weichselbaum R．ら、２００９年、Cancer Gene Therapy、１６巻、６０９〜６１９頁、doi:10.1038/cgt.2009.37）。抗腫瘍活性はまた、膵、直腸、および頭頚部がんを有する患者においても観察された（同書）。しかしながら、局所的に進行した膵がんを有する患者におけるＴＮＦｅｒａｄｅの第３相試験は、生存ベネフィットを証明することができず（Herman J．M．ら、２０１３年、JCO、３１巻、７号、８８６〜８９４頁）、スポンサーはこの薬剤の開発を中止した。
ＴＮＦは、ヒトがん治療のための有効な薬剤であるが、全身性の副作用を制限する方法で、ＴＮＦの抗腫瘍活性を利用するための更なるアプローチを開発する必要がある。
Das, M.ら（２００９年）Ligand-based targeted therapy for cancer tissue. Expert Opin. Drug Deliv.、６巻、２８５〜３０４頁 Mohanty, C.ら（２０１１年）Receptor mediated tumor targeting: an emerging approach for cancer therapy. Curr. Drug Deliv.８巻、４５〜５８頁 Hanahan D.ら、２０１１年、Cell、１４４巻、５号、６４６〜６７４頁 Balkwell F．ら、２００５年、Cancer Cell、７巻（３号）、２１１〜２１７頁Topalian S．ら、２０１５年、Cancer Cell、（４巻）、４５０〜４６１頁 Carswell E.A.ら、PNAS、１９７５年、Proc. Nat. Acad. Sci.、７２巻、９号、３６６６〜３６７０頁 Brenner D．ら、２０１５年、Nat. Rev. Immunol.１５巻、３６２〜３７４頁 Spriggs D.R.ら、１９８８年、J Natl Cancer Inst、８０巻（１３号）、１０３９〜１０４４頁 Sherman M.L.ら、１９８８年、JCO、２月、６巻、２号、３４４〜３５０頁 Jakob J.ら、２０１６年、Cancer、doi: 10.1002/cncr.29991 Hallahan D．ら、１９９５年、Nature Medicine、１巻、７８６〜７９１頁 Weichselbaum R．ら、２００９年、Cancer Gene Therapy、１６巻、６０９〜６１９頁、doi:10.1038/cgt.2009.37 Herman J．M．ら、２０１３年、JCO、３１巻、７号、８８６〜８９４頁
要旨
本発明の一態様は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分とを含む組成物を提供する。様々な実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号９またはその部分の配列と少なくとも７０％〜９９％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列、または、配列番号１０もしくはその部分の配列と少なくとも５０％〜９９％（例えば少なくとも７０％）同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明の一態様は、ＰＬＡおよびＰＥＧを含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、配列番号１１の配列を含む単離された核酸またはその部分とを含む組成物を提供する。様々な実施形態では、単離された核酸は、配列番号１１またはその部分の配列と少なくとも７０〜９９％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、単離された核酸の配列は、配列番号９または配列番号１０の配列をコードする。
組成物の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーを含む。
組成物の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含む。
組成物の様々な実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーのＰＬＡとのコンジュゲーションから形成される。例えば、コンジュゲーションは化学的コンジュゲーションである。
組成物の様々な実施形態では、ＰＬＡの分子量は、約１０，０００〜約１００，０００ダルトンである。例えば、ＰＬＡの分子量は、約１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００ダルトンである。更なる実施形態では、ＰＬＡの分子量は、約１２，０００ダルトン（すなわち１２ｋＤＡ）または約７２，０００ダルトン（すなわち７２ｋＤＡ）である。
組成物の様々な実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号９またはその部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。様々な実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号１０またはその部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
組成物の様々な実施形態では、単離された核酸は、配列番号１１またはその部分の配列を含む。組成物の様々な実施形態では、単離された核酸は、配列番号９またはその部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。組成物の様々な実施形態では、単離された核酸は、配列番号１０またはその部分と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。
様々な実施形態では、組成物はカチオン性ペプチドを更に含む。様々な実施形態では、組成物は細胞透過性ペプチドを更に含む。様々な実施形態では、組成物はカチオン性の細胞透過性ペプチドを更に含む。様々な実施形態では、ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。例えば、ポリアルギニンは、少なくとも約２〜２０個のアルギニンを含む。様々な実施形態では、ポリアルギニンは、少なくとも約２、５、７または９個のアルギニンを含む。
様々な実施形態では、組成物はＣ環化されたポリカチオン性ペプチドを更に含む。例えば、Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチドは、配列番号８またはその部分のアミノ酸配列を含む。
組成物の様々な実施形態では、細胞透過性またはカチオン性ペプチドおよび単離された核酸は、複合体化される。
様々な実施形態では、組成物は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリン、ボルテゾミブ、およびそれらの組合せからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む。
本発明の一態様は、がん、自己免疫性疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経障害からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号１１の配列を含むかもしくは配列番号９もしくは１０の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸とを含む医薬組成物を提供する。
組成物の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
組成物の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、表５に記載されるテトラブロックコポリマーを含む。
組成物の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリマーナノ粒子の外側に付着した標的化部分を更に含み、標的化部分は、抗体、ペプチドまたはアプタマーである。様々な実施形態では、標的化部分は、免疫グロブリン分子、ｓｃＦｖ、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖおよびジスルフィド結合したＦｖを含む。
本発明の一態様は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーまたはＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成されたポリマーナノ粒子であって、サイトカインもしくはその部分、またはサイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸を負荷しているポリマーナノ粒子を提供する。
本発明の様々な実施形態では、サイトカインは、配列番号９またはその部分の配列と少なくとも７０％同一である。本発明の様々な実施形態では、サイトカインは、配列番号１０またはその部分の配列と少なくとも７０％同一である。方法の様々な実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号９または配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
様々な実施形態では、単離された核酸は、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される。例えば、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される。
本発明の一態様は、それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、対象に、
ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成されたポリマーナノ粒子と、
ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。例えば、単離された核酸は、配列番号１１の核酸配列を含む。
方法の様々な実施形態では、医薬組成物は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリン、ボルテゾミブおよびそれらの組合せからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む。
方法の様々な実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、転移性結腸がん、膵がんまたは血液悪性腫瘍である。例えば、がんは、ＰＤ−１不応性腫瘍を含む。
方法の様々な実施形態では、アミノ酸配列は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一である。
本発明の一態様は、細胞においてＴＮＦ発現を誘導する方法であって、細胞を、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成された有効量のポリマーナノ粒子と接触させることを含み、ポリマーナノ粒子が、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする単離された核酸を含む、方法を提供する。例えば、単離された核酸は、配列番号１１の核酸配列を含む。
方法の様々な実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
方法の様々な実施形態では、単離された核酸は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。
方法の様々な実施形態では、単離された核酸は、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される。例えば、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される。
方法の様々な実施形態では、ナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
方法の様々な実施形態では、ナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。方法の様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、表５に見出されるテトラブロックコポリマーを含む。
本明細書において提供される方法の様々な実施形態では、ＰＬＡの分子量は、約１０，０００〜約１００，０００ダルトンである。例えば、ＰＬＡの分子量は、約１０，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００または１００，０００ダルトンである。更なる実施形態では、ＰＬＡの分子量は、約１２，０００ダルトン（すなわち１２ｋＤＡ）または約７２，０００ダルトン（すなわち７２ｋＤＡ）である。
本明細書において提供される組成物または方法のいずれかの様々な実施形態では、ナノ粒子は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーと、ＴＮＦ−αタンパク質またはＴＮＦ−αタンパク質をコードする単離された核酸とから形成される。一実施形態では、ナノ粒子は、一定の期間にわたりタンパク質または単離された核酸を放出する。更なる実施形態では、一定の期間は少なくとも１日〜２０日である。方法の様々な実施形態では、一定の期間は約５日〜１０日である。
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の態様を更に例示するために含まれる。
図１（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は、本明細書に記載されるナノ複合体およびナノ粒子を特徴付ける一組の顕微鏡写真およびグラフである。図１Ａは、異なるナノ粒子の流体力学的直径（ナノメートル；ｎｍ）を示す表である。各ナノ粒子の流体力学的直径を、非生理的緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定した。図１Ｂは、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体およびナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。画像化したナノ粒子は、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）、負荷していないポリマーナノ粒子（ＮＰ）、ｐＤＮＡを負荷したポリマーナノ粒子（ＰＤＮＰ）およびＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＰＰＤ−ＮＰ）を含む。スケールは１００ｎｍである。図１Ｃは、血清と共に添加した時のナノ粒子の流体力学的直径を示す一組のグラフである。流体力学的直径をＤＬＳ（ｎｍ）によって決定した。図１Ｄは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のナノ粒子の放出動態を示すグラフである。グラフは、時単位の経時的な（横軸：ｈｒｓ）、ｐＤＮＡを負荷したポリマーナノ粒子（ＰＤＮＰ）およびＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＰＰＤ−ＮＰ）の、放出されたＤＮＡの蛍光パーセント（縦軸）を示す。 図１（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）は、本明細書に記載されるナノ複合体およびナノ粒子を特徴付ける一組の顕微鏡写真およびグラフである。図１Ａは、異なるナノ粒子の流体力学的直径（ナノメートル；ｎｍ）を示す表である。各ナノ粒子の流体力学的直径を、非生理的緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中の動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して決定した。図１Ｂは、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体およびナノ粒子の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像である。画像化したナノ粒子は、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）、負荷していないポリマーナノ粒子（ＮＰ）、ｐＤＮＡを負荷したポリマーナノ粒子（ＰＤＮＰ）およびＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＰＰＤ−ＮＰ）を含む。スケールは１００ｎｍである。図１Ｃは、血清と共に添加した時のナノ粒子の流体力学的直径を示す一組のグラフである。流体力学的直径をＤＬＳ（ｎｍ）によって決定した。図１Ｄは、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のナノ粒子の放出動態を示すグラフである。グラフは、時単位の経時的な（横軸：ｈｒｓ）、ｐＤＮＡを負荷したポリマーナノ粒子（ＰＤＮＰ）およびＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＰＰＤ−ＮＰ）の、放出されたＤＮＡの蛍光パーセント（縦軸）を示す。
図２（Ａ、ＢおよびＣ）は、経時的なＮＣ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰ ＮＰの有効性および毒性を示す。図２Ａは、１０％の血清の存在下でのＮＣ−ＧＦＰ（カラムＡ）、ＰＤ−ＧＦＰ（カラムＢ）およびＰＰＤ−ＧＦＰ（カラムＣ）によるトランスフェクション後のＭＣＦ−７細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示すグラフである。ＧＦＰを発現している細胞のパーセンテージ（縦軸）を、数日にわたり（横軸）分析した。ＮＣ−ＧＦＰ、ＰＤ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰのＧＦＰの動態的発現パターンを６日間調べた。図２Ｂは、ＰＰＤ−ＧＦＰナノ粒子で処理したＭＣＦ−７細胞の、経時的な（すなわち２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後の）ＧＦＰ発現パターンの定性分析を示す一組の顕微鏡写真である。図２Ｃは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）のみで処理した細胞の細胞毒性と比較した、ＮＣ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰによるトランスフェクション後のＭＣＦ−７細胞の細胞毒性を経時的に分析したグラフである。グラフは、ＮＣ−ＧＦＰ（カラムＢ）、ＰＰＤ−ＧＦＰ／ＮＰ（カラムＣ）およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ（カラムＤ）でトランスフェクションした後の生存細胞のパーセント（縦軸）を示す。非トランスフェクト細胞のデータをカラムＡに示す。 図２（Ａ、ＢおよびＣ）は、経時的なＮＣ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰ ＮＰの有効性および毒性を示す。図２Ａは、１０％の血清の存在下でのＮＣ−ＧＦＰ（カラムＡ）、ＰＤ−ＧＦＰ（カラムＢ）およびＰＰＤ−ＧＦＰ（カラムＣ）によるトランスフェクション後のＭＣＦ−７細胞における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示すグラフである。ＧＦＰを発現している細胞のパーセンテージ（縦軸）を、数日にわたり（横軸）分析した。ＮＣ−ＧＦＰ、ＰＤ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰのＧＦＰの動態的発現パターンを６日間調べた。図２Ｂは、ＰＰＤ−ＧＦＰナノ粒子で処理したＭＣＦ−７細胞の、経時的な（すなわち２４時間、４８時間、７２時間および９６時間後の）ＧＦＰ発現パターンの定性分析を示す一組の顕微鏡写真である。図２Ｃは、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）のみで処理した細胞の細胞毒性と比較した、ＮＣ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰによるトランスフェクション後のＭＣＦ−７細胞の細胞毒性を経時的に分析したグラフである。グラフは、ＮＣ−ＧＦＰ（カラムＢ）、ＰＰＤ−ＧＦＰ／ＮＰ（カラムＣ）およびｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅのみ（カラムＤ）でトランスフェクションした後の生存細胞のパーセント（縦軸）を示す。非トランスフェクト細胞のデータをカラムＡに示す。
図３（Ａ、ＢおよびＣ）は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞における抗腫瘍タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥ４２５−ＴＮＦα）の生成、発現および機能的効果を示す。図３Ａは、プラスミドＤＮＡおよびカチオン性ペプチドが静電的に相互作用してナノ複合体化されることを示す図である。得られるナノ複合体は不安定となり、血清と相互作用すると凝集する。図３Ｂは、ＰＬＡ−ＰＥＧブロックコポリマーによる図３Ａの複合体のナノ粒子封入により、血清中で安定なカチオン性ペプチド−プラスミドＤＮＡナノ粒子が形成されることを示す図である。図３Ｃは、ＰＰＤ−ＧＦＰ／ＮＰまたはＰＰＤ−ＴＮＦ−α処理の２４、４８、７２および９６時間後における細胞生存率パーセント（縦軸）を示すグラフである。対照細胞にはトランスフェクトしなかった。
図４（Ａ、ＢおよびＣ）は、ＭＣＦ−７細胞における抗腫瘍タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥ４２５−ＴＮＦα）の発現および機能的効果を示す。図４Ａは、ＰＰＤ−ＴＮＦ−α処理した細胞における、経時的な（横軸）アネキシンＶ陽性ＭＣＦ−７細胞のパーセンテージ（縦軸）を示すグラフである。データは、２４、４８および７２時間後におけるアポトーシスＭＣＦ−７細胞のアネキシンＶ染色を示す。図４Ｂは、ＰＰＤ−ＴＮＦα／ＮＰでＭＣＦ−７細胞を処理した後、２４時間、４８時間および７２時間の異なる時間間隔における、ＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３の免疫細胞化学分析を示す一組の顕微鏡写真である。図４Ｃは、ＴＮＦ−αｐＤＮＡを封入したＮＣ−ＴＮＦαおよびＰＰＤ−ＴＮＦ−αによりトランスフェクトしたＴＮＦ−α発現ＭＣＦ−７細胞において発現されたカスパーゼ−３タンパク質のウエスタンブロットの写真である。免疫染色画像は、２４時間、４８時間および７２時間後の、ＰＰＤ−ＴＮＦαをトランスフェクトした細胞におけるＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３の存在を示す。 図４（Ａ、ＢおよびＣ）は、ＭＣＦ−７細胞における抗腫瘍タンパク質をコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥ４２５−ＴＮＦα）の発現および機能的効果を示す。図４Ａは、ＰＰＤ−ＴＮＦ−α処理した細胞における、経時的な（横軸）アネキシンＶ陽性ＭＣＦ−７細胞のパーセンテージ（縦軸）を示すグラフである。データは、２４、４８および７２時間後におけるアポトーシスＭＣＦ−７細胞のアネキシンＶ染色を示す。図４Ｂは、ＰＰＤ−ＴＮＦα／ＮＰでＭＣＦ−７細胞を処理した後、２４時間、４８時間および７２時間の異なる時間間隔における、ＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３の免疫細胞化学分析を示す一組の顕微鏡写真である。図４Ｃは、ＴＮＦ−αｐＤＮＡを封入したＮＣ−ＴＮＦαおよびＰＰＤ−ＴＮＦ−αによりトランスフェクトしたＴＮＦ−α発現ＭＣＦ−７細胞において発現されたカスパーゼ−３タンパク質のウエスタンブロットの写真である。免疫染色画像は、２４時間、４８時間および７２時間後の、ＰＰＤ−ＴＮＦαをトランスフェクトした細胞におけるＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３の存在を示す。
図５は、異なるｐＤＮＡ−ＴＮＦ−α濃度（０．６ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇまたは２．４ｍｇ／ｋｇ）のＰＰＤ−ＴＮＦ−αナノ粒子の単回用量を腹腔内投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの群（群当たり５匹のマウス）の体重変化パーセント（縦軸）を示すグラフである。
図６（ＡおよびＢ）は、ＥＡＴを担持する同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに対する、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ−ＴＮＦα）、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ−ＴＮＦα）およびＰＬＡ−ＰＥＧ−ペプチド−ｐＤＮＡナノ粒子（ＰＰＤ−ＴＮＦα）による処理後の、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍後退効果を示す。５０ｍｍ３の初期腫瘍体積を有する腫瘍担持マウスに、生理食塩水（対照）、ｐＤＮＡ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＮＣ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを０．６ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇで、１、５、９、１３、１７、２１日目に腹腔内投与した。各データポイントは、平均腫瘍サイズ±ＳＥＭ（ｎ＝６）を表す。図６Ａは、異なるナノ粒子、すなわちペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ−ＴＮＦα）、ｐＤＮＡ−ＴＮＦα−ｐＤＮＡ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦα＿ａ−ＰＰＤ−ＴＮＦαを０．６ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）、およびＰＰＤ−ＴＮＦα＿ｂ−ＰＰＤ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ（ＩＰ）を腹腔内投与したＢＡＬＢ−Ｃマウスの、経時的な（横軸）腫瘍サイズ（縦軸）を示すグラフである。図６Ｂは、異なるナノ粒子を腹腔内投与された図６ＡのＢＡＬＢ−Ｃマウスの、経時的な腫瘍サイズ（縦軸）を示す拡大グラフを示す。
図７（ＡおよびＢ）は、ＥＡＴを担持する同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ−ＴＮＦα）、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ−ＴＮＦα）およびＰＬＡ−ＰＥＧ−ペプチド−ｐＤＮＡナノ粒子（ＰＰＤ−ＴＮＦα）を腫瘍内投与したＢＡＬＢ−Ｃマウスの腫瘍サイズおよび腫瘍体積を示す。５０ｍｍ３の初期腫瘍体積を有する腫瘍担持マウスに、生理食塩水（対照）、ｐＤＮＡ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＮＣ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを０．６ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇを、１、５、９、１３、１７、２１日目に腹腔内投与した。各データポイントは、平均腫瘍サイズ±ＳＥＭ（ｎ＝６）を表す。図７Ａは、異なるナノ粒子を腫瘍内投与されたＢＡＬＢ−Ｃマウスの、経時的な（横軸）腫瘍サイズ（縦軸）を示すグラフである。図７Ｂは、異なるナノ粒子を腫瘍内投与された図７ＡのＢＡＬＢ−Ｃマウスの、経時的な腫瘍体積（縦軸）を示すグラフである。
図８は、本明細書において記載されているプラスミド、ナノ複合体またはナノ粒子を腹腔内または腫瘍内投与したマウス対象からのヘマトキシリン−エオジン腫瘍組織の一組の顕微鏡写真である。
図９Ａは、最終ＩＰ注射またはＩＴ注射から３日目にｐＤＮＡ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＮＣ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを０．６ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ用いて処理した、切除された腫瘍組織における、ＴＮＦαおよびカスパーゼ−３タンパク質の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析を示すグラフである。図９Ｂは、ｐＤＮＡ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＮＣ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ、ＰＰＤ−ＴＮＦαを０．６ｍｇ／ｋｇおよびＰＰＤ−ＴＮＦαを１．２ｍｇ／ｋｇ用いて処理し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色した腫瘍組織の一組の高倍率顕微鏡写真である。点線円で示される対照の完全な核（左から５列目）と比較し、点線円で示される、ＩＴ注射によりＰＰＤ−ＴＮＦα １．２ｍｇ／ｋｇで処理した腫瘍（左下行から４列目）において、いくつかのアポトーシス小体を伴う断片化した核が見られた。
図１０は、非生理的緩衝液（ＰＢＳ、ｐｈ７．４）におけるＴＮＦのＤＮＡ放出プロファイルの比較を示す折れ線グラフである。遊離ＤＮＡのみ、ＰＬＡ １２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＴＮＦ−ＤＮＡナノ粒子、ＰＬＡ １２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子、ＰＬＡ ７２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子およびＰＬＡ ７２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子について、放出されたＤＮＡの蛍光パーセント（縦軸）を、時間（日、横軸）の関数として示す。
図１１は、非生理的緩衝液（ＰＢＳ、ｐｈ７．４）におけるＴＮＦのＤＮＡ放出プロファイルの比較を示す折れ線グラフである。ＰＬＡ １２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子およびＰＬＡ ７２ＫＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子の２つの異なるナノ粒子について、放出されたＤＮＡの蛍光パーセント（縦軸）を時間の関数として示す。
詳細な説明
本明細書では、腫瘍細胞における炎症性サイトカインの発現を亢進するのに使用するための、二重ナノ粒子または二重ナノ粒子（ＤＮＰ）システムが提供される。ＤＮＰシステムは、小型のカチオン性ナノ複合体を囲むジブロックポリマーＮＰからなる。データは、ポリマーＮＰが腫瘍細胞内でカチオン性ナノ複合体を放出したことを示す。次に、カチオン性ナノ複合体は核に入り、外因性遺伝子、例えばサイトカインを発現する遺伝子の発現を誘導した。様々な実施形態では、ＴＮＦを、多面的な炎症性および抗がん活性に基づいて使用した。実施例は、ＤＮＰシステムが腫瘍細胞においてＴＮＦなどのサイトカインの発現を亢進するのに極めて有効であったことを示す。データは、マウスモデルにおいてＤＮＰが腫瘍のアポトーシスを誘導する活性を有したことを示す。これらのＤＮＰは、炎症性サイトカインの選択的な発現により抗腫瘍免疫を促進できた。まとめると、データは、このアプローチが、毒性を与えずに抗腫瘍活性を付与するのに極めて有効であることを証明する。実施例は、このＤＮＰシステムが免疫認識および破壊を促進するサイトカインに広く適用できることを更に示す。
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて増殖する腫瘍内で外因性遺伝子を発現させる治療ストラテジーは、有効な送達システムがないため、実質的に縮小した（Yin H.ら、２０１４年、Nature Rev. Genetics、１５巻、５４１〜５５５頁、Amer M.H.、２０１４年、Mol Cell Ther. ２０１４年、２巻、２７号、１〜１９頁、Collins M.ら、２０１５年、Proc. Biol. Sci.、２２、２８２巻（１８２１号）、20143003. doi: 10.1098/rspb.2014.3003）。大きな課題の１つは、充分なレベルでカチオン性ＤＮＡ複合体を腫瘍細胞に送達し、腫瘍の表現型に顕著な影響を及ぼすことであった（Kircheis R．ら、２００２年、Cancer Gene Ther．、９巻（８号）、６７３〜６８０頁）。この障壁にある程度対処するため、腫瘍細胞へのペプチドカーゴの全身性送達のための、高分子量ＰＬＡを有する新規なポリマーＮＰが開発された。（Kumar M.ら、２０１４年、２０１４巻（２０１４年）、論文ＩＤ９３９３７８、全１２頁、Hasegawa M．ら、２０１５年、Clin Cancer Res．２１巻（１０号）、２３３８〜２３４７頁、doi：10.1158/1078-0432.CCR-14-3000. Ｅｐｕｂ２０１５年２月２３日）。更に、有効なＤＮＡ送達のために、ＤＮＡの凝縮を維持し、エンドソーム回避特性を付与し、核移行を方向付ける直鎖状の短いヒスチジンおよびシステイン変性アルギニン（ＨＣＲ）ペプチドが開発された（Mann A．ら、２０１４年、Mol．Pharmaceutics、１１巻（３号）、６８３〜６９６頁）。
本明細書の実施例は、新規なＨＣＲペプチドを使用して、カチオン性ペプチド−ＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）の生成に成功できたことを証明する。更に、これらの約８０ｎｍのＮＣを約２００ｎｍのポリマーＮＰに封入して、血漿中でのＮＣの分解を回避することに成功した。血漿中でのナノ粒子の分解は、遺伝子送達システムにおいて大きなハードルであった（Yin Hら、２０１４年、Nature Reviews Genetics、１５巻、５４１〜５５５頁、Amer M.H.、２０１４年、Mol Cell Ther. ２０１４年、２巻、２７号、１〜１９頁、ら、２０１５年、Proc. Biol. Sci.、２２、２８２巻（１８２１号）、20143003. doi: 10.1098/rspb.2014.3003）。
本明細書の実施例において、遺伝子送達のための「ナノ粒子中のナノ粒子」または二重ＮＰシステムを利用した。このシステムの有効性を評価する際、ＮＰ／ＮＣを、プロトタイプモデルとして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を取り込ませて生成した。実際、データは、ＮＰ／ＧＦＰ−ＮＣによるＭＣＦ−７細胞の処理がＧＦＰ発現と関連することを示し、ＨＣＲペプチド−ＤＮＡ ＮＣが、外因性ＧＦＰ遺伝子を駆動させるのに機能することを示している。２５００ｎｍのシリカ微粒子へのポリマー−ドキソルビシンＮＰ（約８０ｎｍ）の封入が、腫瘍へのドキソルビシンの送達に利用されている（Xu R．ら、２０１６年、Nature Biotechnology、３４巻、４１４〜４１８頁）。したがって、この「ナノ粒子中のナノ粒子」は、約２００ｎｍのＮＰ／ＮＣより大きく、腫瘍細胞へのＤＮＡならびにある特定の抗がん剤の送達のための二重ＮＰの可能性を提供する。
ＤＮＡベクターの送達のための別の障壁は、しばしば、顕著な治療的インパクトを与えるために腫瘍細胞集団への高いトランスフェクションまたは形質導入効率を達成する必要性である。この障壁は、分泌タンパク質の発現によって回避することができ、腫瘍微小環境を再プログラムすることに特に適用できる。これに関連して、ＴＮＦは、免疫監視を促進し、がん細胞を直接殺す多面的サイトカインである（Brenner D．ら、２０１５年、Nature Reviews Immunology、１５巻、３６２〜３７４頁）。抗腫瘍剤としてのＴＮＦの有望性にもかかわらず、このサイトカインの臨床開発は、肉腫に対する分離式肢灌流の設定を除き、全身性のＴＮＦ誘導毒性により不可能になった（Jakob J.ら、２０１６年、Cancer、doi: 10.1002/cncr.29991）。しかしながら、ＴＮＦｅｒａｄｅの腫瘍内投与が多様なヒトがんの治療において活性を有するという知見は注目に値し（Weichselbaum R．ら、２００９年、Cancer Gene Therapy、１６巻、６０９〜６１９頁）、腫瘍へのＴＮＦの送達システムが、全身性の毒性を回避しつつ、有効な抗がん治療であり得るという根拠を裏付けるものである。したがって、ｐＥ４２５−ＴＮＦベクターを発現する二重ＮＰ／ＮＣが構築された。ｐＥ４２５プロモーターは、放射線および化学療法（同書）に対する腫瘍細胞の応答の際、ＲＯＳによって活性化される。加えて、ｐＥ４２５プロモーターは、ＲＯＳレベルの増加によりがん細胞において選択的に活性化され（Gorrini C．ら、２０１３年、Nat Rev Drug Discov．１２月、１２巻（１２号）９３１〜９４７頁）、ＴＮＦの産生が自己誘導プロセスにおいてＲＯＳ産生を更に亢進する（Blaser H、２０１６年、Trends Cell Biol、２６巻（４号）、２４９〜２６１頁）。したがって、ｐＥ４２５−ＴＮＦベクターは、腫瘍におけるＴＮＦの誘導に特に適している。エールリッヒ胸部腫瘍の全身性ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ治療は、ＴＮＦの産生、アポトーシスの誘導および増殖の阻害に関連する。興味深いことに、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣが腫瘍内に投与されるときに同様の効果が観察され、この二重ＮＰシステムを腫瘍に全身的に、または直接供給できることを示している。更に重要なことに、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣは、あったとしてもごくわずかな全身性毒性を誘導した。
本明細書で報告される二重ＮＰ／ＮＣシステムは、がん治療に対するある特定の潜在的な利点を有する。例えば、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣは、放射線および／または化学療法と組み合わせて全身的に、または局所的に投与することができる（Weichselbaum R．ら、２００９年、Cancer Gene Therapy、１６巻、６０９〜６１９頁）。更に、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣによる腫瘍の治療は、免疫微小環境を再プログラムするために使用できる。このようにして、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣは、「冷たい」腫瘍を「熱い」腫瘍に変換することができ、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせることができる。この二重ＮＰシステムは、ｐＥ４２５プロモーターの制御下でＩＬ−１２等などのサイトカインをコードする遺伝子を組み込むことにより、腫瘍において免疫監視を再プログラムすることにも使用できる。
本開示は、サイトカイン（例えばＴＮＦ）を負荷しているナノ粒子（本明細書において「ＮＰ」とも称する）を含む組成物を提供する。ＴＮＦは、腫瘍細胞の壊死に関与する。ＴＮＦタンパク質の活性の阻害は、がん細胞の生存および増殖を減少させる。がん細胞の細胞内空間へのＴＮＦなどのサイトカインの送達は、ＮＰにより促進される。したがって、本開示は、腫瘍壊死を誘導するペプチドまたはポリヌクレオチドを負荷しているＮＰを含む組成物を投与することによって、がんなどの疾患を治療する方法を提供する。組成物を製造する方法も提供される。
ナノ粒子（本明細書において「ＮＰ」とも称される）は、ナノカプセルまたはナノ球体として製造することができる。ナノ粒子へのタンパク質負荷は、吸着プロセスまたは封入プロセスにより実施できる（Spadaら、２０１１年、Protein delivery of polymeric nanoparticles、World Academy of Science, Engineering and Technology、７６巻）。ナノ粒子は、受動的および能動的な標的化ストラテジーを使用することにより、正常細胞における毒性を回避しながらがん細胞内の薬物の細胞内濃度を増加させることができる。ナノ粒子が特定の受容体に結合して、細胞内に入るとき、それらは通常、受容体媒介性のエンドサイトーシスを介してエンドソームにより封入され、それにより、主要な薬物耐性機構の１つであるＰ糖タンパク質の認識を回避する（Choら、２００８年、Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer、Clin. Cancer Res.、２００８年、１４巻、１３１０〜１３１６頁）。ナノ粒子は、オプソニン化および食作用により体内から除去される（Sosnikら、２００８年、Polymeric Nanocarriers: New Endeavors for the Optimization of the Technological Aspects of Drugs; Recent Patents on Biomedical Engineering、１巻、４３〜５９頁）。ナノ担体ベースのシステムは、有効な薬剤送達に使用することができ、細胞内透過、局所的送達、早期分解からの薬物の保護、制御された薬物動態学的および薬物生体内分布プロファイル、低い必要用量および対費用効果の改善という利点が得られる（Farokhzad OCら、Targeted nanoparticle-aptamer bioconjugates for cancer chemotherapy in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA、２００６年、１０３巻（１６号）、６３１５〜２０頁、Fonseca Cら、Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles: preparation, physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity. J. Controlled Release、２００２年、８３巻（２号）、２７３〜８６頁、Hoodら、Nanomedicine、２０１１年、６巻（７号）、１２５７〜１２７２頁）。
ナノ粒子の取り込みは、それらの寸法の小ささに間接的に比例する。ポリマーナノ粒子は、それらが小型サイズであるため、細網内皮系（ＲＥＳ）による認識および取り込みを回避することが見出されており、したがって、長期間血液中を循環することができる（Borchardら、１９９６年、Pharm. Res. ７巻、１０５５〜１０５８頁）。ナノ粒子は、固体腫瘍の漏出しやすい脈管系などの病理学的部位において血管外遊出することもでき、受動的な標的化機構を提供する。表面積が大きいほど可溶化速度が速くなるため、ナノサイズの構造は、通常、より高い血漿中濃度および曲線下面積（ＡＵＣ）値を示す。小さい粒子サイズは、宿主の防御機構を回避する際に役立ち、血液循環時間が増加する。ナノ粒子のサイズは、薬剤放出に影響を及ぼす。大きい粒子ほど、系内への薬剤の拡散が遅くなる。小さい粒子ほど表面積が大きくなるが、薬剤放出が速くなる。小さい粒子ほど、ナノ粒子分散液の貯蔵および輸送の間、凝集する傾向がある。したがって、ナノ粒子の小さいサイズと最大の安定性との間の妥協点が望ましい。薬物送達システムで使用されるナノ粒子のサイズは、毛細血管へのそれらの迅速な漏出を防止するのに十分大きくなければならないが、肝臓および脾臓などの細網内皮系に存在する固定されたマクロファージによる捕捉を回避するのに十分な小さくなければならない。
ナノ粒子の表面の特徴は、それらのサイズに加えて、循環の間の寿命および運命を決定する重要な因子でもある。ナノ粒子は理想的には親水性表面を有してマクロファージの捕捉を回避しなければならない。親水性および疎水性ドメインを有するブロックコポリマーから形成されるナノ粒子は、これらの基準を満たす。ポリマー分解の制御も、病的状態への薬剤送達のレベル増加を可能にする。ポリマー分解は、粒径によっても影響を受け得る。分解速度は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは粒径の増加とともに増加する（Biopolymeric nanoparticles、Sundarら、２０１０年、Science and Technology of Advanced Materials、doi:10.1088/1468-6996/11/1/014104）。
ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は、組織工学、医療用材料および薬物担体における用途に関して米国ＦＤＡにより承認されており、またポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）、ＰＬＡ−ＰＥＧベースの薬物送達システムは、当技術分野において公知である。ＵＳ２００６／０１６５９８７Ａ１は、剛性をナノ球体に付与し、医薬化合物を組み込むための、ポリ（エステル）−ポリ（エチレン）マルチブロックコポリマーおよび任意選択の成分を含むステルス型のポリマー性生分解性ナノ球体を記載している。ＵＳ２００８／００８１０７５Ａ１は、機能性内核および親水性外殻を有し、グラフト巨大分子および１つまたは複数のブロックコポリマーから自己組織化した新規な混合ミセル構造を開示している。ＵＳ２０１０／０００４３９８Ａ１は、相間領域を有する殻／核構成のポリマーナノ粒子、およびそれを製造するプロセスを記載している。
様々な実施形態では、本発明は、治療用分子（例えば、ＴＮＦ−αタンパク質をコードする単離された核酸）と相互作用して安定なナノ複合体を形成し、および／または細胞透過性ペプチドとして機能するカチオン性分子を更に含む。様々な実施形態では、カチオン性分子細胞は、透過性ペプチドまたはタンパク質形質導入ドメインを含む。様々な実施形態では、カチオン性分子は、核への治療剤（例えば、ＤＮＡおよびベクター）の導入を促進するカチオン性ペプチドである。
当業者であれば、本明細書に記載される本発明が、具体的に記載されているもの以外の変形および変更を受けることを認識するであろう。本明細書に記載される本発明は、全てのかかる変形および変更を含むことを理解すべきである。本発明はまた、本明細書で参照されまたは示される、全てのかかるステップ、特徴、組成物および化合物を、個々に、または集合的に含み、前記ステップまたは特徴の任意の２つまたはそれより多くのあらゆる組合せを含む。
定義
便宜上、本発明の更なる説明の前に、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるある特定の用語をここに集約する。これらの定義は、本開示の残り部分を考慮して解釈されるべきであり、また当業者によるように理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。特定の場合おいて特に限定されない限り、本明細書全体にわたって使用される用語は、以下の通りに定義される。
冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的対象の１つまたは１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために使用される。
用語「含む」、「含むこと（comprising）」、「含むこと（including）」、「含有すること」、「を特徴とする」、およびその文法的均等物は、包括的な、オープンな意味において使用され、追加要素が含まれ得ることを意味する。「のみからなる」と解釈されることを意図しない。
本明細書において使用する場合、「からなる」およびその文法的均等物は、請求項で指定されていないいかなる要素、ステップまたは成分も除外する。
本明細書において使用する場合、用語「約」または「およそ」は通常、所与の値または範囲の２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは更に５％以内を意味する。
本明細書において使用する用語「生分解性」は、ポリマー構造の酵素的および非酵素的破壊または分解の両方を指す。
用語「カチオン性」は、それぞれの環境条件下で正味の正電荷または正のゼータ電位を有するあらゆる剤、組成物、分子または材料を指す。様々な実施形態では、本明細書に記載されるナノ粒子は、カチオン性のポリマー、ペプチド、タンパク質担体または脂質を含む。
用語「細胞透過性」は、細胞の細胞膜を横切って（すなわち細胞原形質内に）輸送される、ペプチド、タンパク質、断片、またはその変異体を指す。細胞透過性ペプチドまたはタンパク質は、大分子（例えばイムノグロブリン）の一部であってもよい。様々な実施形態では、細胞透過性ペプチド、タンパク質、断片、またはその変異体は、担体またはコンジュゲートを用いずに細胞の細胞原形質内にナノ粒子、治療剤／ナノ粒子および／または複合体／ナノ粒子を輸送するのに効果的である。一部の実施形態では、抗体、断片、またはその変異体は、治療剤および／またはナノ粒子に接触し、結合し、またはコンジュゲートする。
本明細書において使用する場合、用語「ナノ粒子」は、直径１０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の粒子を指し、直径は、該粒子と同じ体積を有する完全な球体の直径を指す。用語「ナノ粒子」は、「ナノ粒子（単数または複数）」として交換可能に使用される。場合によっては、粒子の直径は約１〜１０００ｎｍ、１０〜５００ｎｍ、２０〜３００ｎｍまたは１００〜３００ｎｍの範囲である。様々な実施形態では、直径は約３０〜１２０ｎｍである。
場合によっては、粒子の集団が存在してもよい。本明細書において使用する場合、ナノ粒子の直径は、特定の集団における分布の平均値である。
本明細書において使用する場合、用語「ポリマー」は、当技術分野において使用されるその通常の意味で用いられ、すなわち、共有結合により連結された１つまたは複数の反復単位（モノマー）を含む分子構造を指す。反復単位は全て同一でもよく、または、場合によっては、１つより多くの種類の反復単位がポリマー内に存在してもよい。
用語「核酸」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、その変異体およびその誘導体などのポリヌクレオチドを指す。
本明細書において使用する場合、用語「治療剤」および「薬物」は、交換可能に使用され、もともと薬学的または生物学的に活性である化合物または種のみならず、これらの活性化合物または種の１つまたは複数を含む材料、ならびにそのコンジュゲート、修飾物および薬理活性断片、ならびに抗体誘導体も包含することも意図する。
「標的化部分」は、標的化された細胞の表面に選択的に結合する分子である。例えば、標的化部分は、特定のタイプの細胞に見られるか、または他の細胞よりも標的細胞上において高い頻度で発現される細胞表面受容体に結合するリガンドであってもよい。
本明細書において使用する場合、用語「複合体を形成した」は、核酸−ペプチド複合体の形成を可能にする条件下で、本明細書において提供されるカチオン性の細胞透過性ペプチドと共に、本明細書において提供される単離された核酸を配置することを指す。用語「複合体」は、カチオン性の細胞透過性ペプチドにコンジュゲートした、本明細書において提供される単離された核酸を指す。核酸−ペプチド複合体の形成を可能にする条件の非限定的な例を、下記の実施例１３に記載する。
標的化部分または治療剤は、ペプチドまたはタンパク質であってもよい。「タンパク質」および「ペプチド」は、当技術分野において周知の用語であり、本明細書において使用する場合、これらの用語は当技術分野におけるそれらの通常の意味で用いられる。一般的には、ペプチドは約１００アミノ酸未満の長さのアミノ酸配列であるが、最高３００アミノ酸を含んでもよい。タンパク質は、一般的には少なくとも１００アミノ酸の分子であると考えられている。アミノ酸は、Ｄ−またはＬ−立体配置であってもよい。タンパク質は、例えば、タンパク質薬物、抗体、組換え抗体、組換えタンパク質、酵素などであってもよい。場合によっては、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の１つまたは複数は、例えば、炭化水素基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化用リンカーなどの化学的実体の添加により、または環化、副環化、ならびにペプチドおよびタンパク質により有利な特性を付与することを意図する多数の他の修飾のいずれかなどの他の修飾により修飾することができる。他の例において、ペプチドまたはタンパク質のアミノ酸の１つまたは複数は、１つまたは複数の非天然アミノ酸による置換により修飾されてもよい。ペプチドまたはタンパク質は、ファージライブラリー、酵母ライブラリーまたはｉｎ ｖｉｔｒｏコンビナトリアルライブラリーなどのコンビナトリアルライブラリーから選択されてもよい。
本明細書において使用する場合、用語「抗体」は、あらゆる種由来の分子を含有する免疫グロブリン可変領域により示される結合親和性と同様の、またはそれより強力な、所与の抗原に対する結合親和性を付与する二次または三次構造的な類似性を有するアミノ酸配列または分子を組み込んでいるあらゆる分子を指す。用語「抗体」には、限定されないが、２つの重鎖および２つの軽鎖からなる天然抗体、軽鎖、重鎖もしくはその両方の断片から誘導される結合分子、可変ドメイン断片、重鎖もしくは軽鎖単独の抗体、または、これらのドメインのあらゆる工学的に作製された組合せが含まれ、それらは単一特異的または二重特異的であってもよく、画像化剤または化学療法分子などの、第２の診断用または治療用部分とコンジュゲートされてもされなくてもよい。用語には、限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ラマ、ラクダ、ヒト由来であれまたは他のあらゆる脊椎動物種由来であれ、免疫グロブリン可変領域由来の結合部分が含まれる。用語は、発見方法（ハイブリドーマ由来の、ヒト化、ファージ由来、酵母由来、コンビナトリアルディスプレイ由来、または当技術分野において公知のあらゆる同様の誘導方法）または製造方法（細菌、酵母、哺乳動物細胞培養、もしくはトランスジェニック動物、または当技術分野において公知のあらゆる同様の製造方法）にかかわらず、あらゆるかかる免疫グロブリン可変領域結合部分を指す。
本明細書で使用される用語「組合せ」、「治療的組合せ」または「医薬的組合せ」は、２つまたはそれより多くの治療剤の併用投与（例えば同時送達）を指す。
用語「サイトカイン」は、１つの細胞集団により放出され、細胞間メディエーターとして別の細胞集団に作用するタンパク質の総称である。かかるサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカインおよび従来のポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えば、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、サイロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、糖タンパクホルモン、例えば、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子、例えば、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）および腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−β）、ミュラー管阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、神経成長因子、例えばＮＧＦ−アルファ（ＮＧＦ−α）、血小板成長因子、胎盤成長因子、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ−アルファ（ＴＧＦ−α）およびＴＧＦ−ベータ（ＴＧＦ−β）、インスリン様成長因子−１および−１１、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子、インターフェロン、例えば、インターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−α）、インターフェロン−ベータ（ＩＦＮ−β）およびインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ））、顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書において使用する場合、用語サイトカインには、天然源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な均等物が含まれる。
用語「ＴＮＦ」または「ＴＮＦ−α」は、腫瘍壊死因子を指す。ＴＮＦの生物学的効果は、エンドトキシンにより誘導され、ある特定の種類の腫瘍の壊死を引き起こす、血清中に存在する因子として、Carswelら、１９７９年、PNAS、７２巻、３６６６頁により最初に記載された。より最近、組換え産生されたヒトＴＮＦもまた、有効な抗がん剤であることが示されている（Pannicaら、（Nature (London)（１９８４年）３１２巻、７２４〜７２９頁）、Shiraiら、（Nature (London)、（１９８５年）３１３巻、８０３頁）、Wangら、（Science（１９８５年）、２２８巻、１４９頁）。またその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第８，８３５，６１０号も参照。
用語「ヒトＴＮＦ−α」（ｈＴＮＦ−αとして本明細書に略記）は、二量体サイトカインタンパク質を含む。用語は、３つの１７．５ｋＤのＴＮＦ−αタンパク質を含むホモ三量体のタンパク質を含む。用語ヒト「ＴＮＦ−α」は、標準的な組換え発現方法によって調製できる組換えヒトＴＮＦ−α（ＴＮＦ−α）を含むことを意図する。ヒトＴＮＦ−αのアミノ酸配列（配列番号９）を表２に示す。ＴＮＦ−αをコードする全ベクターの核酸配列（配列番号１０）およびアミノ酸配列（配列番号１１）も表２に示し、それらは、様々な実施形態ではナノ粒子に封入される全ベクターの配列である。ＴＮＦａは、ＥＧＲ１−プロモーター（ｐＥ４２５）により誘導される。
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、堅実な医療的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激性アレルギー反応および他の問題となる合併症を伴わずに、妥当な利益／危険率に相応する、温血動物、例えば、哺乳動物またはヒトの組織との接触に適切な化合物、材料、組成物および／または投与形態を指す。
１つまたは複数の治療剤を含むポリマーナノ粒子の「治療有効量」は、組合せにより治療される障害の臨床的に観察可能な徴候および症状のベースラインを超えて観察できるか、または臨床的に顕著な改善を提供するのに十分な量である。
本明細書で使用される用語「対象」または「患者」は、がんまたはがんを直接的もしくは間接的に含む任意の障害に罹患し得るかまたは影響を受け得る動物を含むことを意図する。対象の例としては、哺乳動物、例えば、ヒト、類人猿、サル、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラットおよびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。一実施形態では、対象はヒト、例えば、がんに罹患している、罹患するリスクがある、または潜在的に罹患し得るヒトである。
本明細書で使用される用語「治療すること」または「治療」は、対象における少なくとも１つの症状を緩和、低減もしくは軽減する、または疾患の進行の遅延をもたらす治療を含む。例えば、治療は、障害の１つもしくはいくつかの症状の減弱、または障害、例えばがんの完全な根絶であってもよい。本開示の意味の範囲内では、用語「治療する」はまた、疾患を悪化させるリスクを抑制および／または減少させることを意味する。本明細書で使用される用語「予防する」または「予防すること」または「予防」は、予防される状態、疾患または障害に関連し、またはそれにより引き起こされる少なくとも１つの症状の予防を含む。
本明細書において使用する場合、がん患者または腫瘍に言及するときの治療剤に対する用語「不応性」は、がんまたは腫瘍が、固有の抵抗性を有するか、または治療剤との接触の結果、治療剤の作用に対する抵抗性を得たことを意味する。言い換えると、がんは、特定の治療剤に関連する通常の標準的ケアに対して抵抗性を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載されるがんを治療する方法は、ＰＤ−１不応性腫瘍を含む。
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指すことを意図する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、それは更なるＤＮＡセグメントをライゲーションできる環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、更なるＤＮＡセグメントをウイルスゲノムにライゲーションすることができる。ある特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製が可能である（例えば、細菌の複製開始点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば非エピソーム性の哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。更に、ある特定のベクターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。かかるベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または簡単に「発現ベクター」）と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはプラスミドの形態であることが多い。本明細書においては、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、交換可能に使用され得る。しかしながら、本発明は、同等な機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
用語「作動可能に連結される」は、記載される成分が、それらの意図された方法で機能することを可能にする関係にある並置状態を指す。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コーディング配列の発現が制御配列と互換性を有する条件下で達成されるようにライゲーションされる。「作動可能に連結される」配列には、目的遺伝子に隣接する発現制御配列、および目的遺伝子を制御するためにｉｎ ｔｒａｎｓで、または離れて作用する発現制御配列の両方が含まれる。本明細書で使用される用語「発現制御配列」は、それらがライゲーションされたコーディング配列の発現およびプロセシングを実行するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列には、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列、効果的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシングおよびポリアデニル化シグナル、細胞質のｍＲＮＡを安定化させる配列、翻訳効率を強化する配列（すなわちＫｏｚａｋコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を強化する配列、ならびに必要に応じて、タンパク質分泌を強化する配列が含まれる。かかる制御配列の性質は、宿主生物により異なり、原核生物では、かかる制御配列は通常、プロモーター、リボゾーム結合部位および転写終結配列を含み、真核生物では、通常、かかる制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、その存在が発現およびプロセシングに必要不可欠である成分を含むことを意図し、その存在が有利である更なる成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列も含んでもよい。
ポリマーナノ粒子
本明細書では、１つまたは複数の治療薬、例えば、サイトカインまたはプラスミドまたはサイトカインをコードするＤＮＡの送達のための生分解性ポリマーナノ粒子が提供される。
したがって、一態様では、本明細書では、サイトカインもしくはその部分、またはサイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸を含むポリマーナノ粒子が提供される。
別の態様では、本明細書では、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸を含むポリマーナノ粒子が提供される。
一実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含む。ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）は疎水性ポリマーであり、ポリマーナノ粒子の合成のための好ましいポリマーである。しかしながら、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸−ｃｏ−グリコール酸のブロックコポリマー（ＰＬＧＡ）も使用してもよい。疎水性ポリマーは、生物学的に導出されてもよく、またはバイオポリマーであってもよい。使用するＰＬＡの分子量は通常、約２，０００ｇ／ｍｏｌ〜８０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。したがって、一実施形態では、使用するＰＬＡは、約１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜８０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。ＰＬＡの平均分子量は約７０，０００ｇ／ｍｏｌであってもよい。
ＰＥＧは、それが親水性、マクロファージに対する抗食作用および免疫学的認識に対する抵抗性を付与するため、ポリマーナノ粒子を形成するために使用されるポリマーの別の好ましい成分である。ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のようなブロックコポリマーは、本発明において使用できる親水性または親水性−疎水性コポリマーである。ブロックコポリマーは、２、３、４またはそれより多くの数の異なるブロックを有してもよい。
本明細書において使用する場合、１ｇ／モルは、１「ダルトン」に等しい（すなわち、ポリマーの分子量に言及するとき、ダルトンおよびｇ／ｍｏｌは交換可能である）。本明細書で使用される「キロダルトン」は、１，０００ダルトンを指す。
更なる実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーを含む。
更なる実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含む。様々な実施形態では、ナノ粒子は、生分解性の、血液中の循環期間が長い、ステルス型のテトラブロックポリマーナノ粒子プラットフォームであるＮＡＮＯＰＲＯ（商標）（ＮａｎｏＰｒｏｔｅａｇｅｎ Ｉｎｃ．、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含む。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーのＰＬＡとの化学コンジュゲーションから形成され得る。
ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むナノ粒子の合成および特徴付けは、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１６０７７３号に記載されている。ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子は、安全、安定および無毒性であることが示されている。このテトラブロックコポリマーを形成するために使用するプロセスは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧをポリ乳酸（ＰＬＡ）マトリックスに共有結合させて、マトリックスの一部になるブロックコポリマー、すなわちナノ粒子送達システムをもたらす（実施例２１を参照）ことを含む。これにより、媒体への乳化剤の浸出が防止される。
一部の実施形態では、親水性−疎水性ブロックコポリマー（例えばＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）の平均分子量（Ｍｎ）は、通常、１，０００〜２０，０００ｇ／ｍｏｌの範囲である。更なる実施形態では、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、約４，０００ｇ／ｍｏｌ〜１５，０００ｇ／ｍｏｌである。場合によっては、親水性−疎水性ブロックコポリマーの平均分子量（Ｍｎ）は、４，４００ｇ／ｍｏｌ、８，４００ｇ／ｍｏｌまたは１４，６００ｇ／ｍｏｌである。
本発明のブロックコポリマーは、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のセグメント、およびポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）のセグメントから本質的になることができる。
本発明の具体的な生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）で形成される。
本発明の別の具体的な生分解性ポリマーナノ粒子は、ブロックコポリマーポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（乳酸）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ−ＰＬＡ）から形成される。
本発明の生分解性ポリマーは、共有結合を使用して親水性−疎水性ブロックコポリマーでＰＬＡを化学的に修飾することにより形成することができる。
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、様々な実施形態では、約３０〜３００ｎｍの範囲のサイズ、約１００〜３００ｎｍのサイズ、または約１００〜２５０ｎｍのサイズ、または少なくとも約１００ｎｍのサイズを有する。
本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、様々な実施形態では、約３０〜１２０ｎｍの範囲のサイズ、約１２０〜２００ｎｍのサイズ、または約２００〜２６０ｎｍのサイズ、または少なくとも約２６０ｎｍのサイズを有する。
一実施形態では、本発明の生分解性ポリマーは、乳化剤を実質的に含まないか、または、約０．５重量％〜５重量％の量の外部の乳化剤を含んでもよい。
一実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子はＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は約６０，０００ｇ／ｍｏｌであり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は約８，４００または約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、外部の乳化剤は約０．５重量％〜５重量％である。
別の実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は、およそ１６，０００ｇ／ｍｏｌ未満であるかまたはそれに等しく、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は、約８，４００ｇ／ｍｏｌまたは約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、組成物は、乳化剤を実質的に含まない。
一実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は、約７２，０００ｇ／ｍｏｌ（または７２ｋＤａ）であり、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は、約８，４００または約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、外部の乳化剤は約０．５重量％〜５重量％である。
別の実施形態では、本発明の生分解性ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧであり、ポリ（乳酸）ブロックの平均分子量は、およそ１２，０００ｇ／ｍｏｌ（または１２ｋＤａ）未満であるかまたはそれに等しく、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックの平均重量は、約８，４００ｇ／ｍｏｌまたは約１４，６００ｇ／ｍｏｌであり、組成物は、乳化剤を実質的に含まない。
ポリマーナノ粒子の実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。
別の実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、カチオン性ペプチドを更に含む。
また別の実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、細胞透過性ペプチドを更に含む。
別の実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、カチオン性の細胞透過性ペプチドを更に含む。一実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。これらのペプチドの更なる説明は表１で見つけられる。
特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチド（配列番号８）を更に含む。
別の実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドおよび単離された核酸（例えば、ＴＮＦ−αタンパク質をコードする単離された核酸）は、複合体化される。
別の態様では、本明細書では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーまたはＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成されるポリマーナノ粒子であって、サイトカインもしくはその部分、またはサイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸を負荷しているポリマーナノ粒子が提供される。
一実施形態では、サイトカインは、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一である。
別の実施形態では、単離された核酸は、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合する（すなわち複合体化される）。
更なる実施形態では、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される。
別の態様では、本明細書では、
ａ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする単離された核酸と、
ｂ）カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドと
を含む複合体が提供される。
一実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチド（配列番号８）を含む。
一実施形態では、ペプチドと核酸との複合体は、静電相互作用を介して形成される。更なる実施形態では、複合体は、約５〜１５の荷電比もしくはＺ（±）で、または約１０．０の荷電比で調製され、荷電比は、核酸のリン酸（ＰＯ４ −）基当たりのペプチドのアミノ窒素（ＮＨ３ ＋）の比である。
二重ポリマーナノ粒子の調製
本明細書では、１つまたは複数の治療薬を含むポリマーナノ粒子を調製する方法／プロセスが提供される。得られるポリマーナノ粒子は、無毒性、安全かつ生分解性であるのみならず、ｉｎ ｖｉｖｏで安定であり、高い貯蔵安定性を有し、医療の分野でナノ担体システムまたは薬物送達システムにおいて安全に使用することができる。事実、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子は、ｉｎ ｖｉｖｏで、送達可能な薬物または治療剤の半減期を増加させることができる。
本明細書では、生分解性ポリマーナノ粒子上に効率的にサイトカイン（またはサイトカインをコードする遺伝物質（例えばＤＮＡ））を負荷して、活性薬剤の早期分解を防止し、がん治療において使用される高い可能性を有する、有効かつ標的化された薬物送達システムを形成するプロセスも提供される。
具体的には、本明細書では、生分解性ポリマーナノ粒子上に、ＴＮＦ−αを含むペプチドまたはＴＮＦ−αをコードする遺伝物質（例えばＤＮＡ）を効率的に負荷して、有効かつ標的化された薬物送達ナノ粒子システムを形成するプロセスが提供される。
ペプチド−核酸複合体の調製
一態様において、本明細書では、
ａ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする単離された核酸と、
ｂ）カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドと
を含む複合体を調製するプロセスであって、
ｉ）核酸のストック溶液を調製するステップと、
ｉｉ）ペプチドのストック溶液を調製するステップと、
ｉｉｉ）ボルテックスしながら、核酸のストック溶液をペプチドのストック溶液に添加するステップと
を含むプロセスが提供される。
一実施形態では、核酸のストック溶液は、約２０〜４０ｎｇ／μＬの濃度で調製される。
別の実施形態では、核酸のストック溶液は、ペプチドのストック溶液に滴下添加される。
一実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチド（配列番号８）を含む。
一実施形態では、ペプチドと核酸との複合体は、静電相互作用を介して形成される。更なる実施形態では、複合体は、約５〜１５の荷電比もしくはＺ（±）で、または約１０．０の荷電比で調製され、荷電比は、核酸のリン酸（ＰＯ４ −）基当たりのペプチドのアミノ窒素（ＮＨ３ ＋）の比である。
一実施形態では、このプロセスから生じる複合体は、単分散の複合体である。
これらの複合体は、透過型電子顕微鏡を使用して測定することができる寸法（例えば約３０〜約１５０ｎｍの範囲）を有する。適切な実施形態では、本明細書において提供される複合体の直径は、約５０ｎｍ〜１００ｎｍの直径または約７０ｎｍ〜９０ｎｍである。更なる実施形態では、本明細書において提供される複合体の直径は約８０ｎｍである。
一実施形態では、複合体は、約＋１５ｍＶ〜＋３５ｍＶのゼータ電位を有する。更なる実施形態では、複合体は、約＋３５ｍＶのゼータ電位を有する。
ポリマーナノ粒子の調製
別の態様では、本明細書では、
ａ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする単離された核酸と、
ｂ）カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドと
を含む複合体を含むポリマーナノ粒子を調製するプロセスであって、
ｉ）溶媒中にブロックコポリマーを溶解させてブロックコポリマー溶液を形成させるステップと、
ｉｉ）ブロックコポリマー溶液に複合体を添加して、複合体およびブロックコポリマーを含む溶液を形成させるステップと
を含むプロセスが提供される。
一実施形態では、ブロックコポリマーはＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーである。
一実施形態では、ブロックコポリマーは、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーである。
一実施形態では、ステップｉ）のブロックコポリマー溶液は、約２ｍｇ／ｍ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。更なる実施形態では、ステップｉ）のブロックコポリマー溶液は、約６ｍｇ／ｍｌの濃度で調製される。
一実施形態では、プロセスは、界面活性剤を含む溶液にステップｉｉ）の溶液を添加するステップｉｉｉ）を更に含む。更なる実施形態では、安定なナノ粒子が形成されるまで、ステップｉｉ）から得られる溶液を撹拌する。
様々な実施形態では、ポリマーナノ粒子は、膨張または収縮すると、非球状の構造を採ることができる。
様々な実施形態におけるナノ粒子は両親媒性の性質を有する。
ナノ粒子のゼータ電位およびＰＤＩ（多分散性指数）は算出できる（米国特許第９，１４９，４２６号を参照）。
ポリマーナノ粒子は、透過型電子顕微鏡を使用して測定できる寸法（例えば約１００〜約３５０ｎｍの範囲）を有する。適切な実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子の直径は、約１００〜３５０ｎｍの直径、または約１００〜３０ｎｍの直径、または約１００〜２５０ｎｍである。更なる実施形態では、本明細書において提供されるポリマーナノ粒子の直径は、約１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、１５０ｎｍ、１６０ｎｍ、１７０ｎｍ、１８０ｎｍ、１９０ｎｍ、２００ｎｍ、２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍまたは２５０ｎｍである。
一実施形態では、複合体を含むポリマーナノ粒子は、約−５０ｍＶ〜−１０ｍＶのゼータ電位を有する。更なる実施形態では、複合体は約−３０ｍＶのゼータ電位を有する。
ポリマーナノ粒子を形成するための具体的なプロセスおよび医薬組成物における使用を、参照を目的として本明細書において提供する。これらのプロセスおよび使用は、当業者に明らかな各種方法により実施できる。
組成物
また本明細書では、医療、およびナノ粒子の担体システムもしくは貯蔵部またはデポーを使用する他の分野において使用される、生分解性ポリマーナノ粒子を含む組成物が提供される。本発明のナノ粒子は、予後用、治療用、診断用、または治療診断（ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ）用の組成物において広範囲に使用することができる。最適には、本発明のナノ粒子は、薬物および薬剤送達（例えば腫瘍細胞中への）のために、ならびにヒトおよび動物における疾患の診断および医療用画像化のために使用される。したがって、本発明は、本明細書において記載される治療剤を更に含むナノ粒子を使用した疾患の治療方法を提供する。本発明のナノ粒子は、貯蔵部またはデポーが必要とされる化学的または生物学的反応などの他の用途において、バイオセンサーとして、酵素固定化のための剤などとしても使用できる。
したがって、一態様では、本明細書では、
ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
ｂ）サイトカインもしくはその部分、またはサイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む組成物が提供される。
別の態様では、本明細書では、
ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む組成物が提供される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーを含む。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含む。
更なる実施形態では、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーは、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーとＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成される。
一実施形態では、ＰＬＡの分子量は約１０，０００〜約１００，０００ダルトンである。
一実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。
一実施形態では、本明細書において提供される組成物はカチオン性ペプチドを更に含む。
別の実施形態では、本明細書において提供される組成物は細胞透過性ペプチドを更に含む。
別の実施形態では、本明細書において提供される組成物はカチオン性の細胞透過性ペプチドを更に含む。
一実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、本明細書において提供される組成物は、Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチド（配列番号８）を更に含む。
別の実施形態では、カチオン性、細胞透過性、またはカチオン性の細胞透過性ペプチドおよび単離された核酸（例えば、ＴＮＦ−αタンパク質をコードする単離された核酸）は、複合体化される。
一実施形態では、本明細書において提供される組成物は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリンおよびボルテゾミブからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む。
一態様において、本明細書では、がん、自己免疫性疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経障害からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、
ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む医薬組成物が提供される。
本明細書において提供される組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
本明細書において提供される組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
本明細書において提供される組成物の一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ポリマーナノ粒子の外側に付着した標的化部分を更に含み、標的化部分は、抗体、ペプチドまたはアプタマーである。
適切な医薬組成物または製剤は、例えば、約０．１％〜約９９．９％、好ましくは約１％〜約６０％の有効成分を含有することができる。腸内または非経口投与用の医薬製剤は、例えば、糖衣錠、錠剤、カプセルもしくは坐剤、またはアンプルなどの単位投与形態である。特に断りのない限り、これらは例えば、従来の混合、造粒、糖衣、溶解または凍結乾燥プロセスにより、それ自体公知の方法で調製される。複数の投与単位の投与により必要な有効量を達成できるため、各投与形態の個々の用量に含まれる組合せパートナーの単位含量は、それ自体で有効量を構成する必要がないことは理解される。
医薬組成物は、有効成分として、１つまたは複数の薬学的に許容される担体（賦形剤）と組み合わせて、本発明のナノ粒子の１つまたは複数を含有することができる。本発明の組成物を作製する際、有効成分は典型的には、賦形剤と混合され、賦形剤により希釈され、または、例えば、カプセル、サシェ、紙もしくは他の容器の形態の担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として機能する場合、それは固体、半固体または液体状の物質であり得、これは有効成分に対するビヒクル、担体または媒体として機能する。したがって、組成物は、例えば、１０重量％までの活性化合物を含有する錠剤、丸剤、粉剤、トローチ剤、サシェ、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、エマルジョン剤、液剤、シロップ剤、エアゾール剤（固体として、または液体媒体中）、軟膏、軟および硬ゼラチンカプセル、坐剤、殺菌した注射溶液、ならびに殺菌包装した粉末の形体であり得る。
適切な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース（例えばラクトース一水和物）、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン（例えばデンプングリコール酸ナトリウム）、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン（例えばポビドン）、セルロース、水、シロップ、メチルセルロースおよびヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。製剤は、滑沢剤、例えば、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよびミネラルオイル、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、保存料、例えば、メチルおよびプロピルヒドロキシベンゾエート、甘味料および香料を更に含むことができる。
本発明の化合物および組成物が、経口投与または注射による投与のために取り込まれ得る液体形態としては、水溶液、適切には香味シロップ、水性または油性懸濁液、ならびに綿実油、ゴマ油、ココナッツ油またはピーナッツ油などの食用油を用いた香味エマルジョン、ならびにエリキシル剤および同様の医薬ビヒクルが挙げられる。
治療方法
本明細書では、それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、対象に、
ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
ｂ）サイトカインもしくはその部分、またはサイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
一態様では、本明細書では、それを必要とする対象において疾患を治療する方法であって、対象に、
ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成されたポリマーナノ粒子と、
ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、単離された核酸は、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、医薬組成物は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリンおよびボルテゾミブからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、疾患は、がん、自己免疫性疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経障害である。
別の実施形態では、疾患はがんである。
また別の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、転移性結腸がん、膵がんまたは血液悪性腫瘍である。
別の実施形態では、がんはＰＤ−１不応性腫瘍を含む。
いかなる特定の理論にも拘束されないが、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＯＸ−４０、４−１ＢＢなどのチェックポイント阻害剤は、腫瘍微小環境においてサイトカイン濃度を上昇させることができる剤と組み合わせたとき、実質的により良好に作用し得ることが想定される。したがって、治療剤（例えば、ＴＮＦ ＤＮＡまたはＴＮＦタンパク質）の全身性送達は、腫瘍微小環境における治療剤の局所濃度を著しく上昇させることができ、それにより、その領域の細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を誘引し、したがって、例えばＰＤ−１または他のチェックポイント阻害剤による治療効果を強化することにより、細胞の感受性を高める。例えば、治療剤、例えばＴＮＦ ＤＮＡの全身性送達は、ＰＤ−１不応性腫瘍においてＰＤ−１治療に対する感受性を高める。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、ナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、ナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
一態様では、本明細書では、細胞においてＴＮＦ発現を誘導する方法であって、細胞を、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成される有効量のポリマーナノ粒子と接触させることを含み、ポリマーナノ粒子が、配列番号９またはその部分の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質をコードする単離された核酸を含む、方法が提供される。
本明細書において提供される方法の一実施形態では、単離された核酸は、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される。
更なる実施形態では、カチオン性の細胞透過性ペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
一実施形態では、ポリマーナノ粒子は、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される。
本明細書において提供される方法のいずれかの一実施形態では、ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書において提供される方法のいずれかの別の実施形態では、単離された核酸は、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする。
本明細書において提供される医薬組成物の投与は、症状を軽減し、その進行を遅延またはそれを阻害することに関する有益な効果のみならず、例えば、本明細書において記載されているポリマーナノ粒子システムを使用せずに、または任意の他の従来の手段により薬剤を送達する場合と比較して、更に驚くべき有益な効果、例えば、少ない副作用、より持続的な反応、改良された生活の質、または羅病率の低下ももたらし得る。
本明細書において提供されるポリマーナノ粒子の有効投与量は、具体的なタンパク質、核酸、および／または使用される他の治療剤、投与形式、治療される状態および治療される状態の重症度に応じて変化し得る。したがって、ポリマーナノ粒子の投与レジメンは、投与経路、ならびに患者の腎および肝機能などの様々な要因に従い選択される。
医薬的組合せを含むポリマーナノ粒子
本明細書において記載されるポリマーナノ粒子は、医薬的組合せを送達するために使用することができる。例えば、本明細書において開示される二重ナノ粒子システムにより送達できる医薬的組合せは、化学療法薬、およびサイトカインまたはサイトカインをコードする遺伝物質（例えば、ＴＮＦ−αを含むペプチドまたはＴＮＦ−αをコードする遺伝物質）を含む。
一態様では、本明細書では、
ａ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と、
ｂ）１つまたは複数の化学療法剤または標的化された抗がん剤と
を含むポリマーナノ粒子が提供される。
一実施形態では、化学療法剤または標的化された抗がん剤は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリンおよびボルテゾミブからなる群から選択される。
主題について、そのある特定の実施形態に関してかなり詳細に記載したが、他の実施形態が可能である。ゆえに、添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲は、そこに含まれる特定の実施形態の記載に限定されるべきではない。
本開示は、次に実施例で例示され、これは本開示の実施を例示することを意図するものであり、本開示の範囲に対する制限的ないかなる限定を行うことも意図するものではない。特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての専門用語および科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において記載されるのと類似もしくは同等の方法および材料を、開示される方法および組成物の実施において使用できるが、本明細書では例示的な方法、装置および材料を記載する。
（実施例１）ＧＦＰ発現のフローサイトメトリー分析
緑色蛍光タンパク質を発現するレポータープラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ Ｎ３）を複合体形成において使用し、ナノ複合体およびナノ粒子のトランスフェクション効率を解析した。ＮＣ−ＧＦＰ、ＰＤ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰによるトランスフェクションの後、ＭＣＦ−７細胞を、０．５、１、２、３、４、５および６日の異なる時点で解析した。その際、細胞をトリプシン処理し（０．２５％のトリプシン１００μｌ）、氷冷１ＸＰＢＳで洗浄し、１Ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）２００μｌ中に再懸濁した。Ａｒｉａ−ＩＩＩ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により測定を行った。緑色蛍光タンパク質の発現を４８８ｎｍの蛍光で観察し、ケースごとに５０，０００のイベントを取得した。データは、３回の独立した実験の平均値を示す。
（実施例２）細胞生存率
ナノ複合体およびナノ粒子の毒性効果を、チアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）アッセイを使用して測定した。ヒト胸部腺癌細胞株ＭＣＦ−７細胞を、９６ウェルプレートのフォーマットで、ウェル当たり６０００細胞で播種した。２４時間後、ＮＣ−ＧＦＰ、ＰＰＤ−ＧＦＰおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を用い、８μｇのｐＤＮＡ濃度で４時間、細胞を処理した。トランスフェクションの後１、２、３および４日後に細胞生存率をアッセイした。簡潔には、ある体積（５０μＬ）のＭＴＴ試薬（０．５ｍｇ／ｍＬ）を各ウェルに添加した。プレートを１５分間３７℃でインキュベートし、細胞溶解を達成した。ＭＴＴ試薬を含有する培地をウェルから慎重にデカントし、結晶が分離されないようにした。インキュベーション後、１００μＬのＭＴＴ洗浄緩衝液（０．５ｍＬの１０％ＳＤＳ、および１０ｍＬのイソプロパノール中の０．０６ｍＬの１２Ｎ ＨＣｌ）を各ウェルに添加し、３０分間穏やかに振とうすることによって結晶を溶解させた。（残渣が入らないように）５５０および６７０ｎｍで吸光度分析を行った。生存パーセンテージを、以下に示す通り算出した：
２回の独立した実験の平均をプロットし、各処理を４回反復して実施した。
（実施例３）ウエスタンブロッティング
各種の製剤によるトランスフェクションの後、５０μｌの放射線免疫沈降分析（ＲＩＰＡ）緩衝液中に細胞を溶解させ、１％のβ−メルカプトエタノールを含む５０μｌの２Ｘドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）試料緩衝液中に再懸濁させた。試料を５分間沸騰させ、１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動ゲル（レーン当たり２０μｌ）で分離させた。電気泳動後、ウエット式のトランスファーセルシステム（Ｂｉｏ−ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を使用して、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）に転写した。５％のスキムミルクを含有するＰＢＳ中で２時間、膜をブロッキングした。一次抗体として、それぞれウサギ抗ヒトＴＮＦ−αおよびウサギ抗ヒトカスパーゼ−３（１：２０００希釈、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）と共に、膜を４℃で一晩インキュベートすることによりＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３の発現を検出した。一次抗体溶液を廃棄し、二次抗体として、酵素ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を含有する溶液（１：１０００希釈、Ａｂｃａｍ）と共に、膜を２時間インキュベートした。増強化学発光（ＥＬＣ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）によりＴＮＦ−αタンパク質およびカスパーゼ−３タンパク質を検出した。抗グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）モノクローナル抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）をタンパク質負荷対照として使用した。
（実施例４）アネキシン−Ｖ染色
細胞に対するＴＮＦ−αをコードするプラスミドＤＮＡの機能的効果を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ染色（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ）により分析した。ヒト胸部腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に、ＴＮＦ−αｐＤＮＡを負荷したＰＰＤ−ＴＮＦ−αナノ粒子をトランスフェクトした。２４、４８および７２時間後に、処理した細胞を１×ＰＢＳにより洗浄し、トリプシン処理の後回収した。トリプシン処理された細胞を、１０分間、毎分６００回転（ｒｐｍ）で遠心分離した。細胞ペレットをアネキシン−Ｖ緩衝液中に再懸濁させ、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識したアネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）により１５分間染色した。インキュベーション後、Ａｒｉａ−ＩＩＩ Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ）において細胞を解析した。
（実施例５）免疫細胞化学
共焦点レーザー走査顕微鏡法（ＣＬＳＭ）を使用して、遺伝子発現およびｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対するその機能的効果を調べた。ＣＬＳＭ観察のため、ディッシュ当たり１×１０５細胞の密度で、３５ミリメートル（ｍｍ）のμディッシュに細胞を播種した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、細胞にＰＰＤ−ＴＮＦ−αをトランスフェクトした。１２時間後に培地を除去し、新鮮な培地を添加した。２４、４８および７２時間後に培地を除去し、細胞を１×ＰＢＳで３回洗浄した。その後、細胞を、ＴＮＦ−α一次抗体またはカスパーゼ−３一次抗体と共に１時間、次いでＦＩＴＣおよびシアニン５（Ｃｙ５）フルオロフォアで標識した二次抗体と共に１時間、インキュベートした。次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ヘキスト３３２５８色素（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ）で細胞核を染色した。次いで細胞を、ＣＬＳＭ観察のため２００μｌの１×ＰＢＳと共にインキュベートした。
（実施例６）ｉｎ ｖｉｖｏ試験
１０〜１２週齢の雌の同系ＢＡＬＢ／ｃマウス（体重約２２〜２５グラム）をこのｉｎ ｖｉｖｏ分析に使用した。Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＡＡＡＬＡＣＩ）ガイドラインに従い、対象を病原体フリーの条件下で維持し、全ての試験の前に４日間馴化させた。動物を人道的にケアし、餌料および水を自由に摂取させた。全ての動物実験および試験プロトコールは、Ａｌｌ Ｉｎｄｉａ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＡＩＩＭＳ）、Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉにおいて、施設のガイドラインに従い実施し、またインド政府のＣｏｍｍｉｔｔｅｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｕｒｐｏｓｅ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｎ Ａｎｉｍａｌｓ （ＣＰＣＳＥＡ）、Ｎｅｗ Ｄｅｌｈｉにより承認された。
（実施例７）エールリッヒ腹水腫瘍（ＥＡＴ）モデル
毎週連続の継代により、マウスの腹膜中、腹水の形態でＥＡＴ細胞を維持した。指数関数的に増殖するＥＡＴ細胞を回収し、洗浄し、ＰＢＳに再懸濁した。ある量のＥＡＴ細胞（約１．８×１０６細胞／マウス）を各対象の右後肢の大腿に皮下注射（ｓ．ｃ．）した。
（実施例８）最大耐用量（ＭＴＤ）試験
健康な雌の同系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいてＰＰＤ−ＴＮＦαナノ粒子の単回腹腔内（ＩＰ）送達を実施し、ＭＴＤを試験した。５匹の同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの５つの群に、異なるｐＤＮＡ−ＴＮＦ−α濃度（用量当たり０．６ｍｇ／ｋｇ、１．２ｍｇ／ｋｇ、１．８ｍｇ／ｋｇおよび２．４ｍｇ／ｋｇのｐＤＮＡ）でＰＰＤ−ＴＮＦαナノ粒子の単回ＩＰ注射を施した。ＰＢＳを対照として用いた。マウスの生存および体重変動を１５日間毎日測定した。投与後１週以内に、毒性効果による死も全体的な徴候の著しい変化も起こさなかった対照のメジアン体重の１５％を許容範囲として、ＭＴＤを定義した。２０％超の体重減少を示す動物は、この程度の変化が致死的な毒性を示すことが多いため、屠殺した。
（実施例９）ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍退縮の解析
皮下ＥＡＴモデルにおいて、同系ＢＡＬＢ／ｃマウスの腫瘍が腫瘍体積約５０ｍｍ３に達したときに処置を開始し、この日を０日目とした。０日目に、これらのマウスを５つの群（ｎ＝６）にランダムに分けた。処置の開始時は、腫瘍移植（およそ約５０ｍｍ３の腫瘍体積）後の１日目とみなし、５０日間継続した。１、５、９、１３、１７および２１日目に、マウスに、裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ−ＴＮＦ−α）、ペプチド−プラスミドＤＮＡナノ複合体（ＮＣ−ＴＮＦ−α）およびポリマー−ペプチド−プラスミドＤＮＡナノ粒子（ＰＰＤ−ＴＮＦ−α）を腹腔内または腫瘍内（ＩＴ）投与した。比較のため、ＰＰＤ−ＴＮＦ−αナノ粒子を、２つのｐＤＮＡ用量（０．６ｍｇ／ｋｇおよび１．２ｍｇ／ｋｇ）のどちらかで投与した。裸のｐＤＮＡ−ＴＮＦαおよびＮＣ−ＴＮＦ−αは、１４μｇのｐＤＮＡ濃度で試験した。対照群のマウスには、ＰＢＳのみを投与した。週２回、ノギスで腫瘍サイズを測定した。腫瘍体積は、式（Ｌ×Ｗ２）／２（Ｌは腫瘍の最長径、Ｗは最短径（ｍｍ）である）により算出した。最終投与の３日目に、全てのマウスから血液試料を得て、血球数、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）およびクレアチニンを測定した。また、各群から１匹のマウスを屠殺し、組織病理学評価のため腫瘍、心臓、肝臓、腎臓、脾臓および肺を摘出した。
（実施例１０）組織学的解析
処置されたマウスの組織試料（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓および腫瘍）を組織病理学的解析のため摘出した。試料をパラフィン封埋し、次いで５マイクロメートル（μｍ、ミクロン）寸法の切片を調製した。これらの切片をヘマトキシリンエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色により染色し、顕微鏡を使用して解析した。
（実施例１１）腫瘍切片の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）解析
屠殺したマウスの腫瘍切片を、抗腫瘍タンパク質ＴＮＦ−αおよびアポトーシスカスケードタンパク質であるカスパーゼ−３の存在について解析した。腫瘍切片をカットし、５分間溶解緩衝液で処理した。次いで、処理された切片を５分間、手動ホモジナイザーにおいてホモジナイズした。ホモジナイズした腫瘍切片を遠心分離し、各試料からの上清を回収した。抽出された上清を３０分間、ＴＮＦ−αおよびカスパーゼ−３に対する蛍光抗体でインキュベートした。次いで、処理した上清を、それぞれの抗腫瘍タンパク質に関してＦＡＣＳにより解析した。
（実施例１２）ペプチド配列ＣＲ５Ｈ７Ｒ４Ｃの生成
Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチドＣＲ５Ｈ７Ｒ４Ｃ（アミノ酸配列：ＣＲＲＲＲＲＨＨＨＨＨＨＨＲＲＲＲＣ、＞９５％の純度）を合成した（Ｇ Ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）。ペプチドを５ｍｇ／ｍｌの濃度で脱イオン水に溶解させ、−８０℃で小アリコートで貯蔵し、凍結融解の反復を回避した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）およびｐＥ４２５−ＴＮＦ−αを、ＧｅｎＥｌｕｔｅ ＨＰエンドトキシンフリープラスミドＭａｘｉｐｒｅｐキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して精製した。７５キロダルトン（ｋＤａ）のＰＬＡ−ＰＥＧブロックコポリマーを設計し、合成した。Kumarら、Cancer Research、２０１４年、７４巻（１２号）、３２７１〜３２８１頁を参照。ＴＮＦ−α、カスパーゼ−３およびＧＡＰＤＨに対する一次および二次抗体を入手した（Ａｂｃａｍ Ｐｖｔ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。使用した全ての化学物質は、特に明記しない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
（実施例１３）ペプチド−プラスミドＤＮＡ複合体（ナノ複合体）の調製
ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）を、ＤＮＡのリン酸（ＰＯ４ −）基当たりペプチドのアミノ窒素（ＮＨ３ ＋）の比であり、荷電比（Ｚ（±））として示される比での静電相互作用に基づき調製した。ｐＤＮＡストックを２０〜４０ｎｇ／μＬの濃度に希釈し、ボルテックスしながら、等量の適切なペプチド希釈液に滴下添加した。本実施例において、ナノ複合体は１０．０の荷電比Ｚ（±）で調製した。
（実施例１４）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ペプチド−ｐＤＮＡベースのナノ粒子（ＮＰ）の調製
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ペプチド−ｐＤＮＡナノ粒子を、二重エマルジョン蒸着法を使用して調製した。ポリマー溶液および界面活性剤を、以下の通りに調製した：ａ）ＰＥＧ−ＰＬＡブロックコポリマーを、６ｍｇ／ｍｌの濃度でアセトニトリルに溶解し、ｂ）ポロキサマーＦ−１２７を、連続的に撹拌しながら脱イオン水に３ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、界面活性剤溶液を調製した。ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体の新しいバッチを上記の通り調製し、次いでＰＬＡ−ＰＥＧ溶液と穏やかに混合し、次いで界面活性剤水溶液にゆっくり添加した。この溶液をおよそ１２時間連続撹拌し続け、安定なナノ粒子溶液を形成させた。これらのＮ／Ｐを、ｉ）ポリマーＮ／Ｐのみ（ＮＰ）、ｉｉ）ポリマー−ｐＤＮＡ Ｎ／Ｐ（ＰＤ）、ｉｉｉ）ポリマー−ペプチド−ｐＤＮＡ Ｎ／Ｐ（ＰＰＤ）の３セットで調製した。Ｎ／Ｐ材料を−８０℃で保存した。ｐＥ４２５−ＴＮＦαプラスミドを、ＰＰＤナノ粒子の調製においてレポータープラスミドＤＮＡの代わりに使用し、プラスミドＤＮＡを負荷したナノ粒子の抗腫瘍効果を試験した。レポータープラスミドＤＮＡ（ｐＥＧＦＰ−Ｎ３）を用いて調製したナノ複合体およびナノ粒子は、ＮＣ−ＧＦＰ、ＰＤ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰである。抗腫瘍タンパク質ＴＮＦ−αをコードするプラスミドＤＮＡ（ｐＥ４２５−ＴＮＦα；Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｃ．、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて調製したナノ複合体およびナノ粒子は、ＮＣ−ＴＮＦ−α、ＰＤ−ＴＮＦ−αおよびＰＰＤ−ＴＮＦ−αである。
（実施例１５）生物物理学的特徴付け
Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して、１７３°の固定角および２５℃で、ナノ複合体およびポリマーナノ粒子のサイズおよびゼータ電位を測定した。最低３回のリーディングを各試料について記録した。複製物も解析した。ナノ複合体およびナノ粒子の形態を、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）により画像化した。生理的緩衝液（１×ＰＢＳ）中でナノ粒子をインキュベートすることにより、ナノ粒子からのｐＤＮＡの放出パターンを解析した。１時間ごとに溶液を遠心分離した後、上清を回収し、ｐＤＮＡの存在について解析した。次いでペレットをＰＢＳ中に再び懸濁させた。上清を１マイクロリットル当たり１０マイクログラム（μｇ／μｌ）のヘパリンで１０分間処理し、次いで臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）除外アッセイを使用して解析した。
（実施例１６）ｉｎ ｖｉｔｒｏトランスフェクション
加湿インキュベーター内、３７℃および５％の二酸化炭素で、ＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）を補充したダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。細胞を２４ウェルプレートフォーマットにおいて播種し、７０％のコンフルエントに達したとき、ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験を２４時間後に実施した。ナノ複合体を１０．０の荷電比で調製し、１時間インキュベートした。１００マイクロリットル（μｌ）の体積のナノ複合体（２μｇのｐＤＮＡ／ウェル）を、３００μｌの無血清培地（ＯｐｔｉＭＥＭ／／Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｐｉｅｒｃｅ、Ｌｅｎｅｘａ、ＫＳ）中の細胞に添加した。ナノ粒子（ＰＤ−ＧＦＰおよびＰＰＤ−ＧＦＰ）を、２マイクログラム（μｇ）、４μｇおよび８μｇとして、ウェル当たりのｐＤＮＡ濃度を増加させて細胞に添加した。トランスフェクション効率に対する血清の影響を試験するため、ナノ粒子およびナノ複合体（８μｇのｐＤＮＡ／ウェルで）を、１０％の血清の存在下で細胞に添加した。試料を１２時間インキュベートし、次いでナノ粒子およびナノ複合体を含有する培地を吸引した。細胞を１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）ですすぎ、完全増殖培地を補充した。
（実施例１７）新規な二重ＮＰ／ＮＣの生成
サイトカインをコードするベクターの全身性投与は、腫瘍内免疫微小環境を再プログラムするための可能性のあるアプローチである。しかしながら、この分野は、有効な送達システムがないことにより、制限されてきた（Yin H ら、２０１４年、Nature Reviews Genetics １５巻、５４１〜５５５頁、Amer M.H.、２０１４年、Mol Cell Ther． ２０１４年、２巻、２７号、１〜１９頁、Collins M.ら、２０１５年、Proc. Biol. Sci.、２２、２８２巻（１８２１号）、20143003. doi: 10.1098/rspb.2014.3003）。この障壁に対処するため、本実施例では、ペプチド−ＤＮＡベクターナノ複合体（ＮＣ）を含有するカチオン性粒子を囲む外側のポリマーＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＮＰ）を含む二重システムを開発した。ＤＮＡの凝縮および細胞内放出のバランスを維持するために、ＮＣのヒスチジンおよびシステイン変性アルギニンペプチド（ＨＣＲ）成分が設計されている（Mann A.ら、２０１４年、Mol. Pharmaceutics、１１巻（３号）、６８３〜６９６頁）。
ｉ）負荷していないポリマーナノ粒子（ＮＰ）、ｉｉ）ｐＤＮＡを負荷したポリマーナノ粒子（ＰＤＮＰ）、およびｉｉｉ）ペプチド−ＤＮＡナノ複合体を負荷したポリマーナノ粒子（ＮＰ／ＮＣ）の３セットのナノ粒子を、ＰＬＡ−ＰＥＧブロックコポリマー（７５ＫＤａの分子量）を使用するナノ−沈殿法により調製した。Shi J.ら、２０１３年、J. Bio Eng.、７巻、２５号、１〜１０頁を参照。ナノ粒子の全３つのセットを、それらの生物物理学的なｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの特徴付けのために、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）と比較した。脱イオン水および血清中において、合成されたナノ複合体およびナノ粒子の流体力学的直径および多分散性指数値を分析した（図１Ａおよび図１Ｂを参照）。脱イオン水中では、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）は８０±４ｎｍのサイズ範囲で単分散性であった一方で、ｐＤＮＡ−ポリマーナノ粒子は倍のサイズ（２５０±７ｎｍ）を超えていた。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳシステムを使用して測定して、ＰＬＡ−ＰＥＧ ＮＰのゼータ電位は−３０ｍＶであると決定された。しかしながら、ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体（ＮＣ）は、＋２５ｍＶの正のゼータ電位を示した。
ポリマーナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真を図１Ｂに示し、画像から、ナノ粒子が球形の形状であることが証明される。血清の存在下では、ＮＣは２００〜７００ｎｍの範囲の多分散のサイズを示し、それはナノ複合体の凝集および不安定化を示す。ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体を含有するＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子（ＰＰＤＮＰ）は、血清の存在下でも、いかなる凝集もなく、サイズが安定であることが認められた（図１Ｃを参照）。ポリマー−ｐＤＮＡ（ＰＤ）およびポリマー−ペプチド−ｐＤＮＡ（ＰＰＤ）ナノ粒子を、ｐＤＮＡ負荷効率について評価した。ＰＤＮＰおよびＰＰＤＮＰのｐＤＮＡの負荷効率は、それぞれおよそ４０％および６０％であった。
いかなる特定の理論または作用機構にも拘束されないが、ここで、観察されたＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子へのｐＤＮＡ負荷が少量であったことは、負荷電のＰＬＡ−ＰＥＧとｐＤＮＡとの反発的作用によると考えられ、一方ペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体は正荷電であるため、負荷電のＰＬＡ−ＰＥＧポリマーナノ粒子中に高いパーセンテージで封入されたと想定される。
（実施例１８）ポリマーナノ粒子からのペプチド−ＤＮＡの放出動態
ＰＤＮＰおよびＰＰＤＮＰを、生理的条件（１×ＰＢＳ）におけるそれらのｐＤＮＡ放出動態について、ＥｔＢｒ除外アッセイを使用して解析した。ｐＤＮＡのおよそ６０％が３時間以内にＰＤナノ粒子から放出されたが、ＰＰＤは１２時間、２４時間および４８時間で、それぞれ３０％、４５％および６０％の累積的なｐＤＮＡ放出と共に、ｐＤＮＡを段階的に放出した（図１Ｄ）。ＰＬＡ−ＰＥＧ−ペプチド−ｐＤＮＡナノ粒子（ＰＰＤ）からのｐＤＮＡ放出機構は、二段階、すなわちバースト放出段階および制御放出段階で起こることが観察された。バースト放出段階において、最初の４時間で２０％の放出が起こり、それはナノ粒子の表面上に吸着されるか、または弱い結合によって付着していたペプチド−ｐＤＮＡナノ複合体に対応する。制御放出段階において、ＰＰＤナノ粒子は４８時間までにｐＤＮＡの段階的な放出を有することが観察され、それは高分子量ＰＬＡ−ＰＥＧブロックコポリマーの遅い分解のために生じ得る。いかなる特定の理論または作用機構にも拘束されないが、この観察結果は、細胞系内でのｐＤＮＡの発現パターンに外挿することができ、すなわち、ｐＤＮＡの放出が持続的になるほど、ｉｎ ｖｉｔｒｏの条件における発現がより長くより高いレベルとなるとも考えられる。ＰＤＮＰの場合には、ｐＤＮＡ放出現象は、ＰＰＤＮＰで観察される放出より速いことが観察され、すなわち、ｐＤＮＡおよびＰＬＡ−ＰＥＧナノ粒子の負電荷間の反発により、３時間以内に６０％が放出された。ｐＤＮＡはカチオン性ペプチドと共に凝縮してナノ複合体を形成し、それによりサイズが減少し、ｐＤＮＡの電荷をマスキングし、それにより（ＰＰＤＮＰ）におけるＮＣのより高い負荷がもたらされた。
したがって、データは、二重ＮＰ／ＮＣからのＨＣＲ−ＤＮＡ複合体の放出が、生理的条件下で４８時間にわたり持続したことを示しており、外因性遺伝子の送達可能性を支持している。
（実施例１９）ペプチド−ＧＦＰ ｃＤＮＡ複合体の細胞内発現
外来遺伝子の細胞内発現を評価するため、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｃＤＮＡとのＨＣＲペプチド複合体を生成させた（図２Ａ）。ＮＰ／ＧＦＰ−ＮＣに対するＭＣＦ−７細胞の曝露により、９６時間にわたるＧＦＰ発現の段階的な増加をもたらすことが認められた（図２Ｂ）。更に、注目すべきことに、ＮＰ／ＧＦＰ−ＮＣの細胞生存率に対する効果は、あったとしてもわずかであり、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅの存在下でのＧＦＰ−ＮＣのトランスフェクションとは対照的な知見である（図２Ｃを参照）。
（実施例２０）ＴＮＦ発現およびアポトーシスのｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導モデルとしてのＮＰ／ＮＣの生成
ＥＧＲ１遺伝子に由来する活性酸素種（ＲＯＳ）誘導性プロモーター（ｐＥ４２５）によりヒトＴＮＦ ｃＤＮＡが駆動する発現ベクターを構築した（Weichselbaum R.ら、２００９年、Cancer Gene Therapy、１６巻、６０９〜６１９頁）。モデル系として、ｐＥ４２５−ＴＮＦ ｃＤＮＡ（ＴＮＦ−ＮＣ）に連結したＨＣＲペプチドを含有するＮＣを生成させた（図３Ａ）。次いでＴＮＦ−ＮＣをＰＬＡ−ＰＥＧ ＮＰ（ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ）に封入した（図３Ｂ）。重要なことに、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣによるＭＣＦ−７細胞の処理は、ＴＮＦの膜貫通型（２１ｋＤａ）および可溶性（１７ｋＤａ）タンパク質の発現と関連していた（図３Ｂ）。ＮＰ／ＧＦＰ−ＮＣとは対照的に、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣによる処理は、細胞死の誘導に効果的であった（図３Ｃ）。ウエスタンブロット解析も行った。データは、ＴＮＦαｐＤＮＡを封入するＮＣ−ＴＮＦαおよびＰＰＤ−ＴＮＦαによりトランスフェクトしたＴＮＦα発現細胞においてカスパーゼ−３タンパク質が発現したことを示す。免疫細胞染色データは、ＰＰＤ−ＴＮＦαトランスフェクト細胞における、２４、４８および７２時間後におけるＴＮＦαおよびカスパーゼ−３の存在を示す。アネキシンＶ染色データの解析は、ＭＣＦ−７細胞がＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣに応答し、その結果、細胞がアポトーシスに方向付けられることを示した（図４Ａ）。これらのデータと呼応して、細胞内ＴＮＦ発現の誘導が、免疫細胞化学的解析（図４Ｂ）およびイムノブロット解析（図４Ｃ）により決定されるカスパーゼ−３分裂の活性化と関連することも観察された。
（実施例２１）ｉｎ ｖｉｖｏでのＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣの抗腫瘍活性
最初に、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて腹腔内（ＩＰ）投与によりＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣの許容度を解析した。データは、０．６および１．２ｍｇ／ｋｇの単回ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ用量が、顕著な体重減少または毒性の他の明らかな徴候なく、良好に許容されたことを示す（図５）。対照的に、１．８ｍｇ／ｋｇの用量でのＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣの投与は、７日目までに回復した＞１０％の体重減少と関連した（図５）。
これらのデータに基づき、確立されたエールリッヒ胸部腫瘍を担持するマウスにおけるＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣの効果を解析した。特に、０．６および１．２ｍｇ／ｋｇ×６回の用量によるＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣの複数回ＩＰ投与は、腫瘍増殖の阻害と関連していた（図６Ａ）。更に、５０日目までに腫瘍の再増殖が検出された（図６Ｂ）。比較のため、腫瘍内（ＩＴ）投与の効果も解析した。ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣを０．６ｍｇ／ｋｇ×６回の用量で腫瘍内投与したとき、増殖阻害効果が観察された（図７Ａ）。更に、ＩＴ用量を１．２ｍｇ／ｋｇ×６回に増加させることにより、５０日目まで持続する腫瘍退縮がもたらされることが観察された（図７Ａおよび図７Ｂ）。重要なことに、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ処理と関連する臓器毒性または血液化学的異常の証拠は見られなかった（図８ならびに表３および４）。
更に、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ処理されたマウスからの腫瘍切片の解析も行った。対照腫瘍と比較し、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣ処理されたマウスからの腫瘍において、アポトーシス小体の存在の増加が観察された（図９Ａ）。更に、また重要なことに、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣのＩＰおよびＩＴ投与は、カスパーゼ−３の活性化と関連する腫瘍溶解物におけるＴＮＦ発現の顕著な増加をもたらした（図９Ｂ）。いかなる特定の理論または作用機構にも拘束されないが、ここで、全身または腫瘍内投与したとき、ＮＰ／ＴＮＦ−ＮＣがエールリッヒ胸部腫瘍に対して効果的であり得ることが想定される。
（実施例２２）ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマー（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１６０７７３号にも記載）により形成されるポリマーナノ粒子の調製および特徴付け
ポリ（乳酸）（分子量約４５，０００〜７２，０００ｇ／ｍｏｌ）、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ（表１）および組織培養試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から得た。全ての試薬は、分析用グレードまたはそれ以上とし、特に明記しない限りそのまま使用した。細胞株はＮＣＣＳ Ｐｕｎｅ、Ｉｎｄｉａから得た。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーの調製
６０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する５ｇｍのポリ（乳酸）（ＰＬＡ）を、２５０ｍｌの丸底フラスコ中、１００ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２（ジクロロメタン）に溶解させた。この溶液に、０．７ｇのＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧポリマー（１１００〜１２，５００Ｍｎの分子量範囲）を添加した。溶液を０℃で１０〜１２時間撹拌した。この反応混合物に、５ｍｌの１％ Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカーボジイミド（ＤＣＣ）溶液を添加し、続いて−４℃〜０℃／サブゼロの温度で、５ｍｌの０．１％ ４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）をゆっくり添加した。更に２４時間反応混合物を撹拌し、続いてジエチルエーテルによりＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーを沈殿させ、ワットマン濾紙Ｎｏ．１を使用して濾過した。こうして得られたＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマー沈殿物を低真空下で乾燥させ、更なる使用まで２℃〜８℃で保存した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子の調製
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子を、エマルジョン沈殿法により調製した。上述したプロセスにより得られた１００ｍｇのＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧコポリマーを、有機溶媒、例えば、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジクロロメタンに別々に溶解させ、ポリマー溶液を得た。
２０ｍｌの蒸留水の水相にこのポリマー溶液を滴下添加することによって、ナノ粒子を調製した。溶液を１０〜１２時間室温で磁気撹拌し、残余の溶媒を蒸発させ、ナノ粒子を安定化させた。次いでナノ粒子を１０分間の２５，０００ｒｐｍでの遠心分離により回収し、蒸留水を使用して３回洗浄した。ナノ粒子を更に凍結乾燥し、更なる使用まで２℃〜８℃で保存した。
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧブロックコポリマーのポリマーナノ粒子の特徴付け
前述のプロセスにより得られたナノ粒子の形状は、透過型電子顕微鏡画像により示されるように、本質的に球形である。ＴＥＭ画像は粒径範囲の決定を可能にし、約３０〜１２０ｎｍである。ナノ粒子の流体力学的半径を動的光散乱（ＤＬＳ）装置を使用して測定し、１１０〜１２０ｎｍの範囲である。
異なる分子量のブロックコポリマー、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧを使用して、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧナノ粒子のＮＭＲスペクトルを得た。スペクトルにおいて、約５．１の化学シフトを有する陽子は、ＰＬＡのエステルの陽子を表し、約３．５の化学シフトを有する陽子は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのエーテルの陽子を表す。両方のスペクトル陽子の存在は、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧとＰＬＡとのコンジュゲーションを確認するものである。
（実施例２３）テトラブロックナノ粒子に封入されるペプチド−ｐＥＧＲ−１−ＴＮＦ ＤＮＡの調製および特徴付け
ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧのテトラブロックコポリマーを含み、ペプチド−ｐＥＧＲ−１−ＴＮＦ ＤＮＡを封入するポリマーナノ粒子を調製し、特徴付けた。表５は、２つの異なる分子量のＰＬＡを有する異なるテトラブロックナノ粒子を使用した、ナノ粒子サイズおよび多分散性指数データを示す。
非生理的ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４におけるＴＮＦ ＤＮＡ放出プロファイルの比較は、調製されたテトラブロックナノ粒子のそれぞれがＤＮＡの段階的な放出において有効なビヒクルであったことを示す（図１０）。
２つの異なるナノ粒子を使用して非生理的ＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４におけるＴＮＦ ＤＮＡ放出プロファイルを比較するため、更なる解析を行った。具体的には、ＰＬＡ １２ｋＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子からの、およびＰＬＡ ７２ｋＤａ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧペプチド−ＴＮＦ ＤＮＡナノ粒子からのＴＮＦ−ＤＮＡの日々の放出を解析した（図１１）。
ジブロック（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ナノ粒子を使用することによってＴＮＦ−ＤＮＡの日々の放出と比較し（実施例１８に記載されている、１２０時間または約５日で１００％のＤＮＡ放出が完了した）、ここでのデータは、テトラブロック（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）ナノ粒子が１０日でＴＮＦ−ＤＮＡの１００％を放出し（図１０および１１を参照）、その結果、テトラブロックナノ粒子を使用してＤＮＡ放出がより徐々に行われることを示す。

Claims (35)

  1. ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
    ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号１１の配列を含むかもしくは配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
    を含む組成物。
  2. 前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーを含む、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーを含む、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーが、ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧトリブロックコポリマーのＰＬＡとの化学的コンジュゲーションから形成される、請求項３に記載の組成物。
  5. ＰＬＡの分子量が、約１０，０００〜約１００，０００ダルトンである、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分が、配列番号９または配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記単離された核酸が、配列番号１１の配列を含むか、または、前記単離された核酸が、配列番号９もしくは配列番号１０と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
  8. カチオン性ペプチドを更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  10. カチオン性の細胞透過性ペプチドを更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 前記ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８から１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. Ｃ環化されたポリカチオン性ペプチド（配列番号８）を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記細胞透過性またはカチオン性ペプチドおよび前記単離された核酸が複合体化される、請求項８から１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリンおよびボルテゾミブからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。
  15. がん、自己免疫性疾患、炎症性疾患、代謝障害、発達障害、心血管疾患、肝疾患、腸疾患、感染性疾患、内分泌疾患および神経障害からなる群から選択される疾患の治療に使用するための、
    ａ）ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）およびポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を含むブロックコポリマーを含むポリマーナノ粒子と、
    ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号１１の配列を含むかもしくは配列番号９もしくは１０の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
    を含む医薬組成物。
  16. 前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ）ジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される、請求項１、２および５から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  17. 前記ポリマーナノ粒子が、ポリ（乳酸）−ポリ（エチレングリコール）−ポリ（プロピレングリコール）−ポリ（エチレングリコール）（ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧ）テトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。
  18. 前記ポリマーナノ粒子が、前記ポリマーナノ粒子の外側に付着した標的化部分を更に含み、前記標的化部分が抗体、ペプチドまたはアプタマーである、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーまたはＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成されたポリマーナノ粒子であって、サイトカインもしくはその部分、または前記サイトカインもしくはその部分をコードする単離された核酸を負荷しているポリマーナノ粒子。
  20. 前記サイトカインが、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一である、請求項１９に記載のポリマーナノ粒子。
  21. 前記単離された核酸が、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される、請求項１９または２０に記載のポリマーナノ粒子。
  22. 前記カチオン性の細胞透過性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される、請求項２１に記載のポリマーナノ粒子。
  23. 表５に記載のテトラブロックコポリマーを含む、請求項１から２２のいずれかに記載のポリマーナノ粒子。
  24. それを必要とする対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に、
    ａ）ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成されたポリマーナノ粒子と、
    ｂ）配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分、または、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質もしくはその部分をコードする単離された核酸と
    を含む治療有効量の医薬組成物を投与することを含む方法。
  25. 前記医薬組成物が、ドキソルビシン、ダウノルビシン、デシタビン、イリノテカン、ＳＮ−３８、シタラビン、ドセタキセル、トリプトリド、ゲルダナマイシン、１７−ＡＡＧ、５−ＦＵ、オキサリプラチン、カルボプラチン、タキソテール、メトトレキサート、パクリタキセル、インデノイソキノリンおよびボルテゾミブからなる群から選択される化学療法剤または標的化された抗がん剤を更に含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 前記がんが、乳がん、前立腺がん、非小細胞肺がん、転移性結腸がん、膵がんまたは血液悪性腫瘍である、請求項２４または２５に記載の方法。
  27. 前記がんが、ＰＤ−１不応性腫瘍を含む、請求項２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. 細胞においてＴＮＦ発現を誘導する方法であって、前記細胞を、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーを含むポリマーから形成された有効量のポリマーナノ粒子と接触させることを含み、前記ポリマーナノ粒子が、配列番号９の配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする単離された核酸を含む、方法。
  29. 前記ＴＮＦ−αタンパク質またはその部分が、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記単離された核酸が、配列番号９と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＴＮＦ−αタンパク質またはその部分をコードする、請求項２４から２８のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記単離された核酸が、カチオン性の細胞透過性ペプチドと複合体化される、請求項２４から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記カチオン性の細胞透過性ペプチドが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８およびポリアルギニンからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記ナノ粒子が、ＰＬＡ−ＰＥＧジブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記ナノ粒子が、ＰＬＡ−ＰＥＧ−ＰＰＧ−ＰＥＧテトラブロックコポリマーから本質的になるポリマーから形成される、請求項２４から３２のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ポリマーナノ粒子が、表５に記載のテトラブロックコポリマーを含む、請求項３４に記載の方法。
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