KR20240064009A - 화물 전달용 지질 2중층 코팅물을 가진 메조다공성 실리카 나노입자 - Google Patents

화물 전달용 지질 2중층 코팅물을 가진 메조다공성 실리카 나노입자 Download PDF

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triethylammonium
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안드레 이 넬
환 멍
샹성 류
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

표면을 갖고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 바디를 포함하는 나노캐리어는 기재된다. 나노캐리어는 또한 표면을 코팅하는 지질 2중층, 및 인지질 2중층 안에서 화물포획제를 포함한다. 인지질 2중층은 다수의 기공을 견고하게 밀봉시킨다.화물-포획 시약은 원하는 화물, 예컨대 약물과 상호작용하기 위해 선택될 수 있다.

Description

화물 전달용 지질 2중층 코팅물을 가진 메조다공성 실리카 나노입자{MESOPOROUS SILICA NANOPARTICLES WITH LIPID BILAYER COATING FOR CARGO DELIVERY}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은, 본 명세서에서 참고로 그 전문이 모든 목적을 위해 편입되는, 2016년 1월 8일 출원된, USSN 62/276,634의 이점 및 우선권을 주장한다.
정부 지원의 서술
본 발명은 하기 하에 정부 지원으로 실시되었다: 수여 번호 R01 CA133697 및 UOl CAl98846 (국립 보건원/국립 암 연구소에 의해 수여됨). 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
췌장 관상 선암종 (PDAC)는 6% 미만의 5-년 생존율을 가진 치명적 질환이다 (Siegel 등 (2014) CA Cancer J. CliN. 64(1): 9-29). 현재, 화학요법용 주요 치료 레지멘은 어느 한쪽 단일 시약, 젬시타빈 (GEM), 또는 4-약물 레지멘을 포함한다,). 폴피리녹스가, 개선된 생존 (11 개월 대 6.8 개월)로, GEM (31.6% 대 9.4%)보다 더 나은 반응 속도를 갖는 반면, 전자 조합은 상당히 더욱 독성이고 양호한 성능 상태를 가진 PDAC 환자의 수소로 제한된다 (Conroy 등 (2011) N. Engl. J. Med. 364(19): 1817-1825). 이리노테칸은 하기에서 중증 영향을 포함하는, 이러한 독성에 상당히 기여한다: 골수 (예를 들면 호중구감소증), 간 (예를 들면 괴사 및 지방증) 및 위장 (GI) 관 (예를 들면 구토, 설사) (Conroy 등 (2011) N. Engl. J. Med. 364(19): 1817-1825; Ueno 등 (2007) Cancer Chemother. Pharmacol. 59(4): 447-454; Loupakis 등 (2013) Br. J. Cancer, 108(12): 2549-2556). 따라서, PDAC에서 1차 요법에 대하여 이용가능한 약물 개선의 관점으로, 이리노테칸 독성을 개선하는 치료 레지멘에 대한 요구가 대단하다.
효능을 유지하면서, 이리노테칸 독성 감소에 대한 하나의 접근법은 전신 약물 방출을 감소시키면서 암 부위에 보호된 전달을 가진 나노캐리어에서 고-용량 약물 캡슐화이다. 폴리머 입자 및 리포좀을 포함하는, 상이한 담체 유형은 이리노테칸 전달을 위한 일부 성공으로 이용되고 있다 (Chou 등 (2003) J. Biosci. Bioeng., 95(4): 405-408; Onishi 등 (2003) Biol. Pharmaceut.Bull. 26(1): 116-119; Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res, 10(19): 6638-6649; Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277; Valencia 등 (2013) NanoMed. 8(5): 687-698; Sadzuka 등 (1998) Cancer Lett., 127(1): 99-106; Ramsay 등 (2008) Eur. J. Pharm. BioPharm. 68(3): 607-617; Li 등 (2015) Adv. Func. Mat. 25(5): 788-798). 그러나, 폴리머 나노입자가 유망한 시험관내 결과, 하기를 장입하는 제한된 용량을 보여주는 한편: 이리노테칸 (<1%, w/w) 플러스 미성숙한 약물 방출 (예를 들면, 5 시간 지나서 40%), 나노입자는 종양내 약물 전달을 개선하면서 요구된 독성 감소를 달성하지 못했다 (Valencia 등 (2013) NanoMed. 8(5): 687-698). 리포좀이 황산암모늄 또는 양성자 포획 제제의 사용을 통해 높은 이리노테칸 장입 용량을 달성할 수 있었던 한편 (Chou 등 (2003) J. Biosci. Bioeng., 95(4): 405-408; Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res, 10(19): 6638-6649; Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277; Sadzuka 등 (1998) Cancer Lett., 127(1): 99-106; Ramsay 등 (2008) Eur. J. Pharm. BioPharm. 68(3): 607-617), 전단 및 삼투 스트레스 하에 담체 불안정, 뿐만 아니라 혈청 단백질에 의한 2중층 파괴는 미성숙한 약물 방출 및 독성을 초래하였다 (Liu 등 (2000) In: Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 172(1-3): 57-67; Heurtault 등 (2003) Biomaterials, 24(23): 4283-4300; Sabın 등 (2006) Eur. Phys. J. E. 20(4): 401-408).
전술한 바와 같이, 임상시험에서 또는 치료 설정에서 암 약물을 전달하기 위한 많은 시도는 하기에 기반되고 있다: 리포좀 (Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res, 10(19): 6638-6649; Cancer Res. 2006, 66, 3271) 또는 폴리머계 시스템 (Onishi 등 (2003) Biol. Pharm. Bull. 26(1): 116-119). 대부분의 이들 담체는, 종종 순환 반감기를 연장시키기 위해 표면에서 PEG를 함유하는, 그리고 전형적으로 ~5 w/w% (예를 들면, 폴리머계 나노입자) 내지 ~50 w/w% (예를 들면, 리포좀 담체)의 장입 용량을 나타내는, 80-200 nm의 크기 범위에서 구형 입자 또는 초분자 어셈블리이다. 전-임상 수준에서, 쥣과 PDAC 모델을 포함하는, 동물 연구에서 이들 나노캐리어의 잠재적인 이점은 생체내 독성에서 감소, 향상된 항종양 효능, 및 개선된 생존율을 포함하는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 단지 작은 수의 나노캐리어는 PDAC 환자에 대하여 임상시험으로 진전되었다. 이온투과담체 (칼리마이신으로서 또한 공지된, A23187)을 포함하는 나노캐리어는 하기를 가능하게 하였다: 이리노테칸 전달 리포좀 제형 (Irinophore C) 및 양성자화 제제 이리노테칸 전달 리포좀 제형 (MM-398) (Baker 등 (2008) CliN. Cancer Res. 14: 7260-7271; Drummond 등 (2006) Cancer Res. 15(66): 3271-3277). Irinophore C 제형 (Champions Biotechnology)는, 이온투과담체, A23187, 또는 황산암모늄을 사용하는, 막관통 양성자 구배의 생성을 통해 활성 이리노테칸 장입을 사용하는 리포좀 담체이다 (Ramsay 등 (2008) Eur. J. Pharm. BioPharm. 68: 607-617). Irinophore C 제형은 2011년에 시작하였던 임상 연구에서 사용되었지만, 연구의 성과 또는 결과에 대하여 업데이트된 정보는 없었다.
최근 제3 기 임상시험에서, Merrimack에 의한 이리노테칸용 리포좀 담체 (MM-398)의 개발이 2nd-라인 치료 선택으로서 PDAC에서 개선된 생존 이점을 보여주었던 한편, Gi 관의 상대적으로 높은 비율 및 골수 독성은 중증 및 생명 위협 설사 및 호중구감소증에 대하여 블랙박스 경고를 초래하였다 (Von Hoff 등 (2013) Br. J. Cancer, 109(4): 920-925; www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm468654.htm). MM-398 임상시험에 참여하는 인간 대상체는 또한, 알라닌 아미노기전달효소 (ALT)를 포함하는, 간 효소의 상당한 상승을 보여주었다 (참조, 예를 들면, www.accessdata.fda.gov/drugatfda_docs/label/2015/207793LB.pdf). 그럼에도 불구하고, MM-398은 GEM 요법에 반응하는데 실패하는 환자에 대하여 PDAC에서 사용하기 위하여 FDA 승인을 받았고, Onivyde®로서 시판된다 (참조, 예를 들면, www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm468654.htm).
MM-398 리포좀 제형 (Merrimack Pharmaceuticals)는 다중음이온성 포획제의 지원으로 이리노테칸 하이드로클로라이드를 편입시킨다 (ESMO Gl 2014, www.merrimackpharma.com). 더욱 특이적으로, MM-398 리포좀 속에 이리노테칸 장입은 다가 음이온성 포획제, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)의 리포좀내 약물 캡슐화에 의해 달성되었다. 이러한 화학물질은 수동적 약물 캡슐화를 통해 달성될 수 있는 장입 10배 초과로 이리노테칸 양성자화 및 포획을 유발시킨다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res. 66(6): 3271-3277). MM-398 리포좀의 IV 투여는, 전이성 종양 병소의 억제를 포함하는, 마우스내 다양한 PDAC 종양 모델에서 완전한 종양 퇴행을 유도하는 것으로 나타났다 (Paz 등 (2102) Cancer Res. 72(12 Suppl): Abstract A63). MM-398은 현재 3기 임상시험에 있고 동물 및 인간 연구에서 자유 이리노테칸에 비교하여 개선된 종양 억제, 약동학 및 효능 제공에 대한 권리를 주장한다 (Kalra (2012) AACR meeting, Abstract #5622). 이것은 쥣과 이종이식 연구에서 20 mg/kg MM-398의 용량 (인간 동등 용량 60-120 mg/m2)를 이용하여 완전한 PDAC 퇴행을 주장하는 실험적 데이터를 포함한다 (Paz 등 (2102) Cancer Res. 72(12 Suppl): Abstract A63). MM-398은 또한 마우스에서 자유 이리노테칸의 최대 내성 용량 (MTD)을 80 내지 324 mg/kg 증가시킨다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res. 66(6): 3271-3277). 추가적으로, 하기에 의한 3기 임상시험에서: Merrimack Pharmaceuticals (Hoff 등ESMO GI 2014, www.merrimackpharma.com) (417 PDAC 환자를 포함하는), MM-398, 5-FU 및 류코보린의 조합은 6.1 개월의 전체 생존율 (OS)를 초래하였고, 이는 5-FU 및 류코보린을 받는 대조군 아암보다 1.9 개월 더 길다. 그러나, MM-398 리포좀 제형 속에 이리노테칸의 능동적 부하가 수동적인 캡슐화 절차에 걸쳐 약물 장입 용량을 향상시키는 한편, 합성 기술은 다중 단계를 요구하고 리포좀 담체는 본 명세서에서 제공된 LB-MSNP 플랫폼에 비교하여 세포내 방출의 동일한 양 또는 동일한 콜로이드성 안정성을 제공하지 않는다. 그럼에도 불구하고, MM-398은 GEM 요법에 반응하는데 실패하는 환자에 대하여 PDAC에서 사용하기 위하여 FDA 승인을 받았고, ONIVYDE®로서 시판된다. 리포좀에서 약물 포획을 증가시키기 위한 다중음이온성 폴리머의 사용은 ~80 nm 약물 침전을 유발시키고 (Zhu 등 (1996) 39(1): 138-142; Colbern 등 (1998) CliN. Cancer Res. 4(12): 3077-3082), 이것은 LB-MSNP 기공에 비교하여 리포좀 담체로부터 느린 이리노테칸 방출에 대하여 이유 중 하나를 구성한다.
따라서, 안전성 및 감소된 독성의 개선된 마진으로, 화학요법 예컨대 이리노테칸 화학요법을 포함하는, 효율적인 약물 전달을 가능하게 하는 전달 방법 및 나노캐리어에 대하여 미충족 욕구가 여전히 있다.
긴급 개입은 췌장 관상 선암종 (PDAC)의 5-년 생존율을 개선하기 위해 요구된다. (이리노테칸 (IRIN), 5-플루오로우라실 (5-FU), 옥살리플라틴 (OX), 및 류코보린 (LV)로 구성된) 폴피리녹스인, 4-약물 레지멘이 더 자주 사용된 젬시타빈 (GEM)보다 더 나은 생존 결과를 갖는 한편, 전자 치료 레지멘은 큰 독성이고 양호한 성능 상태를 가진 환자에서 사용하기 위하여 제한된다. 이리노테칸이 폴피리녹스 독성 (골수 및 위장관)에 상당히 기여하기 때문에, 본 발명의 하나의 명확한 목적은 구입-설계된 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP) 플랫폼으로 전자 약물의 독성을 감소시키는 것이고, 이는 코팅된 지질 2중층 (LB)를 거쳐 고-용량 이리노테칸 장입에 대하여 양성자 구배를 이용한다. LB-코팅된 MSNP (LB-MSNP) 담체의 개선된 안정성은, 예를 들어, 면역적격 마우스내 Kras-유래된 동소이식 PDAC 모델에서 리포좀 등가물에 비교된 경우 더 나은 보호된 이리노테칸 전달 및 증가된 종양 약물 농도를 허용한다. LB-MSNP 나노캐리어는 또한 종양 전이 치료에 더욱 효율적이다. 동등하게 중요한, 감소된 누출 및 LB-MSNP 담체에 의한 약물 방출의 더 느린 비율은 리포좀 담체에 비교하여 골수, 위장 및 간 독성의 비율을 극적으로 감소시킨다. LB-MSNP 담체에 의한 감소된 독성 및 고 효능의 조합은 PDAC 생존을 개선하기 위한 1차 치료로서 이리노테칸의 용도를 용이하게 한다.
일반적으로, 본 발명의 하나의 측면에서, 표면을 갖는 그리고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 바디, 상기 표면을 코팅하는 지질 2중층 (예를 들면, 인지질 2중층), 및 상기 코팅된 지질 2중층에 의해 기공에서 함유된 화물포획제를 포함하는 나노캐리어는 제공되고, 여기에서 서브마이크론 구조는 1 마이크론 미만의 최대 치수를 갖고, 상기 인지질 2중층은 다수의 기공을 견고하게 밀봉하고 추가의 패키징, 표적화, 이미지형성 및 작용화를 위하여 기초로서 작용할 수 있다.
본 발명의 하나의 상당한 측면은 개선된 화물/제제 (예를 들면 본 명세서에서 기재된 화학 구조를 가진 이리노테칸 또는 다른 분자(들)) 나노캐리어의 신규한 제조 방법을 포함한다. 이들 방법은 일반적으로 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공과 표면을 갖는 실리카 바디를 포함하는 미장입된 나노캐리어의 제공, 및 지질 2중층 (예를 들면, 인지질 2중층)에 의해 기공 내에서 화물-포획제, 표적제 또는 조영제의 캡슐화를 포함한다. 아래 상세히 논의된 바와 같이, 작업예는, 비제한적으로 농축된 이리노테칸 나노캐리어의 신규한 제조 방법을 포함한다. 특정 구현예에서 이들(tese) 방법은 거기에 이리노테칸을 받는데 적합한 다수의 기공을 포함하는 표면을 갖는 실리카 바디를 포함하는 나노캐리어 선택을 포함한다. 이들 방법에서, 이리노테칸 분자 (예를 들면 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트)를 포획 및/또는 상기의 확산에 특이적으로 영향을 미치는 능력을 갖는 제제는 또한 선택되고 다수의 기공 내에서 배치된다. 나노캐리어 및 기공은 지질 2중층으로 (예를 들어 초음파처리 공정을 이용하여) 완전히 코팅된다. 전형적으로 실리카 바디 나노캐리어는 상기 코팅 단계 직전에 건조 및/또는 세정되지 않는다임의로, 특정 구현예(emobdiments)에서, 상기 지질 2중층은 나노캐리어 기능을 용이하게 하기 위해 선택된 하나 이상의 생물활성 분자 (예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 표적 리간드, 및/또는 파클리탁셀 및/또는 활성화된 이리노테칸, SN38)을 포함할 수 있다. 상기 코팅 단계 이후, 이리노테칸은 그 다음 포획되는 기공 속으로 지질 2중층을 거쳐 이동하게 된다. 이것은 “원격 약물 장입”으로서 또한 공지된다. 이런 식으로, 하기를 갖는 이리노테칸 나노캐리어: 놀랍게도 높은 장입 용량 (예를 들면40 wt% 또는 40% 초과 약물/MSNP)는 형성될 수 있다. 이들 높은 약물 장입 용량에 더하여, 이들 방법을 이용하여 형성된 이리노테칸 나노캐리어는 다른 바람직한 특성의, 예를 들어 37 ℃에 7.4의 pH를 가진 생물학적 완충액에서 24 시간 동안 <5% 이리노테칸 누출을 나타내는 무리를 갖는다.
본 명세서에서 고려된 다양한 구현예는 하나 이상의 하기를 포함할 수 있지만, 상기에 제한될 필요는 없다:
구현예 1: 하기를 포함하는, 나노입자 약물 담체로서:
표면을 갖는 그리고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 나노입자;
표면을 코팅하는 지질 2중층;
상기 다수의 기공을 포함하는 기공 내에서 화물포획제 (카고 포획제, Cargo-trapping agent) ; 및
약물을 포함하는 화물, 상기 화물은 상기 기공에서 상기 화물포획제와 관련됨;
상기 서브마이크론 구조는 1 마이크론 미만의 최대 치수를 갖고, 상기 지질 2중층은 다수의 기공을 견고하게 밀봉시키는, 나노입자 약물 담체.
구현예 2: 구현예 1에 있어서, 상기 지질 2중층이 인지질, 콜레스테롤 (CHOL), 및 mPEG 인지질을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 3: 구현예 1 내지 2 중 어느 하나에 있어서, 상기 인지질이 C14-C20 탄소 쇄를 가진 포화 지방산, 및/또는 C14-C20 탄소 쇄를 가진 불포화 지방산, 및/또는 C12-C20 탄소 쇄와 지방산의 혼합물을 포함하는 천연 지질을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 4: 구현예 3에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린 (DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 및 디악틸포스파티딜콜린 (DAPC)로 구성되는 군으로부터 선택되는 포화 지방산을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 5: 구현예 3에 있어서, 상기 인지질이 계란 포스파티딜콜린 (계란 PC), 및 콩 포스파티딜콜린 (콩 PC)로 구성되는 군으로부터 선택되는 천연 지질을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 6: 구현예 3에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디미리스트올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 및 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 불포화 지방산을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 7: 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 인지질 C14-C18 탄소 쇄, 및 약 350 Da 내지 5000 Da 범위의 PEG 분자량을 가진 mPEG 인지질을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 8: 구현예 7에 있어서, 상기 지질 2중층이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG (DSPE-PEG)를 포함하는, 나노입자(nanoparitlce) 약물 담체.
구현예 9: 구현예 2에 있어서, 상기 지질 2중층이 DPPC/Chol/DSPE-PEG 또는 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 10: 구현예 9에 있어서, 상기 지질 2중층이 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 11: 구현예 10에 있어서, 상기 지질 2중층이 DSPC/Chol/DSPE-PEG2000을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 12: 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 50-90 mol% 인지질 : 10-50 mol% CHOL : 1-10 mol% mPEG 인지질의 비에서 인지질, 콜레스테롤, 및 mPEG 인지질을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 13: 구현예 10에 있어서, 상기 지질 2중층이 약 3:2:0.15의 몰비에서 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 14: 구현예 1 내지13 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 전체 나노입자를 포함하는 실질적으로 연속 2중층을 형성하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 15: 구현예 1 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 전체 나노입자를 포함하는 실질적으로 균일한 및 온전한 2중층을 형성하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 16: 구현예 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 실리카 나노입자가 메조다공성 실리카 나노입자인, 나노입자 약물 담체.
구현예 17: 구현예 16에 있어서, 상기 실리카 나노입자가 졸-겔 합성된 메조다공성 실리카 나노입자를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 18: 구현예 16 내지17 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 크기-제어되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 19: 구현예 16 내지18 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 콜로이드성으로 안정적인, 나노입자 약물 담체.
구현예 20: 구현예 16 내지19 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카가 약 1 내지 약 20 nm, 또는 약 1 내지 약 10 nm, 또는 약 2 내지 약 8 nm 범위인 평균 기공 크기를 갖는, 나노입자 약물 담체.
구현예 21: 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 약 50 nm 최대 약 300 nm, 또는 약 50 최대 약 200 nm, 또는 약 50 최대 약 150 nm, 또는 약 50 최대 약 100 nm, 또는 약 50 최대 약 80 nm, 또는 약 50 최대 약 70 nm, 또는 약 60 최대 약 70 nm 범위의 평균 크기를 갖는, 나노입자 약물 담체.
구현예 22: 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물과 반응전 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS), (NH4)2SO4, 암모늄 염, 트리메틸암모늄 염, 및 트리에틸암모늄 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 23: 구현예 22에 있어서, 상기 화물 포획제가 (NH4)2SO4를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 24: 구현예 22에 있어서, 상기 화물 포획제가 황산암모늄; 암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트,, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 포스페이트; 암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 시트레이트, 및 암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 암모늄 염을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 25: 구현예 22에 있어서, 상기 화물 포획제가 트리메틸암모늄 설페이트, 트리메틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 포스페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 시트레이트, 및 트리메틸암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 트리메틸암모늄 염을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 26: 구현예 22에 있어서, 상기 화물 포획제가 트리에틸암모늄 설페이트, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 포스페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 시트레이트, 및 트리에틸암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 트리에틸암모늄 염을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 27: 구현예 22에 있어서, 상기 약물과 반응전 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)인, 나노입자 약물 담체.
구현예 28: 구현예 27에 있어서, 상기 약물이 양성자화되고 SOS8-의 회합에서 겔-유사 침전물로서 상기 기공에서 포획되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 29: 구현예 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 약염기성 기를 포함하고, 화물포획제가 적어도 하나의 음이온성 기를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 30: 구현예 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 7 초과 11 미만 pKa를 갖도록 선택되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 31: 구현예 1 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 1차, 2차, 및 3차 아민을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 32: 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 약 5 내지 약 25 mg/mL의 수용해도 지수를 갖도록 선택되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 33: 구현예 1 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 약 -3.0 내지 약 3.0의 옥탄올/물 분배 계수 또는 logP 값을 갖도록 선택되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 34: 구현예 1 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 2-8 nm 및 실리카 나노입자의 기공의 평균 또는 중앙 크기 미만이도록 선택되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 35: 구현예 29 내지34 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 항암 약물을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 36: 구현예 35에 있어서, 상기 화물이 이리노테칸을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 37: 구현예 35에 있어서, 상기 화물이 토포이소머라제 억제제, 항종양 안트라사이클린 항생제, 유사분열 억제제, 알칼로이드, 알칼리성 알킬화제, 퓨린 또는 피리미딘 유도체, 및 단백질 키나제 억제제로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 38: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 토포테칸을 포함하는 토포이소머라제 억제제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 39: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 토포테칸, 10-하이드록시캄프토테신, 벨로테칸, 루비테칸, 비노렐빈, 및 LAQ824로 구성되는 군으로부터 선택되는 알칼로이드를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 40: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 독소루비신, 및 미톡산트론으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항종양 안트라사이클린 항생제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 41: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 빈블라스틴, 및 비노렐빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유사분열 억제제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 42: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 사이클로포스파마이드, 메클로르에타민, 및 테모졸로마이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 알칼리성 알킬화제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 43: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 5-플루오로우라실, 5’-데옥시-5-플루오로우리딘, 및 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 유도체를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 44: 구현예 37에 있어서, 상기 담체가 이마티닙, 오시머티닙 및 수니티닙 파조파닙, 엔자스타우린, 반데타닙, 에를로티닙, 다사티닙, 및 닐로티닙으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 억제제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 45: 구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 표적 모이어티, 융합유도 펩타이드, 및 수송 펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 모이어티에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 46: 구현예 45에 있어서, 상기 약물 담체가 암 세포 또는 종양 혈관에서 수용체를 결합시키는 펩타이드에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 47: 구현예 46에 있어서, 상기 약물 담체가 iRGD 펩타이드에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 48: 구현예 46에 있어서, 상기 약물 담체가 표에서 보여진 표적 펩타이드에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 49: 구현예 45 내지 48 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 트랜스페린, 및/또는 ApoE, 및/또는 폴레이트에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 50: 구현예 45 내지 49 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 암 마커에 결합하는 항체를 포함하는 표적 모이어티에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체.
구현예 51: 구현예 50에 있어서, 상기 약물 담체가 표에서 보여진 암 마커를 결합시키는 항체를 포함하는 표적 모이어티에 콘주게이션되는, 나노입자 약물 담체1.
구현예 52: 구현예 29 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 항생제, 항바이러스제, 또는 항진균제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 53: 구현예 52에 있어서, 상기 화물이 시프로플록사신, 및 레보플록사신으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항생제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 54: 구현예 52에 있어서, 상기 화물이 HIV 항바이러스를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 55: 구현예 54에 있어서, 상기 화물이 테노포비르, 디소프록실, 및 푸마레이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 항바이러스를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 56: 구현예 52에 있어서, 상기 화물이 암포테리신 B, 아니둘라펀진, 카스포펀진, 플루코나졸, 플루시토신, 이사부코나졸, 이트라코나졸, 마이카펀진, 포사코나졸, 및 보리코나졸로 구성되는 군으로부터 선택되는 항진균제를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 57: 구현예 1 내지 56 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 37 ℃에 7.4의 pH를 가진 생물학적 완충액에서 24 시간 동안 화물의 약 20% 미만, 또는 약 15% 미만, 또는 약 10% 미만, 또는 약 5% 미만 누출을 갖는, 나노입자 약물 담체.
구현예 58: 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 적어도 약 8% w/w, 또는 적어도 약 10% w/w, 또는 적어도 약 20% w/w, 또는 적어도 약 30% w/w, 또는 약 40% w/w 초과, 또는 약 50% w/w 초과, 또는 약 60% w/w 초과, 또는 약 70% w/w 초과, 또는 약 80% w/w 초과의 약물 장입 용량을 갖는, 나노입자 약물 담체.
구현예 59: 구현예 1 내지 57 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 적어도 80% w/w의 약물 장입 용량을 갖는, 나노입자 약물 담체.
구현예 60: 구현예 1 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 소수성 약물을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 61: 구현예 60에 있어서, 상기 지질 2중층이 파클리탁셀, 엘립티신, 캄프토테칸, SN-38, 및 지질 전구약물 (예를 들면, 아사이클로비르 디포스페이트 디미리스토일글리세롤, 독소루비신 콘주게이션된 인지질 전구약물, 뉴클레오사이드 유사체의 인지질 유도체, 인지질 연결된 클로르암부실, 및 기타 동종)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 소수성 약물을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 62: 구현예 60에 있어서, 상기 지질 2중층이 파클리탁셀을 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 63: 구현예 1 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 현탁액내 상기 약물 담체가 4 ℃에서 저장된 경우 적어도 1 개월, 또는 적어도 2 개월, 또는 적어도 3 개월, 또는 적어도 4 개월, 또는 적어도 5 개월, 또는 적어도 6 개월 동안 안정적인, 나노입자 약물 담체.
구현예 64: 구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 현탁액내 상기 약물 담체의 모집단이 약 30nm 미만, 또는 약 20 nm 미만, 또는 약 10 nm 미만, 또는 약 5 nm 미만, 또는 약 3 nm 미만, 또는 약 2 nm 미만의 폭 (반치폭)에서 범위로 하는 크기 분포를 보여주는, 나노입자 약물 담체.
구현예 65: 구현예 1 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 현탁액내 상기 약물 담체의 모집단이 실질적으로 단봉 크기 분포를 보여주는, 나노입자 약물 담체.
구현예 66: 구현예 1 내지 65 중 어느 하나에 있어서, 현탁액내 상기 약물 담체의 모집단이 약 0.2 미만, 또는 약 0.1 미만 PDI를 보여주는, 나노입자 약물 담체.
구현예 67: 구현예 1 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 현탁액내 상기 약물 담체의 모집단이 약 0.1 미만 또는 약 0.05 미만, 또는 약 1.7/120 미만 크기에서 변동 계수를 보여주는, 나노입자 약물 담체.
구현예 68: 구현예 1 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체의 ~ 3% 이상이 IV 주사로 발생하는 종양 부위에 분포하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 69: 구현예 1 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체가 동결건조후 재수화에서 안정적인 현탁액을 형성하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 70: 구현예 1 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체가, 항암 약물과 장입된 경우, 동소이식 PDAC 모델에서, 자유 약물, 또는 상기 약물을 함유하는 리포좀보다 더 효과적인 암 세포 사멸을 제공하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 71: 구현예 1 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체가, 항암 약물과 장입된 경우, 자유 약물 및/또는 리포좀내 약물에 비교된 대로 감소된 약물 독성을 보여주는, 나노입자 약물 담체.
구현예 72: 구현예 1 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체가 pH 7.4를 가진 생리 유체에서 콜로이드성 안정성을 갖고 전신 체내분포를 허용하도록 단분산되고 혈관 누출 (EPR 효과) 또는 통과세포외배출에 의해 질환 부위에 진입할 수 있는, 나노입자 약물 담체.
구현예 73: 하기를 포함하는, 약제학적 제형 상기 제형:구현예 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 다수의 나노입자 약물 담체; 및약제학적으로 허용가능한 담체.
구현예 74: 구현예 73에 있어서, 상기 제형이 유탁액, 분산액, 또는 현탁액인, 제형.
구현예 75: 구현예 74에 있어서, 상기 현탁액, 유탁액, 또는 분산액이 4 ℃에서 저장된 경우 적어도 1 개월, 또는 적어도 2 개월, 또는 적어도 3 개월, 또는 적어도 4 개월, 또는 적어도 5 개월, 또는 적어도 6 개월 동안 안정적인, 제형.
구현예 76: 구현예 73 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 제형내 상기 나노규모 약물 담체가 실질적으로 단봉 크기 분포를 보여주는, 제형.
구현예 77: 구현예 73 내지 76 중 어느 하나에 있어서, 상기 현탁액, 유탁액, 또는 분산액내 상기 약물 담체가 약 0.2 미만, 또는 약 0.1 미만 PDI를 보여주는, 제형.
구현예 78: 구현예 73 내지77 중 어느 하나에 있어서, 상기 제형이 정맥내 투여, 동맥내 투여, 뇌내 투여, 척추강내 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여, 흡입을 통한 투여 (비강내 및 기관내 전달 포함, 캐뉼라를 통한 두개내 투여, 및 피하 또는 근육내 데포 침착으로 구성되는 군으로부터 선택되는 경로를 통한 투여를 위하여 제형화되는, 제형.
구현예 79: 구현예 73 내지77 중 어느 하나에 있어서, 상기 제형이 멸균 주사가능한, 제형.
구현예 80: 구현예 73 내지 79 중 어느 하나에 있어서, 상기 제형이 단위 투약량 제형인, 제형.
구현예 81: 암 치료 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:구현예 1 내지 51 또는 57 내지 72 중 어느 하나에 따른 나노입자 약물 담체, 또는 구현예 73 내지 80 중 어느 하나에 따른 약제학적 제형의 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형내 약물은 항암 약물을 포함함.
구현예 82: 구현예 81에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형이 화학요법적 레지멘에서 1차 요법인, 방법.
구현예 83: 구현예 81에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형이 다중-약물 화학요법적 레지멘에서 성분인, 방법.
구현예 84: 구현예 83에 있어서, 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘이 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2 약물을 포함하는, 방법.
구현예 85: 구현예 83에 있어서, 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3 약물을 포함하는, 방법.
구현예 86: 구현예 83에 있어서, 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘이 적어도 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)를 포함하는, 방법.
구현예 87: 구현예 81 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 췌장 관상 선암종 (PDAC)인, 방법.
구현예 88: 구현예 81 내지 86 중 어느 하나에 있어서, 상기 암이 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 암인, 방법: 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련된 암 (예를 들면, 카포시 육종, 림프종), 항문 암, 부록 암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 담관 암, 간외 암, 방광 암, 뼈 암 (예를 들면, 유잉 육종, 골육종, 악성 섬유질 조직구종), 뇌간 신경아교종, 뇌 종양 (예를 들면, 별아교세포종, 뇌 및 척수 종양, 뇌간 신경아교종, 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 세균 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 유방 암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양 (예를 들면, 소아기, 위장), 심장 종양, 자궁경부 암, 척색종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장 암, 결장직장 암, 두개인두종, 피부 t-세포 림프종, 관 암 예를 들면(담즙, 간외), 관상피내 암종 (DCIS), 배아 종양, 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도 암, 비강신경교세포종, 두개외 세균 세포 종양, 고환외 세균 세포 종양, 간외 담관 암, 눈 암 (예를 들면, 안구내 흑색종, 망막모세포종), 골, 악성, 및 골육종의 섬유질 조직구종, 담낭 암, 위 (위) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 세균 세포 종양 (예를 들면, 난소 암, 고환 암, 두개외 암, 고환외 암, 중추 신경계), 임신성 융모성 종양, 뇌간 암, 털이 많은 세포 백혈병, 두경부 암, 심장 암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 랑게르한스 세포 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 안구내 흑색종, 소도 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장 암 (예를 들면, 신장 세포, 윌름스 종양, 및 다른 신장 종양), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두 암, 백혈병, 급성 림프아구성 (ALL), 급성 골수 (AML), 만성 림프구성 (CLL), 만성 골수성 (CML), 털이 많은 세포, 구순 및 구강 암, 간 암 (1차), 상피내 소엽 암종 (LCIS), 폐 암 (예를 들면, 소아기, 비소 세포, 소 세포), 림프종 (예를 들면, AIDS-관련된, 버킷 (예를 들면, 비-호지킨 림프종), 피부 T-세포 (예를 들면, 균상식육종, 세자리 증후군), 호지킨, 비-호지킨, 1차 중추 신경계 (CNS)), 거대글로불린혈증, 발덴스트룀, 남성 유방 암, 골 및 골육종의 악성 섬유질 조직구종, 흑색종 (예를 들면, 소아기, 안구내 (눈)), 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평상피 목 암, 정중선 관 암종, 입 암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수성 백혈병, 만성 (CML), 다발성 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경교세포종, 구강 암, 구순 및 구강인두 암, 골육종, 난소 암, 췌장 암, 췌장 신경내분비 종양 (소도 세포 종양), 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경 암, 인두 암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 혈장 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 1차 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선 암, 직장 암, 신장 세포 (신장) 암, 신우 및 요관, 과도기적 세포 암, 횡문근육종, 타액샘 암, 육종 (예를 들면, 유잉, 카포시, 골육종, 횡문근육종, 연조직, 자궁), 세자리 증후군, 피부 암 (예를 들면, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 기저 세포 암종, 비흑색종), 소장 암, 편평상피 세포 암종, 원발 불명의 편평상피 목 암, 위 (위) 암, 고환 암, 목 암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 융모성 종양, 요관 및 신우 암, 요도 암, 자궁 암, 자궁내막 암, 자궁 육종, 질 암, 외음부 암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 및 윌름스 종양.
구현예 89: 구현예 81 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 나노입자 약물 담체가 iRGD 펩타이드에 콘주게이션되지 않고 나노입자 약물 담체가 iRGD 펩타이드와 함께 투여되는, 방법.
구현예 90:감염 치료 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:구현예 1 내지 34 또는 52 내지 56 중 어느 하나에 따른 나노입자 약물 담체, 또는 구현예 73 내지 80 중 어느 하나에 따른 약제학적 제형의 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형내 약물이 항미생물 약물을 포함함.
구현예 91: 구현예 81에 있어서, 상기 감염이 약물-저항성 박테리움, 바이러스, 또는 진균에 의한 감염을 포함하는, 방법.
구현예 92: 구현예 81 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형이 정맥내 투여, 동맥내 투여, 뇌내 투여, 척추강내 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여, 흡입을 통한 투여 (비강내 및 기관내 전달 포함, 캐뉼라를 통한 두개내 투여, 및 피하 또는 근육내 데포 침착으로 구성되는 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여되는, 방법.
구현예 93: 구현예 81 내지 91 중 어느 하나에 있어서, 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형이 주사로서, IV 드립 백으로부터, 또는 약물-전달 캐뉼라를 통해 투여되는, 방법.
구현예 94: 구현예 81 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
구현예 95: 구현예 81 내지 93 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체가 비-인간 포유동물인, 방법.
구현예 96: 나노입자 약물 담체의 제조 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:표면을 갖는 그리고 거기에 약물 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카를 포함하는 나노입자를 제공하는 단계; 상기 포획제가 상기 기공 내에서 상기 약물을 포획하는 그것의 능력에 대하여 선택되는 상기 다수의 기공을 포함하는 기공에서 포획제를 배치하는 단계; 나노입자의 기공을 지질 2중층으로 코팅하는 단계; 및 상기 약물이 상기 기공을 진입하고, 상기 포획제와 반응하고 2중층 내에서 유지되는 상기 2중층을 통과할 수 있는 약물과 지질 2중층으로 코팅된 상기 나노입자를 접촉 또는 배싱하는 단계.
구현예 97: 구현예 96에 있어서, 상기 지질 2중층이 인지질, 콜레스테롤 (CHOL), 및 mPEG 인지질을 포함하는, 방법.
구현예 98: 구현예 96 내지 97 중 어느 하나에 있어서, 상기 인지질이 C14-C20 탄소 쇄를 가진 포화 지방산, 및/또는 C14-C20 탄소 쇄를 가진 불포화 지방산, 및/또는 C12-C20 탄소 쇄를 가진 지방산의 혼합물을 포함하는 천연 지질을 포함하는, 방법.
구현예 99: 구현예 98에 있어서, 상기 인지질이 포스파티딜콜린 (DPPC), 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 및 디악틸포스파티딜콜린 (DAPC)로 구성되는 군으로부터 선택되는, 포화 지방산을 포함하는, 방법.
구현예 100: 구현예 98에 있어서, 상기 인지질 계란 포스파티딜콜린 (계란 PC), 및 콩 포스파티딜콜린 (콩 PC)로 구성되는 군으로부터 선택되는 천연 지질을 포함하는, 방법.
구현예 101: 구현예 98에 있어서, 상기 인지질이 1,2-디미리스트올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 및 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린으로 구성되는 군으로부터 선택되는 불포화 지방산을 포함하는, 방법.
구현예 102: 구현예 96 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 인지질 C14-C18 탄소 쇄, 및 약 350 Da 내지 5000 Da 범위의 PEG 분자량을 가진 mPEG 인지질을 포함하는, 방법.
구현예 103: 구현예 102에 있어서, 상기 지질 2중층이 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-PEG (DSPE-PEG)를 포함하는, 나노입자 약물 담체.
구현예 104: 구현예 97에 있어서, 상기 지질 2중층이 DPPC/Chol/DSPE-PEG 또는 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 방법.
구현예 105: 구현예 104에 있어서, 상기 지질 2중층이 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 방법.
구현예 106: 구현예 105, 상기 지질 2중층이 DSPC/Chol/DSPE-PEG2000을 포함하는, 방법.
구현예 107: 구현예 96 내지 106 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 50-90 mol% 인지질 : 10-50 mol% CHOL : 1-10 mol% mPEG 인지질의 비에서 인지질, 콜레스테롤, 및 mPEG 인지질을 포함하는, 방법.
구현예 108: 구현예 105, 상기 지질 2중층이 약 3:2:0.15의 몰비에서 DSPC/Chol/DSPE-PEG를 포함하는, 방법.
구현예 109: 구현예 96 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층을 포함하는 상기 지질이 전체 나노입자에 걸쳐 연속 2중층을 형성하는데 충분한 비로 상기 나노입자와 조합되는, 방법.
구현예 110: 구현예 96 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층을 포함하는 상기 지질이 약 1.0:3.0 범위의 입자:지질 비로 상기 나노입자와 조합되는, 방법.
구현예 111: 구현예 96 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층을 포함하는 상기 지질이 약 1.0:1.1의 입자:지질 비로 상기 나노입자와 조합되는, 방법.
구현예 112: 구현예 96 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 전체 나노입자를 포함하는 실질적으로 연속 2중층을 형성하는, 방법.
구현예 113: 구현예 96 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 전체 나노입자를 포함하는 실질적으로 균일한 및 온전한 2중층을 형성하는, 방법.
구현예 114: 구현예 96 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 상기 실리카 나노입자가 메조다공성 실리카 나노입자인, 방법.
구현예 115: 구현예 114에 있어서, 상기 실리카 나노입자가 졸-겔 합성된 메조다공성 실리카 나노입자를 포함하는, 방법.
구현예 116: 구현예 96 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 크기-제어되는, 방법.
구현예 117: 구현예 96 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 콜로이드성으로 안정적인, 방법.
구현예 118: 구현예 96 내지 117 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카가 약 1 내지 약 20 nm, 또는 약 1 내지 약 10 nm, 또는 약 2 내지 약 8 nm 범위인 평균 기공 크기를 갖는, 방법.
구현예 119: 구현예 96 내지 118 중 어느 하나에 있어서, 상기 메조다공성 실리카 나노입자가 약 50 nm 최대 약 300 nm, 또는 약 50 최대 약 200 nm, 또는 약 50 최대 약 150 nm, 또는 약 50 최대 약 100 nm, 또는 약 50 최대 약 80 nm, 또는 약 50 최대 약 70 nm, 또는 약 60 최대 약 70 nm 범위의 평균 크기를 갖는, 방법.
구현예 120: 구현예 96 내지 119 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물과 반응전 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS), (NH4)2SO4, 암모늄 염, 트리메틸암모늄 염, 및 트리에틸암모늄 염으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
구현예 121: 구현예 120에 있어서, 상기 화물 포획제가 (NH4)2SO4를 포함하는, 방법.
구현예 122: 구현예 120에 있어서, 상기 화물 포획제가 황산암모늄; 암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트,, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 포스페이트; 암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 시트레이트, 및 암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 암모늄 염을 포함하는, 방법.
구현예 123: 구현예 120에 있어서, 상기 화물 포획제가 트리메틸암모늄 설페이트, 트리메틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 포스페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 시트레이트, 및 트리메틸암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 트리메틸암모늄 염을 포함하는, 방법.
구현예 124: 구현예 120에 있어서, 상기 화물 포획제가 트리에틸암모늄 설페이트, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 포스페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 시트레이트, 및 트리에틸암모늄 아세테이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 트리에틸암모늄 염을 포함하는, 방법.
구현예 125: 구현예 120에 있어서, 상기 약물과 반응전 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)인, 방법.
구현예 126: 구현예 125에 있어서, 상기 약물은 양성자화되고 SOS8-의 회합에서 겔-유사 침전물로서 상기 기공에서 포획되는, 방법.
구현예 127: 구현예 96 내지 126 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 약염기성 기를 포함하고, 화물포획제가 적어도 하나의 음이온성 기를 포함하는, 방법.
구현예 128: 구현예 96 내지 127 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 7 초과 11 미만 pKa를 갖도록 선택되는, 방법.
구현예 129: 구현예 96 내지 128 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민을 포함하는, 방법.
구현예 130: 구현예 96 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물이 약 5 내지 약 25 mg/mL의 수용해도 지수를 갖도록 선택되는, 방법.
구현예 131: 구현예 96 내지 130 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 약 -3.0 내지 약 3.0의 옥탄올/물 분배 계수 또는 logP 값을 갖도록 선택되는, 방법.
구현예 132: 구현예 96 내지 131 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 2-8 nm 및 실리카 나노입자의 기공의 평균 또는 중앙 크기 미만이도록 선택되는, 방법.
구현예 133: 구현예 127 내지132 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 항암 약물을 포함하는, 방법.
구현예 134: 구현예 133에 있어서, 상기 화물이 이리노테칸을 포함하는, 방법.
구현예 135: 구현예 133에 있어서, 상기 화물이 토포이소머라제 억제제, 항종양 안트라사이클린 항생제, 유사분열 억제제, 알칼로이드, 알칼리성 알킬화제, 퓨린 또는 피리미딘 유도체, 단백질 키나제 억제제로 구성되는 군으로부터 독립적으로 선택되는 하나 이상의 약물을 포함하는, 방법.
구현예 136: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 토포테칸을 포함하는 토포이소머라제 억제제를 포함하는, 방법.
구현예 137: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 토포테칸, 10-하이드록시캄프토테신, 벨로테칸, 루비테칸, 비노렐빈, 및 LAQ824로 구성되는 군으로부터 선택되는 알칼로이드를 포함하는, 방법.
구현예 138: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 독소루비신, 및 미톡산트론으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항종양 안트라사이클린 항생제를 포함하는, 방법.
구현예 139: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 빈블라스틴, 및 비노렐빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 유사분열 억제제를 포함하는, 방법.
구현예 140: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 사이클로포스파마이드, 메클로르에타민, 및 테모졸로마이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 알칼리성 알킬화제를 포함하는, 방법.
구현예 141: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 5-플루오로우라실, 5’-데옥시-5-플루오로우리딘, 및 젬시타빈으로 구성되는 군으로부터 선택되는 퓨린 또는 피리미딘 유도체를 포함하는, 방법.
구현예 142: 구현예 135에 있어서, 상기 담체가 이마티닙, 오시머티닙 및 수니티닙 파조파닙, 엔자스타우린, 반데타닙, 에를로티닙, 다사티닙, 및 닐로티닙으로 구성되는 군으로부터 선택되는 단백질 키나제 억제제를 포함하는, 방법.
구현예 143: 구현예 96 내지 142 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 표적 모이어티, 융합유도 펩타이드, 및 수송 펩타이드로 구성되는 군으로부터 선택되는 모이어티에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 144: 구현예 96 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법이 구현예 1 내지 72 중 어느 하나에 따른 나노입자 약물 담체를 생산하는, 방법.
구현예 145: 구현예 143에 있어서, 상기 약물 담체가 암 세포에서 수용체를 결합시키는 펩타이드에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 146: 구현예 145에 있어서, 상기 약물 담체가 iRGD 펩타이드에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 147: 구현예 145에 있어서, 상기 약물 담체가 표 2에서 보여진 표적 펩타이드에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 148: 구현예 143 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 트랜스페린, 및/또는 ApoE, 및/또는 폴레이트에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 149: 구현예 143 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 암 마커에 결합하는 항체를 포함하는 표적 모이어티에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 150: 구현예 149에 있어서, 상기 약물 담체가 표 1에서 보여진 암 마커를 결합시키는 항체를 포함하는 표적 모이어티에 콘주게이션되는, 방법.
구현예 151: 구현예 127 내지132 중 어느 하나에 있어서, 상기 화물이 항생제를 포함하는, 방법.
구현예 152: 구현예 151에 있어서, 상기 화물이 시프로플록사신, 레보플록사신, 및 HIV 항레트로바이러스 (예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트, 등) 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 항생제를 포함하는, 방법.
구현예 153: 구현예 96 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 적어도 30% w/w, 또는 약 40% w/w 초과, 또는 약 50% w/w 초과, 또는 약 60% w/w 초과, 또는 약 70% w/w 초과, 또는 약 80% w/w 초과의 용량으로 장입되는, 방법.
구현예 154: 구현예 96 내지 152 중 어느 하나에 있어서, 상기 약물 담체가 적어도 80% w/w의 용량으로 장입되는, 방법.
구현예 155: 구현예 96 내지 154 중 어느 하나에 있어서, 상기 지질 2중층이 소수성 약물을 포함하는, 방법.
구현예 156: 구현예 155에 있어서, 상기 지질 2중층이 파클리탁셀, 엘립티신, 캄프토테칸, SN-38, 및 지질 전구약물 (예를 들면, 아사이클로비르 디포스페이트 디미리스토일글리세롤, 독소루비신 콘주게이션된 인지질 전구약물, 뉴클레오사이드 유사체의 인지질 유도체, 인지질 연결된 클로르암부실, 및 기타 동종)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 소수성 약물을 포함하는, 방법.
구현예 157: 구현예 155에 있어서, 상기 지질 2중층이 파클리탁셀을 포함하는, 방법.
구현예 158: 하기 단계를 포함하는, 이리노테칸 나노캐리어의 제조 방법:거기에 이리노테칸을 받는데 적합한 다수의 기공을 포함하는 표면을 갖는 실리카 바디를 포함하는 나노캐리어를 제공하는 단계, 다수의 기공 내에서 이리노테칸을 포획하는 그것의 능력에 대하여 선택된 제제를 배치하는 단계; 인지질 2중층으로 (임의로 초음파처리 공정을 이용하여) 나노캐리어의 기공을 코팅하는 단계; 및 인지질 2중층 코팅된 이리노테칸 나노캐리어가 제조되도록, 인지질 2중층 코팅된 기공 속으로 이리노테칸을 도입하는 단계.
구현예 159: 구현예 158에 있어서, 상기 실리카 바디가 졸-겔 합성된, 크기-제어된 및 콜로이드성으로 안정적 실리카 바디를 포함하는, 방법.
구현예 160: 구현예 158에 있어서, 상기 이리노테칸 포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)인, 방법.
구현예 161: 구현예 160에 있어서, 상기 나노캐리어가 하기인, 방법:(a) 적어도 20% (또는 30% 또는 40%) w/w의 이리노테칸 장입 용량을 갖고; 및/또는 (b) 37 ℃에 7.4의 pH를 가진 생물학적 완충액에서 24 시간 동안 <5% (또는 <10%) 이리노테칸 누출을 보여줌.
구현예 162: 구현예 161에 있어서, 상기 나노캐리어가 pH 7.4를 가진 생리 유체에서 콜로이드성 안정성을 갖고 전신 체내분포를 허용하도록 단분산되고 혈관 누출 (EPR 효과) 또는 통과세포외배출에 의해 질환 부위에 진입할 수 있는, 방법.
구현예 163: 구현예 161에 있어서, 상기 인지질 2중층이 콜레스테롤 및/또는 파클리탁셀을 포함하는, 방법.
구현예 164: 하기 단계를 포함하는, 나노캐리어의 제조 방법:표면을 갖는 그리고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 바디, 및 상기 표면을 코팅하는 인지질 2중층을 포함하는 미장입된 나노캐리어를 제공하는 단계; 상기 인지질 2중층 내에서 화물포획제를 캡슐화하는 단계.
구현예 165: 구현예 164에 있어서, 화물포획제와 상호작용하기 위해 선택된 화물에 나노캐리어를 노출시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
구현예 166: 구현예 165에 있어서, 상기 화물이 7 초과 11 미만 pKa를 갖도록 선택되고 양성자화될 수 있고, 화물포획제가 적어도 하나의 음이온성 기를 포함하는, 방법.
구현예 167: 구현예 165에 있어서, 상기 화물이 이리노테칸이고 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)인, 방법.
구현예 168: 구현예 165에 있어서, 상기 화물이 토포이소머라제 I 억제제, 토포테칸; 하나 이상의 항종양 안트라사이클린 항생제, 독소루비신 및 미톡산트론; 하나 이상의 유사분열 억제제, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 또는 하나 이상의 티로신-키나제 억제제 이마티닙, 오시머티닙 및 수니티닙인, 방법.
구현예 169: 구현예 165에 있어서, 상기 나노캐리어가 적어도 30% w/w의 약물 장입 용량을 갖는, 방법.
구현예 170: 하기를 포함하는, 나노캐리어:표면을 갖는 그리고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 바디; 상기 표면을 코팅하는 인지질 2중층; 및 상기 인지질 2중층 내에서 화물포획제; 상기 서브마이크론 구조는 1 마이크론 미만의 최대 치수를 갖고, 상기 인지질 2중층은 다수의 기공을 견고하게 밀봉시킴.
구현예 171: 구현예 170에 있어서, 인지질 2중층 내에서 화물을 추가로 포함하는, 나노캐리어.
구현예 172: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 화물포획제와 회합되는, 나노캐리어.
구현예 173: 구현예 172에 있어서, 상기 화물이 양성자화될 수 있는 적어도 하나의 약염기성 기를 포함하고, 화물포획제가 적어도 하나의 음이온성 기를 포함하는, 나노캐리어.
구현예 174: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 7 초과 11 미만 pKa를 갖도록 선택되는, 나노캐리어.
구현예 175: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민을 포함하는, 나노캐리어.
구현예 176: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 5-25 mg/mL의 수용해도 지수를 갖도록 선택되는, 나노캐리어.
구현예 177: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 -3.0 내지 3.0의 옥탄올/물 분배 계수 또는 logP 값을 갖도록 선택되는, 나노캐리어.
구현예 178: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 2-8 nm 및 나노캐리어의 기공의 크기의 미만이도록 선택되는, 나노캐리어.
구현예 179: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 이리노테칸이고 상기 화물포획제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)인, 나노캐리어
구현예 180: 구현예 171에 있어서, 상기 화물이 토포이소머라제 I 억제제, 토포테칸; 하나 이상의 항종양 안트라사이클린 항생제, 독소루비신 및 미톡산트론; 하나 이상의 유사분열 억제제, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 또는 하나 이상의 티로신-키나제 억제제 이마티닙, 오시머티닙 및 수니티닙인, 나노캐리어.
구현예 181: 구현예 171에 있어서, 상기 나노캐리어가 37 ℃에 7.4의 pH를 가진 생물학적 완충액에서 24 시간 동안 화물의 5% 미만 누출을 갖는, 나노캐리어.
구현예 182: 구현예 171에 있어서, 상기 나노캐리어가 적어도 30% w/w의 약물 장입 용량을 갖는, 나노캐리어.
구현예 183: 구현예 171에 있어서, 상기 나노캐리어가 적어도 80% w/w의 약물 장입 용량을 갖는, 나노캐리어.
구현예 184: 구현예 170에 있어서, 상기 인지질 2중층이 파클리탁셀을 포함하는, 나노캐리어.
본 발명의 다른 목적, 피쳐 및 이점은 다음과 같은 상세한 설명으로부터 당해 분야의 숙련가에 분명해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 예는, 본 발명의 일부 구현예를 나타내면서, 예시로서 및 비제한적으로 주어지는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 많은 변화 및 변형은 이의 사상으로부터 이탈 없이 실시될 수 있고, 본 발명은 모든 그러한 변형을 포함한다.
정의
용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 인간, 뿐만 아니라 비-인간 포유동물 (예를 들면, 비-인간 영장류, 갯과, 말과, 고양이과, 돼지과, 소과, 유제류, 토끼목, 및 기타 동종)을 지칭할 수 있다. 다양한 구현예에서, 대상체는 외래환자로서 병원에서, 또는 다른 임상 문맥에서 의사 또는 다른 건강 작업자의 관리하에 인간 (예를 들면, 성인 남성, 성인 여성, 청소년 남성, 청소년 여성, 남성 아동, 여성 아동)일 수 있다. 특정 구현예에서, 대상체는 의사 또는 다른 건강 작업자의 관리 또는 처방전 하에 있지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 "필요로 하는 대상체"는, 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체 (실리카솜)이 유도되는 병리학에 대하여 위험에 처하거나, 상기를 앓고 있는, 아래 기재된 바와 같은, 대상체를 지칭한다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서 대상체는 암 (예를 들면, 췌장 관상 선암종 (PDAC), 유방 암 (예를 들면, 약물-저항성 유방 암), 결장 암, 뇌암, 및 기타 동종)을 가진 대상체이다. 특정 구현예에서 대상체는, 비제한적으로 약물-저항성 미생물 감염을 포함하는, 미생물 감염을 가진 대상체이다.
예를 들면, 병리학 또는 질환 치료와 관련하여 사용될 때 용어 "치료하다"는 그 병리학 또는 질환의 하나 이상의 증상의 완화 및/또는 제거, 및/또는 그 병리학 또는 질환의 하나 이상의 증상의 발병률 또는 중증도에서 감소 및/또는 상기의 진행에서 지연, 및/또는 그 병리학 또는 질환의 예방을 지칭한다. 용어 치료하다는 병리학 또는 질환의 개시의 예방 또는 개시에서 지연을 포함하는 예방적 치료를 지칭할 수 있다.
제1 화합물 (예를 들면, 이리노테칸을 함유하는 실리카솜) 및 제2 화합물 (예를 들면, iRGD 펩타이드)의 공투여와 관련하여 사용될 때 용어 "공투여" 또는 "와 함께 투여 " 또는 "병용치료"는 제1 화합물 및 제2 화합물이 투여되어서 이들이 투여되는 유기체에서 제1 화합물 및 제2 화합물의 생물학적 활성에서 적어도 일부 연대순의 중첩이 있다는 것을 나타낸다. 공투여는 동시 투여 또는 순차적인 투여를 포함할 수 있다. 순차적인 투여에서 그것의 생물학적 활성이 중첩하는 한 제1 화합물 및 제2 화합물의 투여 사이 일부 실질적인 지연 (예를 들면, 몇분 또는 심지어 몇시간)조차 될 수 있다. 특정 구현예에서 공투여(coadminstration)는 유기체에서 향상된 치료적 또는 예방적 효과를 생산하기 위해 제1 화합물 및 제2 화합물을 허용하는 시간 프레임을 통해서이다. 특정 구현예에서 향상된 효과는 상승작용 효과이다.
용어 "나노캐리어" 및 "나노입자 약물 담체" 및 "실리카솜"은 상호교환적으로 사용되고, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 “다공성 나노입자”와 교환가능한, 다공성 입자 코어, 및 다공성 입자 코어를 감싸는 (또는 둘러싸거나 뒤덮는) 지질 2중층을 갖는 나노구조를 지칭한다. 특정 구현예에서 실리카 나노입자는 다공성 실리카 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP))이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “지질”은 종래의 지질, 인지질, 콜레스테롤, PEG의 부착을 위하여 화학적으로 작용화된 지질 및 리간드, 등을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “지질 2중층” 또는 "LB"는 탄화수소 꼬리가 연속 무극성 상을 형성하기 위해 안으로 맞이하는 배향된 양친매성 지질 분자의 임의의 이중 층을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “리포좀”은, 종래에 정의된 바와 같이, 지질 2중층에 의해 봉입된 수성 구획을 지칭한다 (참조, 예를 들면, Stryer (1981) Biochemistry, 2d Edition, W.H.Freeman & Co., p.213).
실리카솜에서 정의된 지질 2중층과 비교하여, 리포좀에서 지질 2중층은 “지지되지 않은 지질 2중층”으로서 지칭될 수 있고 리포좀 자체는 (미장입된 경우) “비어있는 리포좀”으로서 지칭될 수 있다. 실리카솜에서 지질 2중층이 “지지된 지질 2중층”으로서 지칭될 수 있는 것은 실리카솜에서 지질 2중층이 표면상에 위치하고 다공성 입자 코어에 의해 지지되기 때문이다. 특정 구현예에서, 지질 2중층은 소수성 코어의 3-4 nm 두께, 플러스 수화된 친수성 헤드 그룹 층 (각각 약 0.9 nm) 플러스 약 0.3 nm 각각의 2 부분적으로 수화된(hydrated) 영역을 포함하는 약 6 nM 내지 약 7 nm 범위의 두께를 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “선택적 표적” 또는 “특이적 결합”은 (비어있는 또는 장입된) 실리카솜의 표면에서, 특히, 실리카솜의 지질 2중층의 표면에서 표적 리간드의 사용을 지칭하고, 상기 리간드는 표적, 예를 들면, 관심 세포 표면에서 발현된 수용체 또는 다른 생체분자의 성분과 특이적으로/선택적으로 상호작용한다. 표적 리간드는 펩타이드, 항체, 압타머, 표적 펩타이드, 폴리사카라이드(polysaccharides), 및 기타 동종 같은 그러한 분자 및/또는 물질을 포함할 수 있다.
표적 리간드를 갖는 실리카솜은 “표적된 실리카솜”으로서 지칭될 수 있다.
용어 "실리카솜"은 실리카 나노입자가 지질 2중층 (예를 들면, 인지질 2중층)으로 완전히 피복되는 (약물 전달) 실리카 나노입자를 함유하는 약물을 지칭한다. 특정 구현예에서 실리카 나노입자는 다공성 실리카 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카 나노입자)이다.
용어 "약" 또는 "대략"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 값이 측정 또는 결정되는 방법, 즉 측정 시스템의 한계치, 즉 특정한 목적, 예컨대 약제학적 제형에 요구된 정확성의 정도에 부분적으로 의존할, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정된 바와 같이 특정한 값에 대하여 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것을 지칭한다. 예를 들어, "약"은, 당해 분야에서 실시에 따라, 1 이내 또는 1 초과 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5% 및 더욱 바람직하게는 더욱 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 관하여, 상기 용어는 값의 자릿수 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 및 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정한 값이 본원 및 청구항에서 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 특정한 값에 대하여 허용가능한 오차 범위 내를 의미하는 용어 "약"은 추정될 수 있다.
용어 "약물"은 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 동물 및 인간에서 치료 효과를 나타내는, 다양한 분자 크기, 작은 및 큰, 자연 발생 또는 합성의 화학 독립체를 지칭한다. 약물은, 비제한적으로, 유기 분자 (예를 들면, 작은 유기 분자), 치료 단백질, 펩타이드, 항원, 또는 다른 생체분자, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 작제물 인코딩 CRISPR cas9 성분 및, 임의로 하나 이상의 가이드 RNAs, 및 기타 동종을 포함할 수 있다.
"약제학적으로 허용가능한 담체"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이 임의의 표준 약제학적으로 허용가능한 담체로서 정의된다. 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유용한 조성물의 공지된 제조 방법에 따라 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체는 희석제, 아쥬반트, 및 비히클, 뿐만 아니라 담체, 및 불활성, 무독성 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 또는 본 발명의 활성 성분과 반응하지 않는 캡슐화 물질을 포함할 수 있다. 예는, 비제한적으로, 인산 완충 식염수, 생리적 염수, 물, 및 유탁액, 예컨대 오일/물 유탁액을 포함한다. 담체는 예를 들어, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 기타 동종), 이의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 제형은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려지고 쉽게 이용가능한 수많은 공급원에서 기재된다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin E W [1995] Easton Pa., Mack Publishing Company, 19th ed.)는 본 명세서에서 기재된 실리카솜과 회합하여 사용될 수 있는 제형을 기재한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "항체"는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자의 단편에 의해 실질적으로 인코딩된 또는 표적에 (예를 들면, 표적 폴리펩타이드)에 결합 (예를 들면, 특이적으로 결합)할 수 있는 거기로부터 유래된 하나 이상의 폴리펩타이드로 구성되는 단백질을 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 어느 한쪽 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로서 분류되고, 차례로 면역글로불린 부류, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE, 각각을 정의한다.
전형적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다고 공지된다. 각각의 사량체는 폴리펩타이드 쇄의 2 동일한 쌍으로 구성되고, 각각의 쌍은 1 "경" (약 25 kD) 및 1 "중" 쇄 (약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 쇄의 N-말단은 항원 인식을 주로 책임지는 약 100 내지 110 또는 초과 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 이들 경쇄 및 중쇄 각각을 지칭한다.
항체는 온전한 면역글로불린으로서 또는 다양한 펩티다아제로 소화에 의해 생산된 수많은 양호하게 특성규명된 단편으로서 실재한다. 따라서, 예를 들어, 펩신은 자체가 디설파이드 결합에 의해 VH-CH1에 연결된 경쇄인 F(ab)'2, Fab의 이량체를 생산하기 위해 힌지 영역에서 디설파이드 연결기 밑에서 항체를 소화시킨다. F(ab)'2는 힌지 영역에서 디설파이드 연결을 파괴하기 위해 온화한 조건 하에서 감소될 수 있어서 이로써 (Fab')2 이량체를 Fab' 모노머로 전환시킬 수 있다. Fab' 모노머는 본질적으로 힌지 영역의 일부를 가진 Fab이다 (참조, Fundamental Immunology, W.E. Paul, ed., Raven Press, N. Y.(1993), 다른 항체 단편의 더욱 상세한 설명을 위하여). 다양한 항체 단편이 온전한 항체의 소화에 관하여 정의되는 한편, 당업자는 상기 Fab' 단편이 어느 한쪽 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론 이용에 의해 드 노보 합성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 따라서, 용어 항체는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 또한 어느 한쪽 전체의 항체의 변형에 의해 생산된 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 드 노보 합성된 항체 단편을 포함한다. 특정 바람직한 항체는 단일 쇄 항체 (단일 폴리펩타이드 쇄로서 실재하는 항체), 더욱 바람직하게는 가변 중쇄 및 가변 경쇄가 (직접적으로 또는 펩타이드 링커를 통해) 함께 연결되어 연속 폴리펩타이드를 형성하는 단일 쇄 Fv 항체 (sFv 또는 scFv)를 포함한다. 단일 쇄 Fv 항체는 어느 한쪽 직접적으로 연결된 또는 펩타이드-인코딩 링커에 의해 연결된 VH- 및 VL- 인코딩 서열을 포함하는 핵산으로부터 발현될 수 있는 공유결합된 VH-VL 이종이량체이다. Huston, 등 (1988) Proc.Nat. Acad.Sci. USA, 85:5879-5883.VH 및 VL이 단일 폴리펩타이드 쇄로서 각각에 연결되는 한편, VH 및 VL 도메인은 비-공유적으로 회합한다. 섬유상 파아지의 표면에서 발현되기 위한 제1 기능성 항체 분자는 단일-쇄 Fv's (scFv)이었지만, 그러나, 대안적인 발현 전략은 또한 성공적이었다. 예를 들어 Fab 분자는 (중 또는 경) 쇄 중 하나가 가용성 분자로서 주변세포질에 유출된 상보적 쇄 및 g3 캡시드 단백질에 융합되면 파아지 상에 표시될 수 있다. 2 쇄는 동일한 또는 상이한 레플리콘 상에 인코딩될 수 있고; 중요한 점은 각각의 Fab 분자내 2 항체 쇄가 번역후에 조립하고 이량체가, 예를 들면, g3p에 대해, 쇄 중 하나의 연결을 통해 파아지 입자 속으로 편입되는 것이다 (참조, 예를 들면, 미국특허 번호:5733743). 항원-결합 부위의 구조에 실질적으로 유사한 3차원 구조 속으로 폴딩하는 분자 속에 항체 V 영역으로부터 자연적으로 응집된, 그러나 화학적으로 분리된 경 및 중 폴리펩타이드 쇄를 전환시키는 scFv 항체 및 수많은 다른 구조는 당해 분야의 숙련가에 공지된다 (참조 예를 들면, 미국특허 번호 5,091,513, 5,132,405, 및 4,956,778). 특정 구현예에서 항체는 하기를 포함할 수 있다: 파아지 상에 표시된 모든 것 (예를 들면, scFv, Fv, Fab 및 디설파이드 연결된 Fv (참조, 예를 들어, Reiter 등 (1995) Protein Eng. 8:1323-1331) 뿐만 아니라 아피바디, 유니바디, 및 기타 동종.
용어 "특이적으로 결합하다"는, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 생체분자 (예를 들면, 단백질, 핵산, 항체, 등)을 지칭하는 경우, 분자 (예를 들면, 단백질 및 다른 생물제제)의 불균질 모집단에서 생체분자의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 따라서, 지정된 조건 (예를 들면 항체의 경우에서 면역검정 조건 또는 핵산의 경우에서 엄격한 하이브리드화 조건) 하에, 지정된 리간드 또는 항체는 그것의 특정한 "표적" 분자에 결합하고 샘플에서 존재하는 다른 분자에 상당한 양으로 결합하지 않는다.
참조 번호를 선호하는 도면에 대한 현행 참조는 전반적으로 상응하는 파트를 나타낸다:
도 1A-1E는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 약물 장입용 양성화 제제를 이용하는 리포좀 이리노테칸 담체 및 LB-MSNP의 제조를 설명한다. 도1A는 LB-MSNPs 및 리포좀에 의한 이리노테칸의 장입 및 합성 방법을 도시하는 도식을 보여준다 (도1A, 패널 A1). MSNP 입자 속에 TEA8SOS 침지후, 기공은, 지질 생물막의 초음파처리로부터 유래된, LB에 의해 밀봉된다(Lu 등 (2007) Small, 3:1341-1346). 도1A, 패널 A2:TEA8SOS-침지된 입자는, 양친매성 약물이 TEA8SOS에 의한 양성자화를 위하여 지질 2중층을 거쳐 확산하게 하는 (TEA8SOS ↔ 8TEA + 20 8H+ + SOS8-), 이리노테칸 용액에서 인큐베이션된다. 지질-가용성 TEA는 입자를 빠져나가게 하고, 한편 H+는 LB를 교차시킬 수 없는 친수성 유도체로 이리노테칸을 전환시킨다. 양성자화된 약물은 SOS8-과 상호작용시켜, 기공에서 유지되는, 겔-유사 침전물을 형성한다. 도1A, 패널 A3:동일한 기술은 이리노테칸 포획용 리포좀 등가물을 생산하는데 사용되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 도1B: Ir-MSNP 및 Ir-리포좀 담체의 약물 장입 용량 (DLC)의 평가. DLO [이리노테칸의 총량 (m0) - 비-캡슐화된 이리노테칸 (m1)] /[입자 (mMSNP 또는 m지질)의 총량 x100%. TEA8SOS의 봉입체는 입자의 유체역학적 크기 및 제타 전위에 관하여 무시할만한 효과를 가졌다. 유체역학적 크기 및 제타 전위 데이터는 표 3 (실시예 2)에서 보여진다. 도1C: 비어있는, 비-코팅된 MSNP, Ir- MSNP 및 Ir-리포좀 담체의 CryoEM 이미지.기술은 리포좀에서 이리노테칸 침전을 시각화하기에 충분한 감수성이다. 도1D:담체 안정성은 24시간 동안 37 ℃에 100% 혈청내 인큐베이션, 및 HPLC에 의한 약물 누출 결정에 의해 평가되었다. 도1E) 동결건조 및 물 재현탁 이후, 유체역학적 직경 및 % 약물 누출에서 변화에 의해 결정된 바와 같은, 담체 안정성.
도 2A-2D는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, Ir-LB-MSNP 및 Ir-리포좀의 체내분포를 설명한다. 도2A: KPC-유래된 동소이식 종양 부위 (n=3)에 IV 주사된 NIR-표지된 담체의 체내분포를 비교하기 위한 48 시간 동안 간격 IVIS 이미지형성.100 mg/kg NIR-표지된 LB-MSNPs 또는 리포좀의 IV 주사후 대표적인 동물에서 NIR 형광 이미지는 보여진다. 도2B: 동일한 실험에서 체외이식된 기관의 생체외 이미지형성; 동물은 24 시간후 희생되었다. 공초점 현미경검사는 종양 부위에서 리포좀에 비교하여 NIR-표지된 LB-MSNP의 더 높은 존재도를 확인하였다. 도2C: 이리노테칸 종양 함량은 동소이식 KPC-유래된 이종이식 모델 (n=3)에서 결정되었다. 동물은 상이한 약물 제형에 대하여 60 mg/kg의 이리노테칸 용량 당량의 IV 주사를 받았다. 동물 희생 이후 24 시간후, 종양 조직은 HPLC에 의한 이리노테칸 함량의 측정을 위하여 수집되었다. 이리노테칸 함량은 총 주사된 용량 %/ 종양 조직의 그램 (%ID/g)로서 표현되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다. 도 2D:동일한 실험에서 혈장 이리노테칸 농도의 HPLC 측정. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 3A-3E는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, KPC-유래된 동소이식 종양 모델에서 자유 약물 및 캡슐화된 이리노테칸 담체의 차별적인 종양 억제성 효과를 보여준다. 도3A: NCI 프로토콜을 이용하는, 급성 용량 설정 연구에서 MTD의 평가. 도3B: 최대 8 투여 동안 매 4 일 40 mg/kg 자유 약물 또는 캡슐화된 이리노테칸의 IV 투여 이후, B6/129 마우스에서 KPC-유래된 동소이식 종양의 성장 억제.간격 IVIS 이미지형성은 종양 성장 모니터링에 사용되었고, 이것은 오퍼레이터-정의된 ROI에서 이미지 강도에 따라 정량적으로 발현되었다. 도3C: (40-47 일째에 희생된) 치료후 동물의 1차 종양 부위에서 (절단된 카스파제-3에 대하여 IHC 염색을 이용하는) 세포자멸사의 정량 분석. 도3D:주위 전이에 관한 치료 영향을 보여주기 위한, (40-47 일째에 희생된) 빈사 동물에서 생물발광 강도의 대표적인 부검 결과 및 생체외 이미지형성.가시적인 전이성 확산은 위, 장, 간, 비장, 신장, 횡격막, 및 복벽에서 보여질 수 있다. 심장 또는 폐의 침윤은 없었다. 도3E: 하기에서 정량적 생체외 이미지형성에 의해 결정된 종양 확산의 비교 분석을 요약하기 위한 히트 맵 디스플레이: (도3D). 데이터는 평균 ± SEM, *p<0.05를 나타낸다.
도 4A-4E는 하기에 의한 독성 감소의 비교 분석을 설명한다: Ir-LB-MSNP 대Ir-리포좀 (본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라 ). 도4A: 하기에서 보여진 실험으로부터 조직을 이용하는, (40-47 일째에 희생된) 대표적인 빈사 동물로부터 수득된 간 조직학: 도3B.H&E 염색된 부문에서 화살표는 괴저성 간 조직을 표시하고, 한편 별표로 마킹된 부위는 지방증을 나타낸다. 막대는 200 μm이다. 도4B: 60 mg/kg의 용량 당량에서 상이한 이리노테칸 제형을 받는 동물의 간에서 절단된 카스파제-3 (세포자멸사 마커, 적색) 및 F4/80 (KC 마커, 녹색)의 이중 IHC 염색, 이어서 24 시간에서 희생. 핵은 Hoechst 33342 (청색)으로 염색되었다. 막대 = 100 μm. 도4C: 하기에서 연구된 동일한 치료된 동물 그룹에서 장 융모의 세포자멸사 및 둔화의 확산을 드러내기 위해 H&E 카운터 염색으로, 절단된 카스파제-3에 대한 IHC 염색: 도3B.막대는 100 μm를 나타낸다. 도4D:매 2 일, 3 회 IV 주사된, 이리노테칸의 40 mg/kg 용량-등가물이 흉골 골수에서 영향을 연구하는데 사용되었던, 별개의 실험.흉골은 포매, 탈석회화 및 H&E 염색에 대하여 7 일째에 수집되었다. 막대는 200 μm를 나타낸다. 도4E:간에서 Ir-LB-MSNP 및 Ir-리포좀 제형의 차별적인 간독성을 설명하기 위한 도식.구체적 이론에 구속됨 없이, 주사된 나노캐리어가 KCs에 의해 초기에 흡수되고, 여기에서 담체 붕해가 방관자 간세포에 이리노테칸 방출을 유발시킨다는 것이 고려된다. 간세포에 대한 약물 방출 및 담체 붕해의 후속 비율은 이리노테칸이 대사작용되고 불활성이 되는 정도 여부를 결정할 수 있다. 리포좀 담체의 더 높은 불안정성이 더욱 안정적인 Ir-LB-MSNP보다 더욱 급속 약물 방출을 유발시킨다는 것이 추가로 가정되고, 이는 세포자멸사 및 괴사에서 차이를 설명한다.
도 5는, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라, 지질 2중층 코팅된 메조다공성 실리카 나노입자 (LB-MSNP)의 합성 절차 및 TEA8SOS 매개된 이리노테칸 (IRIN) 장입의 기전을 도시하는 반응식을 설명한다. MSNP는 졸/겔 화학을 이용하여 합성되었다. (인하우스 합성된) TEA8SOS는 MSNP로 먼저 인큐베이션되었다. 이 다음은 하기를 이용하는 LB 코팅물 침착이었다: 우리의 생물막 기술 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). TEA8SOS 침지된 MSNPs는 하기에 첨가되었고: 건조 지질 생물막 (예를 들면DSPC/콜레스테롤/DSPE-PEG 3 : 2 : 0.15의 몰비로) 이어서 초음파처리시 기공 밀봉되었다. 자유 포획제의 제거후, TEA8SOS 장입된 LB-MSNP는 이리노테칸으로 인큐베이션되었다. 이것은 입자 속으로 확산하는 자유, 친유성 이리노테칸이 양성자화되고 기공에서 포획되도록 한다. 상기 반응은 아래와 같이 진행한다: LB-MSNP 내부에서 포획제의 존재로 인해, “TEA8SOS ↔ 8TEA-H+ + SOS8-”의 평형은 입자 인큐베이션 배지 속으로 지질 침투성 트리에틸아민 (TEA)의 유출을 유발시킨다. 입자 내부에서 H+ 방출은, LB를 통해 확산하는, 친유성 이리노테칸의 양성자화를 유발시키는 pH 구배를 창출한다. 지질 불투과성인, 양성자화된 IRIN은 SOS8-와 상호작용하여 침전물을 형성하고, 따라서 LB-MSNP내 효율적인 IRIN 포획을 초래한다.
도 6A 및 6B는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 포획 시약 (Ir-LB-MSNP(+SOS))을 함유하는 이리노테칸 장입된 LB-MSNP 및 포획 시약 (Ir-Lipo(+SOS))를 이용하는 이리노테칸 장입된 리포좀의 형태 및 약물 방출 프로파일을 보여준다. 도6A: Ir-LB-MSNP(+SOS) (상부 패널) 및 Ir-Lipo(+SOS) (하부)의 CryoEM 이미지 (TF20, FET). MSNP 표면에서 코팅된 지질 2중층은 명확히 보여질 수 있다. 상부 줌인 이미지는 입자 표면에서 온전한 지질 코팅물을 가진 MSNP를 보여주고, 한편 다공성 내측은 TEO8SOS와 이리노테칸 사이 고밀도 복합체의 존재를 보여준다. 유사하게, 리포좀 이미지 (하부 패널)에서, 이리노테칸-포획제 복합체는 내부에서 고밀도 침전물로서 보여질 수 있다 (마킹된 적색 화살표). 도6B: PBS (pH=7.4) 및 파고리소좀 자극액 (PSF, pH 4.5)에서 Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 Ir-Lipo(+SOS)의 약물 방출 프로파일.약물 방출 측정을 위하여, NPs는 PBS 또는 PSF (1 mL, 이리노테칸 0.1 mg/mL)에서 제조되었고, 이어서 37 ℃에서 진탕되었다. 표시된 시점에서, 방출된 이리노테칸은 30 kD의 크기 컷오프를 가진 원심 필터 유닛에 의해 NPs로부터 분리되었다. 여과물에서 이리노테칸 농도는 360 nm의 OD에서 마이크로플레이트 판독기에 의해 결정되었다. 실험은 적어도 2회 반복되었다.
도 7는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 공초점 현미경에 의해 결정된 바와 같이 Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 Ir-Lipo(+SOS)의 세포 흡수 및 세포내 분포를 설명한다. LB-MSNPs 및 리포좀은 지질 2중층에서 0.1% w/w 텍사스 레드-DHPE에 의해 형광적으로 표지되었다. 양쪽 입자는 24 시간 동안 PANC-1 세포로 인큐베이션되었고 그 다음 PBS에서 3회 세정되었다. 세포 고정 및 PBS로 세정 후, 세포 막은 WGA 488로 그리고 핵은 Hoechst 염료로 염색되었다. 슬라이드는 공초점 현미경을 이용하여 시각화되었다.
도 8, 패널 A-F는, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라, Ir-LB-MSNP(+SOS) 대 Ir-Lipo(+SOS) 또는 자유 약물의 비교 세포독성 분석을 설명한다. 도8, 패널 A-C: PANC-1 세포의 세포 생존력은, 보여진 농도에서 자유 IRIN, Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 Ir-Lipo(+SOS)로 치료 이후, MTS 검정에 의해 결정되었다. 실험은 또한 상이한 시간 간격 (24 시간, 48 시간 및 72 시간) 동안 수행되었다. 도8, 패널 D-F: PANC-1 세포에 대하여 기재된 바와 같은 상이한 시점 및 약물 농도에서 자유 IRIN, Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 Ir-LB-MSNP(+SOS)로 치료후 BxPC-3 세포의 세포 생존력.
도 9는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 골수의 조직학적 분석을 보여준다. 자유 IRIN, Ir-Lipo(+SOS) 및 Ir-LB-MSNP(+SOS)로 치료 후 골수 조직학. BALB/c 남성 마우스는 60 mg/kg의 약물 용량에서 IRIN, Ir-Lipo(+SOS) 또는 Ir-LB-MSNP(+SOS)로 IV 주사되었다. 24 시간 후, 마우스는 희생되었고 흉골은 수집되었고 10% 포르말린에서 고정되었다. 절편은 헤마톡실린-에오신 (H&E)로 염색되었고, 광학 현미경검사로 검사되었다. 데이터는 양쪽 LB-MSNP 및 리포좀 제형이 이리노테칸에 의해 유도된 골수 고갈을 저하시켰다는 것을 나타낸다. 중증 골수 손상 및 세포자멸사는 자유 약물 그룹에서 보여질 수 있다.
도 10는, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 신장의 조직학적 분석을 보여준다. 자유 IRIN, Ir-Lipo(+SOS) 및 Ir-LB-MSNP(+SOS)로 치료 후 신장의 조직학적 분석. BALB/c 남성 마우스는 60 mg/kg의 약물 용량에서 IRIN, Ir-Lipo(+SOS) 또는 Ir-LB-MSNP(+SOS)로 IV 주사되었다. 24 시간 후, 마우스는 희생되었고 신장은 수집되었고 10% 포르말린에서 고정되었고, 이어서 파라핀 포매되었다. 4 μm 두께의 조직 절편은 유리 슬라이드상에 실장되었다. 절편은 헤마톡실린-에오신 (H&E)로 염색되었고, 광학 현미경검사로 검사되었다. (마킹된 화살표) 보우만 공간의 팽윤 및 부종을 보여주는 대표적인 조직학적 이미지는 자유 IRIN 또는 Ir-Lipo(+SOS) 치료된 동물에서 관측되었다. 이들 병변은 급성 사구체 염증을 나타낸다. 상당한 신장 비정상은 Ir-LB-MSNP(+SOS) 그룹에서 발견되지 않았다.
도 11는, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라, 대표적인 이리노테칸-장입된 LB-MSNP의 저-해상도 cyroEM 이미지를 보여준다. 막대는 100 nm를 나타낸다. ~500 입자의 시각적 시험은, >99% 입자의 성공적인 코팅으로, LB의 구조적 완전성을 확인하였다.
도 12, 패널 A-F는, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라, B6/129 마우스내 이식 5 주 후, 주위 기관 속으로 KPC-유래된 종양의 침윤을 보여주기 위해 H&E 염색을 보여준다. 대표적인 이미지는 췌장 (패널 A), 간 (패널 B), 비장 (패널 C), 신장 (패널 D), 장 (패널 E), 및 위 (패널 F)의 침윤을 보여주기 위해 포획되었다. 막대 크기는 200 μm이다.
도 13는 하기내 KPC-유래된 모델에서 NIR-표지된 입자의 IV 주사 48 시간 후 포획된, 생체외 IVIS 이미지를 보여준다: 도2A, 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라. 이것은 등가 입자 용량에 대하여, 표지된 리포좀에 비교된 종양 부위에서 LB-MSNPs의 증가된 존재도가 있다는 것을 입증한다.
도 14는, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라, 24 시간에서 LB-MSNPs (100 mg/kg)의 IV 주사 및 동물 희생 이후, B6/129 마우스 (n= 3)내 KPC-유래된 동소이식 종양 모델에서 LB-MSNPs의 체내분포를 보여준다. 종양 조직 및 주요 기관은 유도적으로 커플링된 혈장 광학 방출 분광법을 이용하여 Si 함량의 측정을 위하여 수집되었다. 입자 체내분포는 각각의 위치에 대하여 총 주사된 Si 용량의 % (%ID)로서 표현된다. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 15A는 누드 마우스 (n=3)내 피하 PANC-1 이종이식 모델에서 결정된 이리노테칸 종양 함량을 보여준다. 동물은 상이한 약물 제형에 대하여 60 mg/kg의 이리노테칸 용량 당량의 IV 주사를 받았다. 동물 희생 이후 24 시간 후, 종양 조직은 HPLC에 의해 이리노테칸 함량의 측정을 위하여 수집되었다. 이리노테칸 함량은 총 주사된 용량 %/ 종양 조직의 그램 (%ID/g)로서 표현되었다. 데이터는 다른 그룹에 비교된 MSNP에 대하여 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다. 도 15B는 100 mg/kg NIR-표지된 LB-MSNP의 IV 주사 24 시간 후 대표적인 동물에서 NIR 형광 이미지를 보여준다.
도 16는 B6/129 마우스내 주위 기관에서 이리노테칸 함량의 HPLC 정량화를 보여준다. 동물은 상이한 약물 제형 (n=3)에 대하여 60 mg/kg의 이리노테칸 용량 당량의 IV 주사를 받았다. 동물 희생 이후 24 시간 후, 조직은 HPLC에 의해 이리노테칸 함량의 측정을 위하여 수집되었다. 이리노테칸 함량은 총 주사된 용량 % / 조직의 그램 (%ID/g)로서 표현되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 17는, 하기에서 기재된 실험에서 (40-47 일째에 희생된) 각각의 동물 그룹내 1차 종양 부위로부터 수득된, 1차 종양 부위에서 절단된 카스파제-3 (세포자멸사 마커)용 IHC 염색을 보여주기 위한 대표적인 이미지를 보여준다: 도3B.세포자멸적 세포 (갈색 색상)는 적색 화살표에 의해 표시된다. 막대 = 50 μm.
도 18는 하기에서 기재된 효능 연구의 각각의 처리 그룹에서 동물의 사망률을 보여준다: 도3B, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라.x-축상의 화살표는 주사 일을 표시한다. 마우스는 빈번하게 모니터링되었고 하기에 기반하여 희생되었다: “빈사 기준” (Zucker 등 (2009) J. Control. Release, 139(1): 73-80) 자발적인 사망 대신에.이리노테칸 장입된 LB-MSNPs는 염수 및 자유 이리노테칸에 비교된 상당한 (p <0.01, SPSS 19.0, IBM SPSS Statistics, USA를 이용하여 로그-순위 시험에 의해 비교된) 생존 개선을 초래하였다. 더 나은 생존 결과는 Ir-리포좀에 비교된 Ir-LB-MSNP에 대하여 관측되었다.
도 19는 전 혈구 카운트 분석이 하기에서 기재된 실험으로부터 수득된 샘플에서 수행되었다는 것을 보여준다: 도4D, 본 발명의 하나 이상의 구현예에 따라. 차별적인 백혈구 카운트는 자유 약물 또는 Ir-리포좀 치료된 그룹에 대하여 수행된 절대 중성구 카운트의 상당한 감소를 보여주었다. 그에 반해서, Ir-LB-MSNPs로 치료는 중성구 카운트에서 작지만 무의미한 낙하를 보여주었다. 데이터는 평균 ± SEM, 대조군에 비교된 *p<0.05, LB-MSNP 그룹에 비교된 #p<0.05를 나타낸다.
도 20는 본 명세서에서 기재된 하나 이상의 구현예에 따라, 상이한 약물 담체에 대하여 간내 이리노테칸 함량의 HPLC 정량화를 보여준다. 동물은 상이한 약물 제형 (n=3)에 대하여 60 mg/kg의 이리노테칸 용량 당량의 IV 주사를 받았다. 동물 희생 이후 0.5, 4, 24 시간후, 각각, 간 조직은 HPLC에 의해 이리노테칸 함량의 측정을 위하여 수집되었다. 이리노테칸 함량은 총 주사된 용량 % / 간 조직의 그램 (%ID/g)으로서 표현되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 21A 및 21B는 약물 장입용 실리카솜의 합성 및 특성규명 그리고 가시화를 설명한다. 도21A: 최상부 패널은 실리카솜 작제 및 원격 약물 장입용 합성 단계를 보여주는 도식을 제공한다 (참조 실시예 1 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 간단히, MSNP 코어는 졸-겔 화학에 의해 합성되었고 양성자화 제제, TEA8SOS를 함유하는 용액에서 침지되었다. 이들 입자는, 지질 생물막 (Id.)의 존재하에 초음파처리 절차를 이용하여, LB로 코팅되었다. 이에 이어서 TEA8SOS에 의해 제공된 양성자 구배를 거쳐 원격 이리노테칸 장입되었다. 박스 1: 상이한 실리카솜 성분의 개략도. 박스 2: 시스테인-변형된 iRGD 펩타이드를 DSPE-PEG2000-말레이미드에 연결하기 위해 티올-말레이미드 반응을 이용하는, LB에 iRGD 펩타이드 콘주게이션.박스 3:(TEM 가시화용) ~10 nm Au 코어의 포매와 무관하게, 노출된 입자 및 실리카솜을 보여주기 위한 동결-EM 이미지.합성 절차는 실시예 3 보충의 물질 및 방법에서 기재된다. 막대 = 50 nm. 도21B: 면역적격 B6/129 마우스내 KPC-유래된 동소이식 PDAC 모델의 부검 및 IVIS 이미지. 동소이식은 췌장 (좌측 패널)의 꼬리에서 2 × 106 KPC-luc 세포를 주입하기 위한 소형 수술을 포함한다. 부검 및 생물발광 이미지형성은 1-2 주후 1차 종양 성장, 이어서 3-5 주 지나서 종양 전이를 드러낸다. 거대전이는 화살표로 마킹된다.
도 22A 및 22B는 공-투여된 iRGD가 KPC-유래된 동소이식 모델에서 IV-주사된 실리카솜의 종양 체내분포를 향상시켰다는 것을 보여주었다. 도22A: 종양-보유 마우스는 (i) 8 μmol/kg 자유 iRGD (n=3, “실리카솜 + iRGD”로 칭함)의 공-투여와 IV 50 mg/kg의 NIR-표지된 실리카솜 IV, (ii) 50 mg/kg의 NIR-표지된, iRGD-콘주게이션된 실리카솜 (n=3, “실리카솜-iRGD”로 칭함), 또는 (iii) iRGD 없이 50 mg/kg NIR 표지된 실리카솜을 받았다. 동물은 주사 24 시간 후 희생되었고, 이어서, IVIS를 이용하여, 생체외 NIR 이미지형성되었다. 도22B: NIR 형광 강도 및 Si 함량은 동소이식 종양s에서 나노입자 함량을 정량화하는데 사용되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 23A-23E는 iRGD 공-투여가 KPC-유래된 동소이식 모델에서 Ir-실리카솜의 흡수 및 효능을 향상시킨다는 것을 보여준다. 도23A: 루시퍼라아제 발현 KPC-유래된 동소이식 종양 모델 (n=6)에서 효능 연구의 스케줄.선택된 Ir-실리카솜 용량 (40 mg/kg 이리노테칸; 80 mg/kg MSNP)은 이전의 효능 연구 에 기반된다 (Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). Ir-실리카솜 의 상기 용량은, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, IV 주사되었다. 주사는 매 3 일, 총 4 투여 동안 반복되었다. 대조군은 자유 iRGD 또는 Ir-실리카솜 단독의 동일한 용량을 받는 동물 그룹을 포함한다. 도23B: 1차 종양 부하 및 전이를 보여주기 위한 희생에 앞서 마우스에서 생물발광 강도의 대표적인 생체외 이미지형성. 이미지는 iRGD 공-투여가 실리카솜 효능을 향상시킬 수 있다는 것을 보여준다. 도23C: 하기에서 종양 및 종양 전이 억제에 관한 영향을 요약하는 히트 맵: 도23B. 도23D:iRGD 공-투여는, 카플란-마이어 분석에 의해 보여진 바와 같이, Ir-실리카솜의 생존 영향을 개선시켰다. 실리카솜 단독의 효과는 PBS 및 자유 iRGD (p=0.001)에 비교하여 고도로 상당하다. iRGD 공-투여는 생존 (p=0.027)을 추가로 향상시킨다. 도23E: Ir-실리카솜 (40 mg/kg 약물)의 1회용 용량 24 시간후, 종양에서 이리노테칸 함량의 HPLC 분석은, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, 주사되었다. 데이터는 평균 ± SD (n=3), *p<0.05를 나타낸다.
도 24A 및 24C는 iRGD-매개된 실리카솜 흡수가 종양 맥관구조에서 NRP-1 발현을 요구한다는 것을 보여준다. 도24A: iRGD가 나노입자 통과세포외배출을 개시하는 기전을 입증하기 위한 도식. 도24B: KPC-유래된 종양 부문에서 NRP-1 (녹색) 및 CD31 (적색), 플러스 핵 염색 (청색)의 다중-색상 IHC 염색. IHC 염색 방법론은 방법 부문에서 기재된다. NRP-1은 양쪽 종양 조직 또한 혈관에서 발현된다. 병합된 이미지는 CD31을 가진 NRP-1의 공-국재화의 높은 정도 (94.2%)를 보여주고; 공-국재화 비 (CR)은 이미지 J 소프트웨어에 의해 결정되었다. 막대 = 100 μm. 도24C: iRGD-매개된 실리카솜 체내분포에서 항-NRP-1 항체의 간섭.50 μg의 차단 항체 또는 대조군 IgG는 50 mg/kg의 NIR-실리카솜 + 8 μmol/kg 자유 iRGD (n=3)의 IV 주사 15 분 전 IV 주사되었다. 24 시간후 나노입자 체내분포를 보여주는 생체외 NIR 이미지. NIR 강도 뿐만 아니라 Si 함량은 동소이식 종양 부위에서 나노입자 흡수를 정량화하는데 사용되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 25A-25C는 iRGD 공-투여에 의해 개시된 실리카솜 수송 시스템의 초미세구조도를 제공한다. 도25A: 동소이식 종양을 보유하는 마우스는, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, 50 mg/kg Au-실리카솜으로 주사되었다. 종양은 24 시간에서 수확되었고 TEM 분석을 위하여 즉각 고정되었다. 각각의 그룹내 적어도 10 관심 영역은 혈관 내피 세포에서 그룹화된, 상호연결된 소포 (황색 화살표)의 존재도를 정량적으로 발현시키기 위해 보여졌다. 우리는 세포내 표면적(좌측 패널)의 1 μm2당 소포의 수를 계산하였다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다. 고 및 저 배율을 가진 대표적인 TEM 사진은 보여진다. L = 내강; R = 적혈구. 도25B: 50 mg/kg Au-실리카솜을 받았고 그 다음 24 시간 후 희생된 종양-보유 마우스 에서 실리카솜 통과세포외배출의 TEM 가시화. 전자 현미경사진 은 하기에서 실리카솜을 보여준다: (i) 종양 혈관의 내강 (적색 화살표), (ii) 내피 소포에서 수송 (핑크색 화살표), 및 종양 사이질에서 침착 (청색 화살표). 영역 “1”-“3”의 고 배율 이미지는 우측 패널에서 제공된다. E = 내피 세포; L = 내강; P = 혈관주위세포; R = 적혈구. 도25C: 암 세포 내부에 핵주변 분포에서 실리카솜의 존재를 보여주는 TEM 이미지.N = 핵; M = 미토콘드리아.
도 26A-26B는 NSG 마우스내 환자-유래된 이종이식편에서 iRGD-유도된 실리카솜 체내분포를 설명한다. 도26A: 매칭된 기질 존재도를 갖지만 NRP-1 발현의 수준이 상이한, 한 쌍의 종양 (XWR#8 및 XWR#187)은 iRGD 공-투여의 부재 및 존재하에 체내분포 연구를 위하여 선택되었다. 메이슨 트리크롬 염색은 양쪽 종양에서 콜라겐 발현의 등가 수준을 보여준다. 다중-색상 IHC 염색 (NRP-1용 녹색 형광 항체, CD31용 적색 형광 항체) 은, 이미지 J 소프트웨어를 이용하여, NRP-1 발현의 상대 존재비, 및 내피 세포와 중첩의 정도를 결정하는데 사용되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다. 도26B: 종양-보유 동물은 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게 IV 주사 50 mg/kg NIR-표지된 실리카솜을 받았다. 동물은 24 시간 (n=3)후 희생되었다. NIR 형광 강도 및 Si 함량에 의해 결정된 바와 같이 실리카솜의 흡수의 생체외 평가. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다.
도 27, 패널 A-C는, 실리카솜상의 지질 2중층에 iRGD의 성공적인 공유 콘주게이션에 대하여 티올-말레이미드 반응의 용도를 설명한다. 공유 콘주게이션의 성공을 입증하기 위해, 하기에 의해 제공된, 반응성 플루오레신 (FAM) 표지된 iRGD 펩타이드: Dr. Ruoslahti (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16:510-520) 은, DSPE-PEG-말레이미드에 대한 결합에 사용되었다. 상세한 방법은 실시예 3 방법 부문에서 기재된다. 패널 A: 100 μg/mL에서 현탁된, 프리스틴 및 FAM-iRGD-실리카솜의 형광 스펙트럼은 488 nm.의 여기 파장으로 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Device M5e)에서 수득되었고, 세정된 및 정제된 FAM-iRGD-실리카솜에서 형광 신호의 상당한 유지는 성공적인 콘주게이션 반응을 확인시킨다 (Cancer Cell 2009, 16:510). 패널 B 및 C: 실리카솜에 대한 iRGD 콘주게이션의 효과는 세포 흡수에서 그것의 영향에 대하여 시험되었다. 실리카솜-iRGD의 배치는, 방법 부문에서 기재된 바와 같이, MSNP 프레임워크의 NIR-라벨링 (DyLight 680)으로 합성되었다. KPC 세포는 37 ℃에 2시간 동안 100 μg/mL의 입자 농도에서 처리되었고 흡수는 유세포측정 (패널 B), 및 공초점 현미경검사 (패널 C)에 의해 결정되었다. 유사한 라벨링 효율을 가진 iRGD-자유 NIR-실리카솜은 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 ± SD, *p<0.05를 나타낸다. 공초점 현미경검사는 결과를 확인하였다 (세포 막은 밀 배아 응집소로 녹색 염색되었고 핵은 Hoechst 33342로 청색 염색되었다). 막대 = 20 μm.
도 28, 패널 A-B는 IV 실리카솜 체내분포에서 (CendR 모티프가 부족한) 비-기능성 펩타이드의 효과의 평가를 설명한다. 패널 A: 우리는 비-CendR 펩타이드, 사이클로 (RGDfK)를 사용하여, 하기에서 보여진 동소이식 모델에서 체내분포 실험을 반복하였다: 도22. 간단히, 종양-보유 동물은 PBS 또는 8 μmol/kg 자유 사이클로 (RGDfK)와 공-투여된 50 mg/kg NIR-표지된 실리카솜의 IV 주사를 받았고, 이어서 동물은 24 시간 (n=3) 희생되었다. 대표적인 생체외 장기 NIR 형광 이미지는 나노입자 체내분포를 보여주기 위해 수득되었다. 패널 B: (IVIS 소프트웨어에 의한) NIR 형광 강도 분석 및 (ICP-OES에 의한) Si 함량의 결정은 비-CendR 펩타이드가 종양 부위에서 실리카솜 흡수를 개선할 수 없다는 것을 보여주었다. 데이터는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 29, 패널 A-B는 공초점 현미경검사에 의해 종양에서 실리카솜 수송의 평가를 설명한다. 패널 A: 종양 절편은 하기에서 실험으로부터 수득되었다: 도22. 대표적인 공초점 이미지는, 633 nm 레이저를 이용하는, SP2-1P-FCS, Leica 현미경 하에 NIR 표지된 실리카솜 존재도의 종양내 존재도를 평가하기 위해 수득되었다. 혈관의 존재 (녹색으로 CD31) 및 핵의 존재 (청색으로 DAPI 염색)을 검토하기 위한 동일한 절편의 IHC 염색은, 하기에 의해 기재된 방법론을 이용하여, 종양 조직에서 나노입자의 존재 및 이동을 결정할 수 있게 되었다: Sugahara 등 (2010) Science, 328:1031-1035). 막대 = 20 μm.패널 B: 가장 가까운 종양 혈관으로부터 실리카솜 침투 거리의 계산은, 이미지 J 소프트웨어를 이용하여, ~15 혈관에 대하여 추정되었다. 박스-및-위스커 플롯 (Origin 소프트웨어)는 중앙 (수평선), 25번째-75번째 백분위수 (박스), 평균 (개방 정사각형) 및 SD (위스커)를 보여주기 위해 개발되었다. 실리카솜 단독 또는 실리카솜-iRGD와 비교된 * p<0.05.
도 30은, 하기에서 사용된 동물로부터 수득된 기관을 이용하여, 간 (좌측) 및 비장 (우측)에서 Si 함량을 보여준다: 도22,는 ICP-OES 분석에 의해 결정되었다. 데이터는 평균 ± SD, 실리카솜 또는 “실리카솜 + iRGD” 그룹과 비교된 *p<0.05를 나타낸다.
도 31는 iRGD 공-투여가 보여지는 것 없이 50 mg/kg Au-포매된 실리카솜으로 사전 (24 시간) 주사된 동물로부터 KPC-유래된 종양의 대표적인 TEM 이미지를 보여준다. 이미지는, 관강 측에서 입자 침착으로, 통과세포외배출 소포의 부재를 입증한다. E = 내피 세포, L = 내강.
도 32는 원세포와 실리카솜 기술 사이 비교의 결과를 설명한다.
치료 효능을 유지 또는 증가시키면서 독성의 높은 비율을 다루기 위해, 약물 전달 나노캐리어는 전신 독성을 야기시킬 수 있는 자유 약물의 양을 제한하면서 표적 부위 (예를 들면 종양 부위, 감염의 부위, 등)에 약물 전달 (예를 들면, 화학요법 약물, 항미생물 약물, 등)을 향상시키기 위해 제공된다. 담체 자체가 독성을 예방하기 위해 및 효능을 개선하기 위해 안정적인 약물 장입을 유지하는 것이 바람직하다. 다양한 암 세포로부터 확립된 동물 종양 모델에서 화학치료제를 전달하기 위한 나노캐리어의 용도는 약물 순환 반감기를 연장, 개선된 세포독성 사멸로 종양 부위에 높은 약물 농도를 전달, 뿐만 아니라 자유 약물 등가물에 비교된 전신 독성을 감소하기 위한 그와 같은 나노캐리어의 능력을 실증하였다 (참조, 예를 들면, Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res. 10(19): 6638-6649; Drummond 등 (2006) Cancer Res. 66(6): 3271-3277; Ramsay 등 (2008) CliN. Cancer Res. 14(4): 1208-1217).
큰 독성 약물 예컨대 이리노테칸의 안전성을 개선하기 위한 많은 리포좀 담체의 실패의 관점에서, 실리카 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNPs))에 적용된 지질 2중층 (LB)를 사용하는, 이로써 지지된 지질 2중층을 제공하는 신규한 나노입자 약물 담체는 본 명세서에서 제공된다. (또한 실리카솜으로서 공지된) 이들 지질 2중층 코팅된 다공성 실리카 나노입자는 리포좀보다 상당히 덜 누출성인 약물 담체를 제공한다 (Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(2): 994-1005; Meng 등 (2011) ACS Nano, 5(5): 4131-4144; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 약물 패키징에 사용될 수 있는 큰 내부 표면적으로 인해, 조절가능 기공 크기, 담체 안정성, 및 제어된 약물 방출 능력, MSNPs는 암 요법을 위하여 다용도 및 다작용성 나노캐리어 플랫폼을 구성하도록 실증되었다 (Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(2): 994-1005; Meng 등 (2011) ACS Nano, 5(5): 4131-4144; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557; Meng 등 (2010) J. Am.Chem. Soc. 132(36): 12690-12697; Li 등 (2012) Chem. Soc. Rev. 41(7): 2590-2605; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801). 그러나 지질-2중층 코팅된 실리카 입자의 효과적 장입 방법은 제한되고 왔고, 전형적으로 약 10 wt% 최대 40 wt% 범위의 장입을 제공한다.
다양한 구현예에서 신규한 장입 방법은 지질-2중층 코팅된 나노입자 약물 담체의 상당히 더 큰 장입을 달성하는 본 명세서에서 제공된다. 일반적으로 신규한 장입 방법은, 지질 2중층 내부 나노입자의 기공 안에서 화물 (예를 들면, 관심 약물 또는 약물들)을 유지하기 위해, 화물 포획 시약을 사용한다. 더욱 특이적으로, 특정 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 관심 화물 (예를 들면, 약물)을 받을 수 있는 다수의 기공을 포함하는 다공성 실리카 바디를 포함하는 나노캐리어를 제공하는 단계); 제제가 기공 안에서 화물을 포획하는 그것의 능력에 대하여 선택되는 다수의 기공 안에서 포획제 (화물 포획제)를 배치하는 단계; 지질 2중층으로 나노캐리어의 표면 기공을 코팅하는 단계; 및 지질 2중층에 의해 코팅된 기공 속으로 화물을 도입하는 단계, 상기 화물은 포획제와 반응하고 기공 안에서 유지됨.
특정 구현예에서 포획제는 양성자화 제제를 포함하고 방법은 2중층-코팅된 다공성 나노입자 속으로 지질 2중층을 통과할 수 있는 약물 또는 약물들의 제공을 포함한다. 다공성 나노입자에서 양성자화 제제는 지질 2중층을 거쳐 역 확산을 할 수 없는 친수성 유도체 속으로 약물을 전환시킨다.
실시예 1에서 보여진 설명적인, 그러나 비제한적인 구현예에서, MSNP 코어는 졸-겔 화학에 의해 합성되었고 양성자화 제제, TEA8SOS를 함유하는 용액에서 침지되었다. 이들 입자는, 2중층 안정성을 위하여 최적의 조성물의 지질 생물막의 존재하에 초음파처리 절차를 이용하여, LB로 코팅되었다. 이에 이어서 TEA8SOS에 의해 제공된 양성자 구배에 의해 원격 이리노테칸 장입되었다. 이리노테칸은 MSNP 내측 패키징 공간 속으로 LB를 거쳐 확산할 수 있는 약 염기성 양친매성 분자이고, 여기에서 사전 포획된 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)에 의한 양성자 방출은, LB를 거쳐 역-확산할 수 없는, 친수성 유도체 속으로 약물을 전환시킨다. 상기 방법을 이용하여 높은 장입 용량 (예를 들면, 40 wt% 초과, 또는 45 wt% 초과, 또는 50 wt% 초과, 또는 60 wt% 초과, 또는 70 wt% 초과, %, 또는 80 wt% 초과, 등)은 달성된다.
본 명세서에서 기재된 방법을 이용하여 생산된 지질 2중층 나노입자 약물 담체 (LB-MSNPs 또는 "실리카솜")은 수많은 이점을 제공한다. 양성자화 제제, 예컨대 TEA8SOS로 LB-MSNPs를 합성하기 위한 현존하는 생물막 코팅 방법의 조합은, 리포좀에 대해 수많은 이점을 보여주는 미립자 담체에서 약물 예컨대 이리노테칸의 활성 및 고용량 장입을 제공한다. 그와 같은 이점은, 비제한적으로 합성의 용이성, 개선된 약물 장입 및 방출 프로파일, 개선된 안정성 및 개선된 체내분포를 포함한다. 특정 구현예에서 설명적인, 그러나 비제한적인 구현예, 원격 장입의 이러한 방법은 MSNP내 LB 뒤에서 수동적인 약물 캡슐화에 비교된 이리노테칸의 장입 용량에서 4-배 이상 증가를 유발시킨다. 본 명세서에서 기재된 방법을 이용하여, 비-캡슐화된 이리노테칸은 LB를 통한 확산에 의해 MSNP 기공에 들어가고, 그래서 양성자화는 이리노테칸을 친수성으로 만들고 탈출할 수 없게 만든다.
더욱이, 나노캐리어의 증가된 장입 용량은, 이리노테칸이 독성을 야기하는, 부위 예컨대 골수 및 위장관 (GIT)에서 이용가능해지는 자유 약물이 적게, 암 부위에서 증가된 약물 전달을 유발시킨다. 하나의 경우에서, LB-MSNP는 MM-398의 인하우스 리포좀 등가물 (42.5 중량% 장입 용량)에 대한 개선된 장입 용량 (83.5 중량% 이리노테칸 장입)을 갖는다. 장입 시간, 포획제 농도, 및 장입에 제공된 이리노테칸의 양의 최적화 후, LB-MSNP 제형의 구현예는 리포좀 제형에 비교된 산성 pH (4.5)에서 3-5 배 더 높은 방출 용량을 실증하였다. 수반하는 용량 조정은 동일한 효능을 수득하기 위해 더 적은 약물 용량의 투여를 허용하여, 전신 약물 독성에서 추가 감소를 유발시킨다. 하나의 경우에서, 최대 내성 용량 (MTD)의 계산에서, LB-MSNP의 구현예는 자유 약물에 비교된 내성 용량에서 5-배 개선을 보여주었다. 증가된 MTD는 리포좀 제형에 유사하였다. 골수 조직학의 분석은 이리노테칸 독성이 LB-MSNP에 의해 크게 감소되었다는 것을 보여주었다.
추가적으로, 본 명세서에서 기재된 합성/장입 방법은 어느 한쪽 하기에 의해 사용된 종래의 리포좀 제조 또는 폴리머-지질 기술보다 수행하기 더 쉽다: Zhang 등 (2104) Biomaterials, 35(11): 3560-3665). 이것은 비-캡슐화된 약물의 양 감소에 의한 비용 절감을 포함하여, 척도-최대 GMP 제조에 유리하다.
이로써 생산된 방법 및 나노입자 약물 담체 (실리카솜)이 이리노테칸에 관하여 본 명세서에서 기재된 한편, 아래 설명된 바와 같이, 방법은 수많은 다른 화물 (예를 들면, 하나 이상의 약물을 포함하는 화물)에 적용될 수 있다는 것이 이해될 것이다. 또한, 본 명세서에서 제공된 교시의 관점에서, (표적에 관한) 약물 전달에서 개선, 및/또는 감소된 독성, 및/또는 개선된 체내분포, 및/또는 개선된 방출 프로파일이 수많은 다른 약물과 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물을 이용하여 달성될 것으로 믿어진다.
따라서, 특정 구현예에서, 화물포획제의 지원으로, 높은 장입 수준에서 화물의 안정적인 및 보호된 장입을 허용하는, LB-MSNP-기반 나노캐리어 전달 시스템은 기재된다. 일부 구현예에서, 화물은 약물일 수 있다. 변형된 LB-MSNP 캡슐화 및 트랩핑에 의한 약물 전달은, 향상된 효능, 높은 약물 장입 용량 및 감소된 전신 독성 때문에, 약물 캡슐화, 예를 들면, 화학요법 약물의 더욱 빈번한 사용을 허용한다. 나노캐리어 설계 관점으로부터, 이러한 시스템의 다양한 구현예, 예를 들어 LB-MSNP 내에서 다중음이온성 화물포획제는, 암 및 다른 질환 과정의 몇 개의 상이한 유형의 치료를 위하여, 다양한 추가의 약염기성 분자 및 약물 전달을 위하여 효과적인 설계 원리로서 이용된다.
하나의 경우에서, 이리노테칸에 관하여, 변형된 LB-MSNP 캡슐화 및 트랩핑 절차에 의한 전달은 이리노테칸의 향상된 효능, 높은 약물 장입 용량 및 감소된 전신 독성 때문에 인간 PDAC 환자에서 이리노테칸 및 폴피리녹스의 더욱 빈번한 사용을 허용한다. 이것은 또한, 증가된 생존의 약속으로, 더 많은 PDAC 환자를 젬시타빈보다 더 강한 치료 레지멘으로 치료받도록 한다. 궁극적으로, PDAC 치료를 위하여 (MM398 리포좀에 대해) IV 주사가능한, 효율적인, 생체적합성, 및 번역으로 경쟁적 이리노테칸 제형은 제공된다. 특히 본 명세서에서 기재된 방법 및 수득한 나노입자 약물 담체의 관점에서, 이리노테칸 및 폴피리녹스 요법은 또한, 비제한적으로 결장, 직장, 폐, 및 난소 암을 포함하는, 다른 암의 치료에 이용가능할 수 있다.
본 명세서에서 개시된 실리카솜 전달 시스템은 다작용성 플랫폼이다. 메조다공성 실리카 약물 담체는 동물내 암 세포 뿐만 아니라 다양한 인간 암 모델에 광범위한 화물을 전달할 수 있다는 것이 실증되어 왔다. 이들은 마우스내 이종이식 및 동소이식 PDAC 종양에 젬시타빈 및 파클리탁실 공-전달을 포함한다. 또한, MSNPs는 생분해성이고 광범위한 동물 시험에서 안전하다고 입증된다 (Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(2): 994-1005; Meng 등 (2011) ACS Nano, 5(5): 4131-4144; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801; Zhang 등 (2012) J. Am.Chem. Soc. 134(38): 15790-15804; Lu 등 (2010) Small, 6(16): 1794-1805).
개선된 장입, 본 명세서에서 기재된 수득한 약동학적 프로파일, 및 기타 동종의 관점에서, 본 명세서에서 기재된 장입 방법, 지질 2중층 조성물 및 수득한 나노입자 약물 담체의 안정성이 이전의 나노입자 약물 담체에 대해 상당한 개선 및 이점을 제공한다고 믿어진다.
지질-2중층 코팅된 다공성 나노입자의 장입 방법.
다양한 구현예에서, 지질 2중층-코팅된 다공성 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카 입자)의 개선된 장입 방법은 그와 같은 방법에 의해 생산된 약물 전달 나노입자와 함께 제공된다. 특정 구현예에서 본 명세서에서 기재된 방법은 약물 장입의 극도로 높은 수준 예를 들면, 40 wt% 초과, 또는 45 wt% 초과, 또는 50 wt% 초과, 또는 60 wt% 초과, 또는 70 wt% 초과, %, 또는 80 wt% 초과, 등)을 달성한다.
전술한 바와 같이, 특정 구현예에서, 방법은 하기 단계를 포함할 수 있다: 관심 화물 (예를 들면, 약물)을 받을 수 있는 다수의 기공을 포함하는 다공성 실리카 바디를 포함하는 나노캐리어를 제공하는 단계); 제제가 기공 안에서 화물을 포획하는 그것의 능력에 대하여 선택되는 다수의 기공 안에서 포획제 (화물 포획제)를 배치하는 단계; 지질 2중층으로 나노캐리어의 표면 기공을 코팅하는 단계; 및 지질 2중층에 의해 코팅된 기공 속으로 화물을 도입하는 단계, 상기 화물은 포획제와 반응하고 기공 안에서 유지됨.
이전에 MSNP 플랫폼에서 사용되지 않았던 반면, 다중음이온성 화합물, TEA8SOS는 이리노테칸을 포획하기 위해 MM-398에서 사용되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 본 명세서에서 기재된 연구에 앞서, 그러나, TEA8SOS가 다른 장입 또는 침지 방법보다 상당히 더 큰 수준에서 다공성 나노입자의 원격 장입을 효과적으로 수행하는데 사용될 수 있는지 여부는 미공지되었다.
실시예에서 기재된 바와 같이, TEA8SOS는 가수분해시 8 H+ 이온 및 8가 SOS8-를 방출하는 양성자-생성 제제이다 (도 1A, 패널 A2). 이온교환 크로마토그래피는, 방법 부문 (Id.)에서 아래에 기재된 바와 같이, MSNP 속으로 침지된, TEA8SOS를 생성하는데 사용되었다. 침지된 입자는, 3:2:0.15의 몰비에서 DSPC/콜레스테롤/DSPE-PEG2000으로 구성된, 지질 생물막으로 코팅된 둥근바닥 플라스크에 도입되었다. 현탁액의 초음파처리는, 포획 제제를 함유하는, LB-코팅된 입자를 수득하였다 (도 1A, 패널 A1). 이들 입자는 이리노테칸 용액에서 즉시 인큐베이션되어, 약물이 유입되고, 양성자화되고, SOS8와 회합으로 겔-유사 침전물로서 기공에서 포획되었다 (도 1A, 패널 A1 및 A2, 도1B). 이것은 우리가, 이전에 실증된 바와 같이, ∼0.7 cm3/g의 기공 용적 및 850 m2/g의 조합된 표면적을 가진 다공성 담체의 이론적 최대 장입 용량 (∼100 wt %)를 근사하는, 이리노테칸 장입 용량 최대 80 wt % 이상 (도 1B)을 달성하게 하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557).
방법이 포획제로서 약물 이리노테칸 및 TEA8SOS의 용도에 관하여 설명되는 한편, 원리의 증거를 실증하였다면, 동일한 방법이 실리카솜에서 수많은 다른 약물 (특히 약염기성 약물)을 편입시키는데 사용될 수 있고 수많은 다른 포획제가, 예를 들면, 본 명세서에서 기재된 바와 같이 유사하게 이용될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
약물 장입 용량이 약물 독성의 제한 및 치료 유효성에 또한 핵심인 중요한 제조 고려대상이기 때문에, 많은 연구가 MSNP에 의한 약물 캡슐화의 효능 최적화에 헌신되어 왔고, 증가된 장입 용량 및 상승작용 약물 조합을 공-전달하는 능력을 유발시킨다. 전통적 침지 방법에 의해 MSNPs 속으로 약물 예컨대 이리노테칸을 도입하는 것이 가능한 반면, 이러한 장입 방법은 약 10 wt%의 장입 수준을 달성하는 상대적으로 비효율적인 것으로 증명하였고 (참조, 예를 들면, He 등 (2010) Biomaterials, 31(12): 3335-3346), 그리고 기공에서 약물을 유지하는 것은 어렵다 (참조, 예를 들면, Meng 등 (2010) J. Am.Chem. Soc. 132(36): 12690-12697). 물리적 흡착, 정전 부착, 초분자 어셈블리 또는 포획 방법 (예를 들면, 스토퍼, 나노밸브 또는 차단 독립체)의 사용에 의존하는 전통적 약물 장입 접근법과 상이한, 다공성 나노입자에서 배치된 온전한 지질 2중층 코팅의 용도는 약물 포획용 급속 및 즉각적인 기공 밀봉을 제공한다. 이것은 합성을 단순화시키고 안정적인 및 높은 약물 장입 용량을 제공한다. 본 명세서에서 기재된 방법은 높은 수준에서 화물을 가진 다공성 입자를 장입하는데 효과적이고 지질 2중층으로 이러한 급속 및 즉각적인 기공 밀봉과 양립가능하다.
생물막 기술은 지지된 LB에 의해 젬시타빈 (GEM) (예를 들면 수용성 뉴클레오사이드)를 빠르게 캡슐화하는데 사용될 수 있는 LB-코팅된 MSNP 플랫폼을 위하여 개발되어 왔다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 이것은 최대 40 wt% GEM의 장입 용량을 LB-MSNPs가 달성하게 하였고, 뿐만 아니라 지질 2중층 (LB)에 편입될 수 있는 소수성 파클리탁셀 (PTX)의 공-전달을 가능하게 하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 이것은 마우스 (Id.)내 동소이식 인간 PDAC 모델에서 PDAC 치료용 상승작용 및 비율계량-설계된 담체로 제공되었다.
이러한 지지된 LB 코팅 방법은, MSNP 표면에 리포좀 접착, 파열, 추가의 리포좀 조성물의 첨가에 의해 2차로 밀봉되는 불완전한 코팅물에 의해 MSNP 표면의 부분적인 피복을 포함하는, 몇 개의 단계를 포함하는 MSNPs용 비교할만한 리포좀 코팅 기술보다 훨씬 우월한 것으로 또한 실증되어 왔다 (Liu 등 (2009) J. Am.Chem. Soc. 131:7567-7569).
그러나, 지질 2중층 (LB)의 존재가 이전의 약물 전달 나노입자에서 개선을 제공하는 한편, 본 명세서에서 기재된 원격 장입 방법의 이용에 앞서, 2중층은 더욱더 높은 약물 장입 수준 달성에 장애를 여전히 제공하였다
전술한 바와 같이, 다양한 구현예에서 LB-MSNP 플랫폼에 의한 약물 장입은 제1 단계로서 양성자화 제제를 캡슐화하기 위한 LB의 사용, 이어서 약물의 약염기 특성 (pKa = 8.1)에 의존적인, 이리노테칸 장입에 의해 추가로 개선되어 왔다. 본 명세서에서 예에서 나타낸 바와 같이, 비교는 MSNP 담체 및 리포좀 등가물 사이 실시되었고, 여기에서 비-지지된 LB는 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)의 캡슐화에 따른 이리노테칸 장입에 사용되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277; Von Hoff 등 (2013) Br. J. Cancer, 109(4): 920-925). MSNP 담체가 강력한 동소이식 PDAC 모델에서 리포좀 제형보다 이리노테칸 및 종양 사멸용 더 높은 장입 용량을 달성하였고, 뿐만 아니라 리포좀에 비교하여 증가된 담체 안정성 및 감소된 누출 때문에 약물 독성을 예방하였다. 따라서, LB-MSNP 플랫폼은 PDAC (또는 다른 암) 치료용 1차 이리노테칸 담체에 대하여 바람직한 특성을 나타낸다.
최근에, 폴리머-지질 지지된 코팅 방법은 Balb/c 누드 마우스내 약물-저항성 유방 암 종양을 치료하기 위한 MSNPs의 이리노테칸 약물 장입에 대하여 Zhang 등에 의해 기재되어 있다 (Zhang 등 (2014) Biomaterials, 35(11): 3650-3665). 그러나, 이러한 참고문헌에서 기재된 방법론은 상이하고, 본 명세서에서 기재된 방법 및 조성물에 비교하여 동일한 약물 장입 용량을 달성하지 못한다. 먼저, Zhang 등은, 본 명세서에서 제공된 담체 (~83.5%, w/w)의 1/5 장입 용량 (~15 %, w/w)만을 가진 담체를 초래하는, 고전적 LB 또는 포획제를 이용하지 않는다.
제2 주요 차이는 약물 장입 절차이다. 저자들은 “CPT-11 @MSNs”가 원심분리되었고 PBS (pH 7.4)에서 세정된 다음, 실온에서 진공하에서 건조되었다는 것을 언급한다. 그에 반해서, 본 명세서에서 기재된 방법은 비보호된 MSNPs의 건조를 요구하지 않는다. MSNPs의 건조는 전신 약물 전달용 핵심 요건인 수성 매질에서 재-현탁시 분산액 수득의 어려움 때문에 문제가 있을 수 있다. 또한, 본 방법은 약물 손실을 최소화하고, 하기를 용이하게 하는 기공 밀봉 전 약물 (예를 들면 이리노테칸)-장입된 MSNP의 세정을 요구하지 않는다: 높은 장입 용량 (예를 들면, ~83.5% (w/w)).
제3 주요 차이는 LB 제형의 조성물이다. 하나 이상의 구현예에서, 상업적으로 입수가능한 지질 플러스 콜레스테롤의 혼합물 (예를 들면, DSPC/콜레스테롤/DSPE-PEG)는 사용되고, 반면 Zhang 등은 인하우스 합성된, pH-감수성, 플루론산 P123 그라프팅된 DOPE를 사용한다. 플루론산의 사용은 약물 유출의 억제제로서 작용하는 그것의 능력에 분명하게 기반된다 (참조, 예를 들면, Batrakova 등 (2004) Pharm. Res. 21(12): 2226-2233) (앞으로 약물-저항성 유방 암을 치료하기 위한 고려대상). 코팅된 2중층에서 콜레스테롤의 부재는 플랫폼의 유체성 및 안정성을 감소시킨다. 그에 반해서, 실리카솜에서 콜레스테롤의 존재는 본 명세서에서 개시된 LB-MSNP의 탁월한 안정성에 기여한다 (참조 실시예). 또한, 제공된 담체에서 이리노테칸 캡슐화는 37 ℃에 7.4의 pH를 가진 생물학적 완충액에서 24 시간 동안 <5% 누출을 보여준다. 이것은 하기에 의해 기재된 미성숙한 누출 (24 시간 동안 pH 7.4 및 37 ℃에서 ~16% 누출)보다 2.5x 더 낮았다: Zhang 등 (2014) Biomaterials, 35:3650-3665).
Zhang 등에 의해 기재된 약물 전달 플랫폼으로부터 또 다른 차이는 본 발명의 다양한 구현예가 생물막 재수화 및 기공 밀봉용 탐침 초음파처리, 이어서 원심분리 정제 또는 크기 배제 크로마토그래피를 사용한다는 것이다. 다른 한편으로, Zhang 등은, 리포좀에 관하여, 막 압출 방법을 이용한다. 또한, CTAC는 MSNP 합성용 템플레이팅 제제로서 사용되고, 반면에 Zhang 등은 CTAB를 이용한다. 마지막으로, 본 발명은 PDAC 및 다른 암을 위한 요법의 개발을 다루고, 유방 암 연구에서 사용하기 위하여 Zhang 등에 의해 기재된 약물 전달 입자와 같이, 약물 저항을 극복하기 위해 주요하게 설계되지 않는다. 모두 고려하여, 특정한 이론에 구속됨 없이, 본 명세서에서 기재된 지질 2중층 코팅된 나노입자 약물 담체 (예를 들면, 이리노테칸-전달 LB-MSNP)가 혈액 및 바디 유체에서 약물 장입 용량, 콜로이드성 안정성, 생산의 용이성, 및 안정적인 약물 유지에 기반하여 Zhang 등의 담체를 능가하는 특유의 설계를 제공한다고 믿어진다.
나노입자.
다양한 구현예에서 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체는 지질 2중층으로 코팅된 다공성 실리카 나노입자 (예를 들면, 표면을 갖고 거기에 분자를 받는데 적합한 다수의 기공을 정의하는 실리카 바디)를 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서 실리카 나노입자는 메조다공성 실리카 나노입자일 수 있다. 나노입자가 실리카 나노입자로서 지칭된다는 사실은 실리카 나노입자 내에서 또한 편입된 것으로부터 실리카와 다른 물질을 배제하지 않는다. 일부 구현예에서, 실리카 나노입자는 기공에 대한 접근을 제공하는 표면을 통해 다수의 기공 개구들을 가진 실질적으로 구형일 수 있다. 그러나, 다양한 구현예에서 실리카 나노입자는 실질적으로 구형 형상과 다른 형상을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서 실리카 나노입자는 실질적으로 난형, 막대-형상화된, 실질적으로 규칙적 다각형, 불규칙한 다각형, 및 기타 동종일 수 있다.
일반적으로, 실리카 나노입자는 기공 개구들 사이 외부 표면, 뿐만 아니라 기공 안에서 측벽을 정의하는 실리카 바디를 포함한다. 기공은 실리카 바디를 통해 또 다른 기공 개구까지 확장할 수 있거나, 기공은 실리카 바디에 의해 정의된 바닥 표면을 갖도록 단지 부분적으로 실리카 바디를 통해 확장할 수 있다.
일부 구현예에서, 실리카 바디는 메조다공성이다. 다른 구현예에서, 실리카 바디는 미세다공성이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "메조다공성"은 약 2 nm 내지 약 50 nm 직경으로 기공을 갖는 것을 의미하고, 한편 "미세다공성"은 약 2 nm보다 더 작은 직경으로 기공을 갖는 것을 의미한다. 일반적으로, 기공은 임의의 크기일 수 있지만, 전형적인 구현예에서 거기에 하나 이상의 치료 화합물을 함유하기에 충분히 크다. 그와 같은 구현예에서, 기공은 작은 분자, 예를 들어, 치료 화합물 예컨대 항암 화합물이 기공의 표면 내부에 접착 또는 결합하도록 하고, 치료 목적으로 사용될 때 실리카 바디로부터 방출되도록 한다. 일부 구현예에서, 기공은 실질적으로 원통형이다.
특정 구현예에서 나노입자는 직경으로 약 1 nm 내지 약 10 nm 또는 약 2 nm 내지 약 8 nm 기공 직경을 갖는 기공을 포함한다. 특정 구현예에서 나노입자는 약 1 nm 내지 약 6 nm, 또는 약 2 nm 내지 약 5 nm 기공 직경을 갖는 기공을 포함한다. 다른 구현예는 2.5 nm 미만 기공 직경을 갖는 입자를 포함한다. 다른 구현예에서, 기공 직경은 1.5 내지 2.5 nm이다. 다른 기공 크기를 갖는 실리카 나노입자는, 예를 들어, 실리카 나노입자의 제조 동안 상이한 계면활성제 또는 팽윤제 이용에 의해 제조될 수 있다.
다양한 구현예에서 나노입자는 약 1000 nm만큼 큰 (예를 들면, 평균 또는 중앙 직경 (또는 다른 특징적인 치수) 입자를 포함할 수 있다. 그러나 다양한 구현예에서 나노입자는, 일반적으로, 300 nm 초과 입자가 살아있는 세포 또는 혈관 개창술 진입에 덜 효과적일 수 있음에 따라, 전형적으로 500 nm 미만 또는 약 300 nm 미만이다. 특정 구현예에서 나노입자는 크기로 약 40 nm, 또는 약 50 nm, 또는 약 60 nm 최대 약 100 nm, 또는 최대 약 90 nm, 또는 최대 약 80 nm, 또는 최대 약 70 nm 범위이다. 특정 구현예에서 나노입자는 크기로 약 60 nM 내지 약 70 nm 범위이다. 일부 구현예는 약 50 nm 내지 약 1000 nm 평균 최대 치수를 갖는 나노입자를 포함한다. 다른 구현예는 약 50 nm 내지 약 500 nm 평균 최대 치수를 갖는 나노입자를 포함한다. 다른 구현예는 약 50 nm 내지 약 200 nm 평균 최대 치수를 갖는 나노입자를 포함한다. 일부 구현예에서, 평균 최대 치수는 약 20nm 초과, 약 30nm 초과, 40nm 초과, 또는 약 50nm 초과이다. 다른 구현예는 약 500 nm 미만, 약 300nm 미만, 약 200nm 미만, 약 l00nm 미만 또는 약 75 nm 미만 평균 최대 치수를 갖는 나노입자를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 나노입자의 크기는, 투과 전자 현미경검사 (TEM) 또는 유사한 가시화 기술에 의해 측정된 바와 같이, 1차 입자의 평균 또는 중앙 크기를 지칭한다.
설명적인 메조다공성 실리카 나노입자는, 비제한적으로 MCM-41, MCM-48, 및 SBA-15를 포함한다 (참조, 예를 들면, Katiyar등 (2006) J. Chromatog.1122(1-2): 13-20).
다공성 실리카 나노입자의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다. 특정 구현예에서 메조다공성 실리카 나노입자는 테트라에틸 오르토실리케이트 (TEOS)를 교질입자 로드로 만들어진 템플레이트와 반응시킴으로써 합성된다. 결과는 기공의 규칙적 배열로 채워지는 나노-크기의 구형체 또는 로드의 수집이다. 템플레이트는 그 다음 적절한 pH로 조정된 용매로 세정에 의해 제거될 수 있다 (참조, 예를 들면, Trewyn 등 (2007) Chem. Eng.J. 137(1): 23-29. 특정 구현예에서 메조다공성 입자는 또한 단순 졸-겔 방법을 이용하여 합성될 수 있다 (참조, 예를 들면, Nandiyanto, 등 (2009) Microporous and Mesoporous Mat.120(3): 447-453, 및 기타 동종). 특정 구현예에서 테트라에틸 오르토실리케이트는 또한 (템플레이트로서) 추가의 폴리머 모노머와 사용될 수 있다. 특정 구현예에서 3-메르캅토프로필)트리메톡시실란 (MPTMS)는 TEOS 대신에 사용된다.
특정 구현예에서 메조다공성 실리카 나노입자는 하기에 의해 기재된 졸/겔 절차의 변형에 의해 합성된 코어이다: Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557.∼500 mg의 MSNP의 배치를 합성하기 위해, 50 mL의 CTAC는 플라스크 (예를 들면, 500 mL 원뿔형 플라스크)에서 150 mL의 H2O와 혼합되었고, 이어서 (예를 들면, 350 rpm으로 15분 동안 85 ℃에) 교반되었다. 이에 이어서 동일한 온도에서 30분 동안 8 mL의 10% 트리에탄올아민이 첨가되었다. 그 다음, 7.5 mL의 실리카 전구체, TEOS는 연동 펌프를 이용하여 1 mL/min의 비율로 적가된다. 용액은 350 rpm으로 85 ℃에서 20 분 동안 교반되어, ∼65 nm의 1차 크기를 가진 입자 형성을 유발한다. 계면활성제는 24시간 동안 실온에서 메탄올/HCl (500:19 v/v)의 혼합물로 입자의 세정에 의해 제거될 수 있다. 입자는 10 000 rpm으로 60 분 동안 원심분리될 수 있고 세정된 메탄올에서 3회 세정될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 장입 방법이 다공성 실리카 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카)의 장입에 관하여 실증되었던 반면, 유사한 장입 방법이 다른 다공성 나노입자와 사용될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 약물 전달 나노입자에서 사용될 수 있는 수많은 다른 메조다공성 물질은 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 예를 들어, 특정 구현예에서 메조다공성 탄소 나노입자는 이용될 수 있다. 메조다공성 탄소 나노입자는 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다 (참조, 예를 들면, Huang 등 (2016) Carbon, 101:135-142; Zhu 등 (2014) Asian J. Pharm. Sci., 9(2): 82-91; 및 기타 동종).
유사하게, 특정 구현예에서, 메조다공성 폴리머 입자는 이용될 수 있다. 증발 유도된 자가-조립 전략에 의한 가용성, 저-분자-중량 페놀 수지 전구체 (레졸)과 트리블록 코폴리머의 유기-유기 조립으로부터 고도로 정렬된 메조다공성 폴리머 및 탄소 프레임워크의 합성은 하기에 의해 보고되고 있다: Meng 등 (2006) Chem. Mat.6(18): 4447-4464 및 거기에 인용된 참조문헌에서.
본 명세서에서 기재된 나노입자는 설명적이고 비제한적이다. 본 명세서에서 제공된 교시를 이용하여 수많은 다른 지질 2중층 약물 전달 나노입자는 당해 분야의 숙련가에 이용가능할 것이다.
지질 2중층.
본 명세서에서 기재된 약물 담체 나노입자는 지질 2중층으로 코팅된 다공성 나노입자 (예를 들면 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP))를 포함한다. 특정 구현예에서 2중층 조성물은, 바람직한 화물 방출 프로파일을 또한 허용하면서, 급속 및 균일한 입자 코팅을 제공하는데, 콜로이드성 및 순환 안정성을 제공하는데, 그리고 효과적인 화물 유지를 제공하는데 최적화된다.
특정 구현예에서 지질 2중층은 인지질, 콜레스테롤, 및 특정 구현예에서, 하기의 조합을 포함한다: 페길화된 지질 (예를 들면, DSPE-PEG2000), 또는 파벌화된 페길화된 지질 (예를 들면, DSPE-PEG2000-말레이미드) (표적 또는 다른 모이어티와 콘주게이션을 용이하게 하기 위해).
표면 LB 코팅물을 부착시키기 위해, 코팅된 지질 막 절차는 약물- 또는 TEO8SOS-침지된 MSNP 현탁액이, 예를 들면, 둥근바닥 플라스크상에 코팅된, 큰 지질 막 표면에 첨가된 것에서 개발되었다. 상이한 지질 2중층 조성물을 이용하여, 일련의 실험은 급속 및 균일한 입자 랩핑, 코팅 및 초음파처리시 효과적인 화물 유지 및/또는 방출을 제공하는 최적의 지질/입자 비 및 조성을 찾기 위해 수행될 수 있다. 이러한 지질 조성 및 랩핑이 저 에너지 소용돌이 조건하에서 입자 표면에 리포좀 융합에 의해 달성될 수 없다는 것이 믿어진다.
실시예 1에서 기재된 바와 같이, 특정 구현예에서, 500 mg MSNPs는 20 mL TEA8SOS (80 mM 용액)에 침지되고, 이것은 지질 생물막의 최상부에서 첨가되고, DSPC/Chol/DSPE-PEG2000 (몰비 3:2:0.15)의 550 mg 혼합물로 구성되고, 둥근바닥 플라스크의 최하부에서 코팅된다 (참조 실시예 1, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). "3:2:0.15"의 비는 사람이 비를 나타내기 위해 mol%를 사용하면 "58.3 mol% : 38.8 mol% : 3.9 mol%"와 같다. 이것은 ~1.1:1의 지질:입자 비를 제공한다. LB로 입자 랩핑 및 코팅을 달성하기 위한 초음파처리 후, 자유 TEA8SOS는 Sepharose CL-4B 칼럼상에 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거된다. TEA8SOS 장입된 실리카솜은 65 ℃에 수조에서 약물 장입용 10 mg/mL 이리노테칸 용액에서 인큐베이션된다. 장입은 켄칭 및 빙수조에 의해 30 min 후 중단되고, 그 이후 약물-장입된 실리카솜은 원심분리 및 PBS에 재현탁에 의해 3회 세정되었다.
상기 및 실시예 1에서 기재된 지질 2중층 제형은 설명적이고 비제한적이다. 실리카솜 속으로 장입되는 약물(들) 및 원하는 방출 제공에 의존하여, 다양한 구현예에서 상이한 지질 2중층 제형(formulaitosn)은 사용될 수 있고 최적의 제형은 결정될 수 있다.
따라서, 특정 구현예에서 지질 2중층은 하기를 포함할 수 있다: 1) C14-C20 탄소 쇄를 가진 하나 이상의 포화 지방산, 예컨대 디미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 디팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 및 디악틸포스파티딜콜린 (DAPC); 및/또는 2) C14-C20 탄소 쇄를 가진 하나 이상의 불포화 지방산, 예컨대 1,2-디미리스트올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디팔미톨레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린, 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DOPC), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린; 및/또는 3) C12-C20 탄소 쇄를 가진 지방산의 혼합물을 포함하는 천연 지질, 예컨대 계란 PC, 및 콩 PC, 스핑고미엘린, 및 기타 동종.이들 지질은 설명적이지만 비제한적이고 수많은 다른 지질은 공지되고 실리카솜의 형성용 지질 2중층 속으로 편입될 수 있다.
특정 구현예에서 실리카솜은 지질 (예를 들면, 인지질), 콜레스테롤, 및 PEG 작용화된 지질 (예를 들면, mPEG 인지질)을 함유한다. 특정 구현예에서 mPEG 인지질은 하기로부터 C14-C18 인지질 탄소 쇄, 및 350-5000의 PEG 분자량을 포함한다: (예를 들면, MPEG 5000, MPEG 3000, MPEG 2000, MPEG 1000, MPEG 750, MPEG 550, MPEG 350, 및 기타 동종). 특정 구현예에서 mPEG 인지질은 DSPE-PEG5000, DSPE-PEG3000, DSPE-PEG2000, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG750, DSPE-PEG550, 또는 DSPE-PEG350을 포함한다. MPEGs는 상업적으로 입수가능하다 (참조, 예를 들면, //avantilipids.com/product-category/products/polymers-polymerizable-lipids/mpeg-phospholipids/).
특정 구현예에서 하기의 비: 인지질:CHOL:PEG,는 약 하기이다: 인지질 (50-90 mol%): CHOL (10-50 mol%) : PEG (1-10 mol%).
상기 및 실시예에서 제공된 이러한 프로토콜은 설명적이다. 특정 구현예에서 포획제는 변경될 수 있고, 지질 조성 및 몰비는 변경될 수 있고, 약물 또는 약물들은 그것의 특정한 화물(들)에 대하여 최적화된 다른 실리카솜을 확인하기 위해 변경될 수 있다.
예를 들어, 젬시타빈-함유 실리카솜용 효과적 지질 제형이 77.5:20:2.5의 몰비에서 DPPC/콜레스테롤/DSPE-PEG를 포함하고, 한편 실리카솜을 함유하는 이리노테칸용 효과적 지질 제형이 DSPC/Chol/DSPE-PEG2000 (58.3 mol% : 38.8 mol% : 3.9 mol%와 같은, 몰비 3:2:0.15)를 포함한다는 것이 주목된다.
특정 구현예에서 이들 방법은 약물-장입 용량 (약물의 중량/담체의 총 중량)을 개선하기 위해 다양해질 수 있다. 특정 구현예에서 약물 장입 용량은 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 또는 적어도 80% w/w이다. 특정 구현예에서 약물 장입은 40% w/w 초과, 또는 45% w/w 초과, 또는 50% w/w 초과, 또는 60% w/w 초과, 또는 70% w/w 초과, %, 또는 80% w/w 초과이다.
본 명세서에서 기재된 프로토콜은, 본 명세서에서 제공된 개선된 장입 용량 및 방출 프로파일 그리고 합성의 용이성의 설명에 의해 설명된 바와 같이, MSNP 표면과 융합에 의한 리포좀 코팅 방법에 의해 제조된 나노캐리어를 능가하는 나노입자 약물 담체 (나노캐리어)를 제공한다. 전형적인 구현예에서, LB 코팅 절차는 하기를 빠르게 캡슐화하는데 사용된다: 양성자화 제제, 예를 들면, TEA8SOS (이것은 후속적으로 이리노테칸 장입 및 LB를 거쳐 확산하는 들어오는 약물 양성자화에 의한 포획을 제공한다). 이것은 입자 기공에서 높은 약물 장입을 유발시킨다. 하기를 유지하기 위한 급속 및 효과적 기공 밀봉: 포획제 (예를 들면, TEA8SOS)는, 누출 없이, 담체의 유효성 및 안정성에 기여한다.
화물 포획 시약.
화물-포획 시약은 원하는 화물과 상호작용하기 위해 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 다른 방식의 상호작용이 고려되어도, 상기 상호작용은 이온성 또는 양성자화 반응일 수 있다. 화물포획제는 하나 이상의 이온성 부위를 가질 수 있다, 즉, 모노-이온성 또는 폴리-이온성일 수 있다. 이온성 모이어티는 양이온성, 음이온성일 수 있거나, 일부 경우에, 화물포획제는 양쪽 양이온성 및 음이온성 모이어티를 포함할 수 있다. 이온성 부위는 상응하는 미하전된 형태와 평형일 수 있고; 예를 들어, 음이온성 카복실레이트 (-COO-)는 그것의 상응하는 카복실산 (-COOH)와 평형일 수 있거나; 또 다른 예에서, 아민 (-NH2)는 그것의 상응하는 양성자화된 암모늄 형태 (-NH3 +)와 평형일 수 있다. 이들 평형은 국부 환경의 pH에 의해 영향받는다.
마찬가지로, 특정 구현예에서, 화물은 하나 이상의 이온성 부위를 포함할 수 있다. 화물포획제 및 화물은 나노입자 (예를 들면, 메조다공성 실리카 나노입자) 내부에서 상호작용하기 위해 선택될 수 있다. 상기 상호작용은 화물의 방출이 요구되는 때까지 나노입자 내에서 화물을 유지하는데 도울 수 있다. 일부 구현예에서, 화물은 비-이온성 및 이온 형태 사이 pH-의존적 평형에서 실재할 수 있다. 비-이온성 형태는 지질 2중층을 거쳐 확산할 수 있고 MSNP의 기공에 진입할 수 있다. 거기서, 화물포획제 (예를 들면, 폴리이온성 화물포획제)는 화물의 이온 형태와 상호작용할 수 있고 이로써 나노캐리어 안에서, 예를 들면, MSNP의 기공 안에서 화물을 유지시킬 수 있다 (단 화물 및 화물포획제의 이온 형태는 반대 전하를 갖는다). 상호작용은 이온성 상호작용일 수 있고, 침전물의 형성을 포함할 수 있다. 나노캐리어 안에서 화물의 포획은 유사한 시스템, 예를 들면, 화물포획제를 생략하는 나노캐리어, 또는 포획제를 포함하는 리포좀에 비교하여 더 높은 수준의 화물 장입을 제공할 수 있다. 화물의 방출은 화물과 화물포획제 사이 상호작용을 파괴하기 위해 pH에서 적절한 변화에 의해, 예를 들어, 지질 2중층을 거쳐 더욱 쉽게 확산할 수 있는 그것의 비-이온성 상태로 화물의 되돌림에 의해 달성될 수 있다. 하나의 구현예에서, 화물은 이리노테칸이고 화물포획제는 TEA8SOS이다.
화물 포획제는 TEA8SOS로 제한될 필요는 없다. 특정 구현예에서 화물 포획은 (NH4)2SO4, 및 기타 동종 같은 작은 분자를 포함한다. 다른 포획제는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 암모늄 염 (예를 들면, 황산암모늄, 암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트,, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄 아세테이트, 및 기타 동종), 트리메틸암모늄 염 (예를 들면, 트리메틸암모늄 설페이트, 트리메틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 포스페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 시트레이트, 트리메틸암모늄 아세테이트, 및 기타 동종), 트리에틸암모늄 염 (예를 들면, 트리에틸암모늄 설페이트, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 포스페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 시트레이트, 트리에틸암모늄 아세테이트, 및 기타 동종).
TEA8SOS에 더하여, 막관통 pH 구배가 하기에 의해 또한 생성될 수 있다는 것이 또한 가치있는 언급이다: 산성 완충액 (예를 들면 시트레이트) (Chou 등 (2003) J. Biosci. Bioengineer., 95(4): 405-408; Nichols 등 (1976) Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 455(1): 269-271), 양성자-생성 분리가능한 염 (예를 들면(NH4)2SO4) (Haran 등 (1993) Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1151(2): 201-215; Maurer-Spurej 등 (1999) Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1416(1): 1-10; Fritze 등 (2006) Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1758(10): 1633-1640), 또는 하기로부터 이온투과담체-매개된 이온 구배: 금속 염 (예를 들면A23187 및 MnSO4) (Messerer 등 (2004) Clinical Cancer Res. 10(19): 6638-6649; Ramsay 등 (2008) Eur. J. Pharmaceut.Biopharmaceut.68(3): 607-617; Fenske 등 (1998) Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Biomembranes, 1414(1)L 188-204). 또한, 약물 장입용 역 pH 구배를 생성하는 것, 예컨대 리포좀에서 이용되고 있는 전략인, LB-MSNP에서 양친매성 약산 장입을 개선하기 위한 칼슘 아세테이트 구배를 사용하는 것이 가능하다 (Avnir 등 (2008) Arthritis & Rheumatism, 58(1): 119-129).
화물/약물.
하나 이상의 구현예에서, 화물은, 양성자화될 수 있는, 적어도 하나의 일차 아민 기, 또는 적어도 하나의 2차 아민 기, 또는 적어도 하나의 3차 아민 기, 또는 적어도 하나의 4차 아민 기를 포함하는 유기 화합물, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 우리는 또한 양성자 구배를 통해 LB-MSNPs 속으로 장입될 수 있는 약염기성 약물의 포괄적인 목록을 확인하였다. 이들 화물 분자의 일반적인 특징은 다음과 같은 화학 특성을 포함한다: (i) 1차, 2차, 3차 또는 4차 아민(들)을 포함하는 유기 분자 화합물;(ii) LB 뒤에서 양성자화 및 포획을 허용하는 pKa <11 (Zucker 등 (2009) J. Control. Release, 139(1): 73-80; Cern 등 (2012) J. Control. Release, 160(2): 147-157; Xu 등 (2014) Pharmaceut.Res. 31(10): 2583-2592); (iii) 5-25 mg/mL의 수용해도 지수 그리고 LB를 거쳐 확산을 허용하는 양친매성 특징;(iv) -3.0 내지 3.0의 옥탄올/물 분배 계수 또는 logP 값 (Zucker 등 (2009) J. Control. Release, 139(1): 73-80; Cern 등 (2012) J. Control. Release, 160(2): 147-157); (v) MSNP 기공 속으로 진입을 허용하는, MSNP 기공 크기 (2-8 nm) 미만 기하학적 크기를 가진 적합한 분자량 (Li 등 (2012) Chem. Soc. Rev. 41(7): 2590-2605; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801).
모두-포함됨 없이, 다양한 구현예에서 잠재적인 화학요법 제제의 목록은 하기를 포함할 수 있다: 이리노테칸 유도체 및 대사물 예컨대 다른 알칼로이드와 함께 SN38 (예를 들면 토포테칸, 10-하이드록시캄프토테신, 벨로테칸, 루비테칸, 비노렐빈, LAQ824, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 호모하링토닌, 트라벡테딘), 안트라사이클린 (예를 들면 독소루비신, 에피루비신, 피라루비신, 다우노루비신, 루비도마이신, 발루비신, 암루비신), 알칼리성 안트라센디온 (예를 들면 미톡산트론), 알칼리성 알킬화제 (예를 들면 사이클로포스파마이드, 메클로르에타민, 테모졸로마이드), 퓨린 또는 피리미딘 유도체 (예를 들면5-플루오로우라실, 5’-데옥시-5-플루오로우리딘, 젬시타빈, 카페시타빈), 및 단백질 키나제 억제제 (예를 들면 파조파닙, 엔자스타우린, 반데타닙 에를로티닙, 다사티닙, 닐로티닙, 수니티닙).
상기 제제의 하나 또는 조합을 패키징 및 전달하는 능력은, 추가의 암 유형 예컨대 결장, 유방, 폐, 간, 신경아교종, 흑색종, 등의 치료 고려대상을 포함하여, 다작용성 LB-MSNP 플랫폼의 광범위 유용성을 향상시킬 것이다.
단일 담체 속으로 상기 목록내 약물 조합을 코패키징하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 우리가 우리의 GEM/ PTX 공-전달 플랫폼으로 달성하였던 성공에 기반하여 (참조, 예를 들면Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557), 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 이용하여 상승작용 및 비율계량 전달용 폴피리녹스 레지멘 (예를 들면, 이리노테칸을 가진 옥살리플라틴)에서 약물 조합을 고려하는 것이 가능하다. 또한, 우리의 LB-MSNP에 의한 약물 장입은 비-암성 적용, 예컨대 감염성 질환 적용, 예를 들면, 시프로플록사신, 레보플록사신 또는 HIV 항레트로바이러스 (예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트)용 항생제 캡슐화에 사용될 수 있다.
상기 언급된 암 약물에 더하여, 약물 분자가 상기에 기재된 바와 같이 염기성인 한, 포획 시약 촉진된 LB-MSNP 플랫폼은 효율적인 약물 장입 및 전달에 유용하다. 비-염기성 약물 분자에 대하여, 포획 시약이 제한된 도움을 제공할 것인 반면, MSNP 기공 치유용 제공된 1단계 생물막 기술은 더욱더 큰 범위의 약물 분자, 예컨대 항암 약물, 항-바이러스성 약물, 항진균 약물, 및 항생제에 여전히 유효하다.
예를 들어, MSNP 밀봉용 LB 생물막의 용법으로, 특정 구현예에서 효율적인 약물 캡슐화는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 에버롤리무스, 트라벡테딘, 파클리탁셀, TLK 286, AV-299, DN-101, 파조파닙, GSK690693, RTA 744, ON 0910.Na, AZD 6244 (ARRY-142886), AMN-107, TKI-258, GSK461364, AZD 1152, 엔자스타우린, 반데타닙, ARQ-197, MK-0457, MLN8054, PHA-739358, R-763, AT-9263, FLT-3 억제제, VEGFR 억제제, EGFR TK 억제제, 오로라 키나제 억제제, PIK-1 모듈레이터, Bcl-2 억제제, HDAC 억제제, c-MET 억제제, PARP 억제제, Cdk 억제제, EGFR TK 억제제, IGFR-TK 억제제, 항-HGF 항체, PI3 키나제 억제제, AKT 억제제, JAK/STAT 억제제, 체크포인트-1 또는 2 억제제, 국부 점착 키나제 억제제, Map 키나제 키나제 (mek) 억제제, VEGF 트랩 항체, 페메트렉세드, 에를로티닙, 다사타닙, 닐로티닙, 데카타닙, 파니투무맙, 암루비신, 오레고보맙, Lep-etu, 놀라트렉세드, azd2171, 바타불린, 오파투무맙, 자놀리무맙, 에도테카린, 테트란드린, 루비테칸, 테스밀리펜, 오블리메르센, 틸실리무맙, 이필리무맙, 고시폴, Bio 111, 131-I-TM-601, ALT-110, BIO 140, CC 8490, 실렌지타이드, 지마테칸, IL13-PE38QQR, INO 1001, IPdR1 KRX-0402, 루칸톤, LY 317615, 뉴라디압, 비테스판, Rta 744, Sdx 102, 탈람파넬, 아트라센탄, Xr 311, 로미뎁신, ADS-100380, 수니티닙, 5-플루오로우라실, 보리노스타트, 에토포시드, 젬시타빈, 독소루비신, 5′-데옥시-5-플루오로우리딘, 빈크리스틴, 테모졸로마이드, ZK-304709, 셀리시클립; PD0325901, AZD-6244, 카페시타빈, L-글루탐산, N-[4-[2-(2-아미노-4,7-디하이드로-4-옥소-1H-피롤로[2,3-d] 피리미딘-5-일)에틸] 벤조일] -, 디나트륨 염, 헵타히드레이트, 캄프토테신, PEG-표지된 이리노테칸, 타목시펜, 토레미펜 시트레이트, 아나스트라졸, 엑세메스탄, 레트로졸, DES(디에틸스틸베스트롤), 에스트라디올, 에스트로겐, 콘주게이션된 에스트로겐, 베바시주맙, IMC-1C11, CHIR-258,); 3-[5-(메틸설포닐피페라딘메틸)-인돌릴j-퀴놀론, 바탈라닙, AG-013736, AVE-0005, [D-Ser(Bu t) 6,Azgly ] 의 아세테이트 염 (피로-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(Bu t)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2 아세테이트 [C59H84N18Oi4-(C2H4O2)X 식중 x=1 내지 2.] , 고세렐린 아세테이트, 류프롤라이드 아세테이트, 트립토렐린 파모에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메게스트롤 아세테이트, 랄록시펜, 바이칼루타마이드, 플루타미드, 닐루타마이드, 메게스트롤 아세테이트, CP-724714; TAK-165, HKI-272, 에를로티닙, 라파타닙, 카네르티닙, ABX-EGF 항체, 어비툭스, EKB-569, PKI-166, GW-572016, 이오나파르닙, BMS-214662, 티피파르닙; 아미포스틴, NVP-LAQ824, 수베로일 아날리드 하이드록삼산, 발프로산, 트리코스타틴 A, FK-228, SU11248, 소라페닙, KRN951, 아미노글루테티미드, 암사크린, 아나그렐라이드, L-아스파라기나제, 바실러스 칼메트-구에린 (BCG) 백신, 블레오마이신, 부세렐린, 부설판, 카보플라틴, 카무스틴, 클로르암부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로드로네이트, 사이프로테론, 사이타라빈, 다카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 디에틸스틸베스트롤, 에피루비신, 플루다라빈, 플루드로코르티손, 플루옥시메스테론, 플루타미드, 젬시타빈, 글리벡, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파마이드, 이마티닙, 류프롤라이드, 레바미솔, 로무스틴, 메클로르에타민, 멜팔란, 6-메르캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미토탄, 미톡산트론, 닐루타마이드, 옥트레오타이드, 옥살리플라틴, 팔미드로네이트, 펜토스타틴, 플리카마이신, 포르피머, 프로카바진, 랄티트렉세드, 리툭시맙, 스트렙토조신, 테니포시드, 테스토스테론, 탈리도마이드, 티오구아닌, 티오테파, 트레티노인, 빈데신, 13-시스-레틴산, 페닐알라닌 머스타드, 우라실 머스타드, 에스트라무스틴, 알트레타민, 플록수리딘, 5-데오옥시우리딘, 시토신 아라비노시드, 6-머캅토퓨린, 데옥시코포르마이신, 칼시트리올, 발루비신, 미트라마이신, 빈블라스틴, 비노렐빈, 토포테칸, 라족신, 마리마스타트, COL-3, 네오바스타트, BMS-275291, 스쿠알라민, 엔도스타틴, SU5416, SU6668, EMD121974, 인터류킨-12, IM862, 안지오스타틴, 비탁신, 드롤록시펜, 이독시펜, 스피로노락톤, 피나스테라이드, 시미티딘, 트라스투주맙, 데닐류킨 디프티톡스, 게피티닙, 보르테지밉, 파클리탁셀, 크레모포어-자유 파클리탁셀, 도세탁셀, 에피틸론 B, BMS-247550, BMS-310705, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 피펜독시펜, ERA-923, 아르족시펜, 풀베스트란트, 아콜비펜, 라소폭시펜, 이독시펜, TSE-424, HMR-3339, ZK186619, 토포테칸, PTK787/ZK 222584, VX-745, PD 184352, 라파마이신, 40-O-(2-하이드록시에틸)-라파마이신, 템시롤리무스, AP-23573, RAD001, ABT-578, BC-210, LY294002, LY292223, LY292696, LY293684, LY293646, 보르트만닌, ZM336372, L-779,450, PEG-필그라스팀, 다베포에틴, 에리트로포이에틴, 과립구 콜로니-자극 인자, 졸렌드로네이트, 프레드니손, 세툭시맙, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 히스트렐린, 페길화된 인터페론 알파-2a, 인터페론 알파-2a, 페길화된 인터페론 알파-2b, 인터페론 알파-2b, 아자시티딘, PEG-L-아스파라기나제, 레날리도마이드, 젬투주맙, 하이드로코르티손, 인터류킨-11, 덱스라족산, 알렘투주맙, 올-트랜스레티노산, 케토코나졸, 인터류킨-2, 메게스트롤, 면역 글로불린, 질소 머스타드, 메틸프레드니솔론, 이브리트구모맙 티욱세탄, 안드로겐, 데시타빈, 헥사메틸멜라민, 벡사로텐, 토시투모맙, 삼산화 비소, 코르티손, 에디트로네이트, 미토탄, 사이클로스포린, 리포좀 다우노루비신, Edwina-아스파라기나제, 스트론튬 89, 카소피탄트, 네투피탄트, NK-1 수용체 길항제, 팔로노세트론, 아프레피탄트, 디펜히드라민, 하이드록시진, 메토클로프라마이드, 로라제팜, 알프라졸람, 할로페리돌, 드로페리돌, 드로나비놀, 덱사메타손, 메틸프레드니솔론, 프로클로르퍼라진, 그라니세트론, 온단세트론, 돌라세트론, 트로피세트론, 페그필그라스팀, 에리트로포이에틴, 에포에틴 알파, 및 다르베포에틴 알파, 보세프레비어, 다클라타스비르, 아수나파비르, INX-189, FV-100, NM 283, VX-950 (텔라프레비르), SCH 50304, TMC435, VX-500, BX-813, SCH503034, R1626, ITMN-191 (R7227), R7128, PF-868554, TT033, CGH-759, GI 5005, MK-7009, SIRNA-034, MK-0608, A-837093, GS 9190, GS 9256, GS 9451, GS 5885, GS 6620, GS 9620, GS9669, ACH-1095, ACH-2928, GSK625433, TG4040 (MVA-HCV), A-831, F351, NS5A, NS4B, ANA598, A-689, GNI-104, IDX102, ADX184, ALS-2200, ALS-2158, BI 201335, BI 207127, BIT-225, BIT-8020, GL59728, GL60667, PSI-938, PSI-7977, PSI-7851, SCY-635, 리바비린, 페길화된 인터페론, PHX1766, SP-30, 또는 이들의 혼합물.
특정 구현예에서 화물은 항진균제를 포함한다. 설명적 항진균제는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 암포테리신 B (예를 들면, 슈달레스케리아 sp., 및 기타 동종을 제외한 대부분의 진균 감염용), 아니둘라펀진 (예를 들면, 캔디다혈증, 및 기타 동종을 포함하는, 캔디다증용), 카스포펀진 (예를 들면, 아스페르길루스증, 캔디다혈증을 포함하는, 캔디다증, 및 기타 동종용), 플루코나졸 (예를 들면, 점막 및 전신 캔디다증, 크립토코쿠스 수막염, 콕시디오이데스 수막염, 및 기타 동종용), 플루시토신 (예를 들면, 캔디다증 (전신), 효모균증, 및 기타 동종용), 이사부코나졸 (예를 들면, 아스페르길루스증, 털곰팡이증, 및 기타 동종용), 이트라코나졸 (예를 들면, 피부진균증, 히스토플라마증, 블라스토마이세스병, 콕시디오이데스 진균증, 스포로트리쿰증, 및 기타 동종용), 마이카펀진 (예를 들면, 캔디다혈증을 포함하는, 캔디다증용), 포사코나졸 (예를 들면, 침습성 아스페르길루스증 및 캔디다증, 경구 캔디다증, 이트라코나졸에 난치성 경구 캔디다증, 및 기타 동종 예방용), 보리코나졸 (예를 들면, 침습성 아스페르길루스증, 푸사리오시스, 세도스포리오시스, 및 기타 동종에 대한), 및 기타 등등.
이중 치료 실리카솜.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체 (실리카솜)이 2 이상의 치료제를 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 따라서, 예를 들어, 특정 구현예에서 실리카솜에서 기공은 2, 또는 3, 또는 4, 또는 초과 상이한 치료제로 장입될 수 있다. 이것은, 특정 구현예에서, 이들 치료제의 비율계량 전달을 허용할 수 있다. 비제한적 실례로써, 수많은 다중-제제 치료 레지멘은 암의 치료에 대하여 공지된다. 이들은, 비제한적으로 하기를 포함한다: COMP (메토트렉세이트, 프레드니손), LSA2-L2 (사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 프레드니손, 다우노마이신, 메토트렉세이트, 사이타라빈, 티오구아닌, 아스파라기나제, 및 카무스틴), 폴피리녹스 (이리노테칸, 옥살리플라틴, 5-플루오로우라실, 류코보린), 및 기타 동종. 특정 구현예에서 본 명세서에서 기재된 방법을 이용하여 실리카솜 속으로 약물이 장입되도록 본 명세서에서 기재된 요건을 충족시키는 2 이상의 제제는 실리카솜에서 제공될 수 있다. 다중약물 레지멘이 본 명세서에서 기재된 장입 방법과 양립가능하지 않은 제제를 포함하는 경우, 일부 제제 (예를 들면, 이리노테칸)은 개선된 내성을 제공하도록 실리카솜에서 제공될 수 있고 치료 레지멘의 다른 성분은 전통적 양식에 의해 투여될 수 있다.
특정 구현예에서 소수성 (예를 들면, 친유성) 약물, 및 다른 제제)는 실리카솜의 지질 2중층 성분에서 제공될 수 있다. 그와 같은 소수성 약물은, 비제한적으로 파클리탁셀, 엘립티신, 캄프토테칸, L-아스파라기나제, 독소루비신, SN-38 및 기타 동종을 포함한다. 특정 구현예에서 실리카솜의 지질 2중층 성분은 하나 이상의 인지질 전구약물 (예를 들면, 지질에 콘주게이션된 약물)을 함유할 수 있다. 설명적 지질 전구약물은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 아사이클로비르 디포스페이트 디미리스토일글리세롤 (참조, 예를 들면, Hostetler, 등 (1993) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90(24): 11835-11839), 독소루비신 콘주게이션된 인지질 전구약물 (참조, 예를 들면, Wang 등 (2015) J. Mater. Chem. B., 3:3297-3305), 뉴클레오사이드 유사체의 인지질 유도체 (예를 들면, 하기의 5'-디포스페이트-L-1,2-디팔미틴 유도체: 1-β-D-아라비노푸라노실시토신 (ara-C), 9-β-D-아라비노푸라노실아데닌 (ara-A), 투베르시딘, 및 기타 동종 (참조, 예를 들면, Matsushita 등 (1981) Cancer Res., 41:2707-2713)), 인지질 연결된 클로르암부실 (참조, 예를 들면, Pederson 등 (2010) J. Med. Chem., 53:3782-3792), 및 기타 동종.
전술한 다중-제제 실리카솜은 설명적이고 비제한적이다. 본 명세서에서 제공된 교시를 이용하여 본 명세서에서 기재된 실리카솜에서 (또는 그 위에) 편입용 치료제의 수많은 조합은 당해 분야의 숙련가에 이용가능할 것이다.
표적 리간드 및 면역접합체.
특정 구현예에서 LB-코팅된 나노입자 (실리카솜)은, 예를 들면, 암 세포에, 내피 세포내 특이적 전달을 용이하게 하기 위해, 하나 이상의 표적 리간드에, 예를 들면, 엔도조말 탈출을 용이하게 하기 위해, 융합유도 리간드에, 혈액-뇌 장벽을 거쳐 수송을 촉진시키는 리간드, 및 기타 동종에 콘주게이션될 수 있다.
하나의 설명적, 그러나 비제한적 구현예에서, 실리카솜은 하기에 콘주게이션된다: 융합유도 펩타이드 예컨대 히스티딘-풍부 H5WYG (H2N-GLFHAIAHFIHGGWHGLIHGWYG-COOH, (서열 식별 번호:1))(참조, 예를 들면, Midoux 등,(1998) Bioconjug.Chem. 9:260-267).
특정 구현예에서 실리카솜은 항체 뿐만 아니라 표적 펩타이드를 포함하는 표적 리간드에 콘주게이션된다. 표적 항체는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 온전한 면역글로불린, 면역글로불린 단편 (예를 들면, F(ab)'2, Fab, 등) 단일 쇄 항체, 디아바디, 아피바디, 유니바디, 나노바디, 및 기타 동종. 특정 구현예에서 암 마커 (예를 들면, 종양 관련된 항원)을 특이적으로 결합시키는 항체는 사용될 것이다. 다양한 암 마커는 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 마커는 암 세포에 특별할 필요는 없지만, 또한 마커의 발현이 (정상 건강한 세포에 비교된 경우) 암 세포에서 상승되는 경우 또는 마커가 주위 조직에서 비교할만한 수준으로 존재하지 않는 경우 (특히 키메라성 모이어티가 국소적으로 전달되는 경우) 효과적일 수 있다.
설명적 암 마커는, 예를 들어, ND4 단클론성 항체에 의해 인식된 종양 마커를 포함한다. 상기 마커는 저조하게 분화된 결장직장 암, 뿐만 아니라 위장 신경내분비 종양에서 발견된다 (참조, 예를 들면, Tobi 등 (1998) Cancer Detection and Prevention, 22(2): 147-152). 암 면역요법에 대하여 다른 중요한 표적은, 생체내 및 시험관내 대부분의 종양 세포에서 발현되는 것으로 밝혀진, 막 결합된 보체 조절 당단백질 CD46, CD55 및 CD59이다. 인간 뮤신 (예를 들면MUC1)은, 흑색종에서 발견되는, gp100, 티로시나제, 및 MAGE이듯이, 공지된 종양 마커이다. 야생형 윌름스 종양 유전자 WT1은 대부분의 급성 골수구성, 급성 림프구성, 및 만성 골수구성 백혈병에서, 뿐만 아니라 폐 암을 포함하는 다양한 유형의 고체 종양에서 높은 수준으로 발현된다.
급성 림프구성 백혈병은 TAAs HLA-Dr, CD1, CD2, CD5, CD7, CD19, 및 CD20을 특징으로 하고 있다. 급성 골수성 백혈병은 TAAs HLA-Dr, CD7, CD13, CD14, CD15, CD33, 및 CD34를 특징으로 하고 있다. 유방 암은 마커 EGFR, HER2, MUC1, Tag-72를 특징으로 하고 있다. 다양한 암종은 마커 MUC1, TAG-72, 및 CEA를 특징으로 하고 있다. 만성 림프구성 백혈병은 마커 CD3, CD19, CD20, CD21, CD25, 및 HLA-DR을 특징으로 하고 있다. 털이 많은 세포 백혈병은 마커 CD19, CD20, CD21, CD25를 특징으로 하고 있다. 호지킨 질환은 Leu-M1 마커를 특징으로 하고 있다. 다양한 흑색종은 HMB 45 마커를 특징으로 하고 있다. 비-호지킨 림프종은 CD20, CD19, 및 Ia 마커를 특징으로 하고 있다. 그리고 다양한 전립선 암은 PSMA 및 SE10 마커를 특징으로 하고 있다.
또한, 많은 종류의 종양 세포는 어느 한쪽 세포 유형 및/또는 그것의 환경에 대하여 부적절한 흔치않은 항원을 표시하거나, 유기체의 발생 (예를 들면, 태아 항원) 동안 정상적으로 존재할 뿐이다. 그와 같은 항원의 예는, 뉴런의 세포의 외부 표면 막에서 상당한 수준으로 정상적으로 단지 발현되는 디시알로강글리오사이드인, 글리코스핑고지질 GD2를 포함하고, 여기에서 면역 시스템에 그것의 노출은 혈액-뇌 장벽에 의해 제한된다. GD2는 신경교세포종, 수모세포종, 별아교세포종, 흑색종, 소세포 폐 암, 골육종 및 다른 연조직 육종을 포함하는 광범위한 종양 세포의 표면에서 발현된다. GD2는 따라서 면역요법에 대하여 편리한 종양-특이적 표적이다.
다른 종류의 종양 세포는 건강한 세포의 표면에서 드물거나 부재인, 그리고 종양 세포의 조절되지 않은 성장 및 분할을 야기하는 세포 신호전달 경로 활성화를 책임지는 세포 표면 수용체를 표시한다. 예는, 유방 암 종양 세포의 표면에서 비정상적으로 높은 수준으로 생산되는 구성적으로 활성 세포 표면 수용체인, (ErbB2) HER2/neu를 포함한다.
다른 유용한 표적은 비제한적으로 CD20, CD52, CD33, 표피 성장 인자 수용체 및 기타 동종을 포함한다.
적합한 종양 마커의 설명적인, 그러나 비제한 목록은 표에서 제공된다1. 이들 및 다른 암 마커에 대한 항체는 당해 분야의 숙련가에 공지되고, 예를 들면 파아지-디스플레이 기술을 이용하여 쉽게 생산될 수 있거나 상업적으로 수득될 수 있다. 그와 같은 항체는, 예를 들면, iRGD 펩타이드가 실시예 3에서 콘주게이션되는 동일한 방식으로, 본 명세서에서 기재된 실리카솜에 쉽게 콘주게이션될 수 있다.
임임전술한 마커는 본 명세서에서 기재된 실리카솜 작제물을 포함하는 표적화 모이어티용 표적으로서 사용될 수 있다. 특정 구현예에서 상기 표적 마커는, 비제한적으로 하기의 구성원을 포함한다: 표피 성장 인자 계열 (예를 들면, HER2, HER3, EGF, HER4), CD1, CD2, CD3, CD5, CD7, CD13, CD14, CD15, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD33, CD34, CD38, 5E10, CEA, HLA-DR, HM 1.24, HMB 45, 1a, Leu-M1, MUC1, PMSA, TAG-72, 포스파티딜 세린 항원, 및 기타 동종.
전술한 마커는 설명적이고 비제한으로 의도된다. 다른 종양 관련된 항원은 당해 분야의 숙련가에 공지될 것이다.
종양 마커가 세포 표면 수용체인 경우, 그 수용체에 대한 리간드는 표적 모이어티로서 기능할 수 있다. 유사하게 그와 같은 리간드의 모방체는 또한 표적 모이어티로서 사용될 수 있다. 따라서, 특정 구현예에서 펩타이드 리간드는 다양한 항체에 더하여 또는 대신에 사용될 수 있다. 적합한 표적 펩타이드의 설명적인, 그러나 비제한적인 목록은 표2에서 보여진다. 특정 구현예에서 임의의 하나 이상의 이들 펩타이드는 본 명세서에서 기재된 실리카솜에 콘주게이션될 수 있다.
특정 구현예에서 실리카솜은 순환에서 안정성을 용이하게 하는 및/또는 세망내피 시스템 (REC)로부터 실리카솜을 감추는 및/또는 장벽 (예를 들면, 기질 장벽, 혈액 뇌 장벽, 등)을 거쳐, 및/또는 조직 속으로 수송을 용이하게 하는 모이어티에 콘주게이션될 수 있다. 특정 구현예에서 실리카솜은 혈액 뇌 장벽을 거쳐 수송을 용이하게 하기 위해 트랜스페린 또는 ApoE에 콘주게이션된다. 특정 구현예에서 실리카솜은 폴레이트에 콘주게이션된다.
표적 (또는 다른) 제제에 실리카솜의 커플링 방법은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려진다. 예는, 비제한적으로 하기의 용도를 포함한다: 바이오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘 (참조, 예를 들면, 미국특허 번호:US 4,885,172 A), 예를 들어, 하기를 이용하는 전통적 화학 반응에 의해: 이중작용성 커플링제 예컨대 글루타르알데하이드, 디이미드 에스테르, 방향족 및 지방족 디이소시아네이트, 디카복실산의 비스-p-니트로페닐 에스테르, 방향족 디설포닐 클로라이드 및 이중작용성 아릴할라이드 예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠; p,p'-디플루오로 m,m'-디니트로디페닐 설폰, 설프하이드릴-반응성 말레이미드, 및 기타 동종.그와 같은 커플링에 적용될 수 있는 적절한 반응은 하기에서 기재된다: Williams 등Methods in Immunology and Immunochemistry Vol.1, Academic Press, New York 1967.실시예 3에서 기재된 하나의 설명적인 그러나 비제한적인 접근법에서 펩타이드 (이 실시예에서 iRGD)는, DSPE-PEG2000의 DSPE-PEG2000-말레이미드 로의 치환 (참조 실시예 3에서 방법 부문), 시스테인-변형된 펩타이드에 티올-말레이미드 커플링 허용에 의해 실리카솜에 커플링된다. 특정 구현예에서 표적 (및 다른) 모이어티가 지질 2중층을 포함하는 지질에 콘주게이션될 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다.
전자 콘주게이트 및 커플링 방법은 설명적이고 비제한적이다. 본 명세서에서 제공된 교시를 이용하여, 수많은 다른 모이어티는 임의의 다양한 방법에 의해 본 명세서에서 기재된 실리카솜에 콘주게이션될 수 있다.
약제학적 제형, 투여 및 요법
약제학적 제형.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체는 투여의 경로 및 표준 약제학적 실시에 따라 선택된 생리적으로-허용가능한 담체 (예컨대 생리적 염수 또는 인산 완충액)과 혼합물로 또는 단독으로 투여된다. 예를 들어, 주사가능한 것으로서 사용될 때, 실리카솜은 약제학적으로 허용가능한 담체를 가진 멸균 현탁액, 분산액, 또는 유탁액으로서 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서 정상 식염수는 약제학적으로 허용가능한 담체로서 이용될 수 있다. 다른 적합한 담체는, 향상된 안정성을 위한 당단백질, 예컨대 알부민, 지질단백질, 글로불린, 등을 포함하여, 예를 들면, 물, 완충된 물, 0.4% 염수, 0.3% 글리신, 및 기타 동종을 포함한다. 염수 또는 다른 염-함유 담체를 포함하는 조성물에서, 담체는 바람직하게는 실리카솜 형성 이후 첨가된다. 따라서, 실리카솜이 형성되고 적합한 약물(들)과 장입된 후, 실리카솜은 약제학적으로 허용가능한 담체 예컨대 정상 식염수로 희석될 수 있다. 이들 조성물은 종래의, 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 수득한 수성 용액, 현탁액, 분산액, 유탁액, 등은 사용을 위하여 패키징될 수 있거나 무균성 조건하에서 여과될 수 있다. 특정 구현예에서 실리카솜은 동결건조되고, 동결건조된 제제는 투여에 앞서 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 또한 생리적 병태에 근사하기 위해 요구되는 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH-조정제 및 완충제, 긴장성 조정제 및 기타 동종, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 등을 함유할 수 있다.
추가적으로, 특정 구현예에서, 약제학적 제형은 저장시 지질-과산화성 손상 및 자유 라디칼에 대해 지질을 보호하는 지질-보호성 제제를 포함할 수 있다. 친유성 자유 라디칼 켄쳐, 예컨대 알파-토코페롤 및 수용성 철-특이적 킬레이터, 예컨대 페리옥사민은 적합하다.
약제학적 제형에서 실리카솜의 농도는 널리, 예를 들면, 대략 0.05% 미만, 일반적으로 적어도 대략 2 내지 5%부터 10 내지 50%, 또는 내지 40%, 또는 내지 30중량 %까지 다양할 수 있고, 선택된 특정한 투여 방식에 따라, 유체 용적, 점도, 등에 의해 주로 선택된다. 예를 들어, 농도는 치료와 관련된 유체 부담을 저하시키기 위해 증가될 수 있다. 이것은 죽상경화증-관련된 울혈성 심장기능상실 또는 중증 고혈압을 가진 환자에서 특히 바람직할 수 있다. 대안적으로, 성가신 지질로 구성된 실리카솜은 투여의 부위에서 염증을 줄이기 위해 저농도로 희석될 수 있다. 투여된 실리카솜의 양은 사용된 특정한 약물, 치료되는 질환 상태 및 임상의의 판단에 의존할 것이지만 일반적으로 대략 0.01 내지 대략 50 mg / 체중의 킬로그램, 바람직하게는 대략 0.1 내지 대략 5 mg / 체중의 kg일 것이다.
일부 구현예에서, 예를 들면, 실리카솜에서 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-변형된 인지질을 포함하는 것이 바람직하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 특정 구현예에서, PEG-세라미드, 또는 강글리오사이드 GMI-변형된 지질은 실리카솜에서 편입될 수 있다. 그와 같은 성분의 첨가는 실리카솜 응집 예방을 돕고 순환 수명 증가 및 상기 표적 조직에 장입된 실리카솜의 전달 증가를 제공한다. 특정 구현예에서 실리카솜에서 PEG-변형된 인지질, PEG-세라미드, 또는 GMI-변형된 지질의 농도는 대략 1 내지 15%일 것이다.
일부 구현예에서, 전반적인 실리카솜 충전은 혈액으로부터 실리카솜 청소능에서 중요한 결정인자이다. 하기인 것이 믿어진다: 충전된 실리카솜이 전형적으로 세망내피 시스템에 의해 더욱 빠르게 흡수될 것이고 (참조, 예를 들면, Juliano (1975), Biochem.Biophys.Res. CommuN. 63:651-658 RES에 의한 리포좀 청소능 논의) 그리고 따라서 혈류에서 더 짧은 반감기를 가짐. 장기적인 순환 반감기를 가진 실리카솜은 치료 용도에 전형적으로 바람직하다. 예를 들면, 특정 구현예에서, 8 시간, 또는 12 시간, 또는 24 시간, 또는 초과로부터 유지되는 실리카솜은 바람직하다.
이들의 용도의 또 다른 예에서, 약물-장입된 실리카솜은, 예를 들면, 국소 암의 치료를 위하여 비제한적으로 겔, 오일, 유탁액, 및 기타 동종을 포함하는 넓은 범위의 국소 투약량 형태로 편입될 수 있다. 예를 들면, 일부 구현예에서 약물-장입된 실리카솜을 함유하는 현탁액은 제형화되고 국소 크림, 페이스트, 연고, 겔, 로션, 및 기타 동종으로서 투여된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 추가적으로 완충제를 편입시킨다. 완충제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 완충제일 수 있다. 완충액 시스템은, 비제한적으로 시트레이트 완충액, 아세테이트 완충액, 보레이트 완충액, 및 인산 완충액을 포함한다. 완충액의 예는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 시트르산, 시트르산나트륨, 아세트산나트륨, 아세트산, 인산나트륨 및 인산, 나트륨 아스코르베이트, 타르타르산, 말레산, 글리신, 락트산나트륨, 락트산, 아스코르브산, 이미다졸, 중탄산나트륨 및 카본산, 석신산나트륨 및 석신산, 히스티딘, 및 벤조산나트륨, 벤조산, 및 기타 동종.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 추가적으로 킬레이트제를 편입시킨다. 킬레이트제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 킬레이트제일 수 있다. 킬레이트제는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 에틸렌 디아민테트라아세트산 (또한 EDTA, 에데트산, 베르센 산, 및 세퀘스트렌과 동의어), 및 EDTA 유도체, 예컨대 디칼륨 에데테이트, 디나트륨 에데테이트, 에데테이트 칼슘 디나트륨, 나트륨 에데테이트, 트리나트륨 에데테이트, 및 칼륨 에데테이트. 다른 킬레이트제는 시트르산 (예를 들면, 시트르산 일수화물) 및 이의 유도체를 포함한다. 시트르산의 유도체는 무수 시트르산, 트리나트륨시트레이트-이수화물, 및 기타 동종을 포함한다. 또 다른 킬레이트제는, 비제한적으로, 니아신아미드 및 이의 유도체 및 나트륨 데옥시콜레이트 및 이의 유도체를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 산화방지제를 함유하는 생체활성제를 추가적으로 편입시킨다. 산화방지제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 산화방지제일 수 있다. 산화방지제는 당해 분야의 숙련가에 잘 알려지고, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 물질 예컨대 아스코르브산, 아스코르브산 유도체 (예를 들면, 아스코르빌팔미테이트, 아스코르빌스테아레이트, 나트륨 아스코르베이트, 칼슘 아스코르베이트, 등), 부틸화된 하이드록시 아니솔, 부틸화된 하이드록시 톨루엔, 알킬갈레이트, 나트륨 메타-바이설페이트, 중황산나트륨, 나트륨 디티오나이트, 나트륨 티오글리콜 산, 나트륨 포름알데하이드 설폭실레이트, 토코페롤 및 이의 유도체, (d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤 아세테이트, dl-알파 토코페롤 아세테이트, d-알파 토코페롤 석시네이트, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤, 감마 토코페롤, 및 d-알파 토코페롤 폴리옥시에틸렌 글리콜 1000 석시네이트) 모노티오글리세롤, 아황산나트륨 및 N-아세틸 시스테인. 특정 구현예에서 그와 같은 물질은, 존재할 때, 0.01 내지 2.0% 범위에서 전형적으로 첨가된다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 동결보호제와 제형화된다. 동결보호 제제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 동결보호 제제일 수 있다. 통상 동결보호 제제는, 비제한적으로, 히스티딘, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리딘, 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 폴리올, 및 기타 동종을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 등장제와 제형화된다. 등장제는 임의의 약제학적으로 허용가능한 등장제일 수 있다. 상기 용어는 이소-삼투제와 상호교환적으로 당해 분야에서 사용되고, 삼투압을 증가시키기 위해 약제학적 제제에, 예를 들면, 일부 구현예에서 인간 세포외액, 예컨대 혈장과 이소-삼투성인, 0.9% 염화나트륨 용액의 것에 첨가되는 화합물로서 공지된다. 설명적 등장성 제제는, 비제한적으로, 염화나트륨, 만니톨, 소르비톨, 락토오스, 덱스트로오스 및 글리세롤을 포함한다.
특정 구현예에서 실리카솜의 약제학적 제형은 보존제를 임의로 포함할 수 있다. 통상 보존제는, 비제한적으로, 클로로부탄올, 파라벤, 티메르솔, 벤질 알코올, 및 페놀로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 포함한다. 적합한 보존제는 하기를 비제한적으로 포함한다: 클로로부탄올 (예를 들면, 0.3-0.9% w/v), 파라벤 (예를 들면, 0.01-5.0%), 티메로살 (예를 들면, 0.004-0.2%), 벤질 알코올 (예를 들면, 0.5-5%), 페놀 (예를 들면, 0.1-1.0%), 및 기타 동종.
일부 구현예에서, 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은, 예를 들면, 경구 적용에서 쾌적한 입맛을 제공하기 위해 휴멕턴트와 제형화된다. 당해 분야에서 공지된 휴멕턴트는, 비제한적으로, 콜레스테롤, 지방산, 글리세린, 라우르산, 스테아르산마그네슘, 펜타에리트리톨, 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
일부 구현예에서, 유화제는, 예를 들어, 모든 부형제, 특히 소수성 성분 예컨대 벤질 알코올의 완전한 용해를 확보하기 위해, 제형에서 포함된다. 많은 유화제, 예를 들면, 폴리소르베이트 60은 당해 기술에 공지되어 있다.
경구 투여에 관련된 일부 구현예에 대하여, 약제학적으로 허용가능한 풍미제 및/또는 감미제를 첨가하는 것이 바람직할 수 있다. 화합물 예컨대 사카린, 글리세린, 단순 시럽, 및 소르비톨은 감미제로서 유용하다.
투여 및 요법
화물 (예를 들면, 약물) 장입된 실리카솜은 임의의 다양한 기술에 의해 대상체 (예를 들면, 환자)에 투여될 수 있다.
특정 구현예에서 약제학적 제형은 비경구로, 예를 들면, 관절내로, 정맥내로, 복강내로, 피하로, 또는 근육내로 투여된다. 일부 구현예에서, 약제학적 조성물은 볼러스 주사에 의해 정맥내로, 동맥내로(intraarteraly), 또는 복강내로 투여된다 (참조, 예를 들면, 미국특허번호3,993,754; 4,145,410; 4,235,871; 4,224,179; 4,522,803; 및 4,588,578 (리포좀의 투여를 기재함)). 이러한 투여에 적합한 특정한 약제학적 제형은 하기에서 발견된다: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed.(1985). 전형적으로, 제형은 허용가능한 담체, 바람직하게는 수성 담체에 현탁된 실리카솜의 용액을 포함한다. 전술한 바와 같이, 적합한 수용액은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 생리적으로 양립가능한 완충액 예컨대 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리적 (예를 들면, 0.9% 등장의) 염수 완충액 및/또는 특정 유탁액 제형에서. 용액(들)은 제형제 예컨대 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 특정 구현예에서 활성제(들)은, 사용 전, 적합한 비히클, 예를 들면, 멸균 무발열원 물로 구성을 위하여 분말 형태로 제공될 수 있다. 경점막 투여를 위하여, 및/또는 혈액/뇌 장벽 통로를 위하여, 침투되는 장벽에 적절한 침투제는 제형에서 사용될 수 있다. 이들 조성물은 종래의, 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나, 멸균 여과될 수 있다. 수득한 수용액은 그대로 사용하기 위해 패키징될 수 있거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여에 앞서 멸균 수용액과 조합된다. 조성물은 생리적 병태를 근사하기 위해 요구되는 바와 같이 약제학적으로 허용가능한 보조 물질, 예컨대 pH 조정제 및 완충제, 긴장성 조정제, 습윤제 및 기타 동종, 예를 들어, 아세트산나트륨, 락트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트, 등을, 예를 들면, 상기에 기재된 바와 같이 함유할 수 있다.
다른 방법에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜(silicsasomes)을 함유하는 약제학적 제형은 조직에 제제의 직접 적용에 의해 상기 표적 조직과 접촉될 수 있다. 적용은 국소, "개방" 또는 "폐쇄" 절차에 의해 실시될 수 있다. "국소"는 환경, 예컨대 피부, 구인두, 외이도, 및 기타 동종에 노출된 조직에 약제학적 제제의 직접 적용을 의미한다. 개방 절차는 약제학적 제형이 적용되는 기저의 조직을 직접적으로 시각화 및 환자의 피부 절개를 포함하는 그러한 절차이다. 이것은 수술 절차, 예컨대 폐에 접근하기 위한 개흉술, 복부 내장에 접근하기 위한 복부 개복술, 또는 상기 표적 조직에 다른 직접적인 외과적 접근법에 의해 일반적으로 달성된다. 폐쇄 절차는 내부 표적 조직이 직접적으로 시각화되지 않지만, 피부에서 작은 상처를 통해 기기 삽입을 통하여 접근되는 침습 절차이다. 예를 들어, 제제는 바늘 세척에 의해 복막에 투여될 수 있다. 마찬가지로, 약제학적 제제는 요추 천자 동안 주입 이어서 척수의 메트리자미드 이미지형성 또는 척추 마취용으로 통상적으로 실시된 바와 같이 환자의 적절한 위치결정에 의해 수막 또는 척수에 투여될 수 있다. 대안적으로, 제제는 내시경 디바이스를 통해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서 약제학적 제형은 캐뉼라를 통해 도입된다.
특정 구현예에서 본 명세서에서 기재된 실리카솜을 포함하는 약제학적 제형은 흡입을 통해 (예를 들면, 에어로졸로서) 투여된다. 흡입은 폐에 및/또는 뇌에 투여용 특히 효과적인 전달 경로(rout)일 수 있다. 흡입에 의한 투여를 위하여, 실리카솜은, 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 가스의 사용으로, 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무의 형태로 편리하게 전달된다. 가압된 에어로졸의 경우에서 투약량 단위는 계량된 양을 전달하기 위한 밸브 제공에 의해 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용을 위하여 예를 들면 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적합한 분말 기제 예컨대 락토오스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하여 제형화될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에서 기재된 실리카솜 은 경구 투여를 위하여 제형화된다. 경구 투여를 위하여, 적합한 제형은 당해 분야에서 잘 알려진 경구 전달에 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체와 실리카솜(들) 조합에 의해 쉽게 제형화될 수 있다. 그와 같은 담체는 치료받는 환자에 의한 경구 섭취를 위하여 본 명세서에서 기재된 활성제(들)이 정제, 알약, 당의정, 타원형 당의정, 로젠지, 젤라틴캡슐, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 및 기타 동종으로서 제형화되게 할 수 있다. 경구 고형 제형 예컨대, 예를 들어, 분말, 캡슐 및 정제로, 적합한 부형제는 하기를 포함할 수 있다: 충전제 예컨대 당류 (예를 들면, 락토오스, 수크로오스, 만니톨 및 소르비톨), 셀룰로오스 제제 (예를 들면, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰검, 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스), 합성 폴리머 (예를 들면, 폴리비닐피롤리돈 (PVP)), 과립화제; 및 결합제.요망하는 경우, 붕해제, 예컨대 가교결합된 폴리비닐피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염 예컨대 알긴산나트륨은 첨가될 수 있다. 요망하는 경우, 고형 투약 형태는 표준 기술을 이용하여 당-코팅 또는 장용성-코팅될 수 있다. 장용성-코팅된 입자의 제제는 예를 들어 하기에서 개시된다: 미국특허번호4,786,505 및 4,853,230.
다양한 구현예에서 실리카솜(들)은, 예를 들면, 종래의 좌약 기제 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드를 함유하는 직장 또는 질 조성물 예컨대 좌약 또는 유지 관장제로 제형화될 수 있다. 직장 또는 질 전달용 활성제의 제형화 방법은 당해 분야의 숙련가에 잘 알려지고 (참조, 예를 들면, Allen (2007) Suppositories, Pharmaceutical Press) 그리고 전형적으로 적합한 기제 (예를 들면, 친수성 (PEG), 친유성 물질 예컨대 코코아 버터 또는 Witepsol W45), 양친매성 물질 예컨대 Suppocire AP 및 폴리글리콜화된 글리세라이드, 및 기타 동종)과 활성제의 조합을 포함한다. 상기 기제는 원하는 용융하는/전달 프로파일을 위하여 선택되고 화합된다.
실리카솜의 전달 경로는 바디에서 그들의 분포에 또한 영향을 줄 수 있다. 실리카솜의 수동 전달은, 비록 다른 효과적인 투여 형태, 예컨대 관절내 주사, 흡입제 미스트, 경구 활성 제형, 경피 이온침투요법, 또는 좌약이 또한 예상되어도, 다양한 경로 예를 들면, 비경구로의 투여의 사용을 포함한다. 각각의 경로는 실리카솜의 국재화에서 차이를 낳는다.
약제학적 제제용 투약량 레지멘이 개업의에 잘 알려지기 때문에, 효과적인 리포좀 약제학적 제제 제형의 양 또는 포유동물에서 및 특히 인간에서 질환 또는 병태의 처치용 치료는 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이다. 본 명세서에서 제형의 개별 투약량의 최적의 양 및 간격은 치료받는 병태의 성질 및 정도, 형태, 투여의 경로 및 부위, 그리고 치료받는 특정한 환자에 의해 결정될 것이고, 그와 같은 최적은 종래의 기술에 의해 결정될 수 있다. 최적의 치료 과정, 예를 들면, 한정된 일수 동안 날마다 주어진 용량의 수가 종래의 치료 과정 결정 시험을 이용하여 당해 분야의 숙련가에 의해 확인될 수 있다는 것이 또한 당해 분야의 숙련가에 의해 인정될 것이다.
특정 구현예에서 실리카솜 및/또는 이의 약제학적 형성물은 다양한 암, 또는 다양한 감염, 및 하기를 필요로 하는 병태를 포함하는 기타 동종의 치료에서 (사람을 포함하는) 동물에서 치료적으로 사용될 수 있다: (1) 반복된 투여, (2) 그것의 생체활성 형태로 약물의 지속된 전달, 또는 (3) 문제의 자유 약물과 비교된 적합한 효능을 가진 감소된 독성. 다양한 구현예에서 실리카솜 및/또는 이의 약제학적 형성물은 치료적으로 효과적 용량으로 투여된다. 본 명세서에서 기재된 실리카솜 및 이의 제형에 관련함에 따라 용어 "치료적으로 효과적"은 생물학적 활성 서브스턴스 (치료제)가 의도되는 특정한 의료 효과를 달성하기에 충분한 방식으로 제공된/방출된 실리카솜에서 및/또는 또는 생물학적 활성 서브스턴스가 존재하는 것을 의미한다. 획득될 수 있는 바람직한 의료 효과의 제한 없이, 예는 화학요법, 항생제 요법, 및 대사의 조절이다. 따라서, 예를 들어, 암 화학요법을 위하여 치료적으로 효과적 용량은 암 세포의 성장 및/또는 증식을 저속화하는데, 및/또는 고체 종양의 성장을 저속화, 중단 또는 고체 종양을 수축 또는 제거하는데, 및/또는 전이성 세포, 및 기타 동종의 증식을 저속화, 중단하는데 효과적인 용량 (및/또는 투약량 레지멘)일 수 있다. 감염 치료를 위하여 치료적으로 효과적 용량은 병원체의 성장 및/또는 증식을 억제시키는데, 및/또는 병원체를 사멸시키는데, 및/또는 병원체에 의해 생산된 하나 이상의 증상을 완화시키는데 충분한 용량 (및/또는 투약량 레지멘)일 수 있다.
정확한 투약량은 특정한 치료제 및 바람직한 의료 효과, 뿐만 아니라 환자 인자 예컨대 연령, 성별, 일반적인 병태, 및 기타 동종과 같은 인자에 의존하여 다양할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 쉽게 이들 인자를 고려할 수 있고 과도한 실험과정에 의지 없이 효과적인 치료 농도를 확립하는데 이들을 이용할 수 있다.
질환의 치유적, 경감적, 지연적, 또는 예방적 치료에서 인간에 (또는 비-인간 포유동물에) 투여를 위하여 처방의는 주어진 인간 (또는 비-인간) 대상체에 대하여 약물의 적절한 투약량을 궁극적으로 결정할 것이고, 이것은 개체의 연령, 체중, 및 반응 뿐만 아니라 환자의 질환의 성질 및 중증도에 따라 다양하도록 기대될 수 있다. 특정 구현예에서 실리카솜(들)에 의해 제공된 약물의 투약량은 자유 약물에 대하여 이용된 것과 대략 같을 수 있다. 그러나 전술한 바와 같이, 본 명세서에서 기재된 실리카솜은 이로써 투여된 약물(들)의 독성을 상당히 감소시킬 수 있고 치료 윈도우를 상당히 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 경우에 자유 약물에 대하여 처방된 것의 과량으로 투약량은 이용될 것이다.
특정 구현예에서, 특정한 시점에서 투여된 캡슐화된 약물의 용량은 약 1 내지 약 1,000 mg/m2/일, 또는 내지 약 800 mg/m2/일, 또는 내지 약 600 mg/m2/일, 또는 내지 약 400 mg/m2/일의 범위일 것이다. 예를 들어, 특정 구현예에서 하기 범위를 제공하는 투약량 (투약 레지멘(regiment))은 이용된다: 약 1 내지 약 350 mg/m2/일, 1 내지 약 300 mg/m2/일, 1 내지 약 250 mg/m2/일, 1 내지 약 200 mg/m2/일, 1 내지 약 150 mg/m2/일, 1 내지 약 100 mg/m2/일, 약 5 내지 약 80 mg/m2/일, 약 5 내지 약 70 mg/m2/일, 약 5 내지 약 60 mg/m2/일, 약 5 내지 약 50 mg/m2/일, 약 5 내지 약 40 mg/m2/일, 약 5 내지 약 20 mg/m2/일, 약 10 내지 약 80 mg/m2/일, 약 10 내지 약 70 mg/m2/일, 약 10 내지 약 60 mg/m2/일, 약 10 내지 약 50 mg/m2/일, 약 10 내지 약 40 mg/m2/일, 약 10 내지 약 20 mg/m2/일, 약 20 내지 약 40 mg/m2/일, 약 20 내지 약 50 mg/m2/일, 약 20 내지 약 90 mg/m2/일, 약 30 내지 약 80 mg/m2/일, 약 40 내지 약 90 mg/m2/일, 약 40 내지 약 100 mg/m2/일, 약 80 내지 약 150 mg/m2/일, 약 80 내지 약 140 mg/m2/일, 약 80 내지 약 135 mg/m2/일, 약 80 내지 약 130 mg/m2/일, 약 80 내지 약 120 mg/m2/일, 약 85 내지 약 140 mg/m2/일, 약 85 내지 약 135 mg/m2/일, 약 85 내지 약 135 mg/m2/일, 약 85 내지 약 130 mg/m2/일, 또는 약 85 내지 약 120 mg/m2/일. 특정 구현예에서 특정한 시점에서 투여된 용량(does)은 또한 하기일 수 있다: 약 130 mg/m2/일, 약 120 mg/m2/일, 약 100 mg/m2/일, 약 90 mg/m2/일, 약 85 mg/m2/일, 약 80 mg/m2/일, 약 70 mg/m2/일, 약 60 mg/m2/일, 약 50 mg/m2/일, 약 40 mg/m2/일, 약 30 mg/m2/일, 약 20 mg/m2/일, 약 15 mg/m2/일, 또는 약 10 mg/m2/일.
투약량은 또한, 당해 분야에서 그 기술에 의해 인정되는 바와 같이, 생체내 동물 모델을 이용하여 추정될 수 있다. 이와 관련하여, 본 명세서에서 기재된 이리노테칸-장입된 실리카솜에 대해서, KPC-유래된 동소이식 동물 모델에서 Ir-실리카솜의 효과적인 치료 용량이, 70 Kg 인간 대상체에서 120 mg/m2와 등가인, 약 40 mg/kg인 것이 주목된다 (Liu, 등 (2016) ACS Nano, 10:2702-2715). 피보나치 분석은 이러한 용량이 40 및 80 mg/m2의 시작 및 중간 용량에 의해 달성될 수 있다는 것을 나타낸다.
투여된 용량은, 다른 인자 중에서, 조성물의 생체이용률, 유해한 부작용에 대한 개체의 내성, 투여의 방식 및 상기 논의된 다양한 인자에 의존하여, 본 명세서에서 기재된 용량 범위보다 더 높거나 더 낮을 수 있다. 투약량 및 간격은, 처방의의 판단에 따라, 치료 효과를 유지하는데 충분한 조성물의 혈장 수준을 제공하기 위해 개별적으로 조정될 수 있다. 숙련가는 본 명세서에서 제공된 교시의 관점에서 과도한 실험과정 없이 효과적인 국부 투약량을 최적화할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 조성물의 다중 용량 (예를 들면, 연속 또는 볼러스)는 또한 시간, 일, 주, 또는 개월의 과정에서 필요로 하는 개체에 투여될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 회 매일, 매 2일, 매 10 일, 매주, 매월, 매주 2회, 3회 1 주, 매달 2회, 3회 1 개월, 4회 1 개월, 5회 1 개월, 매 2번째 달, 매 3번째 달, 매 4번째 달, 등
치료 방법.
다양한 구현예에서 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체를 포함하는 나노입자 약물 담체(들) 및/또는 약제학적 제형(들)을 이용하는 치료 방법은 제공된다. 특정 구현예에서 방법(들)은 암의 치료 방법을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 나노입자 약물 담체를 포함하는 약제학적 제형, 및/또는 나노입자 약물 담체의 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있고, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형에서 상기 약물은 항암 약물을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형은 화학요법적 레지멘에서 1차 요법이다. 특정 구현예에서 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형은 다중-약물 화학요법적 레지멘에서 성분이다. 특정 구현예에서 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘은 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2 약물을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘은 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 3 약물을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘은 적어도 이리노테칸 (IRIN), 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)를 포함한다.
다양한 구현예에서 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체를 포함하는 상기 나노입자 약물 담체(들) 및/또는 약제학적 제형(들)은 임의의 다양한 암 치료에 효과적이다. 특정 구현예에서 상기 암은 췌장 관상 선암종 (PDAC)이다. 특정 구현예에서 상기 암은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 암이다: 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 부신피질 암종, AIDS-관련된 암 (예를 들면, 카포시 육종, 림프종), 항문 암, 부록 암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 담관 암, 간외 암, 방광 암, 뼈 암 (예를 들면, 유잉 육종, 골육종, 악성 섬유질 조직구종), 뇌간 신경아교종, 뇌 종양 (예를 들면, 별아교세포종, 교모세포종, 뇌 및 척수 종양, 뇌간 신경아교종, 중추 신경계 비정형 기형/횡문근양 종양, 중추 신경계 배아 종양, 중추 신경계 세균 세포 종양, 두개인두종, 뇌실막세포종, 유방 암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양 (예를 들면, 소아기, 위장), 심장 종양, 자궁경부 암, 척색종, 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장 암, 결장직장 암, 두개인두종, 피부 t-세포 림프종, 관 암 예를 들면(담즙, 간외), 관상피내 암종 (DCIS), 배아 종양, 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도 암, 비강신경교세포종, 두개외 세균 세포 종양, 고환외 세균 세포 종양, 간외 담관 암, 눈 암 (예를 들면, 안구내 흑색종, 망막모세포종), 골, 악성, 및 골육종의 섬유질 조직구종, 담낭 암, 위 (위) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 세균 세포 종양 (예를 들면, 난소 암, 고환 암, 두개외 암, 고환외 암, 중추 신경계), 임신성 융모성 종양, 뇌간 암, 털이 많은 세포 백혈병, 두경부 암, 심장 암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 랑게르한스 세포 암, 호지킨 림프종, 하인두 암, 안구내 흑색종, 소도 세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장 암 (예를 들면, 신장 세포, 윌름스 종양, 및 다른 신장 종양), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두 암, 백혈병, 급성 림프아구성 (ALL), 급성 골수 (AML), 만성 림프구성 (CLL), 만성 골수성 (CML), 털이 많은 세포, 구순 및 구강 암, 간 암 (1차), 상피내 소엽 암종 (LCIS), 폐 암 (예를 들면, 소아기, 비소 세포, 소 세포), 림프종 (예를 들면, AIDS-관련된, 버킷 (예를 들면, 비-호지킨 림프종), 피부 T-세포 (예를 들면, 균상식육종, 세자리 증후군), 호지킨, 비-호지킨, 1차 중추 신경계 (CNS)), 거대글로불린혈증, 발덴스트룀, 남성 유방 암, 골 및 골육종의 악성 섬유질 조직구종, 흑색종 (예를 들면, 소아기, 안구내 (눈)), 메르켈 세포 암종, 중피종, 전이성 편평상피 목 암, 정중선 관 암종, 입 암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종/혈장 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 만성 골수 백혈병 (CML), 다발성 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경교세포종, 구강 암, 구순 및 구강인두 암, 골육종, 난소 암, 췌장 암, 췌장 신경내분비 종양 (소도 세포 종양), 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부갑상선 암, 음경 암, 인두 암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 혈장 세포 신생물, 흉막폐 모세포종, 1차 중추 신경계 (CNS) 림프종, 전립선 암, 직장 암, 신장 세포 (신장) 암, 신우 및 요관, 과도기적 세포 암, 횡문근육종, 타액샘 암, 육종 (예를 들면, 유잉, 카포시, 골육종, 횡문근육종, 연조직, 자궁), 세자리 증후군, 피부 암 (예를 들면, 흑색종, 메르켈 세포 암종, 기저 세포 암종, 비흑색종), 소장 암, 편평상피 세포 암종, 원발 불명의 편평상피 목 암, 위 (위) 암, 고환 암, 목 암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암, 융모성 종양, 요관 및 신우 암, 요도 암, 자궁 암, 자궁내막 암, 자궁 육종, 질 암, 외음부 암, 발덴스트룀 거대글로불린혈증, 및 윌름스 종양.
특정 구현예에서 상기 나노입자 약물 담체는 iRGD 펩타이드에 콘주게이션되지 않고 상기 나노입자 약물 담체는 iRGD 펩타이드와 함께 투여된다 (예를 들면, 상기 나노입자 약물 담체 및 상기 iRGD 펩타이드는 별개의 제형으로서 공-투여된다).
특정 구현예에서 상기 방법(들)은 감염의 치료 방법을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 방법은 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체를 포함하는 약제학적 제형, 및/또는 나노입자 약물 담체의 유효량을 필요로 하는 대상체에 투여하는 것을 포함할 수 있고, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 상기 약제학적 제형에서 상기 약물은 항-미생물 또는 항-바이러스제를 포함한다. 특정 구현예에서 상기 감염은 병원 감염을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 감염은 바이러스성, 박테리아, 또는 진균 병원체에 의해 야기된다. 특정 구현예에서 상기 감염은 혈류 감염 (BSI), 폐렴 (예를 들면, 환기장치-관련된 폐렴 (VAP)), 위장 감염, 요로 감염 (UTI), 수술 부위 감염 (SSI), 또는 피부 감염을 포함한다. 특정 구현예에서 상기 감염은 하기에 의해 야기된다: 병원체 예컨대 스타필로코쿠스 아우레스 (예를 들면, 혈액 감염), 에스케리치아 콜라이 (예를 들면, UTI), 엔테로코카이 (예를 들면, 혈액, UTI, 상처), 슈도모나스 에어루기노사 (예를 들면, 신장 또는 호흡 감염), 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (예를 들면, 폐), 및 기타 동종. 특정 구현예에서 상기 감염은 하기이다: 바이러스성 감염 (예를 들면, HIV, B형 간염, C형 간염, 등).
특정 구현예에서 상기 감염은 약물-저항성 병원체에 의해 야기된다. 설명적 약물-저항성 병원체는, 비제한적으로 하기를 포함한다: 메티실린-저항성 스타필로코쿠스 아우레스 (MRSA), 반코마이신-저항성 엔테로코쿠스 (VRE) 및 다중-약물-저항성 마이코박테리움 투베르쿨로시스 (MDR-TB), 및 클렙시엘라 뉴모니아에 카바페네마제-생산 박테리아 (KPC).
이들 치료 방법의 다양한 구현예에서, 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 경로를 통해 투여된다: 정맥내 투여, 동맥내 투여, 뇌내 투여, 척추강내 투여, 경구 투여, 에어로졸 투여, 흡입을 통한 투여 (비강내 및 기관내 전달 포함, 캐뉼라를 통한 두개내 투여, 및 피하 또는 근육내 데포 침착. 특정 구현예에서 상기 나노입자 약물 담체 및/또는 약제학적 제형은 주사로서, IV 드립 백으로부터, 또는 약물-전달 캐뉼라를 통해 투여된다. 다양한 구현예에서 상기 대상체는 인간이고 다른 구현예에서 상기 대상체는 비-인간 포유동물이다.
키트.
특정 구현예에서, 키트는 병리학 (예를 들면, 암, 미생물 감염, 바이러스성 감염, 등)의 치료를 위하여 본 명세서에서 기재된 지질 2중층 코팅된 나노입자 약물 담체를 함유하고 있다. 상기 키트는 전형적으로 본 명세서에서 기재된 바와 같이 약물-장입된 실리카솜 및/또는 본 명세서에서 기재된 약물-장입된 실리카솜을 포함하는 면역접합체를 포함한다. 특정 구현예에서 상기 실리카솜은 이리노테칸을 함유한다. 특정 구현예에서 상기 실리카솜은 iRGD 펩타이드를 거기에 부착시켰고 한편 다른 구현예에서 상기 키트는 약물 (예를 들면, 이리노테칸) 장입된 실리카솜 또는 실리카솜 면역접합체와 공-투여를 위하여 제형화된 별개의 iRGD 펩타이드를 함유한다.
추가적으로, 특정 구현예에서, 상기 키트는 (예를 들면 췌장 암, 위 암, 자궁경부 암, 난소 암, 등용 치료제로서) 약물-장입된 실리카솜 또는 실리카솜 면역접합체의 사용 수단을 개시하는 지침용 자료를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 임의로, 예를 들면, 다양한 암의 치료를 위하여 단독 또는 조합으로, 본 명세서에서 기재된 나노입자 약물 담체의 사용을 위한 사용법 (예를 들면, 프로토콜)을 제공하는 라벨링 및/또는 지침용 자료를 포함한다. 지침용 자료는 또한 권고된 투약량, 금기의 설명(들), 및 기타 동종을 포함할 수 있다.
다양한 키트에서 지침용 자료가 전형적으로 문서화된 또는 인쇄된 자료를 포함하는 한편 이들은 그와 같은 것에 제한되지 않는다. 그와 같은 지침을 저장할 수 있고 최종 사용자에 이들을 전할 수 있는 임의의 매체는 본 발명에 의해 고려된다. 그와 같은 매체는 비제한적으로 하기를 포함한다: 전자 저장 매체 (예를 들면, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩), 광학 매체 (예를 들면, CD ROM), 및 기타 동종. 그와 같은 매체는 그와 같은 지침용 자료를 제공하는 인터넷 사이트에 주소를 포함할 수 있다.
실시예
다음과 같은 실시예는 비제한적으로 청구된 발명을 설명하기 위해 제공된다.
실시예 1
지질-코팅된 메조다공성 실리카 나노입자에 의한 이리노테칸 전달은 췌장 암용 리포좀에 대하여 개선된 효능 및 안전성을 보여준다
리포좀 담체가 큰 독성 약물 예컨대 이리노테칸의 안전성을 개선하는데 실패할 수 있다는 염려 때문에, 우리는 이것이 (리포좀보다) 더욱 안정적인 담체를 초래할지를 보기 위해 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNPs)에 적용되는 지지된 지질 2중층 (LB) 이용에 관심을 두었다. 약물 패키징, 조절가능 기공 크기, 담체 안정성, 및 제어된 약물 방출 능력에 사용될 수 있는 큰 내부 표면적 때문에, MSNPs는 암 요법을 위하여 다용도 및 다작용성 나노캐리어 플랫폼을 구성하는 것으로 실증되고 있다 (Lu 등 (2007) Small, 3:1341-1346; Slowing 등 (2008) Adv. Drug Deliv.Rev. 60:1278-1288; Meng 등 (2010) J. Am.Chem. Soc. 132(36): 12690-12697; Lee 등 (2010) Angew. Chem. 122:8390-8395; Meng 등 (2011) ACS Nano, 5(5): 4131-4144; He and Shi (2011) J. Mater. Chem21: 5845-5855; Gao 등 (2011) ACS Nano, 5:9788-9798; Li 등 (2012) Chem. Soc. Rev. 41:2590-2605; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(2): 994-1005; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Argyo 등 (2014) Chem. Mater. 26: 435-451; Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 또한, MSNPs는 생분해성이고 광범위한 동물 시험에서 안전한 것으로 증명된다 (Meng 등 (2011) ACS Nano, 5(5): 4131-4144; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(2): 994-1005; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557; Lu 등 (2010) Small, 6(16): 1794-18050. 침지에 의해 MSNPs 속으로 이리노테칸 또는 캄프토테신을 도입하는 것이 가능한 반면, 상기 방법은 상대적으로 비효율적이고 (장입 용량 <10 wt %) (Lu 등 (2007) Small, 3:1341-1346; He 등 (2010) Biomaterials 31:3335-3346) 그리고 좋지 못한 약물 유지를 초래할 수 있다 (Meng 등 (2010) J. Am.Chem. Soc. 132(36): 12690-12697). 그러나, 우리는 지지된 LB에 의해 급속 GEM 캡슐화를 위하여 사용될 수 있는 생물막 기술을 개발하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 수많은 LB 코팅 절차가 공개되고 있는 반면, 하기를 포함하여: 리포좀 상호작용 및 입자 표면과 융합 (Liu, 등 (2009) J. Am.Chem. Soc., 131(22): 7567-7569; Liu, 등 (2009) J. Am.Chem. Soc., 131(4): 1354-1355) 또는 EtOH-분산된 지질 용액을 이용하는 용매 교환 (Cauda 등 (2010) Nano Lett.10:2484-2492), 생물막 기술의 이용은 더욱 재생가능한 및 완전한 코팅, 급속 캡슐화, 및 개선된 담체 안정성을 제공한다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 이것은 LB-MSNPs가 최대 40 wt % GEM의 장입 용량을 달성하게 하고 뿐만 아니라, LB (Id.)에서 편입될 수 있는, 파클리탁셀 (PTX)의 공-전달을 가능하게 하였다. 이것은 우리가 마우스 (Id.)내 동소이식 인간 PDAC 모델에서 PDAC 치료를 위하여 상승작용 및 비율계량-설계된 담체를 개발하도록 하였다. 최근에, Zhang 등은 이리노테칸의 전달을 위하여 폴리머-지질-지지된 MSNP를 보고하였지만, 약물 장입은 더 낮았다 (즉, ∼16 wt %) (Zhang 등 (2014) Biomaterials, 35:3650-3665).
이 실시예에서, 우리는, 특히, LB가 양성자화 제제를 캡슐화하는데 사용되는 LB- MSNP 플랫폼에대하여 신규한 설계 피쳐를 도입하고; 이것은 약물의 약염기 특성 (pKa = 8.1)을 이용하는 높은 이리노테칸 약물 부하의 원격 장입을 허용한다. 또한, 지지된 LB의 증가된 능력은 또한 우리가 리포좀 등가물에 비교 분석을 수행하도록 하였고, 여기에서 비지지된 LB 소포는 하기에 의한 이리노테칸의 원격 장입에 사용되었다: 포획제, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS) (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277; Von Hoff 등 (2013) Br. J. Cancer, 109(4): 920-925). MSNP 담체가 강력한 동소이식 PDAC 모델에서 리포좀 제형보다 더 높은 장입 용량 및 종양 사멸을 달성하였고 뿐만 아니라, 개선된 담체 안정성 및 감소된 누출 때문에 이리노테칸 독성을 예방하였다. 이것은 LB-코팅된 담체에 의한 큰 독성 화학치료제의 독성 감소에 획기적인 접근법을 제공하고, 이는 GEM 치료 실패에 대하여 유보된 것보다 PDAC에 대하여 가장 중요한 치료 선택으로서 이리노테칸을 사용한다 (리포좀 담체의 사용에 대하여 현행 FDA-개선된 징후)
결과
코팅된 LB 및 양성자 구배의 이용을 통한 MSNP에서 높은 이리노테칸 장입.
우리의 첫번째 시도는 급속 및 균일한 기공 밀봉을 제공하는 LB 코팅물에 의해 이리노테칸을 캡슐화하는 MSNP 담체를 생산하는 것이었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 이것은 (MSNP 중량에 비해) 22 wt % 이리노테칸의 수동적 포획을 허용하였다. 장입 용량을 더욱 개선하기 위해, 우리는, 기공에서 유지되는 친수성 유도체 속으로, LB를 거쳐 확산할 수 있는, 양친매성 이리노테칸을 전환시키는 양성자화 제제의 포획 여부를 또한 결정하였다 (도 1A, 패널 A1). 우리 및 다른 사람들은 약염기성 약물, 예컨대 GEM 및 이리노테칸의 효과적인 도입 및 캡슐화를 위하여 리포좀에서 이러한 포획 절차를 사용하였다 (Chou 등 (2003) J. Biosci. Bioeng., 95(4): 405-408; Meng 등 (2013) ACS Nano, 7(11): 10048-10065; Haran 등 (1993) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1151:201-215). 이전에 MSNP 플랫폼에서 결코 사용되지 않은 반면, 다중음이온성 화합물, TEA8SOS는 이리노테칸을 포획하기 위해 MM-398에서 사용되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). TEA8SOS는 가수분해시 8 H+ 이온 및 8가 SOS8를 방출하는 양성자- 생성 제제이다 (도 1A, 패널 A2). 이온교환 크로마토그래피는, 방법 부문 (Id.)에서 아래에 기재된 바와 같이, MSNP 속으로 침지된, TEA8SOS를 생성하는데 사용되었다. 침지된 입자는, 3:2:0.15의 몰비에서 DSPC/콜레스테롤/DSPE-PEG2000으로 구성된, 지질 생물막으로 코팅된 둥근바닥 플라스크에 도입되었다. 최적의 지질:입자 비는 1.1:1.0인 것으로 결정되었다. 현탁액의 초음파처리는 LB-코팅된 입자를 수득하였고, 이는 포획 제제를 함유한다 (도 1A, 패널 A1). 이들 입자는 이리노테칸 용액에서 즉시 인큐베이션되어, 약물이 유입되고, 양성자화되고, SOS8-와 회합으로 겔-유사 침전물로서 기공에서 포획되었다 (도 1A, 패널 A1 및 A2, 도1B). 이것은 우리가, 이전에 실증된 바와 같이, 조합된 표면적 850 m2/g 및 기공 용적 ∼0.7 cm3/g을 가진 다공성 담체의 이론적 최대 장입 용량 (∼100 wt %)에 근사하는, 이리노테칸 장입 용량 최대 80 wt % (도 1B)를 달성하게 하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 후속적인 연구는 50 wt % 이리노테칸을 함유하는 입자로 수행되었다.
TEA8SOS를 이용하여 리포좀 담체를 가진 이리노테칸- 장입된 LB-MSNPs (Ir-LB-MSNP)의 효능(effcacy) 및 안전성을 비교하기 위해, 리포좀은 MM-398의 것과 유사한 절차에 의해 작제되었다 (도 1A, 패널 A3) (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 이것은 ∼40 wt % 이리노테칸 장입 용량을 가진 리포좀 (지정된 “Ir-리포좀”)을 수득하였고; 즉 포획 제제 (∼5 wt %) 없이 리포좀 생산보다 상당히 더 높았다 (도 1B). 동결-전자 현미경검사 (cryoEM)은 리포좀 및 LB-MSNPs, 각각에 대하여 ∼75 및 ∼80 nm의 입자 크기를 드러냈다 (도 1C). 고-배율 cryoEM 이미지는 온전한 ∼7 nm 두께 2중층에 의해 Ir-LB-MSNPs의 균일한 코팅이 있다는 것을 확인하였다. 저-배율 cyroEM 이미지는 LB가 입자의 >99%에서 온전하다는 것을 보여주었다 (도 11). 이것은, MSNP 2중층 코팅의 다른 방법에 대해 상당한 이점을 보유하는, 1 단계 캡슐화 프로토콜의 재현성을 확인한다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557).
우리의 주요 가설은 LB-MSNP가 리포좀에 비교하여 담체 안정성을 개선할 수 있기 때문에, 양쪽 담체는 혈청에서 인큐베이션되었고 동결건조되어 그것의 약물 유지 능력 및 이리노테칸 누출을 결정하였다. 양쪽 담체는, 연속 및 부드러운 진탕으로, 100% 혈청에서 37 ℃에 24시간 동안 인큐베이션되었다. 혈청 단백질의 흡착이 cryoEM 가시화를 방해하기 때문에, 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석은, 대신에, 담체 현탁액에서 약물 방출을 결정하기 위해, 사용되었고; 이것은 리포좀으로부터 ∼22%에 비교하여, LB-MSNPs에 의해 <6% 미성숙한 이리노테칸 방출을 보여주었다 (도 1D). 그러나, 4 ℃에 90 일 동안 무혈청 현탁액에서 입자 저장은 양쪽 담체가 높은 콜로이드성 안정성을, 소수의 (<5%) 미성숙한 약물 방출 또는 유체역학적 입자 크기에서 변화 (<5%)와 함께 가졌다는 것을 보여주었다. 반대로, 동결-보호성 5% 덱스트로오스 용액40에서 입자 동결건조는 물에서 재현탁시 담체 안정성에서 상당한 차이를 보여주었다 (도 1E). 따라서, Ir-LB-MSNPs가 유체역학적 크기를 변화시키지 않았고 단지 2.7% 약물 방출을 유발시켰던 반면, 리포좀은 가시적으로 응집되었고 그것의 이리노테칸 함량의 20.8%를 방출시켰다. 이것은 LB-코팅된 담체가 형태적으로 유사하게 보여도, LB-MSNPs가 리포좀보다 상당히 더욱 안정적이라는 것을 확인한다.
Kras-유래된 동소이식 PDAC 모델에서 리포좀에 비교된 개선된 체내분포, 약동학 (PK), 및 LB-MSNP에 의한 이리노테칸 전달
체내분포 및 PK 연구는, 유전자도입 KrasLSL-G12D/+; Trp53LSL-R172H/+; Pdx-1-Cre (KPC) 동물에서 자발적인 PDAC 종양으로부터 유래된 루시퍼라아제-발현 세포주로 동소이식으로 이식된, 면역- 능숙한 B6/129 마우스에서 수행되었다 (Hingorani 등 (2005) Cancer Cell, 7:469-483). KPC-유래된 동소이식 모델은 Kras 돌연변이, 상대적으로 풍부한 기질의 발현, 국부 조직 침습, 및 전이의 발생에서 인간 PDAC를 모방한다 (Tseng 등 (2010) CliN. Cancer Res. 16:3684- 3695; Provenzano 등 (2013) Br. J. Cancer, 108:1-8; Torres 등 (2013) PLoS One, 8:e80580). 1차 종양은, 문헌 (도 12) (Id.)와 일치하는, ∼5 주에서 전이의 외관으로, 23 주 내에서 동소이식 임플란트 부위에서 발생하였다. 종양 부위에 이리노테칸 담체의 체내분포를 따라하기 위해, 동물은, 동소이식 이식 3 주 후 (도 2A), 근적외선 (NIR)-표지된 (Dylight 680) 리포좀 또는 LB-MSNPs로 IV 주사되었다. IVIS 이미지형성은 지시된 시점에서 100 mg/kg 표지된 LB-MSNPs 또는 리포좀의 IV 주사 이전 (칼럼 2) 및 이후 수득되었다 (칼럼 3-6, 도 2A). 이것은 D-루시페린의 복강내 (IP) 주사를 받는 동물내 발생 종양에서 루시퍼라아제 발현을 검출하기 위해 생물발광 IVIS 이미지형성과 커플링되었다 (도 2A, 제1 칼럼). 강력한 형광 강도는 LB-MSNP 주사의 2시간 내에 종양 부위에서 관측되었고, 그 이후 신호는 적어도 48시간 동안 지속되었다. 그에 반해서, NIR 신호 강도는 (유사한 라벨링 효율을 가진) 리포좀으로 주사된 마우스에서 더 희미해졌고 더욱 빠르게 사라졌다. 이것은 또한, 주사후 24시간후 희생 다음에, 동물로부터 수집된 종양 및 주요 기관의 생체외 이미지형성에 의해 확인되었다 (도 2B). 생체외 이미지형성은 또한 48시간 후 수행되었고, 이는 리포좀-치료된 동물에 비교된 LB-MSNP에서 오퍼레이터-정의된 관심 영역 (ROI)에서 더욱 강한 NIR 신호 강도를 확인하였다 (도 13). 종양 부위에서 풍부한 입자 흡수에 더하여, 간 및 비장은 또한 입자 분포의 주요 부위이었다. 작은 신호전달은 폐, 심장, 및 신장에서 수득되었다. 종양 조직 및 주요 기관에서 실리콘 (Si) 존재도를 정량화하기 위해 유도적으로 커플링된 혈장 광학 방출 분광분석법 (ICP-OES)는 총 투여된 원소 Si 용량의 ∼3%가 발생 종양 부위에 분포할 수 있다는 것을 실증하였다 (도 14). 이것은 리포좀, 폴리머 교질입자, 젤라틴, 또는 MoS2/Fe3O4 나노입자에 비교된 예외적으로 양호한 체내분포를 나타내고, 여기에서 PDAC 부위에 분포하는 입자의 백분율은 0.2-2.4%가 되었다 (Yoshida 등 (2012) PLoS One, 7:e39545; Yu 등 (2015) Theranostics, 5:931-945; Cabral 등 (2011) Nat. Nanotechnol. 6: 815-823; Guo 등 (2013) Biomaterials 34:8323-8332; Xu 등 (2013) Mol. Pharmaceutics, 10:2031-2044). 우리는 또한 공초점 현미경검사에 의해 NIR-표지된 입자의 종양내 분포의 가시화용 종양 절편을 수득하였고; 이것은 리포좀에 비교된 LB-MSNPs에 대하여 24시간 후 종양 부위에서 더 높은 입자 존재도를 실증하였다 (도 2B). 종양 부위에서 이리노테칸 함량을 평가하기 위해, 60 mg/kg 약물의 등가물은 자유 약물, Ir-LB-MSNP (60 mg/kg 약물; 120 mg/kg 입자 용량) 또는 Ir-리포좀 (60 mg/kg 약물; 150 mg/kg 입자 용량)의 형태로 단일 용량으로서 주사되었다. 동물은 채혈 및 종양 수확을 위하여 0.5, 4, 24, 및 48 시간후 희생되었다. 이들 조직은 이리노테칸 조직 함량을 정량화하기 위한 HPLC 분석에 사용되었고, 이는 24시간에서 자유 약물에 대한 것보다 Ir-LB-MSNPs 및 Ir-리포좀에 대하여 5- 및 2-배 더 높았다 (도 2C). 이리노테칸용 순환 반감기는 LB-MSNPs, 리포좀, 및 자유 약물, 각각에 대하여 11, 8.7, 및 1.0 시간에 대한 그리고 혈장 약물 농도의 HPLC 정량화 이용에 의해 계산되었다 (도 2D). 마우스로부터 수득가능한 혈액의 용적의 수송 제약은 담체의 혈액 체류 시간 결정에서 우리는 배제되었다. 우리는 또한 피하 PANC-1 이종이식 모델에서 체내분포 및 PK 연구를 수행하였고, 여기에서 우리는 자유 약물에 비해 Ir-LB-MSNPs 및 Ir-리포좀, 각각에 대하여 종양 약물 함량에서 30- 및 4-배 증가를 관측하였다 (도 15). 우리는 또한 개별 기관의 약물 함량을 비교하였다 (도 16). 이것은, 주사후 24시간에서 Ir-LB-MSNP에 비교된 Ir-리포좀에 대하여 간, 비장, 및 장 조직, 각각에서 0.8-, 0.2-, 및 0.2-배 더 높은 약물 함량을 실증하였다. 상당한 차이는 신장에 대하여 보이지 않았다.
Ir-LB-MSNP는 동소이식 PDAC 모델에서 자유 약물 또는 Ir-리포좀보다 더욱 유효한 사멸을 제공한다.
효능 평가용 용량- 탐구 스케줄을 개발하기 위해, 우리는 하기로부터 프로토콜을 사용하였다: 미국국립 암 연구소 (건강한 마우스에서 최대 내성 용량 (MTD)를 결정하기 위해) (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 이러한 평가는 자유 이리노테칸, Ir-리포좀, 및 Ir- LB-MSNPs, 각각에 대하여 60, 295, 및 295 mg/kg의 MTD를 실증하였다 (도 3A). (자유 약물 또는 캡슐화된 약물 양에 대하여 MTD의 66.7 또는 13.3%과 같은) 40 mg/kg의 약물 용량은 후속적인 실험을 위하여 선택되었다. 이들 용량은 Ir-LB-MSNPs 또는 Ir-리포좀, 각각에 대하여 80 또는 100 mg/kg의 나노입자 용량과 같다. IV 주사는 2 × 106 KPC 세포의 동소이식 종양 이식후 14 일째에 시작하였고; 이때, 평균 1차 종양 크기는 매크로-전이 없이 ∼5 mm이었다. IV 주사는 매 4 일, 최대 8 반복 재현 동안 반복되었다 (도 3B). 대조군 그룹은 IV 염수 단독을 받는 동물을 포함하였다. 동소이식 종양 성장은 IVIS 생물발광 이미지형성에 의해 설정 시점에서 모니터링되었다 (도 3B). ROI에서 이미지형성 강도를 결정하기 위해 IVIS 소프트웨어에 의한 종양 성장의 정량적 발현은 염수, 자유 약물, 또는 Ir-리포좀에 비교된 Ir-LB- MSNP 치료에 의해 더 느린 종양 성장을 상당히 실증하였다 (도 3B). 항종양 효능은, 40-47 일째에 희생된 동물로부터 수집된, 종양 외식편에서 세포자멸사의 속도에 따라 또한 측정되었다. 활성화된 (절단된) 카스파제-3의 검출을 위하여 면역조직화학 (IHC) 염색 프로토콜을 이용하여, 우리는, 자유 이리노테칸 또는 Ir-리포좀, 각각에 대하여 ∼6 및 ∼11%에 비교된, Ir-LB-MSNP-치료된 마우스에서 ∼25% 세포자멸적 세포 사망을 관측하였다 (도 3C).
대표적인 IHC 이미지는 도 17에서 보여진다. 우리가 공식 생존 연구를 수행하기 위해 시작하지 않았어도, 조사의 상이한 단계에서 생존한 동물의 수를 비교하기 위해 47 일후 카플란-마이어 데이터 디스플레이를 사용하는 것이 가능하였다 (도 18). 이것은, 리포좀 제제보다 Ir-LB-MSNP의 더 나은 생존율을 포함하여, 자유 약물보다 양쪽 담체에 대하여 개선된 생존을 실증하였다 (도 18).
동물 부검은 국부 종양 확산 및 전이의 외관을 평가하기 위해 수행되었다 (도 3D). 위, 장, 간, 비장, 신장, 횡격막, 및 복벽의 직접적인 종양 침습에 더하여, 수많은 거시적 전이성 병소는, 또한 출혈성 복수를 발생시켰던, 염수-치료된 동물에서 보여질 수 있다. 자유 이리노테칸이 전이에 영향을 주는데 실패하였던 반면, Ir-리포좀은 전이성 부위에서 생물발광 강도의 중간 정도 감소를 제공하였다 (도 3D). 놀랍게도 그에 반해서, Ir-LB-MSNP 치료는, IVIS 이미지형성 동안 1차 종양 영역의 희미한 생물발광 외부의 증거로, 강력한 억제성 효과를 발휘하였다 (도 3D). 이것은, HPLC 분석 동안 이리노테칸의 더 높지만 무의미한 함량을 보여주었던, 신장의 영역에서 특히 두드러졌다 (도 16). 도 3E에서 히트 맵은 종양 전이에 관한 치료 영향의 정량적 디스플레이를 제공한다.
리포좀이 아닌 LB-MSNPs는 마우스 동소이식 모델에서 이리노테칸 전달의 안전성을 개선한다.
이리노테칸이 폴피리녹스 독성에 주요 방식으로 기여하기 때문에, 캡슐화된 전달에 의해 약물 독성 감소의 가능성은 주요 연구 목적이다. MTD 평가는 양쪽 담체가 자유 약물보다 ∼5-배 급성 치명적인 용량을 증가시킬 수 있다는 것을 보여주었다 (도 3A). 캡슐화된 약물 전달을 통해 이리노테칸 독성을 다루기 위해 (도 3B), 간, 흉골 골수, 및 장 조직은 효능 연구에서 희생된 동물로부터 수집되었다. 이들은 PDAC 환자에서 이리노테칸 독성에 대하여 주요 표적 기관이다 (Conroy 등 (2011) N. Engl. J. Med. 364(19): 1817-1825; Ueno 등 (2007) Cancer Chemother. Pharmacol. 59(4): 447-454; Loupakis 등 (2013) Br. J. Cancer, 108(12): 2549-2556). 간의 조직학적 시험은 자유 약물로 처리된 동물에서 중증 및 광범위한 간세포 괴사를 실증하였다 (도 4A). 이것은 간 세포에서 농축된 및 단편화된 핵의 존재에 의해 반영된다 (Ziegler 등 (2004) News Physiol.Sci. 19: 124-128). 간 손상의 중증도가 Ir-리포좀에 의해 어느 정도 감소되었던 반면, 광범위한 간 괴사는 관측되었다 (도 4A). 그에 반해서, Ir-LB-MSNP-처리된 동물은, 괴사 없이, 소수의 지방증, 가역적 약물-유도된 스트레스 반응을 나타낼 뿐이었다 (도 4A) (King and Perry (2001) Oncologist, 6:162-176; Maor and Malnick (2013) Int. J. Hepatol. Art: 815105). 조직학적 데이터는 또한 IHC 분석에 의해 확인되었고, 여기에서 간 조직은 (FITC-표지된 항-F4/80 항체를 가진) Kuppfer 세포 (KC), (절단된 카스파제-3을 인식하는) RITC- 표지된 항체로 검출된 세포자멸적 세포 및 Hoechst 33342 (청색 염료)를 가진 세포 핵을 염색하는데 사용되었다 (도 4B). 형광 현미경하에서 염색된 절편의 시험은 자유 약물로 처리된 동물의 간 전반에 걸쳐 광범위한 세포자멸사를 실증하였다. Ir-리포좀으로 치료를 받는 동물은, KC 또는 인접한 간 조직을 빈번하게 관여하였던, 덜한 세포자멸사를 실증하였다. 그에 반해서, 세포자멸사는 Ir- LB-MSNP로 처리된 동물의 간에서 보여지지 않았다.
Gi 관의 H&E 염색이 임의의 치료 그룹에서 독성의 현미경적 증거를 드러내지 못했던 반면, 절단된 카스파제-3에 대하여 IHC 염색은 세포자멸적 세포의 존재 및 자유 약물에 의한 장 융모의 둔화를 실증하였다 (도 4C). 융모의 둔화에 대해 보호된 Ir-리포좀으로 치료 동안, IHC 염색은 정점 장세포에서 세포자멸사의 존재를 드러냈다. 이것은, 융모에 임의의 세포자멸사 또는 손상을 초래하지 않았던, Ir-LB-MSNPs로 치료와 명백한 대조이다 (도 4C).
골수 독성은 별개의 실험에서 연구되었고, 여기에서 동물은, 상기에 기재된 바와 같이, 40 mg/kg 이리노테칸 용량 당량의 3 주사를 받았다. 희생 후, 흉골 골수는 수집되어 H&E 염색에 의한 골수독성을 평가하기 위해 수집되었다 (도 4D) (Iusuf 등 (2014) Mol. Cancer Ther. 13:492-503). 자유 약물 또는 Ir-리포좀으로 처리된 동물이, 조혈 세포에 의해 채워진 골수 공간의 <30%에 의해 입증된, 광범위한 골수 손상을 보여주었던 반면 (Travlos (2006) Toxicol. Pathol. 34: 566-598), Ir-LB-MSNP-처리된 동물에서 골수 세포질에서 변화는 없었다 (도 4D). 또한, 자유 약물 또는 Ir-리포좀에 의해 골수에 대한 손상은 말초 혈액 호중구감소증에 의해 동반되었고, 반면 Ir-LB-MSNP 치료는 중성구 카운트에서 무의미한 쇠퇴를 보여주었다 (도 19). 모두 고려하여, 이들 데이터는 Ir-LB-MSNP로 치료 동안 전신 및 표적 장기 독성에서 유의미한 감소를 입증하고, 반면 리포좀 담체는 실질적인 장기 독성을 여전히 나타낸다.
논의
우리는 고용량 이리노테칸 장입 및 전달에 대하여 지지된 LB 및 양성자-생성 포획제를 이용하여, 주문-설계된 메조다공성 실리카 나노입자 플랫폼을 개발하였고 면역적격 마우스내 KPC-유래된 췌장 암 모델에서 시험하였다. 담체의 개선된 안정성 및 장입 용량은, 동일한 장입 절차 및 포획제 (TEA8SOS)를 이용하여, 인하우스 합성된 MM-398 리포좀 등가물에 비교하여 이리노테칸의 체내분포, 순환 반감기, 및 약물 종양 함량을 개선시켰다. Ir-LB-MSNP가 1차 종양 부위에서 종양 사멸 유도에 더 효과적이었고, 뿐만 아니라 전이 치료에 대하여 또한 더욱 활성이었다. 동등하게 중요한, LB-MSNP 담체는, 골수, Gi 관, 및 간에서 부정적인 영향을 가졌던 리포좀에 완전한 대조인, 확연한 전신 독성을 유도하지 않았다. 우리는 치료 효능의 유지와 독성 감소를 리포좀의 것에 비교하여 LB-MSNPs의 증가된 담체 능력의 덕으로 돌린다. 따라서, LB-MSNP 담체는, 최근 FDA-개선된 리포좀 담체에 대하여 현재 있는 일이지만, GEM 치료의 실패를 가진 환자에 대하여 유보되는 것보다 가장 중요한 고려대상으로서, 이러한 약물의 사용을 촉진시키기 위한 가능성으로, PDAC의 치료에 대한 이리노테칸의 도입에 획기적인 접근법을 제공한다.
우리는, 리포좀 등가물과 형태적으로 닮은, 이리노테칸용 강력한 MSNP 담체를 개발하였다. 그러나, 온전한 지지된 LB에 의해 제공된 우월한 약물 캡슐화에 더하여, LB-MSNPs는 또한 결합 및/또는 정전 상호작용의 결과로서 다공성 실리카 측벽에 대해 치밀한 약물 패키징을 허용한다 (Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801; Meng 등 (2010) ACS Nano, 4:4539-4550; Ashley 등 (2011) Nat. Mater., 10:389-397). 이것은 우리가 개선된 이리노테칸 장입 용량을 달성하게 하였고, 이는 리포좀에 비교하여 동소이식 종양 부위에서 우월한 사멸 효율을 제공한다. 개선된 장입 용량은, 종양 부위에 체내분포 및 혈액 순환 동안 리포좀 2중층에 비교하여 화물 보호를 개선하는, 지지된 LB 안정성에 의해 추가로 보조된다. 우리는, 짐작컨대 입자 표면과 강력한 정전 및 반데르발스 상호작용의 결과로서, 지지된 LB의 감소된 변동이 비지지된 지질 2중층 (리포좀)과 혈청 단백질 상호작용때문에 지질 손실을 감소시킨다는 것을 제안한다. 지지된 LB는 혈류 동안 생성된전단력 및 보체-매개된 용해에 대해 담체를 또한 보호할 수 있다 (Liu 등 (2000) In: Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, 172(1-3): 57-67; Heurtault 등 (2003) Biomaterials, 24(23): 4283-4300; Ashley 등 (2011) Nat. Mater., 10:389-397; Liang 등 (2004) J. Colloid Interface Sci. 278:53-62; Anderson 등 (2009) Langmuir, 25:6997-7005; Michel 등 (2012) Int.J. Mol. Sci. 13:11610-11642; Wang 등 (2014) Small 10:3927-3931). 예를 들면, 독소루비신-장입된 DOPC 리포좀은 37 ℃에 모의실험된 혈청-함유 생물유체 환경에서 24시간 내에 ∼40% 약물 누출을 나타낸다 (Ashley 등 (2011) Nat. Mater., 10:389-397). 이것은, 나노캐리어로서 효과적인 반면, Ir-리포좀이 전체의 혈청에서 또는 입자 동결건조 및 재현탁 이후 Ir-LB-MSNPs보다 상당히 덜 안정적이라는 우리의 발견에 따른 것이다 (도 1D 및 1E). Ir-리포좀으로부터 큰 독성 토포이소머라제 억제제의 미성숙한 방출은 동물 연구내 골수, 간, 및 장에서 독성의 높은 비율에 의해 또한 동반되었고, 이는 Ir-LB-MSNPs의 보호성 효과과 상당히 상이하다. 따라서, 리포좀에 형태적 닮음에도 불구하고, LB-MSNP 담체는, 양쪽 효능 및 약물 독성 관점으로부터, 리포좀 이리노테칸 전달보다 분명한 이점을 제공한다.
Ir- LB-MSNP에 의한 골수 및 장 독성 감소는 최근에 FDA-승인된 MM-398 리포좀 제형, Onivyde가 PDAC 환자의 치료 동안 가능한 중증 호중구감소증 및 설사의 블랙박스 경고와 시판되는 관점으로부터 주목할만하다 (참조, 예를 들면, www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm468654.htm; www.accessdata.fda.gov/drugatfda_docs/label/2015/207793LB.pdf). 경고는 치명적 호중구감소성 패혈증이 환자의 0.8%에서 관측되었다는 것을 언급하고, 반면 중증 또는 생명-위협 호중구감소 열은 3%에서 발생하였다 (www.accessdata.fda.gov/drugatfda_docs/label/2015/207793LB.pdf). 생명 위협 호중구감소증은 5-플루오로우라실 및 류코보린 (Id.)와 조합으로 Onivyde를 받는 환자의 20%에서 관측되었다. 동일한 약물 조합은 또한 치료된 대상체 (Id.)의 13%에서 중증 설사를 야기하였다. 비록 우리가 비교하기 위해 Onivyde를 사용하지 않았지만, 이리노테칸 장입을 위하여 TEA8SOS를 이용하는 인하우스 리포좀 제형은 자유 약물에 유사한, 상당한 골수 및 장 독성과 관련되었다. 유사한 효과는 Ir-LB- MSNP 플랫폼으로 치료 동안 보여지지 않았다.
양쪽 MSNP 및 리포좀 담체가, NIR-표지된 입자 및 FITC-표지된 항-F4/80 항체를 이용하는 공초점 현미경검사에 의해 실증된 바와 같이, 간에서 KCs에 의해 격리된다는 것이 흥미롭다 (도시되지 않음). 직접적인 생체내 시범을 제공하기 어려운 반면, 우리는 LB의 붕해 및 이리노테칸 방출이 KC에서 산성 엔도/리소좀 구획에서 착수한다는 것을 제안한다 (Hwang 등 (1980) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 77:4030-4034; Derksen 등 (1988) Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 971:127-136; Kolter and Sandhoff (2010) FEBS Lett. 584:1700-1712). 리포좀의 더욱 급속 붕해는 단지 희소 NIR-표지된 입자가 풍부한 Ir-LB-MSNP의 존재에 비교하여 Ir-리포좀으로 주사된 동물에서 보여지는 이유를 설명할 수 있다 (도 2B). 담체 붕해의 비율은, 차례로, 방관자 간세포의 약물 방출의 비율을 결정할 수 있다. 이것은 리포좀 담체로부터 이리노테칸 버스트 방출이, CYP 3A 및 우리딘 디포스페이트-글루쿠로노실전달효소 (UGT1A1)에 의해 수행되는, 약물의 간 대사를 압도할 수 있다는 가능성을 상승시킨다 (Mathijssen 등 (2001) CliN. Cancer Res. 7:2182-2194). 감소된 대사는, 도 4A에서 나타낸 바와 같이, 간세포 손상 및 괴사를 유발시키는, 비대사작용된 약물의 더 높은 유지로 이어질 수 있다. 이것은 Ir-LB-MSNP에 비교된 Ir-리포좀으로 처리된 동물의 간 조직에서 콘주게이션되지 않은 이리노테칸의 상당히 더 높은 함량, 즉, IV 주사후 24시간에 26 대 15%ID/g를 설명할 수 있다 (도 16). 이들 발견은, Ir-LB-MSNP-치료된 동물에서 세포자멸사의 부재에 비교된, Ir-리포좀으로 치료 동안 KC 및 인접한 간세포에서 높은 세포 사망률을 입증하는, KC 및 활성화된 카스파제-3의 IHC 염색과 또한 양립가능하다 (도 4B). 도 4E에서 도식은 간세포 세포자멸사 및 괴사의 정도 결정에서 KC로부터 이리노테칸 방출의 비율 및 담체 안정성의 역할에 관한 우리의 가설을 약술한다 (Zhao 등 (2015) In vivo. Sci. Bull., 60:3-20). 그것의 빈사 상태에서 동물로부터 수득될 수 있는 혈액의 제한된 양으로 인해, 간 효소를 측정하는 것이 불가능하였다.
GEM은 빈번하게, 6.8 개월의 생존 결과로, PDAC에 대하여 가장 중요한 요법으로서 작용한다 (Burris 등 (1997) J. CliN. Oncol., 15:2403-2413; Teague 등 (2014) Ther. Adv. Med. Oncol. 7:68-84). 폴피리녹스가 ∼11 개월까지 생존을 개선할 수 있는 반면, (주로 이리노테칸 및 옥살리플라틴으로 인한) 심각한 약물 독성의 빈번한 발생은 가장 중요한 요법으로서 그것의 사용을 배제시킨다. 따라서, 폴피리녹스는 종종 양호한 성능 상태를 가진 환자에 대하여 유보된다. 불행하게도, 이러한 위치는 Onivyde의 도입으로 변화되지 않았고, 이는 가장 중요한 요법으로서 승인되지 않고 중증 설사 및 호중구감소증의 블랙박스 경고를 포함한다. PDAC 환자의 대략 80%가 질환의 진전된 단계에서 나타나기 때문에, 가장 중요한 치료로서 폴피리녹스 레지멘에서 약물을 사용하는 것이 유리할 것이다. 우리가 비교 분석을 위하여 Onivyde를 사용하지 않았어도, Ir-LB-MSNP 플랫폼은 우리의 등가 인하우스 Ir-리포좀 제형보다 더 낮은 전신 독성으로 더욱 효과가 있고 생체적합성이었다. 우리는, 따라서, Ir-LB-MSNP 플랫폼이 PDAC에서 가장 중요한 요법을 위하여 개발될 수 있다는 것을 제안한다. 우리는 PDAC 모델에서 GEM 및 PTX에 대하여 이중 전달 MSNP 담체의 실행성을 최근에 실증하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 각각의 치료 접근법은 설계 복잡성, 비용, 및 실행전 양호한 제조 실시에 관한 영향을 예의 고려할 수 있다 (Sugahara 등 (2010) Science, 328:1031-1035).
비록 지질-코팅된 MSNPs가 시험관내 및/또는 생체내 화물 전달에 유효한 것으로 밝혀져도 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557; Zhang 등 (2014) Biomaterials, 35:3650-36651; Ashley 등 (2011) Nat. Mater., 10:389-397; Ashley 등 (2012) ACS Nano, 6:2174-2188; Dengler 등 (2013) J. Controlled Release, 168:209-224), 이것은 양성자화 제제가 상기 담체 플랫폼의 장입 효율(efficiency)을 증가시키는데 사용될 수 있는 방법의 제1 시범이다. 우리는 또한 양성자 구배를 통해 LB-MSNPs 속으로 장입될 수 있는 약염기성 약물의 포괄적인 목록을 확인하였다. 이들 화물 분자의 일반적인 특징은 다음과 같은 화학 특성을 포함한다:
(i) 1차, 2차, 3차, 또는 4차 아민(들)을 포함하는 유기 분자 화합물;
(ii) LB 뒤에서 양성자화 및 포획을 허용하는 pKa < 11 (Zucker 등 (2009) J. Control. Release, 139(1): 73-80; Cern Cern 등 (2012) J. Control. Release, 160(2): 147-157; Xu 등 (2014) Pharmaceut.Res. 31(10): 2583-2592);
(iii) LB를 거쳐 확산을 허용하는 양친매성 특징 및 대략 5 내지 25 mg/mL 범위의 수용성;
(iv) 3.0 내지 3.0;71,72의 옥탄올/물 분배 계수 또는 log P 값
(v) MSNP 기공 속으로 진입을 허용하기 위해 MSNP 기공 크기 (2-8 nm) 미만 기하학적 크기를 가진 적합한 분자량 (Li 등 (2012) Chem. Soc. Rev. 41:2590-2605; Tang 등 (2012) Adv. Mat. 24(12): 1504-1534; Tarn 등 (2013) Acc. Chem. Res. 46(3): 792-801).
모두-포함 없이, 잠재적인 화학요법 제제의 목록은 하기를 포함한다: 토포이소머라제 I 억제제, 토포테칸; 항종양 안트라사이클린 항생제, 독소루비신 및 미톡산트론; 유사분열 억제제, 빈블라스틴 및 비노렐빈; 티로신 키나제 억제제, 이마티닙, 오시메르티닙, 및 수니티닙, 등.상기 제제의 하나 또는 조합을 패키징 및 전달하는 능력은, 추가의 암 유형 예컨대 결장, 유방, 폐, 간, 신경아교종, 흑색종, 등의 치료 고려사항을 포함하여, 우리의 다작용성 LB-MSNP 플랫폼의 광범위 유용성을 향상시킬 것이다. 단일 담체 속으로 상기 목록에서 약물 조합을 공-패키징하는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 우리가 우리의 GEM/PTX 공-전달 플랫폼으로 달성하였던 성공에 기반하여 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557), 상승작용 및 비율계량 전달을 위하여 폴피리녹스 레지멘 (예를 들면, 이리노테칸과 옥살리플라틴)에서 조합 약물을 고려하는 것이 가능하다. 또한, 우리의 LB-MSNP에 의한 약물 장입은 비암성 적용, 예컨대 감염성 질환용 캡슐화 항생제, 예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신, 또는 HIV 항-레트로바이러스 (예를 들면, 테노포비르 디소프록실 푸마레이트)에 사용될 수 있다. TEA8SOS에 더하여, 막관통 pH 구배가 또한 하기에 의해 생성될 수 있다는 것이 또한 가치있는 언급이다: 산성 완충액 (예를 들면, 시트레이트) (Chou 등 (2003) J. Biosci. Bioeng., 95(4): 405-408; Nichols 등 (1976) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 455:269-271), 양성자-생성 분리가능한 염 (예를 들면, (NH4)2SO4) (Haran 등 (1993) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1151:201-215; Maurer-Spurej 등 (1999) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1416:1-10; Fritze 등 (2006) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1758:1633-1640), 또는 하기로부터 이온투과담체-매개된 이온 구배: 금속 염 (예를 들면, A23187 및 MnSO4) (Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res, 10(19): 6638-6649; Ramsay 등 (2008) Eur. J. Pharm. BioPharm. 68(3): 607-617; Fenske 등 (1998) Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1414:188-204). 또한, 약물 장입용 역 pH 구배를 생성하는 것, 예컨대 아세트산칼슘 구배를 이용하는 것, 리포좀에서 이용된 전략인, LB-MSNP에서 양친매성 약산 장입을 개선하는 것이 OK 가능하다 (Avnir 등 (2008) Arthritis Rheum. 58: 119-129).
결론
요약하면, 우리는, 리포좀에 그것의 형태적 닮음에도 불구하고, 동등한 리포좀 제형 또는 자유 약물보다 우월한 생체적합성 및 치료 효능을 제공하는, 이리노테칸용 MSNP 전달 플랫폼을 개발하였다. 신규한 담체는 PDAC에 대하여 가장 중요한 상태에 폴피리녹스 레지멘에서 이리노테칸 전달 및 약물 조합을 진전시키는데 사용될 수 있다.
방법
물질.
테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 트리에탄올아민, 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 용액 (CTAC, 물내 25 wt %), 트리에틸아민 (TEA), Dowex 50WX8 수지, Sepharose CL-4B, 및 Sephadex G-25는 하기로부터 구매되었다: Sigma-Aldrich, USA.1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-] (암모늄 염) (DSPE-PEG2000), 및 콜레스테롤 (Chol)은 하기로부터 구매되었다: Avanti Polar Lipids, USA.수크로오스 옥타설페이트 (SOS) 나트륨 염은 하기로부터 구매되었다: Toronto Research Chemicals, Inc., Canada.이리노테칸 하이드로클로라이드 3수화물은 하기로부터 구매되었다: LC Laboratories, USA.페니실린, 스트렙토마이신, 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)은 하기로부터 수득되었다: InvitrogeN. 우태 혈청 (FBS)는 하기로부터 구매되었다 Gemini Bio Products.활성화된 (절단된) 카스파제-3을 검출하는 토끼 mAb 항체 (카탈로그 #9664)는 하기로부터 구매되었다: Cell Signaling.Matrigel 매트릭스 기저막은 하기로부터 구매되었다: BD BiosciencE. 원심 필터 유닛 (컷오프 크기:10K 및 30K)은 하기로부터 구매되었다: EMD MilliporE. 모든 화학물질은 추가 정제없이 직접적으로 사용되었다.
포획 시약을 이용하는 이리노테칸-장입된 LB-MSNP의 제조.
MSNP의 합성.
MSNP 코어는 우리의 이전의 졸/겔 절차의 약간의 변형에 의해 합성되었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). ∼500 mg의 MSNP의 배치를 합성하기 위해, 50 mL의 CTAC는 500 mL 원뿔형 플라스크에서 150 mL의 H2O와 혼합되었고, 이어서 350 rpm으로 15분 동안 85 ℃에서 교반되었다. 이에 이어서 30분 동안 동일한 온도에서 8 mL의 10% 트리에탄올아민이 첨가되었다. 그 다음, 7.5 mL의 실리카 전구체, TEOS는 연동 펌프를 이용하여 1 mL/min의 비율로 적가되었다. 용액은 350 rpm으로 85 ℃에서 20분 동안 교반되어, ∼65 nm의 1차 크기를 가진 형성물 입자를 초래하였다. 계면활성제는 실온에서 24시간 동안 메탄올/HCl (500:19 v/v)의 혼합물로 입자 세정에 의해 제거되었다. 입자는 10,000 rpm으로 60분 동안 원심분리되었고 메탄올에서 3회 세정되었다.
포획제 TEA8SOS의 합성.
TEA8SOS는 이온교환 크로마토그래피에 의해 상업적으로 입수가능한 SOS 나트륨 염으로부터 합성되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 간단히, 500 mg의 염은 1 mL의 탈이온화된 (DI) 물에 용해되어, 500 mg/mL의 수용액을 수득하였다. 용액은, DI 수에서 제조된, 8 cm × 1.5 cm 양이온성 이온- 교환 수지 (Dowex 50WX8) 칼럼에 통과되었다. SOS 염은 칼럼에 첨가되었고 수크로오스 옥타설폰 (SOS) 산으로 전환을 위하여 물로 용출되었다. 산성 SOS 용출물은 순수한 트리에틸아민으로 즉시 적정되어 5.8의 최종 pH에 도달하였다. 이것은 TEA8SOS의 형성을 초래하였다. 염 농도는 ∼80 mM로 조정되었고 사용전 냉장고에서 4 ℃에 저장되었다.
MSNP에서 LB에 의한 TEA8SOS 장입 및 포획.
우리는 LB 코팅의 사용을 통해 MSNP에서 TEA8SOS의 신규한 포획 방법을 사용하였다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 합성은, 15/15 초 온/오프 작동 사이클 및 파워 출력 32.5 W로, 5분 동안 탐침 초음파처리에 의해 4 mL의 수성 80 mM TEA8SOS에서 100 mg의 비어있는 MSNPs 침지에 의해 개시하였다. 입자 현탁액은 코팅된 지질 생물막에 즉시 첨가되었고, 110 mg의 DSPC/Chol/DSPE-PEG2000 (몰비 3:2:0.15)의 혼합물 첨가에 의해 수득되었고, 6 cm 둥근바닥 플라스크의 최하부에 10 mg/mL로 클로로포름에 현탁되었다. 이것은 1.0:1.1의 입자:지질 비와 같다. 실온에서 회전식 증발기에서 용매 증발 이후, 우리는 ∼30 cm2 표면적을 가진 생물막을 수득하였다. 생물막에 입자 현탁액의 첨가 이후, 탐침 초음파처리는 파워 출력 32.5 W에서 15/15 초 작동 사이클로 30분 동안 사용되었다. 미포획된 TEA8SOS는, 용출용 HEPES-완충된 덱스트로오스 용액 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)를 이용하여, Sepharose CL-4B 칼럼 (1.5 × 15 cm) 위에 크기-배제 크로마토그래피에 의해 제거되었다.
이리노테칸 장입용 TEA 8 SOS-장입된 LB-MSNP의 사용.
이리노테칸은 10 mg/mL로 HEPES-완충된 덱스트로오스 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)에 용해되었고, 이것은 TEA8SOS-장입된 입자와 혼합되어 1:1 (w/w)의 이리노테칸/MSNP 비를 달성하였다. 혼합물은 65 ℃에 수조에서 30분 동안 인큐베이션되었고 그 다음 빙수에서 10분 동안 켄칭되었다. 약물-장입된 입자는 세정되었고 원심분리에 의해 15 000 rpm으로 10분 동안 3회 정제되었다. 세정된 입자는 지시된 대로 물, 염수, 또는 PBS에서 재현탁되었다.
이리노테칸 전달용 비교 리포좀 제형의 제조.
포획제의 부재하에 LB-MSNP에 의한 이리노테칸 캡슐화.
비어있는 MSNPs (40 mg)은 초음파처리로 (물내) 10 mg/mL 이리노테칸 용액의 4 mL에 첨가되었고, 이어서 4시간 동안 실온에서 교반되었다. 약물은 그 다음, 상기에 기재된 바와 같이 유사한 조성물의 지질 생물막의 초음파처리를 이용하여, LB에 의해 캡슐화되었다. 탐침 초음파처리후, 입자는 원심분리 및 세정에 의해 정제되었고 상기에 기재된 바와 같이 재현탁되었다.
TEA8SOS를 이용한 이리노테칸의 리포좀 캡슐화.
MM-398 제형의 인하우스 유사체를 개발하기 위해 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277; Ko 등 (2013) Br. J. Cancer, 109:920-925), (3:2:0.015의 몰비로) DSPC/Chol/DSPE-PEG2000을 함유하는 212 mg의 지질 혼합물은 65 ℃에서 0.4 mL의 에탄올에 용해되었다. 4 밀리리터의 TEA8SOS 용액 (80 mM)은 동일한 온도에서 지질 에탄올 용액과 혼합되었고, 이어서 수조에서 2분 동안 초음파처리되었다. 지질 현탁액은 65 ℃에서 0.1 μm 기공 크기를 가진 폴리카보네이트 막을 통해 15회 압출되었다. 미포획된 TEA8SOS는, HEPES-완충된 덱스트로오스 용액 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)로 용출된, 크기-배제 크로마토그래피 칼럼 (Sepharose CL-4B)에 의해 제거되었다. HEPES-완충된 덱스트로오스 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)에서 10 mg/mL로 제조된, 이리노테칸 용액은 TEA8SOS-장입된 리포좀 현탁액 (이리노테칸/지질 = 1:2.1 w/w)와 혼합되었고 수조에서 65 ℃에 30분 동안 인큐베이션되었다. 샘플은 빙수에서 10분 동안 즉시 켄칭되었다. 자유 약물은 HEPES-완충 식염수 (5 mM HEPES, 145 mM NaCl, pH 6.5)로 용출된 Sephadex G-25 칼럼을 이용하여 제거되었다.
포획제의 부재하에 이리노테칸 리포좀 담체의 합성.
우리는, 포획 제제 대신에, 수동적인 캡슐화 접근법을 이용하는 이리노테칸-전달 리포좀을 또한 합성하였다. 간단히, 지질의 혼합물 (53 mg 지질, 3:2:0.015의 몰비로 DSPC/Chol/DSPE-PEG2000)은 65 ℃에서 0.1 mL의 에탄올에 용해되었다. 1 밀리리터의 이리노테칸 용액 (물내 10 mg/mL)는 65 ℃에서 지질 에탄올 용액과 혼합되었고, 이어서 2분 동안 초음파처리되었다. 지질 현탁액은 65 ℃에서 0.1 μm 기공 크기를 가진 폴리카보네이트 막을 통해 15회 압출되었다. 약물-장입된 리포좀은 상기에 기재된 바와 같이 동일한 방법을 이용하여 정제되었다.
물리화학 특성규명.
이 실시예에서 사용된 모든 입자는 형태학, 크기, 크기 분포, 형상, 및 표면 전하에 대하여 광범위하게 특성규명되었다. LB 코팅의 균일성 및 그것의 온전성은 TEM (JEOL 1200-EX) 및 cryoEM (TF20 FEI Tecnai-G2)를 특징으로 하였다. 입자 크기 및 ζ-전위는 ZETAPALS 기기 (Brookhaven Instruments Corporation)에 의해 측정되었다. 이들 측정은 100 μg/mL의 입자 농도로 물, PBS, 및 세포 배양 배지 플러스 10% FBS에 현탁된 나노입자로 수행되었다.
각각의 담체의 약물 장입 용량은, 이전에 기재된 바와 같이, 삭감 방법에 의해 결정되었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 간단히, 정제 동안 검출된 비-캡슐화된 이리노테칸의 양 (m1)은 마이크로플레이트 판독기 (M5e, Molecular Device, USA)에서 OD (360 nm)에 의해 또는 HPLC (Raytest, Germany)를 통해 결정되었다. 약물 장입 용량은 하기로서 정의되었다: DLC = [이리노테칸의 총량 (m0) - 비-캡슐화된 이리노테칸 (m1)] /[입자의 총량 (mMSNP 또는 m지질)] × 100%.약물 유지 안정성은 100% FBS에서 37 ℃에 24시간 동안 시험되었다. 간단히, 40 μl의 약물-장입된 NPs (이리노테칸:10 mg/mL)는, 연속 교반하면서, 1 mL의 혈청에 37 ℃에서 첨가되었다. 혼합물은, 원심 필터 분리 디바이스 (MW 컷오프 10K)를 이용하여, 설정 시간 간격에서 원심분리되었다. 방출된 이리노테칸은 마이크로플레이트 판독기에서 또는 HPLC에 의해 정량화되었다. NPs 없이 혈청 여과물은 대조군으로서 사용되었다. 양쪽 담체의 안정성은 동결건조 절차를 통해 또한 시험되었다. 간단히, Ir-MSNPs는 5% 덱스트로오스에 현탁되었다. 샘플은 -60 ℃에서 밤새 동결건조되었고 -80 ℃ 냉동고에서 저장되었다. 저장된 샘플은 부드러운 소용돌이에 의해 물에서 재현탁되었고, 그 이후 현탁된 용액은 이전에 기재된 바와 같이 크기, ζ-전위, 및 약물 방출에 대하여 특성규명되었다.
세포 배양.
유전자도입 KrasLSL-G12D/+, Trp53LSL-R172H/+, Pdx1-Cre 마우스에서 자발적으로 발생된 종양으로부터 유래된 불멸화된 세포주는 하기에 의해 친절하게 제공되었다: Dr. Andrew Lowy at UC San Diego.PANC-1 세포는 미국 종균 협회 (ATCC)로부터 구매되었다. 양쪽 세포 유형은, 10% FBS, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 및 2 mM L-글루타민을 함유하는, DMEM에서 배양되었다. IVIS 시스템에서 생물- 발광 종양 이미지형성을 허용하기 위해, 양쪽 세포는, 이전에 기재된 바와 같이, UCLA 벡터 코어 설비에서 루시퍼라아제-기반 렌티바이러스 벡터로 영구적으로 형질감염되었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 단일 세포 클론을 선택하기 위한 제한 희석 프로토콜 이후, KPC-luc 및 PANC-1-luc 세포 모집단은 PDAC 모델을 개발하는데 사용되었다.
최대 내성 용량의 평가.
자유 및 캡슐화된 이리노테칸 제형의 MTDs는 국립 암 연구소에서 독성학 및 약리학 분지 (dtp.nci.nih. gov/ branches/tpb/default.htm)으로부터 프로토콜을 이용하여 결정되었다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). 2 건강한 숫컷 BALB/c 마우스는 자유 또는 캡슐화된 이리노테칸의 50 mg/kg (C1 용량) 당량으로 IV 주사되었다. 이에 이어서 1.8의 용량 단계적 확대 인자 처리되어 Cn 용량을 수득하였고, 이는 마지막 투여후 24시간 이내 동물 사망을 초래한다. 제2 라운드의 용량- 탐구는 Cn-1 용량으로 시작하였고 MTD를 찾기 위해 1.15 단계적 확대 인자 (n = 2)를 이용하였고, 이는 사망률 또는 이환율의 부재로서 정의된다. MTD는, 이환율, 사망률, 또는 >15% 체중 감소의 부재를 결정하기 위해 15 일 동안 뒤따랐던, 6 마우스 주사에 의해 입증되었다.
면역적격 마우스내 KPC-유래된 동소이식 종양 모델의 확립.
암컷 B6/129 마우스 (∼8 주)는 The Jackson Laboratory로부터 구매되었고 무병원체 조건하에 유지되었다. 모든 동물 실험은 UCLA 동물 연구 위원회에 의해 승인된 프로토콜로 수행되었다. 동소이식 이종이식물을 성장시키기 위해, 마우스는 이소플루란으로 마취되었고, 이어서 50 mg/kg 케타민 및 10 mg/kg 크실라진의 IP 주사되었다. 수술 부위는 면도되어 절개 부위 주변 1 cm의 여유를 남겼고 베타딘 및 70% 에탄올로 스크러빙에 의해 멸균되었다. 마우스는 히팅 패드위에 수술용으로 배치되었고, 좌측면에서 절개 부위는 멸균된 거즈로 가려졌다. 0.5-0.7 cm수술 절개는 췌장 주사 부위를 노출시키기 위해 실시되었고, 27 게이지 바늘에 의해 췌장 꼬리 속으로 2 × 106 KPC-luc 세포를 함유하는 50 μl의 DMEM/Matrigel (1:1 v/v)이 주사되었다. 근막성 층은 흡수성 봉합 (PDS II, Ethicon)으로 폐쇄되었고 피부는 비흡수성 봉합 (PROLENE, Ethicon)으로 폐쇄되었다마우스는 마취로부터 전체 회복까지 가온 패드에서 유지되었고 그 다음 깨끗한 케이지로 이동되었다. 효능 연구는 이식 대략 2 주후 종양-보유 마우스에서 수행되었고, 이 시점에서 1차 종양은, 거시적 종양 전이의 증거 없이, ∼0.5 cm로 성장하였다. 체내분포 실험을 위하여, 종양- 보유 마우스는 종양 이식 3 주후 사용되었고, 이 시점에서 1차 종양은 ∼0.8 cm의 크기로 성장하였다.
IV 주사된 NIR-표지된 나노입자의 전신 및 종양내 체내분포.
IVIS (제노겐) 생체내 이미지형성 시스템은 KPC-유래된 동소이식 모델 (n = 3 마우스)에서 NIR-표지된 MSNPs 및 리포좀의 체내분포를 연구하는데 사용되었다. NIR 라벨링은 약물 없이 양쪽 리포좀 및 MSNP 담체의 LB에서 0.1% w/w Dylight 680- DMPE를 편입시킴으로써 수행되었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano, 9(4): 3540-3557). 종양 부위의 생물발광 이미지형성을 위하여, 마우스는 75 mg/kg D-루시페린으로 IP 주사되었다. 종양-보유 마우스용 참조 형광 이미지는 입자 주사전 포획되었다. NIR 이미지는 100 mg/kg NIR-표지된 입자로 IV 주사된 동물에서 48시간 동안 수득되었다. 동물 희생 이후, 생체외 이미지는 입자 체내분포를 정량적으로 평가하기 위해 절제된 종양 및 주요 기관으로 수득되었다. 종양 조직의 작은 부문은, OCT 시약을 이용하여, 동결-포매되었고, 종양 절편을 제조하는데 사용되었다. NIR-표지된 입자의 종양내 분포는 NIR 레이저를 이용하여 공초점 현미경검사 (SP2-1P-FCS, Leica)에 의해 연구되었다. 동일한 절편의 핵 염색은 Hoechst 33342 염료 (청색)을 이용함으로써 수행되었다. LB-MSNP로 치료된 동물에서, 종양 조직 및 주요 기관은 ICP-OES에 의해 Si 함량을 평가하는데 또한 사용되었다. 입자 체내분포는 개별 기관에 분포시키기 위해 보여질 수 있는 % 총 주사된 용량 (%ID)로서 표현되었다. 종양 또는 다른 정상 조직에서 이리노테칸 함량을 측정하기 위해, 동물은 60 mg/kg 자유 또는 캡슐화된 이리노테칸 (입자 용량, MSNPs에 대하여 120 mg/kg 및 리포좀에 대하여 150 mg/kg)으로 주사되었고, 이어서 24시간후 희생되었다. HPLC 분석은 이리노테칸 함량을 결정하기 위해 수확된 종양 조직, 간, 비장, 신장, 장, 및 혈액에서 수행되었다.
HPLC 분석.
수확된 종양 및 장기 샘플은 칭량되었고 빙상에서 균질화되었다. 0.4 mL의 산성 용액 (0.1 mol/L 인산/메탄올, 1:4 v/v)로 0.1 mL의 혈장 또는 조직 균질물의 추출 이후, 추출물은 10초 동안 2회 소용돌이되었고 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리되었다. 이리노테칸-함유 상청액은 Knauer Smartline 공압 펌프, C18 칼럼, K-2600 분광측정기, 및 Gina 데이터 취득 소프트웨어를 함유하는 시스템에서 HPLC 분석용 0.22 μm 필터를 통해 여과되었다. 1.00 mL/min의 유속으로 전달된, 이동상은 3% 트리에틸암모늄 아세테이트 수성 완충액 (pH 5.5) 및 아세토니트릴 (73:27 v/v)를 포함하였다 (Noble 등 (2006) Cancer Res., 66(5): 2801-2806). 20 마이크로리터의 이리노테칸-함유 샘플은, 4.4분 지나서 전형적으로 용출된, 254 nm에서 약물 흡수를 측정하기 위해 주사되었다. 이리노테칸 표준 곡선은 0.05-100 μg/mL의 농도 범위에 대해 생성되었다. 이리노테칸 함량은 주사된 용량의 % / 조직의 그램 (%ID/g)로서 표현되었다.
KPC-유래된 동소이식 모델을 이용하는 효능 평가.
종양-보유 B6/129 마우스는, 그룹당 8마리 동물을 포함하여, 4 그룹으로 무작위로 배정되었다. 마우스는 매 4일 40 mg/kg의 용량 (즉, 100 또는 80 mg/kg MSNP의 리포좀 용량)을 받기 위해 자유 또는 캡슐화된 이리노테칸으로 IV 주사되었다. 최대 8 주사는 28 일 관찰 기간 동안 투여되었다. 염수 주사는 음성 대조군으로서 작용하였다. 종양 부하는 매 8 일 IVIS 이미지형성으로 모니터링되었고 오퍼레이터-정의된 ROI에서 생물발광 이미지형성 강도로서 정량적으로 표현되었다. 그룹간 차이의 통계적인 분석은 t-시험 (엑셀 소프트웨어, 마이크로소프트)를 이용하여 수행되었다. 모든 생존한 마우스는 47 일째에 희생되었고, 이 시점에서 염수 및 약물-자유 그룹에서 모든 동물은 사망하였다. 종양 조직 및 주요 기관 (Gi 관, 간, 비장, 심장, 폐, 및 신장)은 생체외 생물발광 이미지 강도의 정량화를 위하여 수확되었다.
상이한 이리노테칸 제형의 독성 포텐셜의 비교.
효능 시험 실험 동안 수집된 주요 조직 (간, 신장, 비장, 위, 및 장)은 10% 포르말린에서 고정되었고, 이어서 파라핀 포매되었다. 조직 절편은 조직학적 분석용 H&E에 의해 염색되었고 또한 활성화된 (절단된) 카스파제-3의 발현의 IHC 분석에 사용되었다. 슬라이드는 경험있는 수의과 병리학자에 의해 맹검 방식으로 판독되었다. 골수 독성 평가용 제2 접근법은, 건강한 마우스내 40 mg/kg으로 자유 약물 및 담체 제형의, 2 일 떨어져서, 3 IV 투여를 사용하였다. 동물은 7 일째에 희생되었고, 흉골은 10% 포르말린에서 고정, 탈회, 파라핀 포매, 및 H&E 염색을 위하여 사용되었다. 우리는 UCLA Division of Laboratory Animal Medicine (DLAM) 진단 실험실 서비스에 의해 차별적인 백혈구 카운트용 혈액을 또한 수집하였다. 자유 약물 및 담체에 의한 차별적인 간 독성의 기전을 이해하기 위해, 60 mg/kg 이리노테칸의 용량 당량의 단일 주사를 받는 마우스는 24시간후 희생되었다. 간 조직은, KC 및 절단된 카스파제-3, 각각을 확인하기 위해 FITC-표지된 항-F4/80 항체 또는 RITC-콘주게이션된 2차 항체를 이용하여, KCs의 면역형광 염색 및 활성화된 카스파제-3의 발현을 위하여 동결-포매되었다. Hoechst 33342 염료는 동일한 절편에서 세포 핵을 국재화하는데 사용되었다. 염색된 슬라이드는 공초점 현미경하에 검사되었다 (Observer D1, Zeiss).
통계적인 분석.
그룹간 차이의 비교 분석은 양측 스튜던트t-시험 (엑셀 소프트웨어, 마이크로소프트)를 이용하여 수행되었다. 통계적으로 유의미한 차이는 p < 0.05에서 결정되었다. 값은, 도면 범례에서 언급된 바와 같이, 평균 ± SD 또는 다중 결정의 SEM으로서 표현되었다.
실시예 2
췌장 관상 선암종 (PDAC)는 5% 미만 5-년 생존율을 가진 난치병이다. 현재, PDAC용 1차 화학요법은, 류코보린, 5-FU, 옥살리플라틴, 및 이리노테칸으로도 알려진 것을 포함하는, 4-약물 레지멘의 이용 또는 젬시타빈 (GEM) (단일 제제 요법)에 의한 치료를 포함한다. 폴피리녹스.폴피리녹스가 GEM에 비교하여 증가된 PDAC 반응 속도, 즉 하기를 갖는 반면31.6% 대 9.4%, 이러한 레지멘은 훨씬 더 독성이고 따라서 양호한 기능성 상태를 가진 소수의 진전된 단계 PDAC 환자로 제한된다 (Conroy 등 (2011) N. Engl. J. Med. 364:1817-1825). 이리노테칸은 하기에서 역효과로 인해 폴피리녹스 독성에 주요 방식으로 기여한다: 골수 (예를 들면, 호중구감소증의 ~60% 발병률), 뿐만 아니라 G.I.T.(예를 들면, 환자의 ~50%에서 구토, 설사, 메스꺼움, 식욕부진) (Ueno 등 (2007) Cancer Chemother. Pharmacol. 59(4): 447-454). 이리노테칸의 독성 감소를 포함하는, 덜한 독성인 폴피리녹스 레지멘을 개발하기 위한 필요성이 충족되지 않는다.
이리노테칸을 전달하기 위한 나노입자 담체의 사용은, 하기에 의한 이리노테칸의 전달에 의해 설명된 바와 같이, 이러한 약물의 독성 감소에 잠재적인 해결책을 제공한다: 리포좀성 (Messerer 등 (2004) CliN. Cancer Res, 10(19): 6638-6649; Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277) 또는 폴리머-기반 나노캐리어 (Onishi 등 (2003) Biol. Pharmaceut.Bull. 26(1): 116-119). 전-임상 수준에서, 이들 나노캐리어 이용의 이점은 다양한 쥣과 PDAC 모델의 독성 감소, 증가된 항종양 효능, 및 향상된 생존율을 포함한다. 현재까지, 이온투과담체, A23187, (Irinophore C) 또는 양성자화 포획 제제, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)에 의해 약물 장입을 촉진시키는 리포좀 제형을 포함하는, 단지 몇몇 이리노테칸 담체는 임상시험에서 시험되고 있다. MM-398의 치료 효능은 다가 음이온성 포획제, TEA8SOS의 사용을 통해 리포좀에서 이리노테칸(iriotecan)의 캡슐화 및 포획에 의존적이다. TEA8SOS는, 지질 2중층을 빠져나갈 수 없는 친수성 성분으로 전환하는, 지질 2중층을 거쳐 확산하는 이리노테칸의 양성자화를 유발시킨다. 약물은 따라서 리포좀 2중층에 의해 수동적인 캡슐화를 10-배만큼 초과하는 농도에서 포획된다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res., 66(6): 3271-3277). MM-398은 현재 하기에 의해 제3 기 시험에 있다: Merrimack Pharmaceuticals (www.merrimackpharma.com) (하기에 의한 포스터 제시: Hoff 등,Society for Medical Oncology, 2014). 이러한 포스터는 //merrimackpharma.com/sites/default/files/documents /ESMOGI2014MM398.pdf)에서 보여질 수 있다. AACR 2012 미팅에서, Merrimack 사는 "MM-398이, 동소이식 전이성 모델을 포함하는, 췌장 암의 다중 마우스 모델에서 종양 퇴행을 유도한다”는 서술을 함유하는, 요약을 공개하였다. 피하 모델은 BxPC3, AsPC-1, Panc-1 및 MiaPaCa를 포함하였다. 췌장에서 동소이식 임플란트는 BxPC3으로 수행되었다. 상세한 데이터는 나타나지 않았다. MM-398의 IV 투여는, 전이성 종양 병소 형성에서 억제를 포함하여, 마우스내 다양한 PDAC 종양 모델에서 완전한 종양 퇴행을 유도하는 것으로 나타났다 (Drummond 등 (2006) Cancer Res. 15(66): 3271-3277). MM-398, 5-FU 및 류코보린의 조합으로 제3 기 PDAC 시험에서 417 환자의 치료는 5-FU 및 류코보린을 받는 사람 대조군에서 1.9 개월에 비교하여 증가된 전체 생존율 (6.1 개월)을 보여주었다 (Hoff 등 ESMO Poster, www.merrimackpharma.com).
이 실시예에서, 우리는, 활성 장입, 포획, 및 리포좀 등가물에 비교하여 우월한 능력을 갖는 나노캐리어에 의한 이리노테칸의 캡슐화를 달성할 수 있는, 신규한 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP) 플랫폼을 기재한다. 이들 입자의 합성은 지지된 지질 2중층 LB에 의해 입자의 다공성 내측에서 TEA8SOS의 급속 캡슐화에 의해 달성되었다. 이리노테칸 용액에서 이들 입자의 후속적인 인큐베이션은 이리노테칸의 활성 장입을 허용하였고, 이는 2중층을 거쳐 확산하고 그 다음 TEA8SOS에 의해 양성자화된다. 비교 분석은 이리노테칸-장입된 LB-MSNP 대 MM-398의 인하우스 합성된 리포좀 등가물 사이 수행되었다. 상기 분석은 MSNP 담체에 의한 우월한 장입 용량, 장입 효능, 및 방출 프로파일을 입증한다. 우리는 또한 인하우스 MM-398 리포좀에 비교하여 유사한 시험관내 유효성 및 생체내 독성 감소를 보여주었다. 우리는 현재 피하 및 동소이식 인간 PDAC 종양 모델에서 이들 담체를 비교하는 동물 효능 연구를 수행하고 있다.
우리는 이리노테칸의 LB-MSNP 매개된 나노-캡슐화 및 표적화된 전달이, 골수 및 GIT에서 이리노테칸의 감소된 독성을 포함하여, 독성 감소에 의해 폴피리녹스의 임상 이용을 개선할 것이라고 믿는다. 상기 발견은 장입 용량 및 충분한 암 부위 약물 방출 때문에 리포좀 담체를 능가할 수 있는 IV 주사가능한, 효율적인, 생체적합성, 및 상업적으로 경쟁적 이리노테칸 제형을 허용한다. 특정 구현예에서 본 발명은 또한 암 치료 뿐만 아니라 다른 질환의 치료에 사용될 수 있는 다른 약염기성 분자 (pKa >7.0) 전달용 효과적인 설계 원리로서 이용될 수 있다.
다음과 같은 설명은 MM-398에 유사한 인하우스-합성된 리포좀 제형과 LB-MSNP 담체의 비교 분석 뿐만 아니라 이리노테칸 장입용 담체 설계의 특정 구현예를 설명한다.
추가의 활성 장입을 달성하기 위해 포획제를 또한 포함하는 LB-MSNP에 의한 이리노테칸 캡슐화
LB-MSNP에 의한 이리노테칸의 효과적인 장입을 제공하기 위해, 우리는 포획제, TEA8SOS의 제1 캡슐화에 의해 우리의 최근에 발견된 약물 장입용 생물막 절차를 적응시켰고, 이는 그 다음 기공을 진입하기 위해 지지된 LB를 거쳐 약물 확산을 촉진시킴으로써 이리노테칸 도입 및 유지를 책임진다. 이것은, 평형이 도달되는 때까지 LB를 거쳐 추가 확산용 구배를 창출하는, 밀봉된 MSNP 기공에서 이리노테칸의 안정적인 포획을 유발시킨다. 이것은 실제로 다공성 내측의 큰 표면적 및 포획제 매개된 약물 유지의 지원으로 고농도에서 약물이 축적하는 것을 허용한다. 특정 구현예에서 합성 절차는 4 파트, 즉, MSNP 코어 합성, TEA8SOS 장입된 LB-MSNP의 합성, TEA8SOS의 작용을 통해 입자 속으로 이리노테칸의 활성 장입, 및 마지막으로 담체의 정제로 구성된다.
화학물질:
테트라에틸 오르토시케이트 (TEOS, ≥99.0%, 로트 #BCBK9540V), 트리에탄올아민 (≥99.0%, 로트 #BCBH9036V), 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 용액 (CTAC, 물내 25 wt.%, 로트 #STBC7888V), 트리에틸아민 (TEA, ≥99.0%, 로트 #SHBD9006V)는 Sigma-Aldrich, USA로부터 구매되었다. 디스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC, >99.0% 로트 #180PC-147), 메톡시폴리(에틸렌)글리콜 (PEG2000)-유도된 디스테아로일포스파티딜에탄올아민 (DSPE-PEG2000, >99.0%, 로트 #180PEG2PE-122), 및 콜레스테롤 (Chol, >98.0%, 로트 #CH-94)는 Avanti Polar Lipids, USA로부터 구매되었다. 수크로오스 옥타설페이트 나트륨 염 (Lot #1-TMH-175-4)는 Toronto Research Chemicals, Inc, Canada로부터 구매되었다. 이리노테칸 하이드로클로라이드 3수화물 (IRIN, ≥99.0%, 로트 #RCN-104)는 LC Laboratories, USA 구매되었다. 모든 화학물질은 추가 정제없이 직접적으로 사용되었다.
MSNP의 졸-겔 합성 및 템플레이트 제거
MSNP 코어는 우리의 졸/겔 절차의 소수의 변형에 의해 합성되었다. 반응은 500 mL 원뿔형 플라스크에서 수행되었다. 50 mL CTAC (25%)는, 350 rpm으로 15분 동안 85 ℃에서 교반하면서, 150 mL H2O와 혼합되었다. 이에 이어서 85 ℃에서 30분 동안 8 mL 10% 트리에탄올아민이 첨가되었다. 실리카 전구체, TEOS (7.5 mL)는 연동 펌프에 의해 제어된 1 mL/min의 비율로 혼합물에 적가되었다. ~60 nm의 1차 크기를 가진 입자의 합성을 달성하기 위해, 용액은 350 rpm으로 85 ℃에서 20분 동안 교반되었다. 계면활성제를 제거하기 위해, 입자는 실온에서 24 시간 동안 멘톨 및 HCl (500:19, v/v)로 세정되었다. 입자는 10,000 rpm으로 60분 동안 원심분리되었고 멘톨에서 3회 세정되었다. 고 품질 MSNP 코어를 수득하기 위해, 입자 응집 및 오염을 모니터링하기 위한 DLS 측정, 입자 형태학 시각화용 TEM, 그리고 세제가 철저하게 제거되었는지를 체크하기 위한 적외선 분광법 & 세포독성 검정을 포함하는, 빈번한 품질 체크는 수행되었다.
포획제로서 TEA 8 SOS를 이용하는 이리노테칸 장입된 LB-MSNP의 제조
LB-MSNP에 의한 이리노테칸 장입을 위하여 최적의 절차를 확립하기 위해, 우리는, 이리노테칸 용액에서 입자의 인큐베이팅 전, (이전에 개시된) 생물막 절차를 이용하여, 입자에서 양성자화 제제를 포획하였던 신규한 접근법을 개발하였다. 이것은 기공에서 후속적인 양성자화를 가진 LB 막을 통해 친유성 이리노테칸이 확산하게 하여, 농도 구배에 대해 약물 포획을 초래한다 (참조 도 5). 장입 용량 및 약물 방출 행동을 고려하여, 우리는 체계적으로 다양한 장입 시간, 포획제 농도, LB-MSNP 농도, 이리노테칸 농도, 및 이리노테칸/LB-MSNP 비에 의해 이리노테칸 장입 절차를 최적화하였다. 이것은 우리가 85% (이리노테칸/MSNP, w/w)의 이리노테칸 장입 용량을 달성하게 하였고, 이는 포획 시약의 부재하에 약물 장입 용량을 ~4-배 초과한다. 이것은 MM-398의 병렬로 합성된 리포좀 버전의 장입 용량 2배가 되었다. 추가 논의를 위하여, 우리는 이리노테칸-장입된 LB-MSNP를 “Ir-LB-MSNP(+SOS)”로서 지정하였다.
TEA 8 SOS 장입된 LB-MSNP의 합성
상업적으로 입수가능한 수크로오스 옥타설페이트 나트륨 염으로부터 포획제 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA 8 SOS)의 제조.
우리는 TEA8SOS를 그것의 전구체, 수크로오스 옥타설페이트의 나트륨 염으로부터 합성하기 위해 이온교환 반응을 사용하였다. 간단히, 500 mg의 전구체 염은 1 mL D.I. 수에 용해되어, 500 mg/mL의 수용액을 수득하였다. 상기 용액은 양이온성 Dowex 50WX8 수지 이온교환 칼럼 (15 mm 직경 및 8 cm 길이, Sigma로부터 구매됨, 로트 # MKBH8810V)에 통과되었다. D.I. 수로 칼럼의 용출 이후, 수크로오스 나트륨은 공정에서 양성자화된 옥타설페이트로 전환된다. 수집된 수크로오스 옥타설폰산은 5.5 내지 6.0의 최종 pH까지 트리메틸아민 (TEA)로 즉시 적정되어, TEA8SOS의 형성을 초래하였다. TEA8SOS 농도는, TEA의 양의 적정에 기반하여, ~80 mM로 조정되었다. 다가 음이온성 TEA8SOS는 사용전 4 ℃ 냉장고에서 저장되었다.
TEA 8 SOS 장입된 LB-MSNP의 제조.
우리는, 이리노테칸 장입에 진행하기 전, TEA8SOS를 캡슐화하기 위해 우리의 이전에 개시된 LB 코팅용 생물막 기술 (그 전문이 참고로 편입되는, PCT/US2014/020857 (UCLA 개시내용 2013-534-2))를 적응하였다. 간단히, 100 mg 비어있는 MSNPs는, 파워 출력 32.5 W에서, 15/15 초 온/오프 작동 사이클로 30 분 동안 탐침 초음파처리를 이용하여, 4 mL TEA8SOS 수용액 (40 mM)에 침지되었다. 현탁액은, 둥근바닥 플라스크 (6 cm 직경)의 최하부에서 ~30 cm2 표면적을 점유하였던, 코팅된 지질 생물막의 최상부에서 즉시 첨가되었다. (누출 없이 안정적인 코팅을 목적으로) 지질 성분의 최적의 혼합을 달성하기 위한 실험과정 이후, 우리는 3:2:0.15의 몰비에서 228 mg DSPC/Chol/DSPE-PEG를 함유하는 혼합물을 결정하였다. 상기 혼합물은 10 mg/mL로 클로로포름에 용해되었다. 생물막 형성은, 실온에서 진공 시스템에 연결된 회전식 증발기를 이용하여, ~1 시간 동안 용매 증발에 의해 달성되었다. 생물막에 4 mL 입자 현탁액의 첨가 이후, 탐침 초음파처리는, 파워 출력 32.5 W에서, 15/15 초 온/오프 작동 사이클로 30 분 동안 사용되었다. 초음파처리된 현탁액이 코팅된 입자, 리포좀, 및 자유 TEA8SOS를 함유하기 때문에, TEA8SOS LB-MSNP는 크로마토그래피 절차를 이용하여 정제되었고, 여기에서 Sepharose CL-4B 칼럼 (15 mm 직경 및 15 cm 길이, Sigma로부터 구매됨, 로트 #MKBP0885V)는 HEPES-완충액 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)로 용출되었다.
활성 이리노테칸 장입을 위한 TEA 8 SOS-장입된 LB-MSNP의 용도.
이리노테칸은 10 mg/mL의 농도에서 HEPES 완충된 용액 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)에 용해되었다. 약물 용액은 1:1 (w/w)의 이리노테칸/입자 비에서 TEA8SOS 장입된 LB-MSNP 현탁액과 혼합되었고, 수조에서 60 ℃에 0.5시간 동안 인큐베이션되었다. 반응은 컨테이너를 빙수에 10분 동안 배치시킴으로써 종결되었다.
입자 정제
Ir-LB-MSNP(+SOS)는 15,000 rpm으로 10분 동안 입자 원심분리, 이어서 염수 또는 5% 덱스트로오스에서 재현탁에 의해 자유 리포좀 및 자유 이리노테칸으로부터 정제되었다. 세정 절차는 3회 반복되었다.
Ir-LB-MSNP (+SOS) 입자를 이용하는, 비교 연구용 대조군 제형의 제조
Ir-LB-MSNP(+SOS) 입자의 특유의 특성을 반영하는 비교 분석을 수행하기 위해, 우리는 포획제 없이 LB-MSNP를 합성하여, LB에 의해 침지된 이리노테칸이 밀봉 제거되도록 하였다. 우리는, 포획제로 제조된, MM-398의 리포좀 등가물, 뿐만 아니라, 포획제 없이, 이리노테칸을 캡슐화하는 대조군 리포좀을 또한 제조하였다.
포획제를 함유하지 않는 이리노테칸 LB-MSNP의 합성:
비어있는 MSNPs (40 mg)은 5 분 동안 초음파처리로 4 mL 이리노테칸 용액 (물내, 10 mg/mL)에 배치되었고, 그 다음 또 다른 4 시간 동안 실온에서 교반되었다. 이리노테칸-침지된 MSNP 현탁액은 건조 지질 막 (3:2:0.15의 몰비에서 DSPC/콜레스테롤/PE-PEG2000을 함유하는 91 mg의 지질 혼합물)에 첨가되었고, 파워 출력 32.5 W에서 15/15 초 온/오프 작동 사이클을 이용하여, 30 분 동안 탐침 초음파처리되었다. 입자는 상기에 기재된 바와 같이 15,000 rpm으로 10분 동안 원심분리, 이어서 입자 세정 및 재현탁을 이용하여 자유 리포좀 및 자유 약물로부터 정제되었다. 우리는 포획제 없는 입자를 “Ir-LB-MSNP (-SOS)”로서 지칭한다.
상업적으로 개발된 리포좀 제제, MM-398의 리포좀 등가물의 인하우스 합성.
합성은 하기에 의해 MM-398용 공개된 절차에 따라 수행되었다: Drummond 등 (Cancer Res. 2006, 66, 3271-3277). 간단히, 지질 (212 mg 지질, 3:2:0.015의 몰비에서 DSPC/Chol/DSPE-PEG)의 혼합물은 60-65 ℃에서 0.4 mL 에탄올에 용해되었다. 4 mL TEA8SOS 용액 (80 mM)은 동일한 온도에서 지질 에탄올 용액과 혼합되었고, 이어서 수조에서 2 분 동안 초음파처리되었다. 지질 현탁액은 60-65 ℃에서 0.1 μm 기공 크기를 가진 폴리카보네이트 막을 통해 15회 압출되었다. 비-포획된 TEA8SOS는, HEPES-완충액 (5 mM HEPES, 5% 덱스트로오스, pH 6.5)로 용출된, Sepharose CL-4B 칼럼 위에 크로마토그래피에 의해 제거되었다. 이리노테칸 용액 (pH 6.5에서 HEPES-완충액, 5 mM HEPES, 및 5% 덱스트로오스를 함유하는 10 mg/mL 수용액)은 TEA8SOS 사전-장입된 리포좀 현탁액 (이리노테칸:지질 = 1:2.1 w/w)와 혼합되었고, 그 다음 수조에서 65 ℃에 0.5시간 동안 인큐베이션되었다. 반응은 혼합물을 빙수에서 10분 동안 배치시킴으로써 종결되었다. 이리노테칸-장입된 리포좀은 그 다음, HEPES-완충 식염수 (5 mmol/L HEPES, 145 mmol/L NaCl, pH 6.5)에 의해 용출된, Sephadex G-25 칼럼 (15 mm 직경 및 15 cm 길이, Sigma, 로트 #019K1077) 위에서 자유 이리노테칸을 제거함으로써 정제되었다. 우리는 인하우스 합성된 리포좀 제형을 “Ir-Lipo(+SOS)”로서 지칭할 것이다.
포획제의 사용 없이, 이리노테칸-캡슐화된 리포좀의 합성.
우리는 또한 수동적인 캡슐화 접근법을 이용하는 리포좀을 합성하였다. 간단히, 지질 (53 mg 지질, 3:2:0.015의 몰비에서 DSPC/Chol/DSPE-PEG)의 혼합물은 60 ℃ 내지 65 ℃에서 0.1 mL 에탄올에 용해되었다. 1 mL 이리노테칸 용액 (물내, 10 mg/mL)는 60 ℃ 내지 65 ℃에서 지질 에탄올 용액과 혼합되었고, 이어서 2 분 동안 수조 초음파처리되었다. 지질 현탁액은 60 ℃ 내지 65 ℃에서 0.1 um 기공 크기를 가진 폴리카보네이트 막을 통해 15회 압출되었다. 약물-부하된 리포좀은, HEPES-완충 식염수 (5 mmol/L HEPES, 145 mmol/L NaCl, pH 6.5)로 용출된, Sephadex G-25 칼럼을 이용하여 자유 이리노테칸을 제거함으로써 정제되었다. 우리는 상기 리포좀 제제를 “Ir-Lipo(-SOS)”로서 지칭한다.
대조군 이리노테칸 제형과 Ir-LB-MSNP(+SOS)의 비교 분석.
Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 대조군 제형의 물리화학 특성규명.
표 3는 대조군 제형에 비교된 Ir-LB-MSNP(+SOS)의 유체역학적 크기, 크기 분포 및 표면 전하를 보여준다. Ir-LB-MSNP(+SOS)는 ~0.1의 다분산도 지수 (PDI)를 가진 110~130 nm의 유체역학적 크기를 갖는다. 이러한 입자는 순수한 물에서 하기를 보여주었다: 음성 제타 전위 값, 즉-24.7 mV.제타 전위는 PBS에서 -2.95 mV, 그리고 완전한 DMEM 배양 배지에서 -3.27 mV로 변화되었다. 이들 물리화학 파라미터는 상이한 용액에서 대조군 제형, 예컨대 Ir-Lipo(-SOS), Ir-Lipo(+SOS), 및 Ir-LB-MSNP(-SOS)에 유사하였다.
표 4는 포획제의 사용과 무관하게 LB-MSNP의 장입 용량 및 장입 효능을 보여준다. 장입 용량 = (총 이리노테칸 - 상청액내 이리노테칸) / (MSNP 또는 리포좀의 질량) x 100%. 장입 효능은 [(총 이리노테칸 - 상청액내 이리노테칸) / 총 이리노테칸] x 100%로서 정의된다. 리포좀에 대하여, 장입 용량은 80 mM 포획 시약의 부재 또는 존재하에 4.12% w/w 및 45.2% w/w이었다. 리포좀 플랫폼에서 이리노테칸의 장입 효능은 포획제의 작용의 결과로서 8.71% 내지 95.5% 증가하였다. 이것은 하기와 일치한다: 공개된 데이터 (Cancer Res. 2006, 66, 3271) 합성된 MM-398 리포좀에 대하여.가장 안정적인 입자 제형을 수득하기 위한 실험과정 이후, 우리는 40 mM의 포획제를 사용하여 LB-MSNP를 합성하였다. 이리노테칸으로 인큐베이션 이후, 우리는 포획 시약 없이 LB-MSNP에 대하여 22.5% w/w의 장입 용량에 비교하여 장입 용량 83.5% w/w를 가진 Ir-LB-MSNP(+SOS)를 달성하였다. Ir-LB-MSNP가 더 적은 포획제 (40 mM)을 사용한 반면, 80 mM 포획제를 함유하는 인하우스 MM-398 리포좀에 비교된 경우 2x 장입 용량을 실제로 초래하였다.
우리는 또한 Ir-LB-MSNP(+SOS)의 형태학을 시각화하기 위해 cryoEM 분석을 수행하였다. 이것은 지질 2중층에 의한 MSNP 표면의 균일한 코팅을 확인하였다 (도 6A, 상부 패널). 고 배율 cryoEM 이미지는 2중층 ~7.1 nm 두께에 의한 완전한 표면 코팅으로 ~80 nm의 1차 입자 크기를 실증하였다. 줌인 이미지가 온전한 지질 코팅물의 존재를 확인하였고, 한편 또한 기공에서 고밀도 물질의 존재를 실증하였고; 상기 물질은 이리노테칸-TEA8SOS 복합체를 나타낸다. 우리는 입자 표면에 단단히 부착되지 않았던 약간 더 큰 리포좀에 의해 캡슐화된 예비 입자를 관측하였지만, 그러나, LB 층은 여전히 온전하다. Ir-Lipo(+SOS)의 이미지는 단일층 2중층 ~6.5 nm 두께를 가진 ~75 nm의 리포좀 구조를 보여주었다 (도 6A, 하부 패널). 고 배율 cryoEM은 리포좀 내부 고밀도 IRIN-TEA8SOS 침전물을 보기 위해 충분한 해상도를 제공한다 (적색 화살표).
각각의 제형의 안정성을 평가하기 위해, 우리는 혈류에서 이리노테칸 안정성을 추정하기 위한 의도로 37 ℃에 PBS (pH=7.4)에서 약물 안정성을 비교하였다 (도 6B). 이것은 Ir-LB-MSNP(+SOS)가 PBS에서 매우 안정적이어서, 24 시간 동안 <5% 방출량을 초래한다는 것을 실증하였다. PBS에서 비교할만한 안정성은 인하우스 MM-398 리포좀에서 발견되었다.
상승된 글루코스 흡수, 당분해, 락트산 생산 (Warburg 효과), 비정상 혈액 관류, 및 치밀한 기질의 존재 때문에, PDAC의 pH 값은 산성이다 (Wojtkowiak, 등 (2012) Cancer Res. 72(16): 3938-3947;; Estrella 등 (2013) Cancer Res. 73(5): 1524-1535). 따라서, 우리는 또한 산성 pH 조건에서 약물 방출 프로파일을 살폈다. 종양 pH는 고전적으로 ∼6.5로 떨어지지만, ∼5.5만큼 낮을 수 있다 (Jahde 등 (1992) Cancer Res. 52:6209-6215). pH는 입자가 PDAC 세포에 의해 흡수된 경우 리소좀 구획에서 <5으로 추가로 떨어질 수 있다 (Mindell 등 (2012) Annu Rev Physiol.74:69-86). 따라서, 우리는 파고리소좀 자극액 (PSF, pH=4.5)에서 약물 방출 실험을 수행하였다. PSF에서, 급속 이리노테칸 방출 (즉4 시간 동안 20%)는 LB-MSNP에서 보여질 수 있다. 그러나, 인하우스 MM-398 제형에서, 우리는 PSF에서 상당히 더 느린 약물 방출 프로파일, 즉 24 시간 지나서 단지 ~4% 약물 방출을 알아내었다.
배양된 PDAC 세포에서 Ir-LB-MSNP(+SOS)의 세포 흡수 및 사멸 효율
텍사스 레드-표지된 LB-MSNP 또는 리포좀을 사용하는, 공초점 현미경검사는 PANC-1 세포내 주변-핵 분포에서 풍부한 세포 흡수를 실증하였다 (도 7). 우리는 또한 증분적 이리노테칸 농도로 치료 동안 PANC-1 및 BxPC3 세포에서 Ir-LB-MSNP(+SOS)의 효과를 결정하기 위해 MTS 세포독성 검정을 이용하였다. 우리는 자유 약물 및 Ir-Lipo(+SOS) 대조군과 이들 입자의 효과를 비교하였다. 자유 약물이 24 시간 동안 사멸에서 더 효과적인 반면, 양쪽 Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 리포좀은 양쪽 세포 유형에서 72 시간에 비교할만한 사멸을 보여주었다 (도 8). 비어있는 나노입자는 48 시간 동안 최대 500 μg/mL 농도에서 독성을 유도하지 않는다.
마우스에서 Ir-LB-MSNP(+SOS) 대 Ir-Lipo(+SOS)의 생체내 독물학적 효과의 비교 분석.
최대 내성 용량 (MTD).
우리는 다양한 이리노테칸 제형의 MTD 결정에 의해 생체내 독성 연구를 시작하였다. 이것은 독성학 및 약리학 분지로부터 NCI 프로토콜 (dtp.nci.nih.gov/ branches/tpb/default.htm)을 이용하여 달성되었다. 2 건강한 숫컷 BALB/c 마우스는 50 mg/kg (C1 용량) 자유 또는 캡슐화된 약물로 IV 주사되었다. 우리는 그 다음 두 동물 (n=2)이 24 시간 이내 사망한 Cn 용량을 결정하기 위해 1.8의 용량 단계적 확대 인자를 사용하였다. 자유 또는 캡슐화된 이리노테칸으로 치료후.제2 라운드의 용량- 탐구는 Cn-1 용량으로 시작하였고, MTD를 찾기 위해 1.15 단계적 확대 인자 (n=2)를 이용하였고, 여기에서 사망률 또는 심각한 이환율은 없었다. MTD는 5 마우스 주사에 의해 추가로 입증되었고, 이들을 15 일 동안 따라서 이환율, 사망률 또는 >20% 체중 감소가 없었음을 확인하였다. 우리의 결과는 Ir-LB-MSNP(+SOS), Ir-Lipo(+SOS), 및 자유 이리노테칸의 MTD 용량 값이 295 mg/kg, 350 mg/kg, 및 60 mg/kg, 각각이었다는 것을 실증하였다. 자유 약물과 비교하여, 나노 제형은 대략 5-배 더 높은 MTD 용량을 보여주었고, 양쪽 LB-MSNP 및 리포좀 제형의 사용시 독성 감소의 능력을 명확히 시사하였다.
조직학적 분석.
별개의 실험에서, 건강한 마우스는 60 mg/kg IV의 약물 용량으로 Ir-LB-MSNP(+SOS), Ir-Lipo(+SOS), 및 자유 이리노테칸의 단일 IV 투여를 받았다. 치료후 24 시간에, 마우스는 장기 수확을 위하여 희생되었다. 흉골, 위장 (GI, 위 및 장) 관, 가슴샘, 간, 신장, 비장, 및 폐의 적절한 크기 절편은 10% 포르말린에서 고정되었고 그 다음 파라핀 속에 포매되었다. 4 μm 두께의 조직 절편은 유리 슬라이드상에 실장되었다. 절편은 헤마톡실린-에오신 (H&E)으로 염색되었고 광학 현미경검사로 검사되었다. 슬라이드는 경험있는 수의과 병리학자에 의해 판독되었다. 결과는 자유 IRIN보다 Ir-LB-MSNP(+SOS) 및 Ir-Lipo(+SOS)에 대하여 훨씬 감소된 골수 독성을 보여주었다 (도 9). 우리는 적혈구(erithroid), 거대심장세포 또는 백혈구 전구체에서 차별적인 독성이 있는지를 평가하기 위해 면역조직화학을 이용하여, 흉골 골수에서 보다 상세한 연구를 수행중이다. 자유 이리노테칸 및 리포좀 제형은, 사구체 팽윤으로서 명시된, 신독성을 초래하였다. 상당한 신장 비정상은 Ir-LB-MSNP(+SOS) 입자에 의해 치료된 마우스에서 발견되지 않았다 (도 10).
결론.
이 프로젝트의 목표는 효과적인 PDAC 사멸 및 독성 감소용 IV 주사가능 이리노테칸 나노 전달 플랫폼을 개발하는 것이다. 높은 약물 장입 용량, 나노캐리어 생체적합성(biocompatability), 및 효율적인 약물 캡슐화의 이용을 통해, LB-MSNP 플랫폼은 PDAC 세포 및 급성 동물 독성 연구에서 유망한 결과를 보여주었다.
실시예 3
iRGD-매개된 통과세포외배출은 쥣과 및 인간 췌장 암에서 실리카솜 나노캐리어의 이리노테칸 전달 및 효능을 향상시킨다.
비록 췌장 관상 선암종 (PDAC)이 거의 균일하게 치명적이어도, 일부 개선된 전체 생존율은 이리노테칸 또는 파클리탁셀을 전달하는 나노캐리어의 도입으로 달성되어 왔다. 우리는, 지질 2중층으로 코팅된 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNPs)로 구성되는 이리노테칸 실리카솜 담체를 이용하여, 동물 동소이식 모델에서 이들 결과를 추가로 개선하였다. 실리카솜 담체는 또한 이리노테칸에 리포좀 담체에 비교하여 주요 독성 감소를 제공한다. 비록 나노캐리어가 종양 접근을 위하여 비정상 누출성 맥관구조 (향상된 투과도 및 유지 효과라고로 알려짐)에 주요하게 의존한다는 것이 일반적으로 추정되어도, 뉴로필린-1 (NRP-1) 수용체에 의해 조절되는 통과세포외배출 수송 경로는 최근에 보고되었다. 이러한 특유의 수송 경로는, 종양-관련된 인테그린에 결합하는, 순환성 iRGD 펩타이드에 의해 유발될 수 있고, 상기 펩타이드는 NRP-1에 후속 결합을 위하여 가공된다. iRGD의 공-투여는 강력한 Kras 동소이식 PDAC 모델에서 이리노테칸-실리카솜의 흡수를 3-4 배 향상시켜, 생존 이점 및 전이에서 상당한 감소를 초래하였다. 매립된 금-나노입자 코어를 가진 실리카솜은 생체내 통과세포외배출 경로의 초미세구조 시야에 사용되어, iRGD 공-투여가 혈관 내강부터 암 세포내 핵주변 부위까지 전자 치밀 담체를 수송하는 소포 수송 경로를 유도한다는 것을 입증하였다. 실리카솜 흡수의 iRGD-매개된 향상은, 종양 혈관에서 NRP-1 발현의 수준에 비례한, 환자-유래된 이종이식물에서 또한 관측되었다. 이들 결과는, 이리노테칸-실리카솜 담체를 이용하여, PDAC 요법에 잠재적인 개인화된 접근법에 대한 iRGD의 유용성을 입증한다.
이 실시예에서 우리는 강력한 췌장 관상 선암종 (PDAC) 동물 모델에서 리포좀을 능가하는 이리노테칸 전달용 지질 2중층 코팅된 메조다공성 실리카 나노캐리어 (실리카솜)의 개발을 기재한다. 우리는 동소이식 종양 부위에서 실리카솜 흡수가, 뉴로필린-1 수용체의 결찰을 통해 신규한 통과세포외배출 경로를 유발시키는, iRGD 펩타이드의 공-투여에 의해 3-4 배 향상될 수 있다는 것을 입증한다. iRGD는 또한 동일한 혈관 수용체를 발현시키는 환자-유래된 이종이식물에서 실리카솜 흡수를 향상시켰다. 우리는, 종양 부위에서 나노캐리어 흡수를 설명하는데 통상적으로 사용된 향상된 투과도 및 유지 효과를 보완할 수 있는, 소포-기반 통과세포외배출 경로의 초미세구조 증거를 제공한다. 통과세포외배출 경로는 PDAC 환자에서 이리노테칸-실리카솜 담체의 이점 향상의 가능성을 나타낸다.
도입
우리는, 약물 캡슐화용 지지된 지질 2중층 (LB)를 이용하는 고용량 PDAC 화학요법을 제공하도록 적응되고 있는, 다작용성 메조다공성 실리카 나노입자 (MSNP) 플랫폼을 개발하였다 (참조, 예를 들면, 실시예 1). 이러한 담체는, 비-지지된 LB를 함유하는, 형태적으로 유사한 리포좀 담체와 식별하기 위해 “실리카솜”으로서 또한 지정되고 있다. 이리노테칸용 인하우스 리포좀 담체를 포함하는, 리포좀에 비교하여, 본 명세서에서 기재된 실리카솜은 상기 약물에 대하여 상당히 더 높은 장입 용량, (지지된 LB의 결과로서) 개선된 순환 안정성, 및 감소된 약물 누출을 나타내는 것으로 알려졌다. 이들 피쳐는 엄격한 동소이식 Kras PDAC 모델에서 실리카솜 대 리포좀의 치료 효능 및 개선된 약동학을 허용한다 (참조, 예를 들면, 실시예 1). 또한, 실리카솜은 리포좀 등가물 (Id.)에 비교하여 위장관, 간, 및 골수에서 주요 독성 감소를 또한 제공한다. 이리노테칸으로 성공 이외, 실리카솜 플랫폼은 또한 파클리탁셀 및 젬시타빈의 상승작용 전달에 적합하였고, 동소이식 PDAC 모델에서 아브락산® 과 자유 젬시타빈의 조합을 상당히 (>10-배) 능가하게 하였다. 실리카솜 담체로 주목할만한, 상기 결과는, 표적 리간드의 사용에 의지할 필요 없이, “수동적인” 전달에 의해 달성될 수 있다.
이러한 배경이 주어지면, 우리는 이리노테칸-장입된 실리카솜 (Ir-실리카솜)에 의한 PDAC 치료의 효능이 통과세포외배출에 의해 개선될 수 있는지, 그리고 이것이 담체에 iRGD 콘주게이션 또는 그것의 공-투여에 의해 최상으로 달성가능한지 관심있었다. 이 실시예에서, 우리는 Kras 동소이식 모델에서 담체 흡수 및 치료 효능을 향상시키기 위해 자유 iRGD 펩타이드의 공-투여 이용의 실행성을 입증한다. 또한, 우리는 혈관 내강부터 암 세포내 핵주변 부위까지 Au-표지된 실리카솜의 수송을 허용하는 그룹화된 소포 시스템의 초미세구조 증거를 제공한다. 우리는 또한 종양 맥관구조에서 NRP-1 발현의 상대 존재비가 iRGD 공-투여의 사용을 통해 실리카솜(slicasomes)에 반응 규모를 결정하는 환자-유래된 PDAC 이종이식물을 입증한다.
결과
PDAC 종양에서 약물 장입 및 가시화용 실리카솜의 합성 및 특성규명
우리는, 양성자화 제제에 의존하는 원격 장입 기술을 이용하여, LB-코팅된 MSNP (실리카솜이라고로 알려짐)에 의해 높은 이리노테칸 장입을 실증하였다 (참조, 예를 들면, 도21A, 최상부 패널, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 이리노테칸은 MSNP 내측 패키징 공간 속으로 LB를 거쳐 확산할 수 있는 약염기성 및 양친매성 분자이고, 여기에서 사전 포획된 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS)에 의한 양성자 방출은, LB를 거쳐 역-확산할 수 없는, 친수성 유도체로 약물을 전환시킨다 (도21A, 최상부 패널). 원격 장입 절차는 50 wt%의 약물 장입 용량 (w/w, 이리노테칸/MSNP) (Id.)를 달성하였던 Ir-실리카솜 배치를 합성하는데 사용되었다. 실리카솜 표면상에 iRGD 펩타이드의 콘주게이션이 PDAC 종양 부위에 대한 담체 체내분포에 영향을 미칠 수 있는지를 결정하기 위해, 우리는 또한 LB의 DSPE-PEG2000 성분이 펩타이드에서 시스테인 잔기에 콘주게이션을 위하여 사용된 입자 배치를 합성하였다. 이것은, 하기에 티올-말레이미드 커플링을 허용하는, DSPE-PEG2000의 DSPE-PEG2000-말레이미드 (참조 방법 부문)으로의 치환에 의해 달성되었다: 시스테인-변형된 펩타이드, Cys-c(CRGDKGPDC) (서열번호:11)(도21A, 박스 2). 콘주게이션 반응의 성공을 확인하기 위해, 우리는 또한, Ruoslahti 등에 의해 개발된, 펩타이드 (FAM-iRGD)의 플루오레신-표지된 버전을 사용하여, 광범위한 세정후 콘주게이션된 실리카솜의 형광 분광법을 수행하였다 (도27, 패널 A) (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520). 이것은 LB와 형광 펩타이드의 안정적인 회합을 확인하였다. iRGD 콘주게이션의 밀도는 담체 흡수에서 간섭 및 콜로이드성 불안정성을 예방하기 위해 (모든 LB 성분의) ~3 mol%로 제한되었다. 온전한 실리카솜-iRGD 담체의 흡수는 KPC 세포에서 유세포측정 및 공초점 현미경검사에 의해 확인되었다 (도.27, 패널 B 및 C).
PDAC 종양에서 통과세포외배출 공정의 TEM 가시화를 수행하기 위해, 우리는 또한 ~10 nm 전자 치밀 Au-나노입자를 포함하는 코어-쉘 MSNPs의 배치를 합성하였다 (도1A, 박스 3). 노출된 입자에 유사하게, 코어/쉘 입자는, CryoEM 에 의해 실증된 바와 같이, LB로 효과적으로 코팅될 수 있다 (도21A, 박스 3). 이 전달에서 사용된 모든 담체에 대하여 상세한 합성 및 특성규명 절차는 지지 정보의 방법 부문에서 논의된다. 실리카솜의 주요 물리화학 특징은 표 5에서 아래 요약된다.
동소이식 PDAC 모델에서 실리카솜 체내분포에 관한 콘주게이션된 대 비-콘주게이션된 iRGD 펩타이드의 효과의 비교
유전자도입 KrasLSL-G12D/+; Trp53LSL-R172H/+; Pdx-1-Cre 동물로부터 자발적인 PDAC 종양에서 유래된, 루시퍼라아제-발현 KPC 세포는 면역적격 B6/129 마우스 내 췌장 꼬리에서 동소이식으로 이식되었다 (참조, 예를 들면, 도21B, 좌 패널, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715; Tseng 등 (2010) CliN. Cancer Res. 16(14): 3684-3695). 이러한 엄격한 PDAC 종양 모델은 종양유전자 발현, 성장 특징, 전이, 조직학적 피쳐 및 형성이상 기질의 발생에 대하여 인간 PDAC를 모방한다. 도21B는 동물 부검 및 IVIS 이미지형성 동안 보여진 바와 같이 종양 성장 특징 및 전이의 세부사항을 요약한다 (도21B) (Tseng 등 (2010) CliN. Cancer Res. 16(14): 3684-3695; Torres 등 (2013) PloS One 8:e80580). 동소이식 종양 부위에 대한 실리카솜 체내분포는 하기된 50 mg/kg 근적외선 (NIR) 표지된 (DyLight 680) 입자의 1회용 정맥내 (IV) 주사에 의해 평가되었다: 어느 한쪽 비-콘주게이션 (즉,“IRGD 자유” 상태) 또는 펩타이드-콘주게이션 (“실리카솜-iRGD”) (도22A). 동물의 제3 그룹은 8 μmol/kg 자유 펩타이드 플러스 콘주게이션되지 않은 입자 (“실리카솜 + iRGD”)의 공-투여를 받았다. 초기 주사 및 동물 희생 24 시간후 수행된, 외식편된 기관의 IVIS 이미지형성은 실리카솜-iRGD 또는 실리카솜 단독 그룹에서 신호전달 강도에 비교하여 “실리카솜 + iRGD” 그룹용 종양 부위에 NIR 신호전달 강도에서 두드러진 증가를 실증하였다 (도22A). 이미지형성 강도는 IVIS Lumina Living Image 소프트웨어에 의해 정량화되었다. 생체내 효과의 그 부족에 대조적으로, 펩타이드-콘주게이션된 실리카솜은 KPC 세포에서 담체 흡수를 향상시키는 것으로 보여질 수 있다 (도 27, 패널 B 및 C). 우리는 막관통 흡수를 개시하기 위한 충분한 NRP-1 수용체 밀도로서 그것을 해석하고, 반면 종양 혈관 부위에서 수용체 존재도는, 하기에 의해 시험관내/생체내 비교로 이전에 보고된 바와 같이, 경험하게 되는 콘주게이션된 입자의 수에서 제한될 수 있다: Ruoslahti 등 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Teesalu 등 (2009) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 106(38): 16157-16162; Hussain 등 (2014) Sci Rep 4:5232). 하기를 보여주기 위하여: NIR 강도 (도22B, 좌 패널)이 실제의 MSNP 흡수를 반영한다는 것, 유도적으로 커플링된 혈장 광학 방출 분광분석법 (ICP-OES)는 종양 실리콘 (Si) 함량의 정량화에 사용되었다 (도22B, 우 패널). 이것은 실리카솜-iRGD 또는 실리카솜 단독 그룹에 비교하여 “실리카솜 + iRGD” 그룹내 Si 함량에서 상당한 (~3-배) 증가를 실증하였다. 우리는 또한 하기를 보여주기 위해 별개의 실험 수행에 의해 PDAC 체내분포용 C-말단 (CendR) 모티프의 중요성을 실증하였다: 대조군 비-CendR 펩타이드, 사이클로 (RGDfK)와 실리카솜 공-투여 (Sugahara 등 (2010) Science, 328(5981): 1031-1035) 가 실리카솜 흡수를 향상시킬 수 있다는 것 (도 28). 이 결과는 또한 ICP-OES에 의해 확인되었다 (도 28).
종양 조직 절편은, 항-CD31 Alexa Fluor® 488-염색에 의해 설명된, 종양 혈관으로부터 이동 거리 및 NIR-표지된 실리카솜의 종양내 체내분포의 상대 존재비를 평가하는데 사용되었다 (도29). 상기 분석은 iRGD 공-투여 가 동소이식 종양 부위에서 실리카솜 흡수를 향상시키기 위한 가장 효과적인 전략이었다는 것을 보여주었다. 그에 반해서, iRGD-콘주게이션된 담체는 우리의 KPC 동소이식 모델에서 이동 거리 뿐만 아니라 입자의 수에서 상당한 효과를 발휘하는데 실패하였다 (도29). 상기 발견은 후속적인 효능 연구를 수행하기 위해 자유 iRGD의 사용을 초래하였다.
모든 나노캐리어가 또한 세망내피 시스템 (RES)에서 용해되기 때문에, (폐, 심장, 및 신장에서 거의 주목할 만한 효과 없이) 간 및 비장에서 관측가능한 실리카솜 흡수를 언급하는 것이 중요하다. 흥미롭게도, IVIS 이미지형성은 RES 기관에 콘주게이션된 담체의 체내분포에서 가능한 증가를 보여주었다 (도22A). 이것은 ICP-OES의 성능 동안 간 및 비장에서 증가된 Si 함량에 의해 확인되었다 (도30). 우리가 상기 관찰에 대하여 정확한 설명이 부족한 반면, 펩타이드 콘주게이션이, 직접적으로 또는 간접적으로, NRP-1에 독립적으로, 포획제 수용체에 의한 증가된 흡수 및 입자 옵소닌화를 유발시키는 것이 가능하다 (Li 및 Huang (2008) Mol. Pharm. 5(4): 496-504).
iRGD 공-투여는 실리카솜에 의한 이리노테칸 전달의 효능을 향상시킨다
Ir-실리카솜으로 PDAC 치료에서 iRGD 공-투여의 가능한 치료 이점을 입증하기 위해, 효능 실험은 동일한 동소이식 종양 모델에서 수행되었다. 동물은, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, (80 mg/kg의 담체 용량에 상당한) 40 mg/kg의 약물 용량에서 Ir-실리카솜의 IV 주사를 받았다. 치료는 2×106 KPC-luc 세포 의 동소이식 실행 후 13 일에 개시하였고 (도23A), 어느 시점에 1차 종양 크기는 매크로-전이의 부재하에 ~3-5 mm이었다 (참조 상기, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 주사는 매 3 일, 총 4 투여 동안 반복되었다 (도23A). 대조군 그룹은 IV PBS, Ir-실리카솜 단독 (동일 용량), 또는 자유 iRGD 단독 (동일 용량)을 받는 동물로 구성되었다. 카플란-마이어 플롯은 동물 생존 (Id.)를 발현시키는데 사용되었고 동물 부검은 국부 종양 확산 및 전이의 존재를 평가하는데 사용되었다. 수많은 전이성 병소는 염수 또는 자유 iRGD 펩타이드로 치료된 동물의 비장, 장, 위, 간, 및 신장에서 보여질 수 있다 (도23B). Ir-실리카솜이 종양 부하 및 전이의 수를 상당히 감소시켰던 반면, iRGD 공-투여는 1차 종양의 수축 뿐만 아니라 간, 위 및 장에 확산 억제를 추가로 향상시켰다 (도23B). 하기에서 히트 맵: 도23C 은 전이성 질환에서 공-투여된 펩타이드의 영향의 정량적 디스플레이를 제공한다. 로그-순위 시험 (SPSS 19.0 소프트웨어, IBM SPSS Statistics, USA)는 또한, PBS 그룹에 비교하여, Ir-실리카솜 단독으로 치료가 iRGD 펩타이드의 공-투여 동안 57.1 %에 비교된 경우 28.6%만큼 생존을 개선하였다는 것을 실증하였고 (도23D); 상기 차이는 통계적으로 유의미하다 (p = 0.027). 우리는 또한, 24 시간에 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)에 의해 결정된 바와 같이, Ir-실리카솜 (40 mg/kg 약물)과 함께 iRGD (8 μmol/kg) IV의 1회용 투여를 받는 동물에서 이리노테칸의 종양내 함량에서 상당한 (~2-배) 증가가 있다는 것을 확인하였다 (도23E).
iRGD-매개된 실리카솜 흡수는 종양 맥관구조에서 NRP-1 발현을 요구한다
약물 흡수 매개에서 iRGD의 작용 기전은, 암 혈관에서 우선적으로 발현되는, αvβ3 또는 αvβ5 인테그린으로 귀소에 의존적이다 (Ruoslahti and Pierschbacher (1987) Science, 238(4826): 491-497; Hanahan and Weinberg (2000) Cell, 100(1): 57-70). 인테그린에 순환형 펩타이드의 결합은 이어서, (즉 C-단부 규칙으로서 또한 공지된) NRP-1과 상호작용을 매개하는, 펩타이드의 C-말단이 절단 및 방출된다. NRP-1 결합은 약물 및 나노입자 수송을 도울 수 있는 소포의 시스템의 유발을 초래한다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Pang 등 (2014) Nat. CommuN. 5:4904). KPC 종양 부위에서 NRP-1의 발현을 결정하기 위해, IHC 염색은 Alexa Fluor® 488-표지된 항-NRP-1에 의해 수행되었고, 반면 내피 세포 및 핵은 Alexa Fluor® 594-표지된 항-CD31 및 DAPI, 각각으로 염색에 의해 국재화되었다. 형광 현미경검사 및 이미지 J 분석은 CD31로 NRP-1의 % 중첩을 결정하기 위해 수행되었고; 이것은 94.2% 공-국재화를 실증하였다 (도24B). 동소이식 종양 부위에서 실리카솜 흡수내 NRP-1의 역할을 증명하기 위해, 종양-보유 마우스는 NRP-1의 b1b2 도메인 에 길항제 항체로 사전-주사되었다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Sugahara 등 (2010) Science, 328(5981): 1031-1035). iRGD 플러스 NIR-표지된 실리카솜의 후속 투여는 차단 항체로 치료되지 않은 동물에 비교하여 담체 흡수에서 최종적인 감소를 실증하였다 (도24C). 동일한 간섭은 대조군 IgG로 보여지지 않았다 (도24C). 이들 데이터는 iRGD-매개된 실리카솜 흡수에서 NRP-1의 역할을 확인한다.
KPC 암 부위에서 통과세포외배출 소포에 의한 실리카솜의 수송의 초미세구조 시범
NRP-1에 iRGD의 C-말단의 결합이 암에 영양소 전달을 위하여 중요한 신규한 소포성 수송 메커니즘을 포함하는 벌크 통과세포외배출 경로를 개시할 수 있다는 것이 실증되었다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Sugahara 등 (2010) Science, 328(5981): 1031-1035; Pang 등 (2014) Nat. CommuN. 5:4904). 우리가 아는 한, 상기 통과세포외배출 경로는 종양의 부위에 치료 나노캐리어 수송 동안 결코 직접적으로 시각화되지 않았다. 시각적 향상 시범을 제공할 수 있는, 전자 현미경검사 (EM)은 KPC 모델에서 iRGD-매개된 수송 경로의 초미세구조 분석을 시도하는데 사용되었다. 초기에, 우리는, iRGD 공-투여와 무관하게, 실리카솜의 IV 주사 후 상이한 간격에서 수확된 종양 부위의 취득된 TEM 이미지를 비교하였다 (도25A). 24 시간에, iRGD 공-투여는, 혈관의 내강부터 반내강 측까지, 내피 세포를 거쳐 확산되는, 110~370 nm 직경 포도-유사 소포의 형성을 유도하는 것으로 명확히 보여질 수 있다 (도25A, 영역 “3” 및 “4”). 이들 피쳐는 하기에 의해 기재된 소포-액포 소기관 또는 VVO를 닮는다: Dvorak 등 (Feng 등 (1996) J. Exp.Med. 183(5): 1981-1986). 적어도 10 관심 영역 (ROIs)에서 소포의 수 계수 및 세포에서 내측 표면적의 μm2당 소포 수 표현에 의해 결정된, 소포 밀도의 세미-정량 분석은 iRGD가 펩타이드 공-투여를 받지 않는 동물에 비교하여 소포 밀도를 ~3-배 증가시킬 수 있다는 것을 실증하였다 (도25A, 좌 패널).
소포성 시스템에 의해 실리카솜 수송을 시각화하기 위해 시도하는 경우, MSNPs의 낮은 전자-밀도는 불균질 및 복합 PDAC 미세환경에서 담체의 존재를 해결하기 어렵다. 상기 과제를 다루기 위해, 실리카솜은 TEM 에 의해 쉽게 시각화될 수 있는 ~10 nm Au-나노입자를 포함하기 위해 합성되었다 (도21A) (Liu 등92013) ACS Nano. 7(7): 6244-6257). 동소이식 KPC 종양을 발현시키는 마우스는, 8 μmol/kg iRGD의 부재 또는 존재하에, 50 mg/kg Au-실리카솜으로 IV 주사되었다. 종양 조직은 주사후 24 시간에 수확되었고 고정되어 TEM 분석을 수행하였다. 하나의 이미지에서, (i) 혈관 내강에서 전자 치밀 실리카솜, (ii) 내피 세포에서 소포 수송, 및 (iii) iRGD 공-투여를 받는 동물의 종양 매트릭스에서 입자 침착을 표시하는 대표적인 전자 현미경사진은 하기에서 보여진다: 도25B. 이미지의 영역 1-3의 더 높은 배율은 Au-함유 입자의 존재를 확인한다. 세포자멸사를 경험하는 종양 세포내 핵주변 분포에서 실리카솜의 외관을 입증하는 것이 iRGD 공-투여 동안 또한 가능하였다 (도25C). 상기 부위는 최근접한 종양 혈관으로부터 몇 백 μm 떨어진다 (도25C). iRGD 치료를 받지 않는 동물의 종양 매트릭스에서 더 낮은 입자 밀도를 관측하는 것이 가능하였던 반면, 우리는 소포 수송 시스템에 의해 운반되는 임의의 실리카솜을 위치시킬 수 없었고, 정적 이미지에서 진입용 대안적인 기전을 확인할 수도 없었다 (도31).
NRP-1 발현에 대하여 표현형화된, 환자-유래된 PDAC 종양에서 실리카솜 흡수에 관한 iRGD 공-투여의 차별적인 영향
명백하게는, NRP-1 경로가 KPC 종양 모델에서 iRGD에 의해 기능적으로 종사될 수 있는 반면, 우리는 펩타이드가 NOD SCID IL2α 녹아웃 (NSG) 마우스에서 성장하는 환자-유래된 이종이식물에서 실리카솜 흡수에 영향을 줄 수 있는지를 보는데 관심이 있었다 (Ruckert 등 (2012). J. Surg.Res. 172(1): 29-39). 우리 (TD) 중 하나는 NSG 마우스에서 23 인간 PDAC 종양의 저장소를 확립하였고; 이들 종양 샘플은 위플스 수술 동안 환자로부터 수득되었다. 전달된 종양 조직은, PDAC (Id.)의 특징인 종양유전자 및 신호 경로 성분의 기질 존재도 및 발현을 포함하는, 상응하는 인간 PDAC 종양에 특징적인 암 피쳐에 대하여 표현형으로 특성규명되었다. 우리는, IHC 염색에 의해 결정된 바와 같이, 동등한 기질 존재도를 가진 그러나 NRP-1의 밀도 및 분포에서 상이한 한 쌍의 종양을 선택하기 위해 표현형검사 정보를 사용하였다. 염색은, NRP-1 발현의 밀도, 뿐만 아니라 CD31 및 세포 핵 (DAPI)로 그것의 공-국재화를 비교하기 위해 이미지 J 소프트웨어를 이용하는, 3번째 또는 4번째 종양 통로에서 NSG 마우스로부터 수확된 종양 조직에서 수행되었다 (도26A). 우리는, 유사한 그러나 NRP-1 발현에서 상이한 콜라겐 밀도 (트리크롬 염색)을 보여주었던, XWR#8 및 XWR#187로 지정된, 2 환자 종양 샘플을 확인할 수 있었다 (도26A). 따라서, XWR#8이 낮은 NRP-1 존재도를 특징으로 하였던 반면, XWR#187은 높은 NRP-1 발현 수준을 가졌다 (도26A). XWR#187은 또한 XWR#8 (~35%)에 비교하여 더 많은 NRP-1 양성 종양 혈관 (~80%)를 나타냈다. 피하 이종이식물 (n = 3)은, iRGD 펩타이드 (8 μmol/kg)의 공-투여와 무관하게, 동물이 NIR 표지된 실리카솜 (50 mg/kg)으로 IV 주사되기 전 NSG 마우스의 옆구리에서 확립되었다. 24 시간 후 동물 희생 이후, 외식편된 조직의 IVIS 이미지형성은 iRGD를 받는 XWR#187 마우스의 종양 부위에서 NIR 강도의 50% 증가율을 보여주었고; 유사한 향상은 XWR#8에서 보여지지 않았다 (도26B). 이들 데이터는 ICP-OES를 이용하는 종양 조직의 원소 Si 함량 평가에 의해 확인되었다 (도26B). 모든 것을 고려하여, 우리의 데이터는 NRP-1 발현의 밀도 및 분포가 생체내 인간 종양에 실리카솜 체내분포의 정도를 결정한다는 것을 나타낸다.
논의
이 실시예에서 우리는 이리노테칸-실리카솜 담체의 효능이 종양 흡수를 향상시키기 위해 담체에 부착되도록 요구하지 않는 콘주게이션되지 않은 iRGD 펩타이드의 공-투여에 의해 상당히 개선될 수 있다는 것을 입증한다. 자유 iRGD 펩타이드의 공-투여는 실리카솜 흡수를 동소이식 KPC 종양 부위에서 3-4 배 증가시켜, 1차 종양의 향상된 사멸 뿐만 아니라 전이 억제를 초래하였다. 전반적으로, 이것은 Ir-실리카솜 단독에 대해 동물 생존에서 상당한 개선을 초래하였다. iRGD 효과는 초기에 종양-관련된 인테그린과 상호작용, 이어서 펩타이드 절단 그리고 NRP-1을 연루시키는 C-말단의 방출에 의해 매개된다. 비록 NRP-1의 생리적 역할이 영양 목적으로 통과세포외배출을 제거하는 것이어도, 소포성 시스템은 또한, 수용체-차단 항체의 주사후 입자 수송의 감소에 의해 실증된 바와 같이, 나노입자의 수송에 사용될 수 있다. 또한, EM 이미지형성은 iRGD가, 혈관 내강부터 종양 매트릭스까지 Au-표지된 실리카솜을 운반하는 능력으로, 내피 세포에서 그룹화된 소포의 외관을 유도할 수 있다는 초미세구조 증거를 제공하였다. 우리는 또한 NRP-1이, NSG 마우스에서 이식된, 인간 췌장 종양에서 통과세포외배출 경로를 조절하는 증거를 수득하였다. 종양 맥관구조에서 차별적인 NRP-1 발현을 가진 종양 쌍의 선택은 iRGD 치료 동안 담체 흡수 및 이리노테칸 전달에서 차이를 실증하였다. 모든 것을 고려하여, 이들 데이터는 iRGD 공-투여에 의해 이리노테칸 실리카솜 담체의 효능을 향상시키기 위해 PDAC 화학요법에 개인화된 접근법을 사용하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
PDAC에서 이리노테칸 전달을 향상시키기 위한 통과세포외배출 경로의 유용성은 수많은 이유로 유의미하다. 첫번째는, 종양 성장 및 전이 확대에 더하여, 종양 부위에서 약물 저항에 기여하는, 형성이상 기질의 표시이다 (Feig 등 (2012) CliN. Cancer Res. 18(16): 4266-4276; Dimou 등 (2012) Ther. Adv. Med. Oncol.1758834012446008). 비정상 혈관 투과도가, EPR 효과로서 지칭된 개념인, 나노입자 분출에 대한 이유인 것이 종종 이해되는 반면, 우리는 췌장 암 기질이 혈관 투과도에서 활동적으로 방해한다는 것을 알고 있다 (Meng 등 (2013) ACS Nano. 7(11): 10048-10065; Kano 등 (2007) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 104(9): 3460-3465; Cabral 등 (2011) Nat. Nanotechnol. 6(12): 815-823; Liu 등 (2012) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 109(41): 16618-16623). 이것은 혈관 내피 세포 (Id.)에 단단히 부착하는 혈관주위세포의 존재를 포함한다.따라서, EPR 효과가 PDAC에서 나노캐리어 흡수에 기여할 수 있는 반면, 다른 혈관 기전이, 상기 수송, 뿐만 아니라 혈관 누출을 조절하는 영양 수송 경로 및 혈관 성장 인자의 가능한 기여를 포함하여, 종양 부위에서 나노입자 흡수에 기여할 수 있는 가능성을 고려하는 것이 중요하다 (Jain and Stylianopoulos (2010) Nat. Rev. CliN. Oncol.7(11): 653-664; Ruoslahti 등 (2010) J. Cell.Biol. 188(6): 759-768; Maeda 등 (2000) J. Control. Release 65(1): 271-284; Li and Huang (2008) Mol. Pharm. 5(4): 496-504; Feng 등 (1996) J. Exp.Med. 183(5): 1981-1986; Kobayashi 등 (2014) Theranostics, 4(1): 81-89). Ruoslahti 등은, 종양 영양에서 역할을 하는, 그리고 또한 종양-침투 iRGD 펩타이드에 의해 치료적으로 연루될 수 있는, 세포내이입 경로를 기재하였다 (Pang 등 (2014) Nat. CommuN. 5:4904). 또한, 혈관 성장 인자, 예컨대 VEGF, VEGF-A, VEGF-A165, TGF-β 및 세마포린 3A는 종양 맥관구조에서 αvβ3 및 αvβ5 인테그린에 결합을 허용하는 RGD 모티프를 표시한다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Sugahara 등 (2010) Science, 328(5981): 1031-1035; Pang 등 (2014) Nat. CommuN. 5:4904). 따라서, CendR 모티프의 단백분해 절단 및 방출은 NRP-1 매개된 통과세포외배출을 유발시킬 수 있다 (Pang 등 (2014) Nat. CommuN. 5:4904) 성장 인자 수용체와 관련된 혈관 투과도 및 신호전달 경로의 역할에 더하여 (Kolodkin 등 (1997) Cell.90(4): 753-762; Ellis (2006) Mol. Cancer Ther. 5(5): 1099-1107; Glinka and Prud'homme (2008) J. Leukoc.Biol. 84(1): 302-310). 결과적으로, NRP-1 경로가, EPR 효과를 포함하지만, 상이한 시간 동력학을 표시하는, 혈관 누출과 공존할 수 있다는 것이 가능하다. CendR 모티프에 대한 반응이 몇 분 내에 개시할 수 있는 반면, EPR 효과는 전형적으로 피크 로 6-8 시간 필요하다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520; Maeda 등 (2003) Int.ImmunoPharmacol. 3(3): 319-328).
iRGD 공-투여 동안 실리카솜 통과세포외배출에 대하여 우리의 데이터는 PDAC 치료 동안 기질-혈관 장벽을 극복하기 위한 이전의 시도를 보완한다 (Feig 등 (2012) CliN. Cancer Res. 18(16): 4266-4276; Dimou 등 (2012) Ther. Adv. Med. Oncol.1758834012446008; Meng 등 (2013) ACS Nano. 7(11): 10048-10065; Meng 등 (2015) ACS Nano. 9(4): 3540-3557). 몇 개의 혈관신생 약물은 나노캐리어의 종양 접근을 개선하기 위해 도입되었다 (Dimou 등 (2012) Ther. Adv. Med. Oncol.1758834012446008; Kobayashi 등 (2014) Theranostics, 4(1): 81-89). 이들 중에서, VEGF는 나노입자 흡수를 확대하기 위해 PDAC 부위에서 관류 및 혈관 누출성에서 일시적 증가를 제공할 수 있다 (Olive 등 (2009) Science, 324(5933): 1457-1461; Jacobetz 등 (2013) Gut, 62(1): 112-120). 종양 부위에서 혈관 투과도를 촉진시키는 다른 제제는 하기를 포함한다: 브라디키닌, 산화질소, 안지오텐신-전환효소 억제제, 종양 괴사 인자 α, 헴 옥시게나제-1, 콜라겐분해효소 및 하이알로니다제 (Kobayashi 등 (2014) Theranostics, 4(1): 81-89; Eikenes 등 (2004) Cancer Res. 64(14): 4768-4773; Seynhaeve 등 (2007) Cancer Res. 67(19): 9455-9462; Fang 등 (2011) Adv. Drug Deliv.Rev. 63(3): 136-151; Fang 등 (2012) Cancer Sci. 103(3): 535-541; Maeda (2013) Cancer Sci. 104(7): 779-789; Eikenes 등 (2005) Br. J. Cancer.93(1): 81-88). 우리는 또한 형질전환 성장 인자 베타 (TGF-β) 경로의 작은 분자 억제제, LY364947을 전달하는 나노캐리어의 사용이 생체내 내피 세포에 혈관주위세포 부착을 빠르게 (<2 시간) 반전시킬 수 있다는 것을 실증하였다 (Meng 등 (2013) ACS Nano. 7(11): 10048-10065). 혈관 투과도에서 동반하는 다중 배수 증가는 종양 부위 (19)에서 젬시타빈-전달 리포좀의 출구에서 극적인 증가를 제공하는 것으로 실증되었다. TGF-β 경로의 표적화에 의한 혈관 투과도의 다른 향상 접근법은 또한 보고되고 있다 (Cabral 등 (2011) Nat. Nanotechnol. 6(12): 815-823; Liu 등 (2012) Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 109(41): 16618-16623). 마지막으로, 실리카솜 담체가 젬시타빈과 파클리탁셀의 공-전달에 의해 기질 감소를 달성할 수 있다는 것은 가치있는 언급이다 (Meng 등 (2015) ACS Nano. 9(4): 3540-3557), 우리의 담체가 마우스내 동소이식 PDAC 종양의 치료 동안 아브락산 플러스 자유 젬시타빈의 투여를 능가할 수 있는 정도로 (Frese 등 (2012) Cancer Discov. 2(3): 260-269).
iRGD의 공-전달이 PDAC 종양 부위에서 실리카솜의 흡수를 향상시킨다는 시범에 기반하여 (도22), 펩타이드가 나노캐리어에 콘주게이션되는 대안적인 전달 기전의 주요 제한을 공-투여 접근법이 극복한다는 것을 강조하는 것이 중요하다. 이러한 차이에 대하여 설명은, NRP-1 수용체의 이용가능한 수에 기반하여, 담체 시스템의 수송 용량에 있다 (Sugahara 등 (2010) Science, 328(5981): 1031-1035; Ruoslahti (2012) Adv. Mater. 24(28): 3747-3756; Ruoslahti (2016) Adv. Drug Deliv.Rev. pii:S0169-409X(16)30094-1. doi: 10.1016/J. addr.2016.03.008). 따라서, 콘주게이션된 실리카솜의 수송이 맥관구조에서 표적 수용체의 비교적 작은 및 유한한 수에 의해 제한되는 반면, 콘주게이션되지 않은 펩타이드의 별개의 주사는 종양 부위에서 (더 큰 수로) 방관자 실리카솜의 벌크 전이를 유발시킨다. 게다가, 자유 iRGD는 또한 파이브로넥틴 매트릭스상에 배양 종양 세포의 부착 및 이동에서 간섭에 의해 실증된 바와 같이, 인테그린 기능의 조절을 통해 항-전이성 활성을 갖는다 (Sugahara 등 (2015) Mol. Cancer Ther. 14(1): 120-128). 이것은, 부분적으로, 우리의 연구에서 종양 전이에 관한 펩타이드 간섭을 설명할 수 있다 (도23B 및 23C). 자유 펩타이드의 용도는 또한 담체 합성의 비용 및 복잡성을 증가시키는 콘주게이션 기전에 의존하는 것에 비교된 바와 같이, 더욱 실제적이고 임상 용도에 알맞다.
물질 및 방법
물질 및 실험적 절차 의 더욱 상세한 설명은 아래 보충의 물질 및 방법에서 나타난다.
실리카솜 제조
이리노테칸 장입된 실리카솜의 합성:
65 nm MSNP 코어는 상기에서 나타낸 바와 같이 졸-겔 절차를 이용하여 합성되었다 (참조 또한, Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 지질 생물막은 이전에 보고된 바와 같이 실리카솜을 생산하는데 사용되었다 (Meng 등 (2015) ACS Nano. 9(4): 3540-3557; 참조 실시예 1 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 간단히, 500 mg MSNPs는 하기에서 침지되었고: 20 mL TEA8SOS (80 mM 용액, 이것은 지질 생물막의 최상부에서 첨가되었고, DSPC/Chol/DSPE-PEG2000 (몰비 3:2:0.15)의 550 mg 혼합물로 구성되었고, 둥근바닥 플라스크의 최하부에서 코팅되었다 (참조 실시예 1, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). LB로 입자 코팅을 달성하기 위한 초음파처리후, 자유 TEA8SOS는 Sepharose CL-4B 칼럼상의 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거되었다. TEA8SOS 장입된 실리카솜은 수조에서 65 ℃에 약물 장입용 10 mg/mL 이리노테칸 용액에 인큐베이션되었다. 장입은 및 빙수조에서 켄칭에 의해 30 분후 중단되었고, 그 이후 약물-장입된 실리카솜은 원심분리 및 PBS에 재현탁에 의해 3회 세정되었다.
iRGD 콘주게이션된 실리카솜의 합성:
iRGD-콘주게이션된 실리카솜은 LB에서 포함된 PEG 쇄에 펩타이드연결에 의해 합성되었다. 이것은, 상기에 기재된 바와 같이 지질의 몰비를 유지하면서, DSPE-PEG2000 대신에 상업적으로 입수가능한 DSPE-PEG2000-말레이미드 이용에 의해 달성되었다. 과잉의 (0.15 mL, 5 mg/mL) 시스테인-변형된 iRGD 펩타이드는, 실온에서 4시간 동안 수행된, 티올-말레이미드 반응을 이용하여, DSPE-PEG2000-말레이미드에 콘주게이션되었다 (Sugahara 등 (2009) Cancer Cell, 16(6): 510-520). 입자는 세정되어 비-반응된 iRGD를 제거하였다. 콘주게이션 반응의 성공은 또한 플루오레신 (FAM) 표지된 iRGD 펩타이드에 콘주게이션된 입자의 배치 제조, 이어서 광범위한 세정 (Id.)에 의해 확인되었다(도27, 패널 A).
금 코어 마커와 실리카솜의 합성:
10 nm Au 나노입자는 시트레이트 함유 용액에서 합성되었다 (참조 보충의 물질 및 아래 물질). MSNP 쉘을 Au 나노입자 코어에서 성장시키기 위해, 36 mL의 시트레이트-캡핑된 입자는 12 mL CTAC 용액 (H2O내 25 wt%) 속으로 빠르게 주사되었다. 입자는 세정되었고, 350 rpm으로 5분 동안 85 ℃에서 교반하면서, CTAC 용액 (H2O내 6.25 wt%)에 재현탁되었다. 상기 혼합물에, 우리는 0.256 mL의 10% (w/v) 트리에탄올아민을 10 분 동안 첨가하였고, 이어서 0.32 mL의 실리카 전구체, TEOS를 적가하였다. 용액은 350 rpm으로 20 분 동안 교반되어, ~65 nm의 평균 크기를 가진 Au 코어/MSNP 쉘 입자의 창출을 초래하였다. 입자는 메탄올 (w/v)내 1% NaCl 및 순수한 메탄올에서 순차적인 세정에 의해 정제되었다. Au-표지된 MSNPs는 그 다음, 이전에 기재된 바와 같이, LB로 코팅되었다.
iRGD 공-투여와 무관하게 IV 주사된 실리카솜의 체내분포 연구
IVIS (제노겐) 이미지형성은 KPC-유래된 동소이식 모델 (n=3 마우스/그룹)에서 NIR-표지된 실리카솜의 체내분포를 연구하는데 사용되었다 (참조 실시예 1, 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715). 동물은, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, 50 mg/kg의 콘주게이션된 및 콘주게이션되지 않은 실리카솜으로 IV 주사되었다. 동물은 24 시간후 희생되었고 이어서 절제된 종양 및 주요 기관의 생체외 이미지형성이 되었다. 종양 체내분포는, ICP-OES 프로토콜 (Id.)를 이용하여, Si 함량 평가에 의해 또한 확인되었다.
KPC-유래된 동소이식 종양 모델에서 iRGD 공-투여에 의한 Ir-실리카솜 효능의 평가
종양-보유 B6/129 마우스는 6 동물 각각을 가진, 4 그룹으로 무작위로 배정되었다. 제1 그룹은 40 mg/kg (80 mg/kg MSNP)의 이리노테칸 용량을 함유하는 실리카솜으로 매 3 일, 총 4 투여 동안 IV 주사되었다. 제2 그룹은 8 μmol/kg iRGD의 공-투여 플러스 Ir-실리카솜의 동일한 용량을 받았다. 제3 및 제4 그룹은 PBS 또는 iRGD 단독으로 처리되었다. 마우스는 자발적인 동물 사망 또는 빈사 상태 접근까지 매일 모니터링되었다 (참조 실시예 1 및 Liu 등 (2016) ACS Nano. 10(2): 2702-2715; Olive 등 (2009) Science, 324(5933): 1457-1461). 1차 종양 및 전이 부위의 생물발광 이미지형성은 희생 10 분전 75 mg/kg D-루시페린으로 복강내로 동물에 주사함으로써 수행되었다. 종양 조직 및 주요 기관 (Gi 관, 간, 비장, 심장, 폐 및 신장)은 생물발광 이미지 강도의 정량적 평가를 위하여 수확되었다.
TEM 보기를 통한 통과세포외배출 경로의 초미세구조 분석
KPC 동소이식 종양 마우스는, 8 μmol/kg iRGD의 공-투여와 무관하게, 50 mg/kg의 Au-캡슐화된 실리카솜의 IV 주사에 의해 치료되었다. 종양 생검은 24 시간후 수집되었고, PBS에서 세정되었고, 4 ℃에 2.5% 글루타르알데하이드로 즉시 고정되었다. 추가 샘플 제조 및 절편화는 UCLA에서 Electron Microscopy Services Center에 의해 수행되었다. 1% OsO4에서 고착후, 샘플은 산화프로필렌에서 탈수되었고 수지에서 포매되었다. 60-80 nm 두께의 조직 슬라이스는 구리 그리드 상에 배치되었고, JEOL 1200-EX 전자현미경하에 보여졌다.
환자-유래된 PDAC 종양내 실리카솜 체내분포
23 PDAC 샘플의 저장소는 위플스 수술을 경험하는 환자로부터 기관의 인간 대상체 승인으로 수집되었고, 하기에서 NSG 마우스내 이종이식물을 확립하는데 사용되었다: Dr. Timothy Donahue’s laboratory.NRP-1 발현용 IHC 염색의 표현형검사 데이터 및 성능을 이용하여, 2 환자 샘플 (XWR#8 및 #187)은 6 주령 암컷 NSG 마우스의 옆구리에서 신선한 피하 이종이식물 성장으로 수집되었다 (Ruckert 등 (2012). J. Surg.Res. 172(1): 29-39). 종양 크기가 ∼0.8 cm의 직경으로 성장한 경우, iRGD 공-투여와 무관하게 실리카솜을 받는 각각의 그룹에서 3 동물은, 상기 기재된 절차에 유사한, 종양 부위에 생물분포를 평가하는데 사용되었다. 동물은 NIR-표지된 실리카솜의 흡수를 결정하기 위한 생체외 이미지형성의 수행을 위하여 24 시간후 희생되었다. 이미지형성 데이터는 또한 ICP-OES에 의해 종양 부위에서 Si 함량 평가에 의해 확인되었다.
통계적인 분석
그룹간 차이의 비교 분석은 양측 스튜던트t-시험 (엑셀 소프트웨어, 마이크로소프트)을 이용하여 수행되었다. 통계적으로 유의차는 p < 0.05에서 결정되었다. 값은, 도 범례에서 언급된 바와 같이, 다중 결정의 평균 ± SD로서 표현되었다. 생존 데이터는 SPSS 소프트웨어를 이용하여 로그 순위 시험 (Mantel-Cox)에 의해 가공되었다.
보충의 물질 및 방법
물질
테트라에틸오르토시케이트 (TEOS). 트리에탄올아민. 세틸트리메틸암모늄 클로라이드 용액 (CTAC.물내 25 wt%). (3-아미노프로필)트리에톡시실란 (APTES). 트리에틸아민 (TEA). 염화금 (III) 수화물. 트리나트륨 시트레이트 탈수물. Dowex 50WX8 수지.및 Sepharose CL-4B는 하기로부터 구매되었다: Sigma-Aldrich.USA.1.2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린 (DSPC). 1.2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글리콜)-] (암모늄 염) (DSPE-PEG2000). 1.2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[말레이미드(폴리에틸렌 글리콜)-] (암모늄 염) (DSPE-PEG2000-말레이미드) 및 콜레스테롤 (Chol)은 하기로부터 구매되었다: Avanti Polar Lipids.USA. 수크로오스 옥타설페이트 (SOS) 나트륨 염은 하기로부터 구매되었다: Toronto Research Chemicals.Canada. 이리노테칸 하이드로클로라이드 3수화물은 하기로부터 구매되었다: LC Laboratories.USA.페니실린. 스트렙토마이신.및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)은 하기로부터 수득되었다: InvitrogeN. 우태 혈청 (FBS)는 하기로부터 구매되었다 Gemini Bio Products.USA.iRGD (CRGDKGPDC, 서열 식별 번호:11)는 하기로부터 구매되었다: Biomatik. USA.(NRP-1의 재조합 b1b2 도메인에 대한) 차단 항-NPR-1 항체 및 시스테인 잔기로 변형된 반응성 iRGD는 하기에 의해 친절하게 제공되었다: Dr. Ruoslahti.사이클로 (-RGDfK) (서열 식별 번호:12)는 하기로부터 구매되었다: ApexBio Technology.USA.항-CD31 항체 (카탈로그 #553708)은 하기로부터 구매되었다: BD Pharmingen™. USA. 항-NPR-1 항체 (ab81321)은 하기로부터 구매되었다: Abcam. USA. 대조군 정상 염소 IgG (sc-2028)은 하기로부터 구매되었다: Santa Cruz Biotechnology.USA.Alexa Fluor® 488 콘주게이션된 염소 항-토끼 IgG (H+L) 2차 항체 (A11008). Alexa Fluor® 594 콘주게이션된 염소 항-랫트 IgG (H+L) 2차 항체 (A11007) 및 DyLight 680 NHS 에스테르는 하기로부터 구매되었다: Thermo Fisher Scientific Inc.USA.Matrigel™ 매트릭스 기저막은 하기로부터 구매되었다: BD BiosciencE. USA. 모든 화학물질은 추가 정제없이 직접적으로 사용되었다.
DyLight 680을 이용하는 MSNPs의 NIR 라벨링
NIR 형광 염료. DyLight 680 NHS 에스테르는 MSNP 라벨링에 사용되었다. 첫째. MSNP 표면은 NHS 에스테르의 콘주게이션용 NH2 그룹으로 작용화되었다. 간단히. 10 mg MSNPs는 1 mL의 에탄올에 현탁되었고 1 μL의 APTES와 혼합되었다. 반응은 불활성 N2 분위기하에 발생하였다. 80 ℃에서 밤새 교반하면서. 후속적으로. 혼합물은 원심분리되었고 에탄올로 3회 세정되었다. NH2-콘주게이션된 MSNPs는 1 mL의 DMF에 현탁되었고, 0.01 mg의 DyLight 680 NHS 에스테르와 혼합되었고 실온에서 2시간 동안 교반되었다. 표지된 MSNPs는 에탄올 및 탈이온수로 세정되었다. NIR-표지된 MSNPs는 실리카솜을 제조하는데 사용되었다.
~10 nm 금 나노입자의 합성
~10 nm의 금 나노입자는 응축기가 구비된 100 mL 둥근바닥 플라스크에 5 mL HAuCl4 (10 mM) 및 45 mL Milli-Q 물 첨가에 의해 제조되었다. 비등 온도 도달 후. 격렬하게 교반되면서.5.8 mL의 시트르산나트륨 (38.8 mM) 은 비등 용액 속에 첨가되었다. 이것은 옅은 황색부터 암적색까지 색상 변화가 동반되었다. 비등 용액은 10분 동안 160 ℃에서 교반되었고 그 다음 가열 없이 추가의 15 분 동안 교반되었다. 금 입자는 실리카솜의 합성용 코어로서 사용되었다. 사본의 방법 부문에서 기재된 바와 같이.
세포주
불멸화된 세포주는 유전자도입 KrasLSL-G12D/+; Trp53LSL-R172H/+; Pdx-1-Cre 마우스에서 자발적으로 종양에서 유래되었다. 동소이식후 성장하는 종양의 생물발광 종양 이미지형성을 허용하기 위해. 세포는 UCLA 벡터 코어 설비에서 루시퍼라아제-기반 렌티바이러스 벡터로 영구적으로 형질감염되었다. 대표적인 세포 클론은 제한 희석 프로토콜의 사용후 수득되었다.
KPC-유래된 세포주를 이용하는, 면역 능숙한 마우스에서 동소이식 종양의 제조
모든 동물 실험은 UCLA 동물 연구 위원회에 의해 승인된 프로토콜로 수행되었다. 암컷 B6/129 마우스 (~8 주)는 The Jackson Laboratory로부터 구매되었다. 동소이식 이종이식물을 성장시키기 위해. 마우스는 이소플루란으로 마취되었다. 이어서 50 mg/kg 케타민 및 10 mg/kg 크실라진의 IP 주사. 수술 부위는 면도되어 절개 부위 주변 1 cm의 여지를 남겼고 베타딘 및 70% 에탄올로 스크러빙에 의해 멸균되었다. 마우스는 가열 패드위에 수술용으로 배치되었다. 그리고 좌측 옆구리에서 절개 부위는 멸균된 거즈로 가려졌다. ~0.7 cm의 수술 절개는 주사 부위를 노출시키기 위해 실시되었다. 이어서 27 G 바늘을 통해 췌장 속으로 2×106 KPC-luc 세포를 함유하는 50 μl의 DMEM/Matrigel (1:1 v/v)의 주사. 근막성 층은 하기로 폐쇄되었다: 흡수성 봉합 (PDS II.Ethicon) 그리고 피부는 비흡수성 봉합으로 (PROLENE. Ethicon). 마우스는 마취로부터 전체 회복까지 가온 패드상에 유지되었다. 및 그 다음 깨끗한 케이지에 전달되었다. 인공 눈물 연고는 수술 동안 마우스 눈을 보호하는데 사용되었다.
iRGD 효과에서 방해하기 위한 항-NRP-1 차단 항체의 사용
50 μg의 차단 항-NRP-1 항체 또는 대조군 IgG는 15 분 주사된 다음 KPC-유래된 동소이식 종양-보유 마우스는 50 mg/kg NIR-표지된 실리카솜 플러스 8 μmol/kg 자유 iRGD의 IV 주사를 받았다. 실리카솜 단독을 받는 동물은 대조군으로서 사용되었다. 동물은 주사후 24 시간에 희생되었다. 그리고 생체외 NIR 이미지형성은 NIR 표지된 실리카솜의 체내분포를 연구하는데 사용되었다. 생체외 이미지형성 데이터는 IVIS 소프트웨어를 이용하여 NIR 강도 분석에 의해 정량화되었다. 이어서 ICP-OES를 이용하는 Si 함량 분석.
HPLC 분석
조직내 이리노테칸의 HPLC 분석을 위하여.수확된 종양 및 장기 샘플은 칭량되었고 빙상에서 균질화되었다. 하기로 0.1 mL 조직 균질물의 추출 이후: 0.4 mL의 산성 용액 (0.1 mol/L 인산/메탄올. 1:4 v/v). 추출물은 10초 동안 2회 소용돌이되었고 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리되었다. 이리노테칸-함유 상청액은 Knauer Smartline 공압 펌프를 함유하는 시스템에서 HPLC 분석용 0.22 μm 필터를 통해 여과되었다. C18 칼럼. K-2600 분광측정기.및 Gina 데이터 취득 소프트웨어.1.0 mL/min의 유량으로 전달된, 이동상은 3% 트리에틸암모늄 아세테이트 수성 완충액 (pH=5.5) 및 아세토니트릴 (73:27 v/v)로 구성되었다. 20 마이크로리터의 이리노테칸-함유 샘플은 주사되어 ~4.4 분에서 전형적으로 용출된 254 nm에서 약물 흡수를 측정하였다. 이리노테칸 표준 곡선은 농도 범위 0.05-100 μg/mL에 대해 생성되었다.
면역형광 염색
이중 색상 면역형광 염색은 KPC 종양 조직에서 NPR-1 양성 혈관을 결정하는데 사용되었다. 종양 조직은 동결-포매되었다. OCT 시약을 이용하여. 그리고 종양 절편을 제조하는데 사용되었다. 절편은 4 ℃에서 밤새 항-NRP1 단클론성 항체 (1:250)로 먼저 처리되었다. 1차 항체의 제거 및 PBS에서 3회 세정후.Alexa Fluor® 488 2차 항체 (1:500)은 첨가되었고 1시간 동안 실 온에서 인큐베이션되었다. 동일한 절편은 항-CD31 항체로 또한 염색되었다. 이어서 Alexa Fluor® 594-콘주게이션된 2차 항체 치료되어 CD31 발현을 확인하였다. DAPI는 세포 핵을 국재화하는데 사용되었다. 염색된 슬라이드는 하기하에 검사되었다: 형광 현미경 (관측자 D1. Zeiss). NRP-1+/CD31+ 혈관의 공국재화 비는 이미지형성 J 소프트웨어에 의해 결정되었다.
실시예 4
실리카솜에 대한 원세포의 비교 분석
지질 2중층 코팅된 나노입자의 제조에 대한 하나의 접근법은 에어로졸-보조된 자가-조립 방법에 의해 합성된 MSNPs의 용도를 포함하였다. MSNPs는 정전기적으로 충전된 리포좀의 사용에 의해 코팅되었고, 이는 순차적으로 부착하고, 파열하고 그 다음 음으로 하전된 MSNP 표면과 융합한다 (참조, 예를 들면, Liu 등 (2009) J. Am. chem.Soc. 131:7567-7569). 하기에 의해 개발된, 상기 생성물: Dr. Brinker’s group at Sandia and the University of New Mexico,는 “원세포”로 불리고, 하기 표제로 미국 특허 (US 8,992,984 B1)을 받았다: “암 세포에 다성분 화물의 표적화된 전달용 원세포 및 이의 용도”. 상기 특허는, 특히, “원세포가 원세포 화합물을 형성하기 위해 화물 성분 및 다공성 입자의 리포좀 또는 지질과의 혼합, 이어서 다공성 입자 상에서 지질 2중층의 융합 및 다공성 입자의 하나 이상의 기공 속으로 화물 성분의 상승작용으로 장입에 의해 형성될 수 있다”는 것을 교시한다. 8,992,984 특허의 도 1C에서 보여진 예 원세포는 “양으로 하전된 다공성 입자가 음으로 하전된 지질 2중층, 예컨대 DOPS 지질 2중층과 융합될 수 있고, 상기 양으로 하전된 다공성 입자는 음으로 전하 화물 성분 (예를 들면, 칼세인 또는 DNA 또는 siRNA)를 흡수할 수 있다”는 것을 도시한다.
본 명세서에서 기재된 방법 및 실리카솜의 개발에서 우리는 수많은 이유로 할 수 없는 그리고 예측할 수 없는 것으로서 상기 접근법을 간주하였기 때문에 우리는 원세포에서 사용된 절차 및 성분을 능동적으로 회피하였다. 우리는 8,992,984 특허에서 기재된 리포좀 융합 방법을 이용하여 균일한 MSNP를 달성하는데 실패하였고, 뿐만 아니라 우리는 다수의 시도에서 상당한 약물 장입을 달성할 수 없었다. 이것은 우리가 본 명세서에서 기재된 생물막 기술, 초음파처리 절차, 및 장입 방법을 개발하게 하여 원세포에 상이한 지질 조성물의 LB로 균일한 입자 코팅용 재생가능한 절차를 수득하였다.
도 32는 하기에 의해 기재된 원세포에 등가인 “원세포”를 생산하기 위한 우리의 시도 동안 생성된 데이터를 도시한다: Ashley 등 (2011) Nat. Mat., 10:389-397. 간단히, 100 μL 25 mg/mL MSNPs는 100 μL 의 리포좀에 2.5 mg/mL로 첨가되었고, Ashley 등 공보 (Id.)에서 기재된 단계의 순서가 이어졌다. 최종 생성물 은 상부 패널에서 보여진다. 상기 생성물은 유체역학적 크기, 크기 분포 및 콜로이드성 안정성의 평가를 거쳤다. 좌측에서 사진 삽입은 “코팅된” 생성물의 상 분리를 보여주고 중간에서 DLS 패널은 미코팅된 입자의 작은 피크 플러스 덩어리화된 입자 질량의 큰 피크(speak)를 보여준다. 우측에서 TEM 이미지는 전세포에 대하여 입자 응집 그리고 실리카솜에 대하여 콜로이드성 안정성을 확인시킨다. 원세포의 콜로이드성 안정성의 부족은 IV 투여에 의한 사용에 대하여 생성물을 실격시킨다. 요약하면, 원세포와 달리, 실리카솜은 탁월한 콜로이드성 안정성, 낮은 PDI, 및 좁은 크기 분포를 나타낸다.
표 6는 실리카솜과 원세포 기술 사이 다양한 차이를 설명한다.
본 명세서에서 기재된 실시예 및 구현예가 단지 설명하기 위한 것이고 이의 점에서 다양한 변형 또는 변화가 당해 분야의 숙련가에 제안될 것이고 본원의 사상 및 범위 그리고 첨부된. 청구항들의 범위 내에서 포함되는 것이 이해된다. 본 명세서에서 인용된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 이로써 그 전문이 모든 목적을 위해 참고로 편입된다.

Claims (17)

  1. 나노입자 약물 담체를 포함하는, 암의 치료를 위한 약제학적 조성물로서,
    상기 나노입자 약물 담체가
    a) 표면을 갖고 다수의 기공을 정의하는 실리카 나노입자;
    b) 상기 표면을 코팅하는 지질 2중층; 및
    c) 상기 다수의 기공 내에 배치된 약물로서, 이리노테칸으로 이루어지는 약물을 포함하고,
    상기 나노입자 약물 담체가 적어도 40% w/w 의 약물 장입 용량을 갖는, 약제학적 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 나노입자 약물 담체가 37 ℃ 에 7.4 의 pH 를 가진 생물학적 완충액에서 20 시간 동안 약물의 15% 미만 누출을 갖는, 약제학적 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 다수의 나노입자 약물 담체가 1 마이크론 미만의 중앙 직경을 갖는, 약제학적 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 나노입자 약물 담체가 다수의 기공 내에 배치된 양성자화 제제를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 양성자화 제제가 지질 2중층을 거쳐 역 확산을 할 수 없는 친수성 유도체 속으로 약물을 전환시키는, 약제학적 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 양성자화 제제가 적어도 하나의 음이온성 기를 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제 4 항에 있어서, 약물과 반응전 양성자화 제제가 암모늄 염, 트리메틸암모늄 염, 또는 트리에틸암모늄 염을 포함하는, 약제학적 조성물.
  8. 제 4 항에 있어서, 약물이 양성자화 제제에 의해 양성자화되고, 겔-유사 침전물로서 다수의 기공에서 포획되는, 약제학적 조성물.
  9. 제 7 항에 있어서, 상기 암모늄 염이 황산암모늄, 암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 암모늄 포스페이트, 암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 암모늄 시트레이트 및 암모늄 아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  10. 제 7 항에 있어서, 상기 트리메틸암모늄 염이 트리메틸암모늄 설페이트, 트리메틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리메틸암모늄 포스페이트, 트리메틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리메틸암모늄 시트레이트 및 트리메틸암모늄 아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  11. 제 7 항에 있어서, 상기 트리에틸암모늄 염이 트리에틸암모늄 설페이트, 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 설페이트, 트리에틸암모늄 포스페이트, 트리에틸암모늄 α-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 β-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 γ-사이클로덱스트린 포스페이트, 트리에틸암모늄 시트레이트 및 트리에틸암모늄 아세테이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  12. 제 7 항에 있어서, 약물과 반응전 양성자화 제제가 트리에틸암모늄 수크로오스 옥타설페이트 (TEA8SOS) 를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제 1 항에 있어서, 나노입자 약물 담체가 화학요법적 레지멘 (regimen) 에서 1차 요법인, 약제학적 조성물.
  14. 제 1 항에 있어서, 나노입자 약물 담체가 다중-약물 화학요법적 레지멘에서의 성분인, 약제학적 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 다중-약물 화학요법적 레지멘이 옥살리플라틴 (OX), 5-플루오로우라실 (5-FU), 및 류코보린 (LV)로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 2 약물을 포함하는, 약제학적 조성물.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 암이 췌장 암, 결장직장 암, 유방 암, 폐 암, 간 암, 신경아교종, 또는 흑색종인, 약제학적 조성물.
  17. 제 1 항에 있어서, 암이 췌장 관상 선암종 (PDAC) 인, 약제학적 조성물.
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