CN109557158B - 酶固定基质在有机磷杀虫剂生物检测领域中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了将介孔二氧化硅包覆的金纳米棒（AuNR@mSiO2）作为掺杂剂制备酶固定基质，以及将其应用于固定化酶并进行生物检测应用。涉及复合材料制备及生物检测产品技术领域。通过将AuNR@mSiO2溶液与二氧化钛水凝胶前体液混合，然后再将该混合溶液与壳聚糖溶液混合后涂覆，制得AuNR@mSiO2掺杂的‘二氧化钛‑壳聚糖’酶固定基质。掺杂AuNR@mSiO2的乙酰胆碱酯酶电极对乙酰胆碱酯酶抑制剂（即有机磷杀虫剂）的检测灵敏度大幅度提高。该掺杂过程操作简单、制得的酶固定基质以及酶电极产品使用稳定性以及储存性高、对酶的底物以及酶的抑制剂检测灵敏度高、精密度好、回收率高，具有很高的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及复合材料制备及生物检测产品技术领域，更具体地说是涉及将二氧化硅包覆的金纳米棒掺杂进酶的固定基质,以及将该酶固定基质应用于固定化酶并进行生物检测应用。
背景技术
酶对底物的特异性识别和催化在生物检测、生物传感器、生物工程等方面有着广泛的应用。酶的固定化技术可将酶束缚或限制于一定区域内、保持酶的特有的催化反应、使酶对温度及pH的变化的耐受能力提高、贮存稳定性提高、并可将酶回收及重复利用，因而可节省资源与能源、减少或防治生态环境污染。在生物检测和生物传感器应用、特别是电化学生物检测和生物传感器应用中，理想的酶固定技术和酶固定基质应大致满足以下要求：1)酶的高效固定，即高的酶固定量、好的酶活性、高的酶稳定性等；2)对酶催化产物的电催化性能好/ 检测灵敏度高；3)小分子化合物如酶底物、酶催化产物、待测物等可穿透固定基质，可与固定化酶高效接触，可与检测界面高效接触；4)酶固定基质的稳定性高；5)样品颜色及浑浊度对检测无干扰。
纳米材料，例如碳纳米材料、金属纳米材料、金属氧化物纳米材料、非金属氧化物纳米材料等具有比表面大、特殊的光、电特性等优点，在酶的固定基质、酶的高效固定、以及生物传感器/生物检测应用中显示了明显的优势。发明人最近报道了一种在石墨烯薄膜修饰的玻碳电极表面修饰制备‘壳聚糖/二氧化钛-壳聚糖’多层复合纳米材料作为酶固定基质的方法，以及在其中高效稳定地固定乙酰胆碱酯酶并对有机磷杀虫剂进行检测的方法和应用(Cui et al.,Biosensors and Bioelectronics 2018,99:223–229)。该酶电极的最大优点是稳定性好。首先，该酶电极对乙酰胆碱酯酶的底物(硫代乙酰胆碱)、以及乙酰胆碱酯酶的抑制剂(有机磷杀虫剂)的检测稳定性非常好。另外，该酶电极的储存稳定性非常高，在4℃和在-20℃下保存30天后该酶电极的性能均无降低。除了稳定性好之外，该酶电极还具有对有机磷杀虫剂检测灵敏度较高(最低检测极限为29nM，即6.4ppb敌敌畏)、特异性好、线性范围宽[0.036μM(即7.9ppb)～22.6μM敌敌畏]，检测快速(约25min)、重现性好、样品颜色及浑浊度对检测无干扰等优点。但是，尽管该酶电极的最低检测极限以及线性范围的低限均低于欧盟以及美国农业部制定的最高限(敌敌畏：10ppb)，考虑到样品制备需要额外引入溶液，该酶电极的检测灵敏度还需要进一步提高，以满足灵敏检测各种样品，如土壤、水、粮食、蔬菜、水果等要求。
金纳米粒具有比表面大，制备技术成熟、易于化学修饰、抗氧化性强、生物相容性好、密度高和光电特性好等优点，近年来在生物检测的应用研究领域得到迅速发展。在不同形状的金纳米粒中，金纳米棒具有可调的光学性质和高的散射截面，并可在其表面包覆二氧化硅形成核壳结构。裸的金纳米棒在可视化生物检测应用中得到了极大关注，而包覆介孔二氧化硅的金纳米棒在生物成像和纳米载药方面的应用得到了很大发展。在纳米载药应用中，介孔二氧化硅壳层可提供多孔、比表面大、生物相容性好的容纳空间和载体用于药物递送。
目前还没有将介孔二氧化硅包覆的金纳米棒(即AuNR@mSiO2)应用于制备酶固定基质的报道。
发明内容
本发明的目的在于通过在‘壳聚糖/二氧化钛-壳聚糖’多层复合纳米材料酶固定基质中掺杂AuNR@mSiO2，提高该酶固定基质的电导性和电催化活性，从而进一步提高乙酰胆碱酯酶电极对有机磷杀虫剂的检测灵敏度；另一目的在于提供该乙酰胆碱酯酶电极对有机磷杀虫剂的生物检测应用性能。
为实现本发明目的，合成了AuNR@mSiO2，然后将其掺杂入‘二氧化钛-壳聚糖’混合水凝胶，在水凝胶表面电沉积一层壳聚糖膜后将乙酰胆碱酯酶通过静电吸附在‘壳聚糖 /AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质上；研究探讨了该酶电极的导电性和对酶底物硫代乙酰胆碱的生物电催化性能，以及对有机磷杀虫剂的检测性能。
具体技术方案如下：
I：合成AuNR@mSiO2，以及将其掺杂入‘二氧化钛-壳聚糖’混合水凝胶的方法如下：
a、采用成熟的种子介导生长法合成金纳米棒：首先将十六烷基三甲基溴化铵(CTAB) 溶液与HAuCl4溶液混合，然后将冰浴冷却的NaBH4溶液在强烈搅拌下迅速加入上述混合溶液，该溶液在避光下放置形成Au种子溶液；将硝酸银溶液加入由CTAB、HAuCl4和硫酸溶液组成的混合溶液，混合后搅拌下加入抗坏血酸溶液，形成Au生长溶液；最后将Au种子溶液加入Au 生长溶液，在25℃-30℃下反应过夜，得到金纳米棒溶液。
b、采用改进的
法在金纳米棒上包覆介孔二氧化硅：将金纳米棒溶液离心，将沉淀重悬于去离子水中，然后在金纳米棒溶液中加入CTAB和NaOH的混合溶液，最后在75℃-80 ℃下在该混合溶液中加入四乙氧基硅烷，迅速搅拌反应，反应结束后，离心并用乙醇洗涤，将得到的AuNR@mSiO2核壳纳米粒重悬于去离子水中。
c、将AuNR@mSiO2掺杂入‘二氧化钛-壳聚糖’混合水凝胶：首先将提前合成的TiO2水凝胶前体液与AuNR@mSiO2溶液迅速混合，然后立即将其与壳聚糖/醋酸溶液混合，最后将该混合液滴加/涂抹在电极或任何需要应用的固体界面上，几分钟内即形成‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶。
II：乙酰胆碱酯酶电极的制备方法及其对有机磷杀虫剂的生物检测性能研究如下：
a、在水凝胶表面电沉积壳聚糖：将修饰有‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶的电极浸入壳聚糖/醋酸溶液，在电极上施加负电位，得到壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质。
b、在‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质上固定乙酰胆碱酯酶：可通过物理吸附法或共价连接法将乙酰胆碱酯酶固定在‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质上。当采用物理吸附法时，将乙酰胆碱酯酶溶液滴加在电极上，空气中干燥后将酶电极放入4℃冰箱保存待用。
c、通过电化学差分脉冲伏安技术研究该酶电极的生物电催化性能及对有机磷杀虫剂的检测性能：首先，将该酶电极置入不同浓度的硫代乙酰胆碱溶液中，用差分脉冲伏安技术检测该酶电极对硫代乙酰胆碱的生物电催化性能；然后将该酶电极置入1mM硫代乙酰胆碱溶液中，检测该酶电极在被不同浓度的有机磷杀虫剂抑制前后的差分脉冲伏安曲线(被有机磷杀虫剂抑制前后的差分脉冲伏安峰电流的变化率即为对有机磷杀虫剂的检测信号)；将该酶电极浸入经过灭菌的缓冲溶液中，检测该酶电极在4℃冰箱中放置一段时间后对1mM硫代乙酰胆碱的差分脉冲伏安曲线的峰电流变化，检验该酶电极在4℃下的储存稳定性；将该酶电极密封后，在冰箱中冷冻放置一段时间，检测其对1mM硫代乙酰胆碱的差分脉冲伏安曲线的峰电流变化，检验该酶电极在冷冻条件下的储存稳定性。
在制备AuNR@mSiO2掺杂的酶固定基质时，可将AuNR@mSiO2掺杂入任何酶固定基质中，例如各种高分子聚合物、生物高分子(如DNA自组装体、蛋白质)、无机氧化物(如TiO2,SiO2) 等。
以不同的合成方法在不同条件下合成的AuNR@mSiO2均可作为掺杂剂掺杂进酶固定基质中。
其它各种酶，如各种氧化酶、各种脱氢酶、各种过氧化物酶、碱性磷酸酶、各种DNAzyme、各种RNAzyme等均可固定在AuNR@mSiO2掺杂的酶固定基质上。
所述金纳米棒包括金纳米棒的等同变化金纳米粒，包括任何形状和结构，例如笼状、中空、蛋壳、三角形、星状、立方体、长方体、多面体、球状的金纳米粒。
所述的金纳米粒粒径在1-999nm。
所述的二氧化硅包覆的金纳米粒作为掺杂剂制备酶固定基质，包括任何掺杂方式如物理掺杂、共价掺杂、分散性掺杂、层层掺杂等。
本发明创新点在于：首次将介孔二氧化硅包覆的金纳米棒掺杂进酶固定基质，以及将该酶固定基质应用于固定化酶并进行生物检测应用。
本发明介孔二氧化硅包覆的金纳米棒掺杂的酶固定基质经过导电性能和扫描电镜表征，其导电性能较未掺杂的相应酶固定基质显著增强。由此酶固定基质制备的乙酰胆碱酯酶电极在生物电催化性能以及有机磷杀虫剂检测性能方面表现很好，均较未掺杂的相应酶固定基质显著提高。另外，本发明酶电极稳定性很好：1、该酶电极对乙酰胆碱酯酶的底物(硫代乙酰胆碱)、以及乙酰胆碱酯酶的抑制剂(有机磷杀虫剂)的检测稳定性非常好；2、该酶电极的储存稳定性非常高，在4℃和在-20℃下保存30天后该酶电极的性能均无降低。除了稳定性好之外，该酶电极还具有对有机磷杀虫剂检测灵敏度高(最低检测极限为5.3nM即1.2ppb)、特异性好、线性范围宽(从0.018μM到13.6μM)，检测快速(约25min)、重现性好、样品颜色及浑浊度对检测无干扰等优点，可满足对经溶液提取处理后的实际样品的检测需求，具有很好的应用前景。
附图说明
图1为掺杂了AuNR@mSiO2的‘二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶的透视电镜图像。其中箭头所指的是部分掺杂的AuNR@mSiO2。
由图中可以看出，AuNR@mSiO以分散状态掺杂在‘二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶中。
图2为在玻碳电极上修饰不同组分的纳米复合水凝胶后在10mM Fe(CN)6 -3/-4/0.1MKCl 溶液中的电化学交流阻抗图谱。(a)为‘二氧化钛-壳聚糖’；(b)为‘掺杂裸的金纳米棒的二氧化钛-壳聚糖’；(c)为本发明‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’。
该图显示a，b，c三种电极的电荷转移电阻分别是262.9Ω，151.5Ω，和79.3Ω，表明掺杂AuNR@mSiO2大大提高了‘二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶的导电性。
图3为不同组分的纳米复合水凝胶修饰的玻碳电极在电沉积壳聚糖膜并静电吸附乙酰胆碱酯酶后对1mM硫代乙酰胆碱的差分脉冲伏安响应曲线。(a)为‘二氧化钛-壳聚糖’；(b) 为‘掺杂裸的金纳米棒的二氧化钛-壳聚糖’；(c)为本发明‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’。插图为对应的差分脉冲伏安峰电流(n＝3)。***表示在t-检验中p值小于0.001。
该图显示掺杂AuNR@mSiO2大大提高了固定乙酰胆碱酯酶后的‘壳聚糖/二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶的生物电催化性能。
图4为经本发明‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’修饰、并电沉积壳聚糖膜、和静电吸附乙酰胆碱酯酶后的玻碳电极，分别在(a)未与有机磷杀虫剂敌敌畏孵育、以及(b)与13.6 μM敌敌畏孵育后对1mM硫代乙酰胆碱的差分脉冲伏安响应曲线。插图为被敌敌畏抑制前后的差分脉冲伏安峰电流的变化率(即有机磷杀虫剂对酶电极的抑制率)与敌敌畏的浓度的线性关系曲线。
该图显示本发明酶电极对敌敌畏的检测线性范围为从0.018μM到13.6μM，最低检测极限值为5.3nM(即1.2ppb)，比我们以前报道的(Cui et al.,Biosensors andBioelectronics 2018,99:223–229)、以在石墨烯薄膜修饰的玻碳电极表面修饰‘壳聚糖/二氧化钛-壳聚糖’多层复合纳米材料作为酶固定基质制备的乙酰胆碱酯酶电极的灵敏度(29 nM，即6.4ppb敌敌畏)大大提高。本发明公开的掺杂有AuNR@mSiO2的‘乙酰胆碱酯酶/壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶电极的最低检测极限是欧盟以及美国农业部制定的最高限(敌敌畏：10ppb)的约8.3分之一，可满足对经溶液提取处理后的实际样品的检测需求。
具体实施方式
为对本发明进行更好的说明，举实施例如下，以下所述百分含量均为质量百分含量：
实施例1
I、在‘二氧化钛-壳聚糖’混合水凝胶中掺杂AuNR@mSiO2并修饰玻碳电极
a、先将50μL 0.6nM AuNR@mSiO2水溶液与450μL提前合成的TiO2水凝胶前体液迅速混合，然后在该混合液中加入5μL 0.5％壳聚糖，迅速混合。
b、取4μL上述混合液滴加在玻碳电极上，在空气中几分钟内即形成‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶。
II、制备乙酰胆碱酯酶电极并检测有机磷杀虫剂
a、首先，将上述‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶修饰的玻碳电极浸入 5mL 0.2％壳聚糖溶液，在电极上施加-2.5V的负电位(相对于银/氯化银/3M KCl参比电极) 20秒，在电极上电沉积壳聚糖膜，制得‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶酶固定基质修饰的玻碳电极。然后将电极进行清洗。
b、在‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶酶固定基质修饰的电极上滴加4μL含5mg/mL乙酰胆碱酯酶的0.01M PBS溶液，在空气中干燥后将电极进行清洗，制得乙酰胆碱酯酶电极。将酶电极放入4℃冰箱保存待用。
c、在对有机磷杀虫剂进行检测时，先将上述制得的乙酰胆碱酯酶电极在5mL含1mM硫代乙酰胆碱的0.01M PBS溶液中进行差分脉冲伏安检测，得到与有机磷杀虫剂孵育前的差分脉冲伏安曲线；然后将同一根酶电极在有机磷杀虫剂溶液中孵育10分钟，再将该电极在同样的硫代乙酰胆碱溶液中进行差分脉冲伏安检测，得到与有机磷杀虫剂孵育后的差分脉冲伏安曲线。酶电极被有机磷杀虫剂抑制前后在1mM硫代乙酰胆碱溶液中的差分脉冲伏安峰电流的变化率(即有机磷杀虫剂对酶电极的抑制率，Inh％)即为酶电极对有机磷杀虫剂的检测信号。
以上所显示的仅为本发明的实施例而已，不能以此来限定本发明的权利范围。因此以本发明申请专利范围所作的等同变化，仍涵盖在本发明请求保护的以介孔二氧化硅包覆的金纳米棒作为掺杂剂制备酶固定基质，以及将介孔二氧化硅包覆的金纳米棒掺杂的酶固定基质应用于固定化酶并进行生物检测应用。
应用例1
将按照上述方法制备的乙酰胆碱酯酶电极应用于检测包菜汁中的有机磷杀虫剂：首先将 100g包菜和100mL PBS(0.02M,pH 7.4)混合，在均质器中制得包菜匀浆，然后将该包菜匀浆在5000rpm下离心10min制得包菜汁，在该包菜汁中加入标准倍硫磷溶液，用按照上述方法制备的乙酰胆碱酯酶电极进行检测。检测结果见表1。表1显示，用本发明公开的乙酰胆碱酯酶电极对含不同浓度倍硫磷的包菜汁进行检测的回收率均在95％以上，重复检测的相对标准偏差(RSD)均在15％以内，表明该酶电极对实际样品检测的准确度和精密度均很高。
按照上述方法制备的乙酰胆碱酯酶电极的储存稳定性非常高：在4℃和在-20℃下保存 30天后该酶电极对底物硫代乙酰胆碱的响应性能均无降低，进一步表明本发明公开的酶固定基质及酶电极具有很高的应用前景。
表1.用乙酰胆碱酯酶电极检测包菜汁中倍硫磷的回收率
Claims (1)
1.酶固定基质在有机磷杀虫剂生物检测领域中的应用，其特征在于， 通过如下方法实现：(1) 采用物理吸附法或共价连接法在‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质修饰电极上固定乙酰胆碱酯酶；（2）将该酶电极置入硫代乙酰胆碱溶液中，检测该酶电极对有机磷杀虫剂抑制前后的差分脉冲伏安曲线，被有机磷杀虫剂抑制前后的差分脉冲伏安峰电流的变化率即为对有机磷杀虫剂的检测信号；根据信号定量或定性判断有机磷杀虫剂的存在；
所述‘壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质通过如下步骤制备而成：（1）将TiO2水凝胶与AuNR@mSiO2溶液混合，然后将其与壳聚糖/醋酸溶液混合，最后将混合液滴加或涂抹在电极上，形成‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶；（2）将修饰有‘AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’纳米复合水凝胶的电极浸入壳聚糖/醋酸溶液，在电极上施加负电位，得到壳聚糖/AuNR@mSiO2-二氧化钛-壳聚糖’酶固定基质。
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