CN101603940A - MWCNTs-TiO2/Nafion 复合介质的酶电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MWCNTs－TiO2/Nafion复合介质的酶电极的制备方法，本发明将MWCNTs－TiO2核－壳型纳米复合材料分散在Nafion中制得无机－有机复合膜作为生物分子的固定基质构建血红蛋白电极的制备方法，利用MWCNTs－TiO2核－壳型纳米复合材料的比表面积大、表面反应活性高、吸附能力强和导电性大等性能和Nafion的成膜、高化学稳定性和抗干扰性等性能，制成了响应快速、灵敏度高、催化能力强的血红蛋白生物传感器。该生物传感器具有很好的生物兼容性、稳定性和重复性，在构建生物传感器上具有潜在应用。此传感器可用于检测过氧化氢、三氯乙酸等物质，具有灵敏度低、检出限低等优点。
Description
技术领域
本发明属于电化学领域，具体涉及一种使用电化学方法测定样品中某些物质的酶电极的制备方法。
背景技术
目前，越来越多的学者致力于氧化还原蛋白质的直接电化学研究，因为这些研究工作不仅能帮助我们理解蛋白质的结构、蛋白分子氧化还原转化机理及代谢过程，还能促进安培型生物传感器和生物电催化系统的进一步发展。血红蛋白是血红素蛋白质的一种，在血红细胞中负责运输氧气和二氧化碳分子。血红蛋白是由两条α-和两条β-多肽链组成的四聚体寡聚蛋白，每条链上各结合一个亚铁血红素集团，每条多肽链的螺旋结构形成一个疏水性的空间，可保护血红素分子不与水接触，Fe2 +不被氧化。因为血红蛋白容易购买和结构明了，是研究血红素蛋白质直接电子转移的理想模型分子。但是，血红蛋白具有扩展的三维结构，由此产生其电活性中心的难以接近，另外它很容易吸附到电极表面而使其钝化，所以血红蛋白很难在裸电极表面发生直接电子转移。研究者们做出了极大的努力去加强血红蛋白的电子转移。
纳米材料具有量子尺寸效应和表面效应，为促进生物活性物质与电极之间的直接电子转移提供了一个重要平台。纳米TiO2具有比表面积大、表面活性基团多、优秀的生物兼容性和化学稳定性等特点，此外，Ti原子与蛋白质分子之间具有特殊的螯合作用，已成功用于生物分子的固定。最近人们发现蛋白质分子与TiO2之间存在强烈的静电吸附作用，通过这种静电作用可以实现蛋白质在TiO2表面的固定，但TiO2本身导电性不是很好，需要对TiO2进行修饰或改性。碳纳米管是一种具有优良导电性能的新型一维纳米新材料，因为其优良的电子导电性和特殊的孔腔立体选择性等被认为是一种优良的催化剂载体。我们合成了多壁碳纳米管(MWCNTs)和TiO2的核-壳型纳米复合材料，希望综合两者的优点，制备出具有高选择性和催化性能的第三代生物传感器。
无机-有机杂化复合功能材料是当今材料科学研究和应用的热点之一，这种材料综合了各成分之间的物理化学性能并改善了它们的特征，其主要优点是兼具有无机物的刚性及稳定性和有机物的柔性及易修饰性。一些具有良好生物兼容性的无机-有机纳米复合材料已用于构制生物传感器。
Nafion(全氟化磺酸酯)是一种优良的阳离子交换剂，它是由碳氢聚合物主链微晶、含侧链、水和磺酸基的界面间区域以及离子簇区三相所组成，其磺酸基基伸于骨架外内部分为憎水基(类似于聚四氟乙烯的氟碳骨架部分)及亲水基(离子化磺酸基SO3 -)，在后者上聚集着极化了的溶剂分子，它就是Nafion中起阳离子交换作用的基团。Nafion具有好的电子传导性、好的生物兼容性、优秀的成膜性和吸附能力、高化学稳定性和具有抗阴离子和生物大分子的能力，是固定生物分子的良好介质。
发明内容
本发明的目的是提供一种MWCNTs-TiO2/Nafion复合介质的酶电极的制备方法，本发明以血红蛋白为模型，通过研究血红蛋白在电极上的电化学行为，预测其他氧化还原蛋白的在类似电极上的应用，探测如何使生物大分子在电极上既保持天然结构又保持生物活性。
本发明的目的可以通过以下措施达到：
一种MWCNTs-TiO2/Nafion复合介质的酶电极的制备方法，包括如下步骤：
A、MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的制备
将酸处理过的MWCNTs多壁碳纳米管，分散于十二烷基硫酸钠溶液中，进行超声吸附处理，再将吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs置于乙醇水溶液中，加入钛酸正丁酯，进行超声处理制得悬浮液，将悬浮液水浴加热进行反应，反应后清洗、干燥，制得MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料；
B、修饰电极的制备
将电极进行抛光和清洗处理；将血红蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中制得血红蛋白溶液；将MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料分散于二次蒸馏水中制得MWCNTs-TiO2悬浮液；
先将MWCNTs-TiO2悬浮液与Nafion溶液混合后，再加入血红蛋白溶液，混合均匀，然后滴在抛光清洗好的电极表面，在密封条件下晾干。
在步骤A中酸处理的具体过程为：将MWCNTs多壁碳纳米管在浓硝酸(质量分数65％)中于130～150℃下氧化9～11h，优选的条件为于140℃回流氧化10h。步骤A中将十二烷基硫酸钠吸附在MWCNTs表面的具体过程为：将酸处理过的MWCNTs分散于十二烷基硫酸钠溶液中，超声2～4h，使十二烷基硫酸钠吸附，然后反复冲洗干净，干燥；其中十二烷基硫酸钠溶液的质量含量为0.8～1.5％，优选为1％。
步骤A中TiO2引入的具体过程为：将钛酸正丁酯和吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs投入乙醇水溶液中，先超声处理形成悬浮液，再水浴加热进行反应。其中乙醇水溶液的体积浓度为3～5％，优选为4％。钛酸正丁酯与乙醇水溶液的体积比为1∶0.9～1.1，优选1∶1～1.1；钛酸正丁酯的用量以吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs的质量计为19～21μL/mg，优选为20μL/mg。水浴时的反应条件为：在75～85℃下反应2.5～3.5h，优选为80℃下反应3h。
本发明所采用的电极为石墨电极、碳电极、玻碳电极、铂-碳电极、金电极、钯电极、银电极或铂电极，优选为玻碳电极(GCE)。对电极进行抛光和清洗处理为：将电极分别用1.0、0.3和0.05μm γ-氧化铝粉末抛光，再分别在丙酮和去离子水中超声清洗。
步骤B中磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，优选为0.12mol/L，pH为6.5；所述的血红蛋白溶液的浓度为5.5～6.5mg/mL，优选为6mg/mL。Nafion溶液的质量浓度为1.8～2.2％，优选为2％。MWCNTs-TiO2悬浮液的浓度为0.9～1.1mg/mL，优选为1mg/mL。
步骤B中MWCNTs-TiO2悬浮液与Nafion溶液和血红蛋白溶液混合过程中，其体积比为1.9～2.1∶1∶1.9～2.1，优选为2∶1∶2。
本发明采用的血红蛋白可以为各种动物的血红蛋白，也可以是其他血红素蛋白，优选为牛血红蛋白(Hb)。
本发明制得的生物传感器(即复合电极)可用于测定过氧化氢和三氯乙酸，过氧化氢是一种十分重要的工业原料，在废水处理、消毒、产生氧等方面均有重要用途，三氯乙酸(TCA)是一种重要的有机卤环境污染物，检测环境污染物中的三氯乙酸对于控制环境污染具有重要的意义，另外，此生物传感器作为一个模型成功测定了过氧化氢和三氯乙酸，说明方法的有效性，当改换用不同酶(本实验中使用的是血红蛋白)时，就可以测定不同的物质。
为验证本发明制备方法以及最终所得电极的效果，对各级合成产物做各种表征和分析检测：
(1)MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的TEM、SEM和XRD表征。
(2)紫外-可见光谱分析，证明了血红蛋白修饰到电极上后保持原来的结构。
(3)Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion复合膜的FT-IR表征。
(4)分别对MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE和Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极做了电化学阻抗谱，表明血红蛋白能很容易地吸附到MWCNTS-TiO2/Nafion膜上。
(5)对Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极的直接电化学研究表明，MWCNTs-TiO2通过与Nafion的协同作用对血红蛋白的直接电子转移起了重要作用。
(6)在10-1000mV·s-1范围内，随着扫速的增加，血红蛋白的阴极和阳极峰电位发生微小的偏移，而峰电流则线性增加，表明电极过程为表面控制过程，计算表明在Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极上发生的为单电子转移反应，血红蛋白在该修饰电极上的转移系数和电子转移速率常数分别为0.53和1.23s-1，表明血红蛋白在复合膜内电子转移是非常容易的。
(7)在实验的pH范围(4.0-9.0)内，复合膜中的血红蛋白均能得到稳定可逆的氧化还原峰。蛋白质的氧化峰电位、还原峰电位及式电位(Epa、Epc和E0’)都随pH值的增加而负移，说明血红蛋白在氧化还原过程中伴随有质子转移，此现象与水分子以及血红素周围氨基酸的质子化作用有关，称为氧化还原波尔反应。
制备的酶电极使用循环伏安法和计时安培法测定了过氧化氢
当向电解池中加入0.06mmol·L-1过氧化氢时，Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极响应的还原峰电流显著增加而氧化峰电流显著减少，表明血红蛋白对过氧化氢的还原过程具有典型的电催化性质，且还原峰电流随过氧化氢浓度的增加而增加，而在MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极上没有观察到该现象，计算Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极对过氧化氢还原的浓度校正曲线得到其线性范围为5-160μmol·L-1，回归方程为I(μA)＝0.085C(μmol·L-1)+0.032(R2＝0.997)，三倍噪声时的检测限为0.13μmol·L-1。
向pH 7.0PBS中不断加入不同体积的过氧化氢，过氧化氢加入后的5s内，还原电流已达到最大响应电流的95％，说明该修饰电极对过氧化氢有良好的响应。
循环伏安法测定三氯乙酸
Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极对不同浓度的三氯乙酸的电催化还原实验表明，三氯乙酸在修饰电极上的还原峰电流随着三氯乙酸浓度的增大而增大；基于MWCNTs-TiO2和Nafion复合膜构建的血红蛋白修饰电极对三氯乙酸具有很好的电催化活性，可用于检测环境中有机卤污染物的浓度。
研究了修饰电极稳定性和重复性
通过两种方法考察了Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion膜修饰电极的循环伏安曲线，以证明其稳定性。首先，在pH 7.0的PBS溶液中循环伏安法扫描100圈(-0.8～0.2V，100mV·s-1)后，其氧化还原峰电流基本不变。其次，制备的该修饰电极保存在4℃冰箱中保存，电极在20天后仍能保持97％的初始响应电流值，显示了很好的长期稳定性。这种很好的长期稳定性进一步说明了复合膜好的生物兼容性。
为考察修饰电极的重复性，在相同的独立条件下制备了6个传感器并用于测定20μmol·L-1过氧化氢，实验结果表明催化电流的相对标准偏差为4.4％，这表明修饰电极的重复性很好。
本发明将MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料分散在Nafion中制得无机-有机复合膜作为生物分子的固定基质构建血红蛋白电极的制备方法，利用MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的比表面积大、表面反应活性高、吸附能力强和导电性大等性能和Nafon的成膜、高化学稳定性和抗干扰性等性能，制成了响应快速、灵敏度高、催化能力强的血红蛋白生物传感器。该传感器优选主要有以下部分组成：玻碳电极(GCE)、多壁碳纳米管(MWCNTs)、二氧化钛(TiO2)、全氟化磺酸酯(Nafion)、牛血红蛋白(Hb)。电化学阻抗谱表明通过静电力血红蛋白能很容易地吸附到MWCNTS-TiO2/Nafion膜上。固载于MWCNTs-TiO2/Nafion无机-有机复合膜内的血红蛋白不仅保持了自身天然构象并且能够实现电极之间直接电子转移。Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion修饰电极对过氧化氢和三氯乙酸表现出很好的催化性能。该修饰电极的催化还原过氧化氢的灵敏度和米氏常数分别为0.78A/M/cm2和34.9μM。该生物传感器具有很好的生物兼容性、稳定性和重复性。这表明该复合介质适合Hb的固定，在构建生物传感器上具有潜在应用。此传感器可用于检测过氧化氢、三氯乙酸等物质，具有灵敏度低、检出限低等优点。
附图说明
图1为酸处理后的MWCNT(a)及MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料TEM图；
图2为MWCNTs-TiO2核-壳型复合材料的SEM图；
图3为MWCNTs(a)和MWCNT-TiO2(b)的XRD图；
图4为Hb在pH 7.0PBS(a)和MWCNTs-TiO2/Nafion复合膜(b)中的紫外-可见光谱；
图5为Hb(a)、Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion(b)和MWCNTs-TiO2/Nafion(c)的傅里叶红外光谱；
图6为MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极(a)和Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极(b)在含有5.00mmol/LK3(Fe(CN)6)/K4(Fe(CN)6)和0.10mol/L KCl.的0.1mol/L pH 7.0PBS中的电化学阻抗谱；
图7为在0.1mol/L pH 7.0PBS中Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE(a)、Hb/Nafion/GCE(b)、Hb/GCE(c)和MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE(d)的循环伏安图，扫描速度：100mV/s；
图8为在0.1mol/L pH 7.0PBS中Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极在不同扫描速度下的循环伏安图。插图为峰电流与扫描速度的关系曲线图；
图9为在0.1mol/L PBS中，Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极在不同pH条件下的循环伏安图，从左到右，PBS的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，扫描速度：100mV/s。插图为在不同的pH条件下，Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极相应的式电位与与pH的关系曲线；
图10为Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极催化还原H2O2电流与H2O2浓度的关系图；
图11为Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极在电位-0.39V时，在0.1mol/L pH 7.0PBS中连续添加H2O2溶液的电流-时间响应。插图A为计时电流与H2O2浓度的关系曲线图；插图B为计时电流倒数与H2O2浓度倒数的关系曲线图
图12为在0.1mol/L pH 5.0PBS中，Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极催化还原不同浓度TCA的循环伏安图：0mmol/L(a)、9.9mmol/L(b)、19.6mmol/L(c)和29.1mmol/L(d)；扫描速度：100mV/s。
具体实施方式
实施例1
1.MWCNTs-TiO2/Nafion复合介质的酶电极的制备步骤如下：
(1)MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的制备
MWCNTs多壁碳纳米管在浓硝酸中于140℃回流氧化10h。将酸处理过的MWCNTs分散于1％十二烷基硫酸钠溶液中，超声3h，使十二烷基硫酸钠吸附在MWCNTs表面，反复冲洗干净，干燥。在4mL无水乙醇中加入100μL钛酸正丁酯、100μL水和5mg吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs。超声30min后将此悬浮液转移到烧杯A中(体积为10mL)。在烧杯B(体积为20mL)中注入4mL二次蒸馏水，然后将烧杯A置于烧杯B中，将此装置密封，置于烘箱中于80℃加热3h。反应结束后，将离心得到的固体样品用无水乙醇和二次蒸馏水反复冲洗干净，然后在真空干燥箱中干燥，制得MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料。
(2)修饰电极的制备
制备电极之前，玻碳电极(GCE，直径为3mm)分别用1.0，0.3和0.05μmγ-氧化铝粉末抛光，分别在丙酮和去离子水中超声清洗，室温下晾干备用。
为了制备Hb电极，将6mg牛血红蛋白溶解在1mL 0.1mol/L pH 6.5的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中制得6mg/mL的血红蛋白溶液；将1mg MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料分散于1mL二次蒸馏水中制得MWCNTs-TiO2悬浮液。
将200μL上述悬浮液与100μL 2％Nafion溶液超声混合均匀，然后加入200μL血红蛋白溶液，混合均匀。将5μL制得的上述悬浮液滴在抛光好的玻碳电极表面，在密封条件下晾干，制得Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE修饰电极，当电极不用时在4℃的条件下储存。
(3)空白对照
将5μL的MWCNTs-TiO2悬浮液、血红蛋白溶液、Nafion溶液或Hb-Nafion混合液单独或两两组合滴在抛光好的玻碳电极表面，在密封条件下晾干，制得各种空白对照电极。
2.对各级合成产物做各种表征和分析检测
(1)MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的TEM、SEM和XRD表征(见图1～3)
(2)紫外-可见光谱分析(见图4)
(3)Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion复合膜的FT-IR表征(见图5)
(4)电化学阻抗谱(见图6)
(5)Hb/MWCNTs-TiO2/Nafion/GCE的直接电化学研究(见图7)
(6)扫描速度的影响(见图8)
(7)pH的影响(见图9)
3.使用制备的酶电极循环伏安法(见图10)和计时安培法(见图11)测定过氧化氢，循环伏安法测定三氯乙酸(见图12)，确定修饰电极稳定性和重复性。
Claims (10)
1、一种MWCNTs-TiO2/Nafion复合介质的酶电极的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
A、MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料的制备
将酸处理过的MWCNTs多壁碳纳米管，分散于十二烷基硫酸钠溶液中，进行超声吸附处理，再将吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs置于乙醇水溶液中，加入钛酸正丁酯，进行超声处理制得悬浮液，将悬浮液水浴加热进行反应，反应后清洗、干燥，制得MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料；
B、修饰电极的制备
将电极进行抛光和清洗处理；将血红蛋白溶解于磷酸盐缓冲溶液中制得血红蛋白溶液；将MWCNTs-TiO2核-壳型纳米复合材料分散于1mL二次蒸馏水中制得MWCNTs-TiO2悬浮液；
先将MWCNTs-TiO2悬浮液与Nafion溶液混合后，再加入血红蛋白溶液，混合均匀，然后滴在抛光清洗好的电极表面，在密封条件下晾干。
2、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中所述的酸处理为将MWCNTs多壁碳纳米管在浓硝酸中于130～150℃下氧化9～11h。
3、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中所述的十二烷基硫酸钠溶液的质量含量为0.8～1.5％。
4、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中，所述的乙醇水溶液的体积浓度为3～5％；所述的钛酸正丁酯与乙醇水溶液的体积比为1∶0.9～1.1，钛酸正丁酯的用量以吸附十二烷基硫酸钠的MWCNTs的质量计为19～21μL/mg。
5、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤A中水浴加热的反应条件为：在75～85℃下反应2.5～3.5h。
6、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的电极为石墨电极、碳电极、玻碳电极、铂-碳电极、金电极、钯电极、银电极或铂电极。
7、根据权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于对电极进行抛光和清洗处理为：将电极分别用1.0、0.3和0.05μm γ-氧化铝粉末抛光，再分别在丙酮和去离子水中超声清洗。
8、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.08～0.12mol/L，pH为6.5；所述的血红蛋白溶液的浓度为5.5～6.5mg/mL。
9、根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤B中，所述的Nafion溶液的质量浓度为1.8～2.2％；MWCNTs-TiO2悬浮液与Nafion溶液和血红蛋白溶液混合过程中，其体积比为1.9～2.1∶1∶1.9～2.1。
10、根据权利要求1、8或9所述的制备方法，其特征在于所述的血红蛋白为牛血红蛋白。
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