CN102353709A

CN102353709A - 合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法及其应用

Info

Publication number: CN102353709A
Application number: CN2011101630796A
Authority: CN
Inventors: 赵国华; 李明芳; 刘梅川
Original assignee: Tongji University
Current assignee: Tongji University
Priority date: 2011-06-17
Filing date: 2011-06-17
Publication date: 2012-02-15

Abstract

本发明涉及一种合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法及其应用。即采用电化学阳极化的方法，在Ti-Pd合金表面直立向上生长一层高度有序的纳米管阵列膜Pd-TiO₂NTs，所得到的Pd-TiO₂NTs进一步被用来自组装血红素类蛋白质。这种生物传感器不仅可以对有机卤素污染物-三氯乙酸进行快速而灵敏测定，而且所组装的蛋白质不易脱落，具有较好的重复性和稳定性，寿命比较长。由于本发明中用于组装蛋白质的基底材料Pd-TiO₂NTs电极在原位生长了高催化活性Pd的同时具有高的比表面积，所以Pd-TiO₂NTs不但可以组装大量的蛋白质分子，而且具有高的电催化活性，直接导致三氯乙酸测定的灵敏度大大提高。该电极制备工艺简单、制作成本低廉，具有广泛的经济和社会效益。

Description

合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及污染控制和材料化学领域，尤其是涉及一种合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法及其应用。

背景技术

三氯乙酸（TCA），是有机卤素环境污染物之一，广泛应用于农业和公共安全领域，也经常存在于用次氯酸消毒过的饮用水中。对三氯乙酸的毒理学研究表明，三氯乙酸能够导致生物体内的肺肿瘤，也可以造成癌症和影响人类生殖功能。世界卫生组织明确规定水环境中三氯乙酸的安全存在量为100 μg L^-1。因此，研发出快速而准确的分析方法来检测三氯乙酸的含量是非常必要的。传统的用于检测三氯乙酸的方法通常是气相色谱和液相色谱法。色谱法虽然能够提供比较准确的检测，但是，它通常需要繁琐的样品制备过程、昂贵的仪器和高度专业的技术操作人员。同时色谱法也难以实现实时现场监测，因而在实际应用中受到限制。一种替代的检测技术，电化学生物传感器，由于具有相对简单、可以实现快速检测，同时也具有高灵敏和高选择性，引起了科学家们的兴趣和关注。在发展电化学生物传感器时，一个非常重要的关键点就是能够制备出一种理想的基底材料提供快速的电子转移通道。一些纳米管材料（碳纳米管等），由于具有生物兼容性好、比表面积大、生物分子易于在表面修饰和负载等优点，已广泛地用于蛋白质直接电化学反应和生物传感器的电极基体材料。但我们应该注意到在碳纳米管表面实现生物分子的直接电化学和生物传感，需要将碳纳米管修饰在一定的基底上，不仅过程冗繁，而且其稳定性也常常值得怀疑。近年来，在钛基底上由电化学阳极化得到的TiO₂纳米管阵列（TiO₂NTs），由于其具有环境友好性、低成本、高的表面活性位点和相对较高的催化活性，在光催化降解污染物、光解水产氢、染料敏化太阳能电池等方面得到了广泛的应用。同时，由于其具有化学惰性、高的尺寸稳定性、亲水性和生物兼容性，经常被用来固定生物分子，实现生物分子的直接电化学，并用来制备电化学生物传感器。但是，由于TiO₂NTs的半导体特性，导致其导电能力相对较差，从而导致了在简单的TiO₂纳米管内难以实现生物分子的电化学传感。在TiO₂纳米管内填塞具有导电性和生物催化活性的掺杂物种可以克服这一缺点。Liu等在纳米管内同时吸附巯瑾和辣根过氧化物酶，制备了一种新颖的H₂O₂传感器。Kafi等通过在Au修饰的TiO₂纳米管内修饰壳聚糖和辣根过氧化物酶，实现了对H₂O₂的电化学传感。我们的前期工作也成功将纳米金颗粒修饰在TiO₂纳米管内，实现了细胞色素C的直接电化学和对H₂O₂的催化还原测定。这些工作都取得了很有意义的结果。但是我们可以注意到，在这些研究工作中，都用到了一种或者几种媒介物，以提高TiO₂ 纳米管的导电性，来促进生物分子直接电化学和生物催化作用的实现。由于这些媒介物是填塞在纳米管道内，或多或少对纳米管结构特有的自由空间和高比表面积会造成一定的破坏，生物分子在纳米管内的负载量因而大打折扣。同时也会带来一些杂质响应信号。这些因素都会对所制备电化学生物传感器的灵敏度和可重复性造成不利的影响。

因此采用贵金属掺杂的钛合金作为原材料，采用简单的电化学阳极化的方法，在钛合金基底上原位直立生长出高度有序的贵金属掺杂的TiO₂纳米管，在提高TiO₂纳米管电催化性能的同时，完美的保持了纳米管阵列结构和高比表面积、高亲水性和优异的生物兼容性等优点，使其成为一种制备电化学生物传感器的基底材料。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种制备工艺简单，成本低廉，检测速度快，灵敏度高的合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提出的合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法，具体步骤如下：

（1）将合金Ti-Pd（Pd的重量百分比为0.2-0.5%）表面用金相砂纸进行打磨抛光，并依次在丙酮、二次蒸馏水、无水乙醇中超声清洗各10~20min；

（2）在含有0.20~0.30 %的HF(氢氟酸)溶液中，以步骤（1）预处理过的钛合金片为工作电极，铂片为对电极，进行预氧化处理，预氧化电位为+10~20V；

（3）在含有0.20~0.30%的NH₄F，1~2% H₂O的乙二醇溶液中，以步骤（2）得到的钛合金片为工作电极，铂片为对电极，进行电化学阳极化处理，在钛合金基底表面获得有序的纳米管阵列，阳极化电位为+30~40V；

（4）将步骤（3）制备得到的钛合金片在管式炉中采用程序升温进行热处理，得到电催化性能良好、高比表面积、高亲水性和良好生物兼容性的Pd-TiO₂ NTs；

（5）将步骤（5）得到的Pd-TiO₂ NTs浸于含有50~80μmol/L马心肌红蛋白pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中20~30h，得到肌红蛋白自组装的Pd-TiO₂ NTs，即为产品。

本发明中，步骤(4)中所述热处理为按1~5℃/min的升温速率升至450~550℃热处理3~5h。

利用本发明方法合成的肌红蛋白电化学生物传感器用于测定含卤有机废水，具体步骤为：以肌红蛋白电化学生物传感器为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电位下电流-时间曲线的方法，对有机含卤废水进行测定。

本发明中，所述含卤有机废水为含有三氯乙酸（TCA）的废水。

所述的基底材料Pd-TiO₂ NTs是以Ti-0.2Pd合金为基底，经电化学阳极化方法处理制备得到的具有高的电催化活性和高比表面积、高亲水性、良好生物兼容性的Ti-Pd合金氧化物纳米管阵列Pd-TiO₂ NTs。

与现有技术相比，本发明用于固定蛋白质的基底材料，是利用电化学阳极化Ti-0.2Pd合金而不是纯钛板，在Ti-0.2Pd合金上原位直立生长一层高度有序的混合氧化物纳米管阵列Pd-TiO₂ NTs，所得到的纳米管阵列在获得高的电催化活性的同时，保持了传统TiO₂ NTs的优点。利用该纳米管阵列可以进行生物分子组装并进而对含卤有机废水-三氯乙酸进行高灵敏测定，具体包括以下优点：

（1）与传统TiO₂ NTs纳米管阵列相比，由于采用Ti-0.2Pd合金而不是纯钛板作为原始材料，Pd-TiO₂ NTs纳米管阵列在纳米管的管底和管壁都高度均匀的原位掺杂有Pd，使得所得到的纳米管具有良好的导电性和电催化活性。

（2）Pd-TiO₂ NTs纳米管阵列形成的同时伴随着Pd的掺杂，不同于传统掺杂的方法，即在TiO₂ NTs制备完成后，再通过电沉积和化学气相沉积等方法在TiO₂ NTs 上修饰一层具有电催化活性的物质。Pd-TiO₂ NTs纳米管阵列的形成和Pd的掺杂是在一个步骤内全部完成。

（3）基底材料的制备很容易控制，通过改变电化学阳极化的参数，可以得到形貌可控的纳米管阵列结构，制备工艺简单，成本低廉。

（4）由于Pd-TiO₂ NTs纳米管阵列兼具高催化活性、高比表面积和良好生物兼容性，可以拥有更多的电催化活性位点和组装更多的肌红蛋白分子，使得本发明制备的电化学生物传感器对于含卤有机废水的电化学测定具有极高的灵敏度。

附图说明

图1为实施例1制备的Pd-TiO₂ NTs的扫描电镜照片。

图2为实施例1制备的Pd-TiO₂ NTs和TiO₂ NTs在铁氰化钾溶液中的交流阻抗图。

图3为实施例1制备的Pd-TiO₂ NTs的接触角示意图。

图4为肌红蛋白分子固定在实施例1制备的Pd-TiO₂ NTs上和处于溶液中时的紫外-可见吸收光谱图。

图5 为实施例1 制备的Pd-TiO₂ NTs与传统TiO₂ NTs对肌红蛋白直接电子传递的对比。

图6为实施例2制备电化学生物传感器在连续添加一定量三氯乙酸的0.1mol L^-1 磷酸盐缓冲溶液中的电流响应图（内插图为所得到的电流响应与三氯乙酸的线性关系曲线）。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种快速而灵敏测定致癌性物质三氯乙酸的合金氧化物纳米管阵列上固定的肌红蛋白电化学生物传感器的制备方法，具体包括以下步骤：

将厚度为0.4mm的Ti-0.2Pd合金（Pd的重量比为0.2%）表面依次用100^＃，300^＃和500^＃砂纸打磨，用金相砂纸进行抛光，使合金板表面如镜面般光滑，然后将打磨过地合金片依次在丙酮、二次蒸馏水、无水乙醇中超声清洗各15min后，用二次蒸馏水清洗干净。随后进行预氧化，以得到的钛合金片为工作电极，铂片为对电极。预氧化的电解液组成为0.25% HF，预氧化电位为20V，预氧化时间为1h。预氧化完成后，进行阳极化。阳极化的电解液为含有0.25%的NH₄F，1% H₂O的乙二醇溶液。以得到的钛合金片为工作电极，铂片为对电极，进行电化学阳极化处理，阳极化电位为+35V，阳极化时间为3h。将阳极化后的钛合金片在管式炉中采用程序升温进行热处理，即按1℃/min的升温速率升至500℃热处理3h，得到Pd-TiO₂ NTs；

材料表面形貌通过场发射扫描电子显微镜（SEM）进行表征，见图1，从图上可以看到在Ti-Pd合金片表面已经形成了一层高度有序的纳米管阵列Pd-TiO₂ NTs。纳米管呈现出管口开放且管底闭合的形式，管与管之间连接紧密。从表面和截面图可以看到阳极化后形成的纳米管，管口直径约为70nm，管长约300nm，管壁厚10nm。

采用三电极电化学测量体系，在CHI660c电化学工作站上，以制备得到的Pd-TiO₂ NTs为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，在5mmol/L K₄(Fe[CN]₆) + 5 mmol/L K₃(Fe[CN]₆)+0.1M KCl溶液中测定电极的电化学阻抗谱，见图2，可以看到，由合金制备Pd-TiO₂ NTs电极，相比于TiO₂ NTs来说，其电荷传递电阻大幅度下降，由原来的7600Ω降低到600Ω。表明Pd掺杂后，其导电性和电催化能力的确有很大程度的提高。

采用静滴接触角/界面张力测量仪对Pd-TiO₂ NTs表面与纯水之间的接触角进行了测量，见图3。如图3所示，Pd-TiO₂ NTs表面与水的接触角达低于10°，跟传统TiO₂ NTs与纯水之间的接触角接近，这表明由Ti合金制备的纳米管阵列保持了良好的亲水性。

将制备得到的Pd-TiO₂ NTs浸泡于含有50μM Mb 的0.1M， pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中24h，得到Mb/Pd-TiO₂ NTs传感器。

采用紫外-可见吸收光谱仪对固定在Pd-TiO₂ NTs上和处于溶液中的Mb进行了表征，见图4。如图4所示，在Pd-TiO₂ NTs上固定了肌红蛋白后，在410nm处有一个最大吸收峰，这与处于溶液状态的肌红蛋白在406nm有一个吸收峰相比，只有4nm的位移，表明Pd-TNTs是一个生物兼容性很好的材料，同时也表明肌红蛋白成功负载到了Pd-TiO₂ NTs上。

采用三电极电化学测量体系，在CHI660c电化学工作站上，以制备得到的Mb/Pd-TiO₂ NTs为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，在0.1M， pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中测定电极的循环伏安曲线，见图5，可以知道，在电位扫描范围内，Pd-TiO₂ NTs在PBS 中没有氧化还原峰，而Mb/Pd-TiO₂ NTs 在矢量电位为-0.375V的地方有一对峰形良好的氧化还原峰，说明这一对位于-0.375V的峰是由于所固定的Mb的氧化还原所产生的。图5中对比实验的结果表明固定在TiO2 NTs内的Mb仅仅表现出非常微弱的氧化还原峰。这清楚地表明Mb的直接电化学更容易在Pd-TiO₂ NTs内实现。再一次表明本发明所制备的Pd-TiO₂ NTs比传统TiO₂ NTs具有更高的电催化活性。

实施例2

采用得到的Mb电化学生物传感器测定废水中的三氯乙酸

采用三电极电化学测量体系，在CHI660c电化学工作站上，以制备得到的Mb/Pd-TiO₂ NTs为工作电极，铂电极为对电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，以0.1M， pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液为支持电解质，在工作电极上施加-0.4V的偏压。向反应池中连续加入标准三氯乙酸溶液，三氯乙酸在工作电极上被固定在Pd-TiO₂ NTs上的Mb电化学还原而产生电流信号，加入标准三氯乙酸后的溶液与空白溶液产生的电流差即为响应电流，根据响应电流与标准三氯乙酸溶液浓度的关系绘制工作曲线；向反应池中加入待测含三氯乙酸有机卤废水溶液，测得响应电流，通过计算即可得到待测三氯乙酸溶液的浓度。

如图6，连续加入一定量标准三氯乙酸溶液后，三氯乙酸被Mb电化学还原产生电流信号，电流10 s内可达到稳定，加入样品溶液与空白溶液产生的电流差值即为响应电流。制备的Mb电化学传感器对三氯乙酸测定的标准曲线见图6插图，从图中可以看到，电流响应与三氯乙酸理论浓度值形成良好的线性关系，线性方程为 I（μA）= -7.76C_TCA（μmol/L）-105，相关系数为0.998，其检测限为94nmol/L，检测范围为0.5~96μmol/L。

上述的对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和应用本发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于这里的实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种合金氧化物纳米管阵列上固定的血红素类蛋白质电化学生物传感器的制备方法，其特征在于具体步骤如下：

（1）将合金Ti-Pd板表面用金相砂纸进行打磨抛光，并依次在丙酮、二次蒸馏水、无水乙醇中超声清洗各10~20min；其中：Pd的重量百分比为0.2~0.5%；

（2）将步骤（1）预处理过的钛合金片作为工作电极，以铂片为对电极，在含有0.20~0.30 %的氢氟酸溶液中进行预氧化处理；

（3）在含有0.20~0.30%的NH₄F，1~2% H₂O的乙二醇溶液中，以上述步骤（2）处理过的钛合金片作为工作电极，铂片为对电极，进行电化学阳极化处理，在钛合金基底表面获得有序的纳米管阵列；

（4）将上述步骤（3）处理过的钛合金片在管式炉中采用程序升温进行热处理，得到Pd-TiO₂ NTs；

（5）将上述步骤（4）得到的Pd-TiO₂ NTs浸于含有50~80μmol/L马心肌红蛋白pH为7.0的磷酸盐缓冲溶液中20~30h，得到肌红蛋白自组装的Pd-TiO₂ NTs，标记为Mb/TiO₂ NTs，即为产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中所述热处理为按1~5℃/min的升温速率升至450~550℃热处理3~5h。

3.一种如权利要求1所述制备方法得到的肌红蛋白电化学生物传感器测定含卤有机废水的应用，具体步骤为：以肌红蛋白电化学生物传感器为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，采用恒电位下电流-时间曲线的方法，对有机含卤废水进行测定。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述含卤有机废水为含有三氯乙酸的废水。