CN104977337A

CN104977337A - 对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器、制备及应用

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Publication number: CN104977337A
Application number: CN201410140564.5A
Authority: CN
Inventors: 孔金明; 于雪花; 胡琼; 胡伟文; 张学记
Original assignee: Nanjing University of Science and Technology
Current assignee: Nanjing University of Science and Technology
Priority date: 2014-04-09
Filing date: 2014-04-09
Publication date: 2015-10-14

Abstract

本发明公开了一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器、制备及应用。该生物传感器是以血色素为主体、PEDOT为修饰材料、1-芘丁酸为中间连接剂，将PEDOT与1-芘丁酸通过π-π共轭作用连接，1-芘丁酸与血色素通过锆离子的配位化学作用形成的仿生传感器。PEDOT为导电高分子，可极大的促进电子转移，从而提高传感器的检测灵敏度；1-芘丁酸与PEDOT通过π-π共轭作用连接，π-π共轭作用力很强，可将1-芘丁酸稳定的连接到PEDOT上；通过锆离子与羧基形成的配位作用，将血色素连接到1-芘丁酸上，这种锆离子配位作用极易形成，可在同等面积的电极表面结合更多的血色素；整个仿生传感器制备主要采用聚合和浸泡的方法，这种方式操作简单，重复性好。

Description

对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器、制备及应用

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体涉及一种生物传感器、制备及其应用，特别是一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器、制备及应用。

背景技术

卟啉及其衍生化合物广泛存在于生物体内和能量转移相关的重要细胞器内。铁卟啉(Hemin)是血红蛋白的活性中心，在运输氧的过程中起重要作用。血色素与铁卟啉结构类似，三价铁离子为其活性中心，血色素对氮气、氧气、一氧化氮、二氧化碳和过氧化物等有极高的催化性能，其催化活性是由与卟啉环配位的三价铁离子在得失电子过程中提供。但是，由于缺乏适宜的仿生环境，其电子传递效率大大低于天然酶，因此为了实现其在电极表面可逆的直接电子转移，选择合适的电极修饰材料和固定方法就显得非常重要。

目前研究较多的是石墨烯和碳纳米管等，由于石墨烯和碳纳米管的量子尺寸效应和大的共轭表面，使得其在促进电子转移方面有着不可或缺的作用，石墨烯和碳纳米管的使用为血色素的高效仿生催化提供了可能。数年来，研究者一直致力于如何更好地将血色素稳定的固定于石墨烯或碳纳米管上。郭通过将血色素连接到石墨烯纳米片上，使石墨烯纳米片功能化，之后将功能化石墨烯修饰于玻碳电极上，这种将石墨烯纳米片功能化的方法制备过程复杂，不易操作且纳米片大小不易控制，所以重复性不高[Sens Actuators B,2011,160:295-300]。韦使用的是用还原性氧化石墨烯固定血色素，这种方法虽制备相对简单，但是检测灵敏度不高[Nanotechnol,2012,23:335707-335714]。屠采用的是碳纳米管与血色素之间的协同作用，将血色素固定于碳纳米管上，这种协同作用不稳定，且固定的血色素的量不易控制[Acid.Chem Eur J,2009,15:779-784]。2001年，陈成功的利用1-芘丁酸将蛋白质固定于碳纳米管上，之后1-芘丁酸作为一种新型的生物分子与碳材料之间的连接剂被广泛关注[J.Am.Chem.Soc.2001,123,3838-3839]。1-芘丁酸包含四个苯环，可以与碳纳米管和石墨烯通过π-π堆积作用稳定结合，所以，1-芘丁酸可以作为连接蛋白质和其他生物分子到碳材料上的一种手段。然而无论是石墨烯还是碳纳米管，它们的前期处理均较复杂且当其修饰到电极上时不易稳定，所以我们一直致力于研究一种制备过程简单且性能稳定的仿生传感器，

聚3,4-乙撑二氧噻吩-聚(苯乙烯磺酸(PEDOT-PSS),自20世纪80年代合成后，已被作为一种稳定的共价聚合物广泛使用，PEDOT电子传递速率高且极易成膜。研究表明，PEDOT作为修饰电极材料对酚类化合物，多巴胺，尿酸和吗啡等有良好的电催化性能。另外，PEDOT-PSS含有大π键的化学结构，可以通过π-π共轭作用有力的连接含有苯环的化合物，这样可同时发挥PEDOT促进电子传递的优良特性，但是目前通过PEDOT的π-π共轭作用制备仿生传感器还尚未发现。

发明内容

针对现有技术传感器制备过程复杂，且灵敏度不高等缺陷，我们的目的在于提供一种生物传感器、制备及其应用。

发明原理：通过对1-芘丁酸连接蛋白质到碳纳米管上的理论研究发现1-芘丁酸与碳纳米管之间存在π-π共轭作用，这种连接作用力稳定，且可同时发挥碳纳米管的优势，然而碳纳米管前期处理较复杂且当其修饰到电极上时不稳定，为了研发出制备过程简单且性能稳定的仿生传感器，我们探索到一种与碳纳米管类似的可通过π-π共轭作用连接1-芘丁酸的聚合物：聚3,4-乙撑二氧噻吩-聚(苯乙烯磺酸(PEDOT-PSS)，PEDOT-PSS性能稳定，电子传递速率高且极易成膜，制备过程简单。本发明第一次采用PEDOT作为电极修饰材料连接1-芘丁酸，在极性有机溶剂DMF中，1-芘丁酸可以不可逆地吸附到聚3,4-乙撑二氧噻吩（PEDOT）膜的疏水表面。基于以上考虑，我们首次利用π-π共轭效应，将1-芘丁酸与导电高聚物PEDOT相连，同时，利用ZrOCl₂可与羧基形成羧基-Zr⁴⁺-羧基配位键的性质，将血色素固定于1-芘丁酸上。

为了解决现有技术中的这些问题，本发明的技术方案是：一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，所述生物传感器是以血色素为主体、PEDOT为修饰材料、1-芘丁酸为中间连接剂，将PEDOT与1-芘丁酸通过π-π共轭作用连接，1-芘丁酸与血色素通过锆离子的配位化学作用形成的仿生传感器，其结构如下：

A:PEDOT；B：血色素；C：1-芘丁酸

一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的制备：包括以下步骤：

步骤一、玻碳电极抛光；

步骤二、通过循环伏安法将3,4-乙撑二氧噻吩（EDOT）聚合于玻碳电极上；

步骤三、将聚合完成后的电极取出后用超纯水淋洗，氮气吹干；

步骤四、将前期处理的电极浸泡于1-芘丁酸溶液中，溶剂为N,N-二甲基甲酰胺（DMF），然后分别在DMF和超纯水中震荡去除多余的1-芘丁酸和DMF溶液，之后氮气吹干；

步骤五、将修饰完1-芘丁酸的电极浸泡于氯氧化锆溶液中，然后用溶剂淋洗电极，氮气吹干；

步骤六、将血色素溶于DMF溶剂中，再将血色素溶液滴加到含水的电极表面，2～5℃的温度下静置1h，分别用DMF和超纯水淋洗，除去多余的血色素和DMF。

步骤二中所述的循环伏安法扫描电位为-0.2～1.2V，优选-0.1～1.0V，扫描速率为0.05～0.15V/s，优选0.1V/s，所述的聚合圈数为6～10圈，优选8圈。

步骤四中所述的1-芘丁酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml，优选1.0mg/ml，浸泡时间1～3h，优选2h。

步骤五中所述的氯氧化锆溶液浓度为0.5～1.5mg/ml，优选1.0mg/ml，浸泡时间为20～50min，优选30min。

步骤六中所述的滴加于电极表面的血色素浓度为0.05～0.15mmol/L，优选0.1mmol/L，电极表面的水与血色素的体积比为1:1，静置时间为30～100min，优选60min。

一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的应用，将上述结构的生物传感器应用于检测过氧化氢和多酚类化合物中。

本发明的有益效果为：

1、聚3,4-乙撑二氧噻吩（PEDOT）为导电高分子，可极大的促进电子转移，从而提高传感器的检测灵敏度。

2、PEDOT性能稳定且及易成模，采用它制备电极，工艺简单。

3、1-芘丁酸与PEDOT通过π-π共轭作用连接，π-π共轭作用力很强，可将1-芘丁酸稳定的连接到PEDOT上。

4、通过锆离子与羧基形成的配位作用，将血色素连接到1-芘丁酸上，这种锆离子配位作用极易形成，可在同等面积的电极表面结合更多的血色素。

5、整个仿生传感器制备主要采用聚合和浸泡的方法，这种方式操作简单，重复性好。

6、通过两种特殊的化学键连接血色素制成的传感器，稳定性好，可重复使用，且制备简单。

附图说明

图1是本发明中裸玻碳电极和实施例3、6、9中的修饰电极在50mmol/L[Fe(CN)₆]^-3/-4（1:1）的0.1mol/L的KNO₃溶液中的电化学交流阻抗图。

图2是本发明实施例9的修饰电极对邻苯二酚的时间电流曲线和浓度与电流的线性关系图。

图3是本发明实施例9的修饰电极对过氧化氢的时间电流曲线和浓度与电流的线性关系图。

具体实施方式

本实验采用导电聚合物PEDOT和1-芘丁酸制备的Hematin仿生传感器，制备过程简单，稳定。且通过实验证明，这种仿生传感器对邻苯二酚和过氧化氢均有极好的催化效果和较高的检测灵敏度，进一步说明此项发明的可行性。

实施例1：采用直径3mm的玻碳电极，将电极在0.05μm的氧化铝悬浮液中打磨至镜面，然后分别在乙醇和水中超声2min，氮气吹干后，将电极置于含有10mmol/L的EDOT和0.3mg/ml的PSS水溶液中，采用循环伏安法聚合EDOT于电极上，循环伏安法扫描电位为-0.2～0.8V，扫描速率0.05V/s，所述的聚合圈数为6圈。

实施例2：同实施例1，电极的前期处理过程不变，只改变循环伏安法聚合EDOT的扫描电位，设置扫描电位为0～1.2V，扫描速率0.15V/s，所述的聚合圈数为10圈。

实施例3:同实施例1，电极的前期处理过程不变，PEDOT膜的修饰，只改变循环伏安法聚合EDOT的扫描电位，设置扫描电位为-0.1～1.0V，扫描速率0.1V/s，所述的聚合圈数为8圈。

实施例4：1-芘丁酸与PEDOT膜π-π共轭效应的形成，取实施例3中的修饰电极浸泡于1-芘丁酸溶液中，1-芘丁酸的浓度为0.5mg/ml，浸泡时间1h，然后分别在DMF和超纯水中震荡去除多余的1-芘丁酸和DMF溶液，之后氮气吹干；

实施例5：1-芘丁酸与PEDOT膜π-π共轭效应的形成，取实施例3中的修饰电极浸泡于1-芘丁酸溶液中，1-芘丁酸的浓度为1.5mg/ml，浸泡时间3h，然后分别在DMF和超纯水中震荡去除多余的1-芘丁酸和DMF溶液，之后氮气吹干；

实施例6：1-芘丁酸与PEDOT膜π-π共轭效应的形成，取实施例3中的修饰电极浸泡于1-芘丁酸溶液中，优选1-芘丁酸的浓度为1.0mg/ml，取优选浸泡时间2h，然后分别在DMF和超纯水中震荡去除多余的1-芘丁酸和DMF溶液，之后氮气吹干；

实施例7：血色素的修饰，取实施例6中的电极浸泡于氯氧化锆溶液中，溶剂为60%的乙醇，氯氧化锆浓度为0.5mg/ml，浸泡时间为20min，之后用60%的乙醇淋洗以去除多余的锆离子，氮气吹干后，滴加浓度0.05mmol/L的血色素3μl，于4℃静置30min，之后分别用DMF和超纯水淋洗电极，氮气吹干。

实施例8：血色素的修饰，取实施例6中的电极浸泡于氯氧化锆溶液中，溶剂为60% 的乙醇，氯氧化锆浓度为1.5mg/ml，浸泡时间为50min，之后用60%的乙醇淋洗以去除多余的锆离子，氮气吹干后，滴加浓度0.15mmol/L的血色素5μl，于4℃静置100min，之后分别用DMF和超纯水淋洗电极，氮气吹干。

实施例9：血色素的修饰，取实施例6中的电极浸泡于氯氧化锆溶液中，溶剂为60%的乙醇，优选氯氧化锆浓度为1mg/ml，优选浸泡时间为30min，之后用60%的乙醇淋洗以去除多余的锆离子，氮气吹干后，滴加优选浓度为0.1mmol/L的血色素4μl，优选时间60min，于4℃静置，之后分别用DMF和超纯水淋洗电极，氮气吹干。

实施例10：采用甘汞电极做参比电极，铂丝电极做对电极，将裸玻碳电极和实施例3、6、9的电极分别在含有50mmol/L[Fe(CN)6]^-3/-4（1:1）的0.1mol/L的KNO₃溶液中扫描阻抗图谱：开路电位为0.19V，频率为10^-2～10⁵Hz，扫描速率为100mV·s^-1。

实施例11：仿生传感器对邻苯二酚的催化效率，本发明通过电流-时间曲线法（I-T），研究这种新型传感器对邻苯二酚的催化性能。首先向10ml的pH7.0的PBS缓冲液中充氮气20min，之后采用甘汞电极做参比电极，铂丝电极做对电极，实施例9的电极做工作电极的三电极体系对邻苯二酚进行检测，设置电位为0.2V，在500rpm搅拌的情况下，每隔80s加样一次，初始加样为0.99μmol/L，通过梯度浓度滴加的方式获得邻苯二酚的时间电流曲线。

实施例12:仿生传感器对过氧化氢的催化效率，同实施例11，对于过氧化氢的检测依然采用I-T法。本发明设置电位为-0.3V，在500rpm搅拌的情况下，每隔80s加样一次，初始加样为0.01mmol/L，通过梯度浓度滴加的方式获得过氧化氢的时间电流曲线。

应用例1：不同修饰电极的阻抗检测，将裸玻碳电极和实施例3、6、9的电极分别在含有50mmol/L[Fe(CN)6]^-3/-4（1:1）的0.1mol/L的KNO₃溶液中扫描阻抗图谱：开路电位为0.19V，频率为10^-2～10⁵Hz，扫描速率为100mV·s^-1。结果显示对于裸电极而言（图1，a线条），半圆直径为150Ω，当电聚合EDOT后，得到的阻抗图，半圆弧几乎消失，近似为一条直线（图1，b线条）说明PEDOT极大的增加了电极传递速率。之后随着1-芘丁酸（图1，c线条）和血色素的修饰（图1，d线条），阻抗略微增加，但仍比裸电极小很多，这直接说明PEDOT促进了血色素和电极之间的电子传递速率。然而图1b、c、d的阻抗依次略微增加，则是由于电极修饰层厚度的增加所致，从侧面说明1-芘丁酸和血色素均修饰于电极上，证明此项专利的可行性。

应用例2：仿生传感器对邻苯二酚的催化效率（图2），本发明通过电流-时间曲线法（I-T），研究这种新型传感器对邻苯二酚的催化性能。首先向10ml的pH7.0的PBS缓冲液中充氮气20min，之后采用甘汞电极做参比电极，铂丝电极做对电极，实施例9的电极做工作电极的三电极体系对邻苯二酚进行检测，设置电位为0.2V，在500rpm搅拌的情况下，每隔80s加样一次，初始加样为0.99μmol/L，通过梯度浓度滴加的方式获得邻苯二酚的时间电流曲线。实验表明，在邻苯二酚浓度0.5μmol/L～0.2mmol/L范围内，其与催化电流强度呈线性相关：S/N=时，i=0.01825C+0.00623,R=0.9998，检测灵敏度0.258μΑ·μM^-1·cm^-2，检测限为0.33nmol/L。

应用例3：仿生传感器对过氧化氢的催化效率（图3），同应用例2，对于过氧化氢的检测依然采用I-T法。本发明设置电位为-0.3V，在500rpm搅拌的情况下，每隔80s加样一次，初始加样为0.01mmol/L，通过梯度浓度滴加的方式获得过氧化氢的时间电流曲线。在过氧化氢浓度5μmol/L～1.322mmol/L范围内，其与催化电流强度呈线性相关：S/N=3时，i=-0.2C-0.0041,R=0.999，检测灵敏度为2.83μΑ·mM^-1·cm^-2，检测限0.03μmol/L。

Claims

1.一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，所述生物传感器是以血色素为主体、PEDOT为修饰材料、1-芘丁酸为中间连接剂，将PEDOT与1-芘丁酸通过π-π共轭作用连接，1-芘丁酸与血色素通过锆离子的配位化学作用形成的仿生传感器，其结构如下：

A:PEDOT；B：血色素；C：1-芘丁酸。

2.根据权利要求1所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，所述传感器通过以下步骤制备：

步骤一、玻碳电极抛光；

步骤二、通过循环伏安法将3,4-乙撑二氧噻吩聚合于玻碳电极上；

步骤四、将前期处理的电极浸泡于1-芘丁酸溶液中，溶剂为DMF，然后分别在DMF和超纯水中震荡去除多余的1-芘丁酸和DMF溶液，之后氮气吹干；

3.根据权利要求2所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，步骤二中所述的循环伏安法扫描电位为-0.2～1.2V，扫描速率为0.05～0.15V/s，所述的聚合圈数为6～10圈。

4.根据权利要求2所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，步骤四中所述的1-芘丁酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml，浸泡时间1～3h。

5.根据权利要求2所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，步骤五中所述的氯氧化锆溶液浓度为0.5～1.5mg/ml，浸泡时间为20～50min。

6.根据权利要求2所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器，其特征在于，步骤六中所述的滴加于电极表面的血色素浓度为0.05～0.15mmol/L，电极表面的水与血色素的体积比为1:1，静置时间为30～100min。

7.一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的制备，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、玻碳电极抛光；

8.根据权利要求7所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的制备，其特征在于，步骤二中所述的循环伏安法扫描电位为-0.2～1.2V，扫描速率为0.05～0.15V/s，所述的聚合圈数为6-10圈；步骤四中所述的1-芘丁酸溶液的浓度为0.5～1.5mg/ml，浸泡时间1～3h。

9.根据权利要求7所述的对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的制备，其特征在于，步骤五中所述的氯氧化锆溶液浓度为0.5～1.5mg/ml，浸泡时间为20～50min；步骤六中所述的滴加于电极表面的血色素浓度为0.05～0.15mmol/L，电极表面的水与血色素的体积比为1:1，静置时间为30～100min。

10.一种对过氧化氢和多酚类化合物高灵敏度检测的生物传感器的应用，其特征在于，将权利要求1所述的生物传感器应用于检测过氧化氢和多酚类化合物中。