CN103336043B - 一种过氧化氢生物传感器的制备方法 - Google Patents
一种过氧化氢生物传感器的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于一种过氧化氢生物传感器的制备方法,其制备方法如下,将玻碳电极用γ-三氧化二铝粉打磨,使其表面洁净;将石墨烯分散在壳聚糖-醋酸溶液中,得到石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液;取黑色悬浊液将其涂布到玻碳电极上,得到石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;将石墨烯-壳聚糖/玻碳电极置于含有氯化钴的离子液体Ethaline中,进行电沉积,得到钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;取血红蛋白溶解于壳聚糖-醋酸溶液中得到血红蛋白的壳聚糖溶液;将滴涂血红蛋白的壳聚糖溶液的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极晾干成膜得到目标修饰电极,即过氧化氢生物传感器;该传感器具有灵敏度高,生物相容性好,节约生物传感器构置成本的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物材料技术领域,具体涉及一种过氧化氢生物传感器的制备方法。
背景技术
过氧化氢不仅是食品、药物、环境分析中的重要成份,而且也是许多高选择性氧化酶的催化反应产物。因此,快速、准确的检测过氧化氢具有非常重要的意义。目前用于检测过氧化氢的方法很多,如滴定法、分光光度法、化学发光法、高效液相色谱法以及电化学方法。其中,电流型酶生物传感器由于构置方法简单、灵敏度高以及选择性好等优点而被广泛应用于过氧化氢的测定。酶的氧化还原活性中心与电极间的电子传递是制备酶电化学传感器的关键,前期研究是借助电子媒介体,由于电子媒介体在传感器的使用过程中容易渗漏,造成污染,近年来传感器的构建主要集中在借助适合的纳米材料实现酶与电极之间的直接电子传递,即第三代无电子媒介体生物传感器。该方法构置的关键是生物活性分子的固定化,生物分子固定方法的选择是影响生物传感器的稳定性、灵敏度和选择性的关键因素。在固定的材料的选择上,一般按照两个原则进行选择,其一是生物相容性好,其二是导电性能好。在目前的研究中,壳聚糖因为具有很好的生物相容性而被广泛的应用于生物传感器的构建,但是其导电性能差,因此需要与其它导电材料结合在一起作为传感器的构置材料,贵金属离子Au、Pt、Ag等广泛的应用于酶传感器的构建,但是贵金属离子价格昂贵,使得传感器构置成本增加。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷,而提供一种制作方法简单、线性范围宽,灵敏度高和节约生物传感器构置成本的一种过氧化氢生物传感器的制备方法。
本发明的目的是这样实现的:本发明的制备方法包括如下步骤:
步骤一:将玻碳电极用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨,将用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨后的玻碳电极用0.05微米的γ-三氧化二铝粉打磨光滑至镜面,将打磨至镜面的玻碳电极用蒸馏水将其表面冲洗干净,然后依次使用乙醇和水超声洗涤至电极表面洁净,在室温下干燥备用;
步骤二:将石墨烯分散在0.5%壳聚糖-醋酸溶液中,超声震荡30分钟,得到浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液;
步骤三:使用微量注射器取上述步骤二中的浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液,将其涂布到上述步骤一中得到的备用玻碳电极上,在空气中晾干即得到石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤四:将步骤三中制备好的石墨烯-壳聚糖/玻碳电极置于含有氯化钴的离子液体Ethaline中,在扫苏0.01V,电位范围为1.0到-1.4V进行电沉积20圈,沉积完成后,使用二次蒸馏水冲洗电极表面,室温晾干,即得到钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤五:取血红蛋白溶解于0.1%的壳聚糖-醋酸溶液中得到6mg·mL-1血红蛋白的壳聚糖溶液;
步骤六:用微量注射器取步骤五中所述的血红蛋白的壳聚糖溶液滴涂于上述步骤四中的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极表面;
步骤七:将步骤六中滴涂血红蛋白的壳聚糖溶液的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极放置于4℃冰箱中晾干成膜,即得到目标修饰电极:血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极,该修饰电极即为过氧化氢生物传感器。
所述步骤四中离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化胆碱和乙二醇按照质量比2∶1进行混合,在磁力搅拌下加热至60℃,20分钟后,形成透明无色溶液,即可。所述含有氯化钴的离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化钴放置在恒温为140℃的烘箱中烘干4小时,取烘干后的氯化钴0.1298克,将其超声溶解于10毫升的离子液体Ethaline中,即可。所述氯化钴为无水氯化钴。
本发明采用生物相容性好的壳聚糖-醋酸溶液分散导电能力好的石墨烯,在离子液体中电沉积纳米钴,作为构置传感器的材料,获得了钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极,具有制作方法简单,线性范围较宽,灵敏度较高,其生物相容性好,导电能力强,使用沉积纳米钴,代替贵金属离子,节约生物传感器构置成本的优点。
附图说明
图1为在离子液体中,沉积纳米钴的循环伏安曲线图;
图2为CS分散的石墨烯和离子液体沉积钴后的扫描电镜图;
图3为修饰电极在1.0mmol·L-1铁氰化钾和亚铁氰化钾溶液中的电化学阻抗光谱(EIS)图;
图4为所示为基于血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极的传感器在0.10~1.50V·s-1扫速下的循环伏安曲线图;
图5为待测溶液pH值在4.5~9.0范围内对该修饰电极的影响图;
图6为通过循环伏安法研究血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极上的血红蛋白对H2O2的电催化行为图。
具体实施方式
本发明为一种过氧化氢生物传感器的制备方法,现结合具体实施例对本发明进行进一步说明。具体的实施方式如下:
实施例1:
本发明的制备方法包括如下步骤:
步骤一:将玻碳电极用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨,将用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨后的玻碳电极用0.05微米的γ-三氧化二铝粉打磨光滑至镜面,将打磨至镜面的玻碳电极用蒸馏水将其表面冲洗干净,然后依次使用乙醇和水超声洗涤至电极表面洁净,在室温下干燥备用;
步骤二:将1毫克石墨烯分散在1毫升0.5%壳聚糖-醋酸溶液中,超声震荡30分钟,得到浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液;
步骤三:使用微量注射器取上述步骤二中的浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液5微升,将其涂布到上述步骤一中得到的备用玻碳电极上,在空气中晾干即得到石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤四:将步骤三中制备好的石墨烯-壳聚糖/玻碳电极置于含有氯化钴的离子液体Ethaline中,在扫苏0.01V,电位范围为1.0到-1.4V进行电沉积20圈,沉积完成后,使用二次蒸馏水冲洗电极表面,室温晾干,即得到钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤五:取6毫克血红蛋白溶解于0.1%的壳聚糖-醋酸溶液中得到6mg·mL-1的血红蛋白的壳聚糖溶液;
步骤六:用微量注射器取步骤五中所述的血红蛋白的壳聚糖溶液5微升,使其滴涂于上述步骤四中的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极表面;
步骤七:将步骤六中滴涂血红蛋白的壳聚糖溶液的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极放置于4℃冰箱中晾干成膜,即得到目标修饰电极:血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极,该修饰电极即为过氧化氢生物传感器。
所述步骤四中离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化胆碱20克和乙二醇36毫升即40克,进行混合,在磁力搅拌下加热至60℃,20分钟后,形成透明无色溶液,即可。
所述含有氯化钴的离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化钴放置在恒温为140℃的烘箱中烘干4小时,取烘干后的氯化钴0.1298克,将其超声溶解于10mL的离子液体Ethaline中,即可。所述氯化钴为无水氯化钴。
制备本发明需要使用电化学工作站和扫描电子显微镜,电化学工作站由上海晨华仪器有限公司制造,其型号为CHI660A;扫描电子显微镜由日本株式会社制造,其型号为JSM-6380。
如图1所示,步骤四中将步骤三中制备好的石墨烯-壳聚糖/玻碳电极置于含有氯化钴的离子液体Ethaline中,在扫苏0.01V,电位范围为1.0到-1.4V进行电沉积20圈,即可得到在离子液体中沉积纳米钴的循环伏安曲线图,由图可知,在-0.302V处,出现了钴的还原峰,氧化峰消失,这与文献报道的一致,证明纳米钴成功的沉积在了壳聚糖分散的石墨烯层上。
如图2所示,将步骤四中得到钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖纳米复合材料进行电镜扫描,即可得到壳聚糖分散的石墨烯和离子液体沉积钴后的扫描电镜图;利用扫描电镜对传感器的修饰过程进行了表征,可以观察到石墨烯在壳聚糖中得到了良好的分散,可以很明显的看到石墨烯的层状结构,当沉积了纳米钴离子后,石墨烯表面覆盖了大量直径在300-400nm的钴离子,纳米粒子表面呈现模糊状态,这是离子液体附着在沉积钴离子周围所致。使得传感器表面具有更大的比表面积,有助于电子的传输,使得传感器性能更加优越。
如图3所示,图3为修饰电极在1.0mmol·L-1铁氰化钾和亚铁氰化钾溶液中的电化学阻抗光谱(EIS)图;EIS是研究电极表面变化信息的有效手段,有曲线a所示,裸ITO电极几乎是一条直线,表明裸ITO电极的表面电阻值(Ret)非常小。当电极表面修饰上石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液纳米复合材料后,Ret增加到478Ω(曲线b),这是因为壳聚糖是一种高分子聚合物,阻碍了电化学探针Fe(CN)6 3-/4-的电子转移导致了表面电阻值(Ret)的增加,但是石墨烯可作为导电中心促进电子传递导致电阻值的降低。当电极表面修饰上离子液体电沉积的纳米钴时Ret明显降低(曲线c),这表明了离子液体电沉积纳米钴有助于促进电子传递。当电极吸附上血红蛋白后,Ret明显增加(1293Ω,曲线d),这可能是由于血红蛋白的绝缘特性阻碍了电子传递。修饰过程中Ret值的变化表明血红蛋白和钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖已经成功的修饰到了电极表面。
如图4所示,图4为所示为基于血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极的传感器在0.10~1.50V·s-1扫速下的循环伏安曲线图;随着扫速的增加氧化峰和还原峰电流均明显增加,且与扫速的一次方呈良好的线性关系,线性方程分别为Ipa(μA)=-6.1045-178.30v(V·s-1)(n=15,r=0.9996)和Ipc(μA)=22.4653+163.645v(V·s-1)(n=15,r=0.9997),说明该电化学过程受吸附控制,呈现出表面控制的薄层电化学行为。氧化还原峰电位随着扫描速率的增加逐渐发生移动,且氧化峰电位(Epa)和还原峰电位(Epc)分别与logv之间存在良好的线性关系,其线性方程分别为Epa(V)=0.1715logv-0.0479(n=16,r=0.9935)和Epc(V)=-0.3628logv-0.0645(n=16,r=0.9993)。根据Laviron理论求得Hb发生电极反应的电子转移数(n)和电子转移系数(α)分别为0.94和0.46。进一步利用Laviron公式,求得发生电极反应时电子转移速率常数(ks)为1.25s-1。当扫描速度从0.05增加到1.5V·s-1时,阴、阳极峰电流均线性增加,表明血红蛋白与电极间的电子转移过程受表面控制的电化学过程,进一步说明膜中电活性的血红蛋白Fe(III)/Fe(II)电对在没有物质传递控制下全部实现相互转化。
如图5所示,图5为待测溶液pH值在4.5~9.0范围内对该修饰电极的影响图;实验发现,随着pH的增加,催化电流值逐渐增大,当pH为7.0时催化电流值最大;继续增大溶液的pH,催化电流值逐渐减小。因此,本实验选定PBS测试底液的pH为7.0。
如图6所示,图6为通过循环伏安法研究血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极上的血红蛋白对H2O2的电催化行为图,通过循环伏安法研究了血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极上的血红蛋白对H2O2的电催化行为,从图中可知,在0.1V·s-1的扫速下,在空白PBS(pH7.0)中,观察到一对峰形良好且准可逆的氧化还原峰;随着测试溶液中H2O2浓度的增加,氧化峰电流值逐渐减小甚至消失,而还原峰电流值逐渐增加,此现象为催化H2O2的一个特征。由图可知,血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极上的血红蛋白催化还原H2O2的还原峰电流与H2O2浓度呈线性关系。该传感器性能优越的原因是:首先,离子液体既可以作为溶剂,沉积纳米颗粒;附着沉积的纳米材料上的离子液体又可以充当内导线的作用,使得传递电子速度增加。其次,石墨烯和离子液体电沉积纳米钴固载蛋白,能够捕获更多的酶蛋白到电极的表面,在保持了酶的活性的同时,增加了传感器的灵敏度。
Claims (4)
1.一种过氧化氢生物传感器的制备方法,其特征在于:其制备方法包括如下步骤:
步骤一:将玻碳电极用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨,将用0.3微米的γ-三氧化二铝粉打磨后的玻碳电极用0.05微米的γ-三氧化二铝粉打磨光滑至镜面,将打磨至镜面的玻碳电极用蒸馏水将其表面冲洗干净,然后依次使用乙醇和水超声洗涤至电极表面洁净,在室温下干燥备用;
步骤二:将石墨烯分散在0.5%壳聚糖-醋酸溶液中,超声震荡30分钟,得到浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液;
步骤三:使用微量注射器取上述步骤二中的浓度为1.0mg·mL-1的石墨烯-壳聚糖黑色悬浊液,将其涂布到上述步骤一中得到的备用玻碳电极上,在空气中晾干即得到石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤四:将步骤三中制备好的石墨烯-壳聚糖/玻碳电极置于含有氯化钴的离子液体Ethaline中,在扫速0.01V.s-1,电位范围为1.0到-1.4V进行电沉积20圈,沉积完成后,使用二次蒸馏水冲洗电极表面,室温晾干,即得到钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极;
步骤五:取血红蛋白溶解于0.1%的壳聚糖-醋酸溶液中得到6mg·mL-1血红蛋白的壳聚糖溶液;
步骤六:用微量注射器取步骤五中所述的血红蛋白的壳聚糖溶液滴涂于上述步骤四中的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极表面;
步骤七:将步骤六中滴涂血红蛋白的壳聚糖溶液的钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极,放置于4℃冰箱中晾干成膜,即得到目标修饰电极:血红蛋白/钴纳米离子/石墨烯-壳聚糖/玻碳电极,该修饰电极即为过氧化氢生物传感器。
2.根据权利要求1所述一种过氧化氢生物传感器的制备方法,其特征在于: 所述步骤四中离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化胆碱和乙二醇按照质量比2∶1进行混合,在磁力搅拌下加热至60℃,20分钟后,形成透明无色溶液,即可。
3.根据权利要求1或2所述一种过氧化氢生物传感器的制备方法,其特征在于:所述含有氯化钴的离子液体Ethaline的制备方法为:将氯化钴放置在恒温为140℃的烘箱中烘干4小时,取烘干后的氯化钴0.1298克,将其超声溶解于10毫升的离子液体Ethaline中,即可。
4.根据权利要求3所述一种过氧化氢生物传感器的制备方法,其特征在于:所述氯化钴为无水氯化钴。
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