CN107941881A - 基于三维石墨烯修饰电极的肌红蛋白电化学生物传感器制备及其电催化研究 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于三维石墨烯(3DGR)修饰电极的肌红蛋白（Mb）电化学生物传感器制备及其电催化研究，通过在离子液体碳糊电极（CILE）表面修饰3DGR构建了3DGR/CILE电化学传感界面，进一步将肌红蛋白（Mb）组装在该界面上，基于Mb/3DGR良好的电催化还原三氯乙酸（TCA）性能，实现了对TCA快速灵敏的电化学生物传感检测，该传感器线性范围为：16.0~80.0 mmol/L，检测限为：5.3 mmol/L。本发明的生物传感器生物相容性好、灵敏度高，制备方法简单、环境友好、成本低廉，可实现对TCA的高效检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种三维石墨烯修饰电极的肌红蛋白生物传感器制备与电催化研究。
背景技术
3DGR是由二维石墨烯之间相互交联形成的多孔网络的三维结构。近期研究发现,基于3DGR构建的功能器件在传感、环境和储能等领域表现出更为突出的性能。因而,新型3DGR材料已成为当前石墨烯的一个研究热点。目前，3DGR的制备主要包括化学气相沉积、界面自组装、溶液自组装和模板介导合成法等方法。3DGR不仅克服了石墨烯纳米片中经常会出现石墨烯聚集和堆叠的情况，还有很多可应用的优点，如三维结构的石墨烯具有优异的电荷传导能力、超低的密度和大的比表面积等。
Mb是由一条肽链和一个血红素辅基组成的结合蛋白是肌肉内储存氧的蛋白质，其由153个氨基酸残基组成，含有血红素，和血红蛋白同源，与氧的结合能力介于Mb和细胞色素氧化酶之间，可帮助肌细胞将氧转运到线粒体。血红素中的Fe(II)能与氧进行氧合作用。氧合作用是可逆的，所以Mb能够储存分子氧且增加其在细胞中的扩散速率。血红素蛋白质在电极上的直接电化学研究，对于理解和认识它们在生命体内的电子转移机制和生理作用、了解生物分子的结构和各种物理化学性质、开发新型第三代生物传感器和生物燃料电池以及生物电子学等均具有重要意义。
第三代电化学酶传感器具有灵敏度高、检测范围广和检测限低等优点，它是基于无媒介体的氧化还原蛋白质酶的直接电化学行为，通过检测酶与电极之间的直接电子转移为特征的生物传感装置，这种传感器无媒介体制作过程相对简单且无外加物质，是当前最理想的生物传感器。以氧化还原蛋白质的直接电化学为研究基础的第三代无媒介体传感器已成为电化学生物传感器研究领域的重要内容。
发明内容
本发明的目的在于提供一种3DGR修饰电极的电化学生物传感器的制备方法，利用所构建的电化学传感界面实现对TCA快速灵敏检测。
为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：
基于3DGR修饰电极的Mb生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
（1）制备基底电极：称取1.6 g石墨粉和0.8 g N-己基吡啶六氟磷酸盐（HPPF6）并加入500 μL液体石蜡作为粘合剂，放入研钵中充分研磨。待充分研磨将其填入内径为4 mm的玻璃电极管中，插入铜丝作为导线，将玻璃电极管中的固体混合物压实即得CILE。使用前将电极表面打磨成镜面；
（2）制备3DGR/CILE电化学传感界面：将步骤（1）制得的CILE表面通过涂布法修饰上3DGR悬浮液，晾干备用，即得3DGR/CILE电化学传感界面；
（3）固定Mb：在步骤（2）得到的3DGR/CILE电化学传感界面滴加配制的Mb溶液，自然晾干后滴加壳聚糖（CTS）溶液构建出用于对TCA快速灵敏检测的电化学生物传感器。
所述步骤（1）中，所述石墨粉1.6 g，HPPF6为0.8 g，液体石蜡500 μL。
所述步骤（2）中，所述3DGR为8 μL 0.8 mg/mL。
所述步骤（3）中，所述Mb溶液为8 μL 15 mg/mL，所述CTS为6.0 μL 15 mg/mL。
所述3DGR是采用以下步骤的制备方法制得：
将20 mL 2.0 mg/mL的氧化石墨烯水溶液混合，超声1h后转入50 mL的高压反应釜中于180℃加热12 h，室温冷却得到圆柱形3DGR水凝胶，用水和乙醇清洗三次后在-87℃冷冻干燥12 h，即得3DGR纳米材料。
本发明的生物传感器生物相容性好、灵敏度高，制备方法简单、环境友好、成本低廉，且可以实现对TCA的高效检测。
本发明提供上述用于对TCA快速灵敏检测的电化学生物传感器，检测时的具体操作包括以下步骤：以所述Mb修饰的电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，采用循环伏安法和交流阻抗法对修饰电极进行电化学测试，得到相应的循环伏安曲线图和交流阻抗谱图。
本发明所制备的Mb修饰的电化学生物传感器研究了Mb的直接电化学行为，其特征在于，使用pH为4.0的PBS缓冲溶液，扫速为0.1 V/s。
本发明 所述电化学交流阻抗法，其特征在于，所用电解质溶液为10.0 mmol L-1 K3[Fe(CN)6]和0.l mol L-1 KCl溶液。
一种基于3DGR修饰电极的Mb生物传感器制备与电催化研究，其特征在于，所构建的Mb/3DGR传感界面对TCA具有良好的电催化还原性能，实现了对TCA快速灵敏检测，所述TCA电催化还原的线性回归方程为：
Iss (µA)=3.61 C (mmol/L) + 8.69 (n = 17, γ= 0.999)
式中Iss是加底物后形成良好线性关系时的稳态电流，C是加入的底物浓度，所述TCA的线性范围为16.0~80.0 mmol/L，检测限为5.3 mmol/L。
附图说明
图1为本发明实施例中制得3DGR实物图和扫描电镜图。
图2为本发明实施例中制得3DGR的XRD图。
图3为本发明实施例中不同修饰电极(a) CTS/3DGR/CILE, (b) CTS/Mb/3DGR/CILE, (c) CTS/Mb/CILE, (d) CTS/CILE 在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5 mol/L KCl混合溶液中的循环伏安曲线，扫描速度0.1 V/s。
图4为本发明实施例的肌红蛋白生物传感器在制作过程中不同修饰电极(a) CTS/3DGR/CILE, (b) CTS/Mb/3DGR/CILE, (c) CTS/CILE and (d) CTS/Mb/CILE在10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的电化学阻抗图谱。
图5为本发明实施例的肌红蛋白生物传感器在制作过程中不同修饰电极(a) CTS/Mb/3DGR/CILE, (b) CTS/Mb/CILE, (c) CTS/3DGR/CILE (d) CTS/CILE 和 (e) CILE在pH4.0 PBS扫描速度0.1 V/s下的循环伏安曲线。
图6为本发明实施例的肌红蛋白生物传感器在制作过程中修饰电极在不同浓度三氯乙酸存在下的循环伏安图（a到k分别为（0, 16.0, 20.0, 25.0, 30.0, 35.0, 40.0,50.0, 60.0, 70.0, 80.0 mmol/L）；插图为催化还原峰电流与三氯乙酸浓度之间的关系曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1
制备CILE：称取1.6 g石墨粉和0.8 g离子液体（HPPF6）放入研钵中充分研磨均匀，把研磨好的混合物填入内径为4 mm玻璃电极管中，内插铜丝作为导线，将玻璃电极管中的固体混合物压实即可得到离子液体修饰的碳糊电极（CILE），使用前将电极表面打磨成镜面。
实施例2
制备3DGR：将20 mL 2.0 mg/mL的氧化石墨烯水溶液混合，超声1h后转入50 mL的高压反应釜中于180℃加热12 h，室温冷却得到圆柱形三维石墨烯水凝胶，用水和乙醇清洗三次后在-87℃冷冻干燥12 h，即得3DGR纳米材料。
3DGR的实物图和扫描电镜图如图1所示。图1A为3DGR前驱体水溶液，经过水热合成制备出3DGR如图1B，宏观上3DGR呈圆柱状多孔结构，微观上如图1C和图1D，3DGR呈现三维孔状结构，存在大小不一孔隙，形成错综复杂的孔道结构，该结构既能保证石墨烯本身所具有的高导电率等优异的性能，同时增加了石墨烯比表面积更好的为离子的扩散提供了更加快捷和畅通的通道；进一步对3DGR的结构进行XRD表征如图2所示，发现位于26.5°的位置出现一个衍射峰，此峰对应石墨类物质（0,0,2）晶面，前人的研究表明这个峰是石墨烯的特征峰，因此证明了3DGR的成功制备。
实施例3
制备修饰电极：取8 μL 0.8 mg/mL 3DGR的溶液滴涂在电极表面，自然晾干后在电极表面涂8 μL 15 mg/mL的Mb溶液，自然晾干后在电极表面涂6 μL 1.0 mg/mL CTS，即得修饰电极CTS/Mb/3DGR/CILE；用同样的方法制备CTS/CILE，CTS/Mb/CILE，CTS/ 3DGR/CILE。
实施例4
图3为不同修饰电极(a) CTS/3DGR/CILE, (b) CTS/Mb/3DGR/CILE, (c) CTS/CILE,(d) CTS/Mb/CILE在1.0 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-和0.5 mol/L KCl混合溶液中的循环伏安曲线。可以看到曲线(a) CTS/3DGR/CILE修饰电极的氧化还原峰电流值最大，这是因为CILE电极表面修饰3DGR加快电子传递速率，增加了电化学响应。
实施例5
电化学交流阻抗谱（EIS）能够有效提供电极表面修饰过程的阻抗变化信息，由阻抗图半圆的直径可获得电子转移电阻（Ret）。如图4所示分别为(a) CTS/3DGR/CILE, (b) CTS/Mb/3DGR/CILE, (c) CTS/CILE, (d) CTS/Mb/CILE的交流阻抗图。CTS/CILE的阻抗为51.14Ω，当3DGR加入到电极表面时，CTS/3DGR/CILE电极的阻抗变为28.33 Ω，这说明3DGR具有高导电性加快电子转移过程。CTS/Mb/CILE的阻抗值为79.85 Ω，说明电极上Mb的存在阻碍了铁氰化钾在电极表面的电子转移。而CTS/Mb/3DGR/CILE的阻抗值为44.46 Ω，阻抗值明显的减小也说明3DGR可以加快电子的转移。结果表明电极表面修饰不同物质导致了不同的界面电阻，也说明了修饰过程的完成。
实施例6
如图5所示，不同修饰电极在pH 4.0的PBS中的循环伏安图，曲线(c) CTS/3DGR/CILE,(d) CTS/CILE, (e) CILE上没有出现氧化还原特征峰，表明电极表面不存在电活性物质。在CTS/Mb/CILE（曲线b）上出现一对明显的非对称氧化还原峰，说明Mb和CILE之间存在电子传输。而在CTS/Mb/3DGR/CILE（曲线a）上出现一对良好且准可逆的氧化还原峰出现，氧化还原峰电位分别是Epc=-0.315V和Epa=-0.253V，峰电位差（ΔEp）为62 mV，式电位E0'=-0.284V（vs. SCE），氧化还原峰电流之比接近于1，表现出蛋白质内血红素辅基Fe(III)/Fe(II)氧化还原电对的特征电化学行为。
实施例7
以本发明实施例中制得的CTS/Mb/3DGR/CILE为工作电极，饱和甘汞电极（SCE）为参比电极，铂电极为对电极，组成三电极系统；将pH 4.0的PBS经过30分钟的氮气除氧后进行电化学检测，考察该修饰电极对TCA的电催化还原能力，结果如图6所示。在-0.278V左右随着TCA加入量的增加，还原峰电流明显增大，氧化峰逐渐消失，这是典型的TCA还原过程。还原峰电流和TCA的浓度在16.0~80.0 mmol L-1的范围内呈良好的线性关系，线性回归方程为Iss (µA)=3.61 C (mmol/L) + 8.69 (n = 17, γ= 0.999),检测限为5.3 mmol L-1，表明修饰电极对TCA具有良好的电催化性能。
Claims (10)
1.一种基于3DGR修饰电极的Mb电化学生物传感器制备及其电催化研究，所述生物传感器其特征在于：采用CILE为基底电极，在CILE表面修饰3DGR构建3DGR/CILE电化学传感界面，并进一步将Mb组装在该界面上，实现对TCA快速灵敏的电化学生物传感检测。
2.一种如权利要求1所述的基于3DGR修饰电极的Mb电化学生物传感器及其电催化研究，包括以下步骤：
（1）制备基底电极：称取1.6 g石墨粉和0.8 g N-己基吡啶六氟磷酸盐（HPPF6）并加入500 μL液体石蜡作为粘合剂，放入研钵中充分研磨，待充分研磨将其填入内径为4 mm的玻璃电极管中，插入铜丝作为导线，将玻璃电极管中的固体混合物压实即得CILE，使用前将电极表面打磨成镜面；
（2）制备3DGR/CILE电化学传感界面：将步骤（1）制得的CILE表面通过涂布法修饰上3DGR悬浮液，晾干备用，即得3DGR/CILE电化学传感界面；
（3）固定Mb：在步骤（2）得到的3DGR/CILE电化学传感界面滴加配制的Mb溶液，自然晾干后滴加壳聚糖（CTS）溶液构建出用于对TCA快速灵敏检测的电化学生物传感器。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述石墨粉1.6 g，HPPF6为0.8 g，液体石蜡500 μL。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所述3DGR为8 μL 0.8mg/mL。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述Mb溶液为8 μL15 mg/mL，所述CTS为6.0 μL 1.0 mg/mL。
6.根据权利要求2、4所述的制备方法，其特征在于：所述3DGR是采用以下方法制得：
将20 mL 2.0 mg/mL的氧化石墨烯水溶液混合，超声1 h后转入50 mL的高压反应釜中于180 ℃加热12 h，室温冷却得到圆柱形三维石墨烯水凝胶，用水和乙醇清洗三次后在-87℃冷冻干燥12 h，即得3DGR纳米材料。
7.一种如权利要求1~6所述用于对TCA快速灵敏检测的电化学生物传感器，检测时的具体操作包括以下步骤：以所述Mb修饰的电化学生物传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极作为对电极，建立三电极系统，将所述三电极系统与电化学工作站连接，将工作电极的检测端置于待测溶液中，采用循环伏安法和交流阻抗法对修饰电极进行电化学测试，得到相应的循环伏安曲线图和交流阻抗谱图。
8.采用权利要求书所制备的Mb修饰的电化学生物传感器研究了Mb的直接电化学行为，其特征在于，使用pH为4.0的PBS缓冲溶液，扫速为0.1 V/s。
9.权利要求书7中所述电化学交流阻抗法，其特征在于，所用电解质溶液为10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.l mol/L KCl溶液。
10.一种基于3DGR修饰电极的Mb生物传感器制备与电催化研究，其特征在于，所构建的Mb/3DGR传感界面对TCA具有良好的电催化还原性能，实现了对TCA快速灵敏检测，所述TCA电催化还原的线性回归方程为：
Iss (µA)=3.61 C (mmol/L) + 8.69 (n = 17, γ= 0.999)
式中Iss是加底物后形成良好线性关系时的稳态电流，C是加入的底物浓度，所述TCA的线性范围为16.0~80.0 mmol/L，检测限为5.3 mmol/L。
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