CN103926294B - Cs/il-gr修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备，其步骤包括CS/IL-GR/GCE的制备，MIPs/CS/IL-GR/GCE的制备；还公开了CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极在检测BSA的应用，以[Fe(CN)6]3-/4-作为电化学探针，采用电化学阻抗(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)对MIPs/CS/IL-GR/GCE的性能进行表征，该印迹电极对1.0×10-10-1.0×10-4g/L浓度范围内的BSA表现出良好的线性关系，探针的峰电流变化值ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)，R＝0.996，检出限达到了2.02×10-11g/L，本发明的有益效果为，基于IL-GR复合物的协同效应及壳聚糖分子与蛋白质分子的相互作用，印迹传感器表现出良好的选择性、灵敏度和重现性，可用于痕量样品的临床分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学传感器，尤其涉及CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其应用。
背景技术
分子印迹电化学传感器(MIECS)结合电化学传感器和分子印迹技术，以分子印迹聚合物作为生物识别元件来提高电化学传感器的灵敏度和选择性，目前已被成功用于印迹生物小分子。与此同时，印迹生物大分子尤其是印迹蛋白质分子，并将其应用于电化学检测引起了研究者们越来越多的关注。但是印迹蛋白质分子的电化学传感器或生物传感器的灵敏度，由于受到蛋白质分子尺寸大、结构多变和较低的再键合效率等限制，研究进展缓慢。
石墨烯(GR)由于比表面积大、电催化性能优异及生物相容性好，因而常被用来作为生物传感界面来制备性能优良的电化学生物传感器。离子液体(ILs)是由有机阳离子和阴离子组成的液体稳态盐，由于离子导电性高和生物相容性良好已经在电化学生物传感器中被广泛用于提高电化学响应，目前，已有报道IL-GR复合物在制备电化学传感器方面表现出更优异的性能，并已成功地用于制备MIECS。
壳聚糖(CS)，(1,4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖，是由甲壳素经过脱乙酰作用后形成的一种天然高分子。壳聚糖分子中含有大量性质活泼的氨基和羟基，利用壳聚糖丰富的-OH或-NH2与蛋白质分子中的-COOH通过氢键作用相结合，来达到在电极表面固定蛋白质分子的目的。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备及其在检测牛血清白蛋白(BSA)的应用，所制备的蛋白质分子印迹电化学传感器具有高灵敏度、高选择性和稳定性，具有良好的临床应用价值。
本发明是通过以下技术方案实现的：
CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备，其步骤如下：
(1)CS/IL-GR/GCE的制备：
将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al2O3粉抛光成镜面，用二次水冲洗电极表面，将冲洗后的电极在二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用；
将250μL的BmimPF6溶于已分散好的1.0mg/mL石墨烯水溶液中，超声分散均匀，制得离子液体-石墨烯复合物(IL-GR)溶液；然后在处理好的玻碳电极表面滴涂5.0μL的IL-GR水溶液，晾干后即得到IL-GR/GCE电极；
再在IL-GR/GCE电极表面滴涂5.0μL的含4％(w/V)壳聚糖的2％(V/V)的乙酸溶液，晾干，得壳聚糖修饰的IL-GR/GCE，即CS/IL-GR/GCE；
(2)MIPs/CS/IL-GR/GCE的制备
首先，将步骤(1)所得电极CS/IL-GR/GCE浸入含有1.0g/L BSA和吡咯单体的除氧磷酸盐缓冲液，在-0.2～1.2V电位范围内，以100mV/s的扫速循环伏安扫描至稳定，然后取出晾干，得到聚合物修饰的CS/IL-GR/GCE，即BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE；然后，将含有模板分子的印迹电极BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE浸入1.0M H2SO4溶液中，洗脱模板分子BSA，得到MIPs/CS/IL-GR/GCE；为了作为比较，采用上述方法用不同的修饰电极分别制备了BSAMIPs/CS/GR/GCE电极和BSAMIPs/CS/IL/GCE电极。
步骤(2)所述除氧磷酸盐缓冲液的pH＝7.0。
本发明还提供一种利用上述方法制备的分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE。
[Fe(CN)6]3-/4-能通过印迹聚合物形成的孔穴扩散进出分子印迹复合物，并达到电极表面产生氧化还原电化学信号，因此以[Fe(CN)6]3-/4-作为电化学探针通过差分脉冲伏安法(DPV)来考察所制备的印迹电化学传感器的性能。将制备的MIPs/CS/IL-GR/GCE浸没在不同浓度的BSA溶液中，培育120min保证蛋白质分子充分再键合到MIPs/CS/IL-GR/GCE上，在0.0～0.4V电位范围内，扫速为100mV/s条件下，在含有0.1mM[Fe(CN)6]3-/4-的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行的DPV测试，考察探针的峰电流变化值(ΔI)与BSA浓度的关系。所有的电化学实验都是在室温条件下进行的，BSA和HSA作为对比蛋白来考察MIPs/IL/GR/GCE的选择性。
CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极在检测BSA的应用，将分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE浸入含有BSA的血浆中培育120min进行键合，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子BSA的电化学响应的线性方程ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)比对，从而得到待测样品中BSA的含量。
本发明的有益效果为，本发明构建了一种新型分子印迹电化学传感器MIPs/CS/IL-GR/GCE并实现对牛血清白蛋白(BSA)的灵敏检测，采用电化学阻抗(EIS)和差分脉冲伏安法(DPV)对MIPs/CS/IL-GR/GCE的性能进行表征，该印迹电极在1.0×10-10-1.0×10-4g/L浓度范围内表现出良好的线性关系，ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)，R＝0.996，检出限达到了2.02×10-11g/L，结果表明印迹传感器表现出良好的选择性、灵敏度和重现性，可用于痕量样品的临床分析检测。
附图说明
图1为在含有BSA(1g/L)的PBS(pH＝7.0)中进行电聚合吡咯(0.1M)的CV图，其中，A为CS/GR/GCE，B为CS/IL/GCE，C为CS/IL-GR/GCE；
图2为不同处理电极在0.1mM[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的DPV图，其中a为MIPs/CS/IL-GR/GCE，b为MIPs/CS/IL-GR/GCE再键合BSA后，c为BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE；
图3为电化学阻抗谱(EIS)图，其中，a为BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE，b为MIPs/CS/IL-GR/GCE；
图4为MIPs/CS/IL-GR/GCE制备条件的优化图，其中A为吡咯单体浓度，B为扫描圈数，C为扫速；
图5为BSA在MIPs/CS/IL-GR/GCE上的响应电流变化值与BSA浓度的关系图，其中，内插图为不同浓度的BSA的DPV响应图；
图6为MIPs/CS/IL-GR/GCE对1.0×10-6g/L BSA、HSA和BHb的选择性结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。本发明采用的牛血清白蛋白和人血清白蛋白购于上海蓝季科技发展有限公司，牛血红蛋白购于国药集团化学试剂有限公司，1-丁基-3-甲基-六氟磷酸咪唑盐(BmimPF6)购于中科院兰州化物所，吡咯购于国药集团化学试剂有限公司，石墨烯为实验室自制，其他试剂均为分析纯，实验中所用溶液均由二次蒸馏水配制；CHI660C电化学工作站购自上海辰华仪器有限公司，经典的三电极工作体系：MIPs/CS/IL-GR/GCE作为工作电极，饱和氯化钾甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极；SK5200H型超声波清洗仪购自上海科导超声仪器，UV755B紫外可见分光光度计购自上海佑科仪器仪表有限公司，所有的电化学实验都是在pH＝7.0含有0.1mM[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸盐缓冲溶液中进行。
石墨烯制备，步骤如下：
(1)采用Hummer法由石墨制备氧化石墨，其步骤为：
取23mL浓硫酸，冷却到0℃，然后加入3g高锰酸钾和0.5g硝酸钠，混合均匀，冷却到0℃，加入0.5g膨胀石墨，在0℃保温24h，加热到35℃，搅拌30min，加入46mL去离子水，温度升至98℃，搅拌15min，可观察到混合物由黑色变为金黄色，用质量分数为30％的过氧化氢溶液中和氧化剩余的氧化剂，直至无气泡生成，静置，除去上清液，用0.1％稀盐酸洗至无SO4 2-，真空干燥。
(2)化学还原法制备石墨烯，其步骤为：
取步骤(1)制备的氧化石墨分散在二次水中离心分离30min，获得棕色的氧化石墨分散液(0.1wt％)，取20mL分散液在50℃下超声搅拌12h，然后在室温下冷却，向所述分散液中加入3.5μL水合肼和40.0μL氨水，缓慢升温至95℃，回流1h，过滤，依次用水和甲醇冲洗，干燥，得到石墨烯。
CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备，其步骤如下，如图1-3所示：
(1)CS/IL-GR/GCE的制备：
将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al2O3粉抛光成镜面，用二次水冲洗电极表面，将冲洗后的电极在二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用；
将250μL的BmimPF6溶于已分散好的1mg/mL石墨烯水溶液中，超声分散均匀，制得离子液体-石墨烯复合物(IL-GR)溶液；然后在处理好的玻碳电极表面滴涂5.0μL的IL-GR水溶液，晾干后即得到IL-GR/GCE电极；
再在IL-GR/GCE电极表面滴涂5.0μL的含4％(w/V)壳聚糖的2％(V/V)的乙酸溶液，晾干，得壳聚糖修饰的IL-GR/GCE，即CS/IL-GR/GCE；
(2)MIPs/CS/IL-GR/GCE的制备
首先，将步骤(1)所得电极CS/IL-GR/GCE浸入含有1g/L BSA和吡咯单体的除氧磷酸盐缓冲液，在-0.2～1.2V电位范围内，以100mV/s的扫速循环伏安扫描至稳定，然后取出晾干，得到聚合物修饰的CS/IL-GR/GCE，即BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE；然后，将含有模板分子的印迹电极BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE浸入1M H2SO4溶液中，洗脱模板分子BSA，得到MIPs/CS/IL-GR/GCE；为了作为比较，采用上述方法用不同的修饰电极分别制备了BSAMIPs/CS/GR/GCE电极和BSAMIPs/CS/IL/GCE电极。
步骤(2)所述除氧磷酸盐缓冲液的pH＝7.0。
如图1所示，在循环电位为-0.2～1.2V范围内以100mVs-1电聚合吡咯的循环伏安图，随着扫描次数的增加，修饰电极的电流逐渐减小，说明聚吡咯印迹膜已经在修饰电极表面形成。在对吡咯进行电聚合的过程中，蛋白质分子BSA中的-COOH先与修饰电极表面壳聚糖中的-NH2或-OH形成氢键，从而将模板蛋白质分子BSA固定在修饰电极表面；然后，吡咯中的-NH-与BSA中的-COOH形成氢键，形成功能性的吡咯单体，并通过电聚合在修饰电极表面形成含有BSA的刚性聚合物结构，当把模板蛋白质分子洗脱后，刚性聚合物上会形成能够特异性识别模板分子的印迹孔穴，从而选择性识别BSA。IL-GR修饰之后的玻碳电极的电流(图C)明显大于GR修饰的玻碳电极的电流(图A)和IL修饰的电极的电流(图B)，因为IL和GR之间的协同作用，使得IL-GR能进一步提高电极表面结合位点的活跃性，从而提高导电性使得电流增加。
为了研究分子印迹膜修饰电极制备过程中的变化，我们以[Fe(CN)6]3-/4-为电化学探针测试了不同制备阶段电极的DPV图，结果如图2所示，MIPs/CS/IL-GR/GCE的峰电流(曲线a)明显大于BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE的峰电流(曲线c)，该现象应该是由于模板分子BSA被洗脱后，导致印迹孔穴的产生，这些印迹孔穴可以作为探针[Fe(CN)6]3-/4-通过印迹聚合物膜到达电极表面的渗透通道；当MIPs/CS/IL-GR/GCE与模板分子BSA再键合后，电极的峰电流明显减小(曲线b)，是由于模板分子BSA再键合到印迹孔穴中，堵塞了探针[Fe(CN)6]3-/4-通过印迹聚合物膜到达电极表面的部分渗透通道，从而导致探针[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的氧化还原电流减小。
电化学阻抗(EIS)作为一种分析修饰电极界面性质的有效手段，能够用于表征传感器的构建过程。如图3所示，印迹电极洗脱模板分子前后的EIS：当把模板分子BSA从印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE表面洗脱后(曲线b)，其电子传递阻力明显小于未洗脱模板分子的印迹电极BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE的电子传递阻力(曲线a)，该现象可解释为印迹电极中模板分子BSA被洗脱后导致电极的导电性和电子传递速率增加，因为蛋白质BSA是非电活性物质，阻碍了电子传递，产生大的电子传递阻力；当模板分子被洗脱后产生了印迹孔穴，从而使电化学探针穿过聚合物膜到达电极表面产生电化学信号，图中电子传递速率的变化说明模板分子BSA已成功从印迹膜中洗脱，并形成了特异性的印迹孔穴。
本发明还提供一种利用上述方法制备的分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE。
MIPs/IL/GR/GCE制备条件的优化
为了制备高效的传感器，需要详细考察影响印迹电极活性的一系列因素，如聚合单体的浓度、电聚合圈数、扫描速度等，Fe[(CN)6]3-/4-在不同制备条件下制得的MIPs/CS/IL-GR/GCE上的峰电流响应能够表现出传感器的性能。
聚合单体浓度在聚合过程中影响着聚合物的沉积厚度和印迹分子的数量，将进一步影响传感器的电化学行为。为了研究吡咯浓度对MIECS的影响，电极在不同浓度的吡咯水溶液中(0.05M-0.12M，BSA浓度为定值1g/L)进行电聚合，结果如图4(A)，当吡咯浓度为0.10M时，[Fe(CN)6]3-/4-在MIECS上的响应峰电流最大，当吡咯浓度小于0.10M时，随浓度的减小，峰电流变小，可能是由于吡咯浓度太低导致在电聚合过程中没有那么多的BSA分子固定。当吡咯浓度大于0.10M时，随着浓度的增加，MIECS上的电流响应明显降低，是由于吡咯的浓度过大导致形成的印迹聚合物太过紧实不利于洗脱后印迹孔穴的形成。因此，制备MIECS的吡咯的最优浓度为0.10M；电聚合扫描圈数和扫速也是影响MIECS制备的重要因素，能够影响分子印迹聚合物的厚度和紧密度，本实施方式为了考察扫描圈数对聚合物膜厚度的影响，分别考察了2、3、4、5、6圈的影响，结果如图4(B)所示，聚合圈数过多导致聚合物膜的厚度太大，减少了有效的印迹孔穴，根据[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流的大小，最佳聚合圈数定为4圈；图4(C)所示的是扫速对峰电流的影响，扫速过小，导致制备的聚合物膜过于紧实，不利于洗脱模板分子形成印迹孔穴；但是如果扫速过快，导致形成的聚合物膜过于疏松，使得洗脱后形成的孔穴容易坍塌，因此，电聚合过程中的扫速设为80mV/s。
综上，将制备好的CS/IL-GR/GCE修饰电极浸入含有1g/L BSA的0.10M的吡咯水溶液中，在-0.2～1.2V电位范围内，扫速为80mV/s，采用循环伏安法电聚合4圈，然后在1M的H2SO4溶液中培养2h以洗脱模板分子BHb得到印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE。
CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极在检测BSA的应用，以[Fe(CN)6]3-/4-作为电化学探针，[Fe(CN)6]3-/4-探针能通过印迹聚合物形成的孔穴扩散进出分子印迹复合物，并达到电极表面产生氧化还原电化学信号，MIPs/CS/IL-GR/GCE被浸没在不同浓度的BSA溶液中，培育120min保证蛋白质分子充分再键合到MIPs/CS/IL-GR/GCE上，在0.0～0.4V电位范围内，扫速为100mV/s条件下，在含有0.1mM[Fe(CN)6]3-/4-的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液中进行的DPV测试，所有的电化学实验都是在室温条件下进行的，HSA和BHb作为对比蛋白来考察MIPs/CS/IL-GR/GCE的选择性。
以[Fe(CN)6]3-/4-作为电化学探针，采用差分脉冲伏安法来考察印迹电极对不同浓度的模板分子BSA的电化学响应的线性范围与灵敏度，如图5所示，MIPs/CS/IL-GR/GCE在不同浓度BSA溶液培育后的DPV电流响应图及其标准曲线，[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流随着BSA浓度的增加逐渐减小，其峰电流的变化值(ΔI)随BSA浓度的增大逐渐增大，说明BSA浓度增大导致印迹电极的导电性逐渐减小，是由于BSA与印迹孔穴再键合，阻碍了探针[Fe(CN)6]3-/4-通过印迹聚合物膜到达电极表面的渗透通道，从而导致印迹电极的导电性下降。结果表明：所制备的MIPs/CS/IL-GR/GCE的电化学响应值与模板分子BSA的浓度的对数(logCBSA)在1.0×10-4-1.0×10-10g/L浓度范围内呈现出良好的线性关系，线性方程为：ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)，R＝0.996，检出限为2.02×10-11g/L(3σ)。
为了考察MIPs/CS/IL-GR/GCE的选择性，本实施方式以1.0×10-6g/L BSA，HSA和BHb作为竞争蛋白，采用DPV法测定相应蛋白分子在MIPs/CS/IL-GR/GCE上的电流变化值(ΔI)。如图6所示，MIPs/CS/IL-GR/GCE对BSA分子的ΔI最大，为13.7μA，分别是HSA的10.6倍和BHb的14.2倍，这表明MIPs/IL/GR/GCE对模板分子BSA具有高的选择性，将该印迹电极在4℃环境下保存10天后仍能获得90％左右的初始峰电流，表明该印迹电极具有良好的稳定性。
为了探究制备的分子印迹电化学传感器的实际应用价值，用MIPs/CS/IL-GR/GCE对血浆样品中的BSA进行分析测定，具体方法为：将制备的印迹电极浸入含有BSA的血浆中培育120min，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子BSA的电化学响应的线性方程ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)比对，从而得到实际样品中的BSA的含量。采用标准加入法，在血浆中加入不同浓度的BSA标准溶液，用所制备的传感器检测加标后的血浆样品，实验结果如表1所示，6次检测的平均回收率为99.3％，说明该蛋白质分子印迹电化学传感器具有高度的准确性和重现性，可用于实际样品的临床分析。
表1血浆样品中BSA的检测
通过电化学聚合制得一种能够灵敏检测牛血清白蛋白(BSA)的新型的分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE，该印迹电极在1.0×10-10-1.0×10-4g/L浓度范围内表现出良好的线性关系，ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)，R＝0.996，检出限达到了2.02×10-11g/L，结果表明印迹电极表现出良好的选择性、灵敏度和重现性，可用于痕量样品的临床分析检测。
Claims (3)
1.CS/IL-GR修饰的牛血清白蛋白分子印迹电极的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)CS/IL-GR/GCE的制备：
将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3μm和0.05μm Al2O3粉抛光成镜面，用二次水冲洗电极表面，将冲洗后的电极在二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干备用；
将250μL的BmimPF6溶于已分散好的1.0mg/mL石墨烯水溶液中，超声分散均匀，制得离子液体-石墨烯复合物(IL-GR)溶液；然后在处理好的玻碳电极表面滴涂5.0μL的IL-GR水溶液，晾干后即得到IL-GR/GCE电极；
再在IL-GR/GCE电极表面滴涂5.0μL含质量分数为4％壳聚糖的体积浓度为2％的乙酸溶液，晾干，得壳聚糖修饰的IL-GR/GCE，即CS/IL-GR/GCE；
(2)MIPs/CS/IL-GR/GCE的制备
首先，将步骤(1)所得电极CS/IL-GR/GCE浸入含有1.0g/L BSA和吡咯单体的除氧磷酸盐缓冲液，在-0.2～1.2V电位范围内，以100mV/s的扫速循环伏安扫描至稳定，然后取出晾干，得到聚合物修饰的CS/IL-GR/GCE，即BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE；然后将含有模板分子的印迹电极BSAMIPs/CS/IL-GR/GCE浸入1.0M H2SO4溶液中，洗脱模板分子BSA，得到MIPs/CS/IL-GR/GCE；
步骤(2)所述除氧磷酸盐缓冲液的pH＝7.0；
所述吡咯浓度范围为0.05-0.12M，扫速为50-120mV/s，扫描圈数为2-6圈。
2.如权利要求1所述的方法制备的分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE。
3.如权利要求2所述的分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE在检测BSA的应用，其特征在于，将分子印迹电极MIPs/CS/IL-GR/GCE浸入含有BSA的血浆中培育120min进行键合，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子BSA的电化学响应的线性方程ΔI(μA)＝27.42+2.21logCBSA(g/L)比对，从而得到待测样品中BSA的含量。
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