CN103243367B

CN103243367B - 链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法

Info

Publication number: CN103243367B
Application number: CN201310184510.4A
Authority: CN
Inventors: 张娟琨; 陈怡�; 刘利娟
Original assignee: TIANJIN QIANFANG TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Tianjin Effect Technology Co., Ltd.
Priority date: 2013-05-17
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2033-05-17
Also published as: CN103243367A

Abstract

本发明涉及一种链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法，制备传感器的步骤如下：⑴玻碳电极预处理；⑵分子自组装膜修饰电极：将处理好的电极浸入聚合底液，通纯N₂10min后，在0～0.8V的电位区间内循环伏安扫描20圈，扫描速度为0.05V/s；⑶洗脱模板分子：采用上述步骤⑵修饰电极，再经70wt%乙醇溶液洗脱后，得到链霉素抗生素分子印迹生物传感器。本发明基于分子印迹技术，通过电化学聚合方法，利用循环伏安法以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体制备出分子印迹电极，建立了快速、灵敏的链霉素检测方法，为小型化和自动化、低检测限的电化学传感器的发明提供依据。

Description

链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法

技术领域

本发明属于化学分析领域，涉及生物传感器，尤其是一种链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法。

背景技术

链霉素（Streptomycin，STR）是一种氨基糖苷类抗生素，对于革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌，尤其是结核杆菌，具有显著的抗菌活性，在畜牧业和水产业中作为饲料添加剂和治疗动物疾病广泛应用。但是，链霉素对听神经有明显的毒性作用，能造成耳聋，对过敏胎儿更为严重，具有肾毒性，滥用、不遵守休药期、超量用药等造成的链霉素残留，会直接威胁人、畜的健康。STR残留物可存在于肉类、肝、肾、牛奶以及蜂蜜中。各国对STR残留限量都做出了明确规定，我国农业部2002年发布的第235号文件《动物性食品中兽药最高残留限量》规定链霉素在牛奶中残留限量为200μg/L，在肌肉、脂肪、肝中为600μg/kg，在肾中为1000μg/kg。

目前，国内外测定链霉素的主要方法有分光光度法、微生物法、免疫学检测法、液相色-串联质谱法（LC-MS/MS）和荧光衍生测定法等。虽然，一些理化检测方法比较灵敏、精确，但由于链霉素缺少较强的紫外吸收生色基团，检测前往往需要通过一系列的衍生方法进行处理，操作繁琐、耗时长；高效液相色谱仪、质谱仪等大型设备的使用，对发明人员要求较高，检测成本高。因此，建立一种快速、简便的检测方法对于链霉素残留检测是非常重要的。

分子印迹技术（molecularimprintingtechnique，MIT）亦称分子模板技术，是指以某一特定的目标分子为模板，制备对该分子具有特异选择性聚合物的过程。分子印迹技术自上世纪90代有了迅猛发展，分子印迹聚合物（MIPs）常作为传感器的识别元件或改性材料应用环境检测、抗生素检测等领域。电化学聚合电活性功能单体制备的分子印迹聚合物，既具有类似金属的特性，也保留了有机聚合物的性能，且与滴涂和旋涂等化学方法在导电基质表面聚合的MIP薄膜相比具有其优越性，如制备简单、膜厚可控、高重现性，以及在水溶液中聚合和操作的可行性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测灵敏度高、重现性好、选择性高的链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法，制备传感器的步骤如下：

⑴玻碳电极预处理：将玻碳电极抛光、清洗，然后将电极置于0.5mol/LH₂SO₄溶液中，在－1.0～＋0.8Ｖ电位区间内，以0.1V/s的扫速进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，得到具有活性的电极；

⑵分子自组装膜修饰电极

将上述处理好的电极浸入聚合底液，通纯N₂10min后，在0～0.8V的电位区间内循环伏安扫描20圈，扫描速度为0.05V/s；

所述聚合物底液为含有功能单体邻苯二胺、模板分子硫酸链霉素的PBS溶液，pH=5.0；

所述聚合底液中功能单体：模板分子的摩尔浓度比为4:1；

⑶洗脱模板分子

采用上述步骤⑵修饰电极，再经70wt%乙醇溶液洗脱后，得到链霉素抗生素分子印迹生物传感器。

而且，所述玻碳电极抛光、清洗的方法为：将玻碳电极在涂有0.05μmAl₂O₃浆液的麂皮上“8”字型抛光至镜面，水冲洗后，依次用1:1HNO₃、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗3min，以洗去电极表面残存的化学物质以及惰化层。

而且，所述步骤⑶洗脱15分钟。

而且，所述步骤⑵聚合底液中含有0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

而且，所述步骤⑵聚合物底液采用0.1mol/L的KCl溶液作为支持电解质。

本发明的优点和有益效果为：

1、本发明基于分子印迹技术，通过电化学聚合方法，利用循环伏安法以硫酸链霉素为模板分子、邻苯二胺为功能单体制备出分子印迹电极，建立了快速、灵敏的链霉素检测方法，为小型化和自动化、低检测限的电化学传感器的发明提供依据。

2、本发明使用的邻苯二胺能形成致密的刚性绝缘聚合膜，非常适合用于分子印迹，能提供亲水性、疏水性及其他的识别位点，但缓冲液中聚邻苯二胺膜对带正电荷的物质具有选择透过性，采用正电荷探针如[Ru(NH₃)₆]³⁺会干扰发明，故本发明中选取[Fe(CN)₆]^3-。铁氰化钾具有良好的电化学稳定性，可保证分析结果的可靠性。由图2可知，K₃[Fe(CN)₆]在洗脱处理后的非印迹膜表面几乎无响应（曲线d），而洗脱处理后的印迹膜峰电流（曲线b）较大，但与裸电极表面峰电流（曲线a）相比较小。

3、本发明制备的传感器经二次洗脱20min，重现的响应值可与原响应值基本一致，以此传感器对1.0μmol/L硫酸链霉素溶液平行测试4次，响应值的RSD为1.33%，显示了良好的重现性。此传感器在连续使用7次，最终响应值降到初始值的79.2%。

附图说明

图1-1和图1-2为本发明循环伏安电聚合曲线：其中，图1-1为邻苯二胺单体聚合；图1-2为邻苯二胺和链霉素聚合；

图2为本发明不同电极在K₃[Fe(CN)₆]溶液中的方波伏安图：（a）裸玻碳电极；（b）MIP/GCE；（c）MIP重键合STR后的电极；（d）NIP/GCE；

图3为本发明不同配比模板-单体配比对印迹膜性能的影响；

图4为本发明的标准曲线。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1

一种链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法，步骤如下：

⑴玻碳电极预处理

将玻碳电极在涂有0.05μmAl₂O₃浆液的麂皮上“8”字型抛光至镜面，水冲洗后，依次用1:1HNO₃、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗3min，以洗去电极表面残存的化学物质以及惰化层。最后将电极置于0.5mol/LH₂SO₄溶液中，在－1.0～＋0.8Ｖ电位区间内，以0.1V/s的扫速进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，得到具有活性的电极；

⑵分子自组装膜修饰电极

将上述处理好的电极浸入含有20mmol/L邻苯二胺（功能单体）、5mmol/L硫酸链霉素（模板分子）和0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=5.0）的聚合底液（其中0.1mol/L的KCl溶液作为支持电解质），通纯N₂10min后，在0～0.8V的电位区间内循环伏安扫描20圈，扫描速度为0.05V/s；

⑶洗脱模板分子

采用上述步骤⑵修饰的电极，再经70wt%乙醇溶液洗脱后，洗脱15分钟，得到链霉素抗生素分子印迹生物传感器；取出后再用双蒸水淋洗5min，以洗脱出模板分子，并在含有4mmol/LK₃[Fe(CN)₆]的PBS缓冲液中经循环伏安曲线比较洗脱效果。

实施例2

非印迹聚合膜（NIP）的制备，以实施例1同样的方法进行，但步骤⑵中不加入模板分子。

实施例3

与实施例1的区别在于：步骤⑶印迹膜的洗脱采用1mol/LNaOH溶液洗脱15分钟，在含有4mmol/LK₃[Fe(CN)₆]的PBS缓冲液中经循环伏安曲线比较洗脱效果。

实施例4

与实施例1的区别在于：步骤⑶印迹膜的洗脱采用1mol/LH₂SO₄溶液洗脱15分钟，在含有4mmol/LK₃[Fe(CN)₆]的PBS缓冲液中经循环伏安曲线比较洗脱效果。

以下内容对上述实施例制备的链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法的性能检测及比较。

1、电化学检测及标准曲线绘制

本发明中均以K₃[Fe(CN)₆]为探针，利用方波伏安法间接表征GC裸电极、MIP电极、MIP重键合后的电极和NIP电极的电流。通过测定吸附前后铁氰化钾方波峰的变化（ΔI），计算出K₃[Fe(CN)₆]相对峰电流与硫酸链霉素溶液浓度之间的关系，绘制标准曲线，进而可间接测得硫酸链霉素的含量。

2、印迹膜的选择性

将制得的印迹电极分别置于相同浓度的以庆大霉素和红霉素为干扰物的缓冲液中吸附后，方波伏安法检测。

3、印迹膜的重现性

使用同一支电极平行测定同一浓度硫酸链霉素溶液。印迹电极每次使用完后浸入0.1mol/LPBS缓冲液中室温下保存。

检测结果如下：

1、分子印迹的电聚合

图1-2(b)为链霉素在与邻苯二胺经电化学作用在玻碳电极表面沉积的电化学行为。随着扫描的进行，峰电流发生正移并且电流值迅速衰减，但是当扫描20圈，法拉第电流基本稳定，说明电极表面形成了低导电性致密的印迹聚合膜。对比图1-1(a)与图1-2(b)，MIP膜与NIP膜的CV曲线峰形、峰位置及变化的趋势相似，没有额外的峰出现，说明链霉素在0～0.8V的电位区间内没有参与电化学氧化反应，保证其在聚合膜中保持正确的三维结构、形成特异性识别位点。

2、印迹膜性能的分析

邻苯二胺能形成致密的刚性绝缘聚合膜，非常适合用于分子印迹，能提供亲水性、疏水性及其他的识别位点，但缓冲液中聚邻苯二胺膜对带正电荷的物质具有选择透过性，采用正电荷探针如[Ru(NH₃)₆]³⁺会干扰发明，故本发明中选取[Fe(CN)₆]^3-。铁氰化钾具有良好的电化学稳定性，可保证分析结果的可靠性。由图2可知，K₃[Fe(CN)₆]在洗脱处理后的非印迹膜表面几乎无响应（曲线d），而洗脱处理后的印迹膜峰电流（曲线b）较大，但与裸电极表面峰电流（曲线a）相比较小。结果说明，脱除模板分子STR后的印迹膜表面留有的空穴为K₃[Fe(CN)₆]扩散提供通道，当MIP电极重新浸入含有硫酸链霉素溶液中吸附一段时间后，硫酸链霉素在氢键、静电作用等作用下重新占据印迹空腔，导致方波峰电流值降低（曲线c）。

本发明中，尝试了不同的模板分子和功能单体的配比下电聚合制备印迹膜，并利用Spartan’08(v1.2.0)模拟模板-单体的预聚合，考察结合能（ΔE_f）的值，得到n(STR)：n(OPD)=1：4的条件下获得的印迹膜具有最负的能量值，可形成相对稳定的聚合物。这也在发明中得到证实，由图3可知，此条件下的制备的印迹膜相同条件洗脱前后可获得最大的峰电流变化值（Δi），增大了电流可变化限度，提高了发明的精确度。其他条件下可能出现功能单体量过少，难以将模板分子束缚印迹膜中，导致留有的空腔不足；功能单体量过大，洗脱时链霉素从交联结构中脱除受阻，印迹位点重键合时不易接近。

3、洗脱剂和洗脱时间的影响

从高交联度的聚合膜中去除模板分子的步骤对印迹位点的形成是非常重要的。链霉素易溶于水，不溶于大多数有机溶剂，分子结构中含有多羟基，通过氢键与邻苯二胺相互作用形成分子印迹聚合物，通过温和的溶剂即可去除模板分子。发明中选取了1mol/LNaOH溶液、1mol/LH₂SO₄溶液和75%的乙醇溶液作为洗脱剂，探讨不同洗脱方法对MIP膜制备的影响，选择出高效、快捷的洗脱方法。发明表明，洗脱时间相同，采用75%乙醇溶液进行一次洗脱，方波峰电流较大，对NIP膜的影响较小，洗脱15min后峰电流趋于稳定。

4、标准曲线的绘制

脱去模板分子的印迹电极放入含有一定浓度的硫酸链霉素溶液中吸附25min，取出后用双蒸水淋洗干净，置于K₃[Fe(CN)₆]溶液中检测电流。（图4）。

5、印迹膜的选择性

庆大霉素和硫酸链霉素同为氨基糖苷类抗生素，结构类似，而红霉素虽为大环内酯类，但其结构中多羟基，可与邻苯二胺单体形成氢键，故选取二者做干扰发明。5倍浓度的庆大霉素浓度和17倍浓度的红霉素浓度基本无影响。可见，硫酸链霉素传感器的选择性较好。

6、印迹膜的重现性

使用过的传感器经二次洗脱20min，重现的响应值可与原响应值基本一致，以此传感器对1.0μmol/L硫酸链霉素溶液平行测试4次，响应值的RSD为1.33%，显示了良好的重现性。此传感器在连续使用7次，最终响应值降到初始值的79.2%。

Claims

1.一种链霉素抗生素分子印迹生物传感器的制备方法，步骤如下：

⑴玻碳电极预处理

将玻碳电极在涂有0.05μmAl₂O₃浆液的麂皮上“8”字型抛光至镜面，水冲洗后，依次用1:1HNO₃、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗3min，以洗去电极表面残存的化学物质以及惰化层，最后将电极置于0.5mol/LH₂SO₄溶液中，在－1.0～+0.8V电位区间内，以0.1V/s的扫速进行循环伏安扫描，直至得到稳定的循环伏安响应，得到具有活性的电极；

⑵分子自组装膜修饰电极

将上述处理好的电极浸入含有20mmol/L邻苯二胺、5mmol/L硫酸链霉素和pH＝5.0的0.2mol/L磷酸盐缓冲液PBS的聚合底液，其中0.1mol/L的KCl溶液作为支持电解质，通纯N₂10min后，在0～0.8V的电位区间内循环伏安扫描20圈，扫描速度为0.05V/s；

⑶洗脱模板分子

采用上述步骤⑵修饰的电极，再经70wt％乙醇溶液洗脱后，洗脱15分钟，得到链霉素抗生素分子印迹生物传感器；取出后再用双蒸水淋洗5min，以洗脱出模板分子，并在含有4mmol/LK₃[Fe(CN)₆]的PBS缓冲液中经循环伏安曲线比较洗脱效果。