CN105466987B - 基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于金属配位的蛋白质分子印记电化学传感器的制备方法，设计蛋白质分子印记电化学传感器的制备及应用领域，本发明在石墨烯修饰的玻碳电极上修饰上壳聚糖与金属铜离子的配合物，通过电聚合法在修饰电极表面制备分子印迹聚合物膜，从而制备具有特异性选择识别能力的分子印迹电化学修饰电极，提高分子印迹电化学传感器的灵敏度，对模板分子具有快速、高灵敏性选择识别能力，可以实现临床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在线分析检测。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白子分子印迹电化学传感器的制备及应用领域，具体地说是一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法。
背景技术
分子印迹技术，是指以某一特定的目标分子（模板分子或印迹分子）为模板，制备对该分子具有特异选择性聚合物的过程。分子印迹聚合物具有预定性、专一识别性和实用性，因而被广泛地应用于分离分析、催化以及传感器等分析化学领域。分子印迹电化学传感器结合电化学传感器和分子印迹技术，以分子印迹聚合物作为生物识别元件来提高电化学传感器的灵敏度和选择性，目前已被成功用于印迹生物小分子。与此同时，印迹生物大分子尤其是印迹蛋白质分子，并将其应用于电化学检测引起了研究者们越来越多的关注。但是印迹蛋白质分子的电化学传感器或生物传感器的灵敏度，由于受到蛋白质分子尺寸大、结构多变和较低的再键合效率等限制，研究进展缓慢。
石墨烯由于比表面积大、电催化性能优异及生物相容性好，因而常被用来作为生物传感界面来制备性能优良的电化学生物传感器。
金属配位技术，金属离子能够特异性地与蛋白质中的某些基团形成配位键，可以利用蛋白质上的氨基酸残基与金属离子的相互作用来固定更多的模板蛋白质，从而在印迹电极表面产生更多的印迹识别活性位点，提高其灵敏性。
发明内容
为解决上述存在的技术问题，本发明提供一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，在石墨烯修饰的玻碳电极上修饰上壳聚糖与金属铜离子的配合物，通过电聚合法在修饰电极表面制备分子印迹聚合物膜，从而制备具有特异性选择识别能力的分子印迹电化学修饰电极，提高分子印迹电化学传感器的灵敏度，对模板分子具有快速、高灵敏性选择识别能力，可以实现临床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在线分析检测。
为达到上述目的，本发明采用的技术解决方案是：
一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，该蛋白质分子印迹电化学传感器由工作电极、参比电极和对电极组成，所述参比电极设置为饱和甘汞电极，所述对电极设置为铂丝电极，所述工作电极采用分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE，所述MIPs-Cu-CS/GR/GCE通过如下步骤制备：
（1）壳聚糖-铜离子配合物修饰电极Cu-CS/GR/GCE的制备：
选取玻碳电极，对其进行表面处理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，制得石墨烯修饰电极GR/GCE；在得到的GR/GCE表面滴涂壳聚糖-铜离子CS-Cu溶液，晾干后得到Cu-CS/GR/GCE；
（2）印迹聚合物膜修饰电极Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备：
将步骤（1）得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能单体和交联剂的除氧的磷酸盐缓冲液中，其中模板蛋白为浓度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能单体为浓度0.05~0.12mol/L的甲基丙烯酸，交联剂为浓度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~1.2 V电位范围内，以100 mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE；
（3）溶菌酶分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备：
将步骤（2）得到的Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入一定浓度洗脱液中，采用循环伏安法在电压-0.2V~ 1.2V、扫描速率100mV/s进行洗脱，溶菌酶分子Lyz被洗脱出来，得到MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
步骤（1）中所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的浓度为1 mg/mL，取5.0 µL。
步骤（1）中所述CS-Cu溶液，是将3 mg/mL壳聚糖乙酸溶液（2%，w/V）中加入0.01mol/L的CuSO4·5H2O，搅拌均匀使其变成澄清蓝色溶液，即为CS-Cu溶液。
步骤（3）中所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1.0 mol/L。
本发明还提供了一种由所述方法制备的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
本发明还提供了一种上述分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE在检测Lyz的应用，将MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入含有Lyz的血浆中培育60 min进行再键合，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子Lyz的电化学响应的线性方程∆I (µA) = 38.87 +3.42 log CLyz(g/L)比对，从而得到待测样品中Lyz的含量，其中电化学探针为[Fe(CN)6]3−/4−，浓度为1 mmol/L。
本发明制备的分子印迹电化学传感器，利用石墨烯优异的导电性来提高基底电极的灵敏度，利用金属配位技术，通过壳聚糖、铜离子、模板蛋白质分子间的相互作用，有效增加了印迹聚合物膜与模板蛋白质分子特异性结合的识别位点，从而提高了印迹电极的灵敏度和对模板蛋白质分子的选择性，且能够缩短再键合时间，对模板蛋白质分子具有快速、高灵敏性选择识别能力，应用其可以实现临床中溶菌酶蛋白Lyz的快速在线分析检测，该制备过程操作简单，条件温和， 适合推广应用。
附图说明：
图1为不同印迹电极在含有1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸盐缓冲液
中的差分脉冲伏安图（pH 7.0），扫速为100 mV/s，a为MIPs-Cu-CS/GR/GCE，b为MIPs/GR/GCE。
图2为不同印迹电极在含有1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸盐缓冲液中的电化学阻抗图（pH 7.0），频率为0.01 - 105 Hz，a为 MIPs-Cu-CS/GR/GCE, b为 MIPs-Cu-CS/GR/GCE再键合Lyz后，c为 Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
图3为[Fe(CN)6]3-/4-在MIPs-Cu-CS/GR/GCE（a）和MIPs/GR/GCE（b）上的峰电流随着再键合时间的变化情况。
图4为MIPs-Cu-CS/GR/GCE对1.0 × 10-6 g/L的Lyz，BSA，BHb和Cyt-C的选择性。
图5为[Fe(CN)6]3-/4-在MIPs-Cu-CS/GR/GCE上的响应电流变化值与Lyz浓度的关系。
具体实施方式：
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述：
本发明阐述了一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，该蛋白质分子印迹电化学传感器由工作电极、参比电极和对电极组成，所述参比电极设置为饱和甘汞电极，所述对电极设置为铂丝电极，所述工作电极采用分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE，所述MIPs-Cu-CS/GR/GCE通过如下步骤制备：
（1）Cu-CS/GR/GCE的制备
选取玻碳电极，先将玻碳电极在金相砂纸上打磨，然后在麂皮上依次用0.3 µm和0.05 µm Al2O3粉抛光成镜面，再用二次蒸馏水冲洗玻碳电极表面，并分别置于二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤20s，室温下晾干；取5.0 µL分散好的1 mg/mL石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，制得GR/GCE；在得到的GR/GCE表面滴涂5.0 µL分散好的CS-Cu溶液，晾干后得到Cu-CS/GR/GCE；
（2）Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备
将步骤（1）得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能单体和交联剂的除氧的磷酸盐缓冲液中，其中模板蛋白为浓度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能单体为浓度0.05~0.12mol/L的甲基丙烯酸，交联剂为浓度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~1.2 V电位范围内，以100 mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE；
（3）MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备
将步骤（2）得到的Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入1.0 mol/L的H2SO4洗脱液中，采用循环伏安法在电压-0.2V~ 1.2V、扫描速率100mV/s进行洗脱，溶菌酶分子Lyz被洗脱出来，得到MIPs-Cu-CS/GR/GCE，即为工作电极。
（4）分子印迹电化学传感器的制备
将步骤（3）得到的MIPs-Cu-CS/GR/GCE作为工作电极，和参比电极、对电极正确连接在电化学工作站上以组成分子印迹电化学传感器，所述参比电极为饱和氯化钾甘汞电极，对电极为铂丝电极。
作为优选的方式，步骤（1）中所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的浓度为1 mg/mL，取5.0 µL。
作为优选的方式，步骤（1）中所述CS-Cu溶液，是将3 mg/mL壳聚糖乙酸溶液（2%，w/V）中加入0.01 mol/L的CuSO4·5H2O，搅拌均匀使其变成澄清蓝色溶液，即为CS-Cu溶液。
作为优选的方式，步骤（3）中所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1.0 mol/L。本发明还阐述了采用上述方法制备的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
本发明还阐述了上述分子印记电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE在检测Lyz的应用，将MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入含有Lyz的血浆中培育60 min进行再键合，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子Lyz的电化学响应的线性方程∆I (µA) = 38.87 + 3.42log CLyz(g/L)比对，从而得到待测样品中Lyz的含量，其中电化学探针为[Fe(CN)6]3−/4−，浓度为1 mmol/L。
下面通过相应实验对本发明制备的分子印迹电化学传感器的电性能进行表征，作为对比，采用上述方法用不同的修饰电极制备了MIPs/GR/GCE。
为了研究分子印迹膜修饰电极的性能，测试了不同印迹电极的DPV图（MIPs-Cu-CS/GR/GCE和MIPs/GR/GCE）。如图1所示，MIPs-Cu-CS/GR/GCE（曲线a）与MIPs/GR/GCE（曲线b）相比，具有更大的[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流，这是由于把CS-Cu修饰到GR/GCE上后，CS-Cu能通过金属配位作用在电极表面固定更多的Lyz，从而产生更多的特异性识别位点，导致更多的[Fe(CN)6]3-/4-到达电极表面产生氧化还原电流，从而提高其灵敏性。
图2为不同印迹电极在含有1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-的磷酸盐缓冲液中的电化学阻抗图，用于表征传感器的构建过程。如曲线c，出现了较大的Nyquist圆弧，说明电聚合后得到的分子印迹聚合物膜对氧化还原探针产生大的电荷转移电阻。然而，曲线a中的Nyquist圆弧半径急剧减小，应该是由于模板分子洗脱后产生了印迹孔穴，为[Fe(CN)6]3-/4-探针通过印迹聚合物膜达到电极表面进行氧化还原反应提供了渗透通道。曲线c，再键合Lyz后，Nyquist曲线半径明显大于曲线a的，应该是由于Lyz在印迹孔穴中的再键合堵塞了探针[Fe(CN)6]3-/4-到达电极表面的通道。上述Nyquist曲线半径的变化表明印迹电极已经成功制备。
为了进一步研究分子印迹电极的效能，通过记录MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸没在1.0×10-3 g/L Lyz溶液中不同时间后的DPV峰电流响应来考察印迹电极的吸附动力学，MIPs/GR/GCE作为对比电极。如图3所示，在相同条件下MIPs-Cu-CS/GR/GCE（曲线a，32.8 和60min）比MIPs/GR/GCE（曲线b，21.0 和120 min）表现出更高、更快的电流响应，表示所制备的MIPs-Cu-CS/GR/GCE具有优异的灵敏度和快速响应能力。为蛋白质的实时快速在线分析检测提供了一种新方法。
为了考察MIPs-Cu-CS/GR/GCE的选择性，以1.0×10-6 g/L BSA，BHb和Cyt-C作为竞争蛋白，采用DPV法测定相应蛋白分子在MIPs-Cu-CS/GR/GCE上的峰电流变化值()。如图4所示，MIPs-Cu-CS/GR/GCE对Lyz分子的最大，分别是BSA的9.4倍，BHb的9.4倍，Cyt-C的5.8倍，这都表明MIPs-Cu-CS/GR/GCE对模板分子Lyz高的选择性。
此外，用不同浓度的Lyz溶液来检测制备的MIPs-Cu-CS/GR/GCE的灵敏度。如图5，随着Lyz浓度的增加（从1.0×10-10到1.0×10-4 g/L），MIPs-Cu-CS/GR/GCE上的电流变化值逐渐减小。线性方程为()= 38.87 + 3.42 log CLyz (g/L)，R=0.998检出限为3.3× 10-11 g/L（3σ）。这些结果表明制备的MIPs-Cu-CS/GR/GCE能够高灵敏度、高选择性地检测Lyz。
综上所述，本发明成功地制备了基于金属配位技术的溶菌酶分子印迹电化学传感器。该印迹电极是通过在Cu-CS/GR/GCE上电聚合含有模板分子Lyz的甲基丙烯酸溶液得到的。在模板蛋白质分子的电化学检测中该印迹电极表现出优异的灵敏度，高的选择性和快速的平衡响应，在1.0×10-10 - 1.0×10-4 g/L Lyz浓度范围内呈现出良好的线性，R=0.998，且检测限为3.3×10-11 g/L。因此，该技术为临床中Lyz的定量检测提供了一种可能的方法。
以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。凡采用等同变换或者等效替换而形成的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，该蛋白质分子印迹电化学传感器由工作电极、参比电极和对电极组成，所述参比电极设置为饱和甘汞电极，所述对电极设置为铂丝电极，所述工作电极采用分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE，所述MIPs-Cu-CS/GR/GCE通过如下步骤制备：
（1）壳聚糖-铜离子配合物修饰电极Cu-CS/GR/GCE的制备：
选取玻碳电极，对其进行表面处理，然后取分散好的石墨烯水溶液滴涂在玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，制得石墨烯修饰电极GR/GCE；在得到的GR/GCE表面滴涂壳聚糖-铜离子CS-Cu溶液，晾干后得到Cu-CS/GR/GCE；
（2）印迹聚合物膜修饰电极Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备：
将步骤（1）得到的Cu-CS/GR/GCE浸入含有模板蛋白、功能单体和交联剂的除氧的磷酸盐缓冲液中，其中模板蛋白为浓度1 g/L的溶菌酶Lyz，功能单体为浓度0.05~0.12 mol/L的甲基丙烯酸，交联剂为浓度0.01~0.2 mol/L的2-乙基-4-甲基咪唑，在-0.2 V ~ 1.2 V电位范围内，以100 mV/s的扫速循环伏安扫描5圈后取出晾干，得到Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE；
（3）溶菌酶分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE的制备：
将步骤（2）得到的Lyz@MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入一定浓度洗脱液中，采用循环伏安法在电压-0.2V~ 1.2V、扫描速率100mV/s进行洗脱，溶菌酶分子Lyz被洗脱出来，得到MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
2.根据权利要求1所述的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述石墨烯为石墨烯本体或经功能化的石墨烯，所述石墨烯水溶液的浓度为1 mg/mL，取5.0 µL。
3.根据权利要求1所述的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述CS-Cu溶液，是将3 mg/mL壳聚糖-乙酸溶液中加入0.01 mol/L的CuSO4·5H2O，搅拌均匀使其变成澄清蓝色溶液，即为CS-Cu溶液，其中乙酸溶液的质量体积比为2%。
4.根据权利要求1所述的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述洗脱液为硫酸溶液，其浓度为1.0 mol/L。
5.如权利要求1-4任意一项所述方法制备的基于金属配位的蛋白质分子印迹电化学传感器的分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE。
6.如权利要求5所述的分子印迹电化学修饰电极MIPs-Cu-CS/GR/GCE在检测Lyz的应用，其特征在于，将MIPs-Cu-CS/GR/GCE浸入含有Lyz的血浆中培育60 min进行再键合，然后将键合后的印迹电极在探针溶液中采用DPV法测其峰电流，根据探针峰电流的变化值与所得到的印迹电极对不同浓度的模板分子Lyz的电化学响应的线性方程∆I (µA) = 38.87 +3.42 log CLyz(g/L)比对，从而得到待测样品中Lyz的含量，其中电化学探针为[Fe(CN)6]3−/4−，浓度为1 mmol/L。
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