CN109374704B - 基于金属离子配位-分子印迹传感器的凝血酶检测方法 - Google Patents

基于金属离子配位-分子印迹传感器的凝血酶检测方法 Download PDF

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Abstract

一种基于金属离子配位‑分子印迹传感器的凝血酶检测方法，所述方法将金属离子配位‑分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对凝血酶的高灵敏检测。所述金属离子配位‑分子印迹修饰电极制备方法包括：（1）氧化法制得氧化石墨烯；（2）得到还原石墨烯修饰玻碳电极；（3）得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极；（4）得到过渡金属‑凝血酶配合物；（5）制得金属离子配位‑分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。本发明提供了一种基于金属离子配位、分子印迹的电化学传感器灵敏地检测非电活性物质凝血酶的方法。

Description

基于金属离子配位-分子印迹传感器的凝血酶检测方法
技术领域
本发明涉及一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器的凝血酶检测方法，属化学传感和电分析化学检测技术领域。
背景技术
凝血酶是一种广泛存在于哺乳动物血液凝固系统中的丝氨酸蛋白水解酶，可以催化体内纤维蛋白元转变成纤维蛋白，在创伤愈合、炎症、血液凝固等方面发挥着极其重要的作用，在临床上常用于毛细血管出血的局部止血和外科手术后组织的愈合，凝血酶的活性及浓度是衡量凝血机制是否健康的重要指标之一，在疾病早期诊断、疗效及愈后判断以及药物研究中具有十分重大的意义。
近年来，分子印迹电化学传感器虽然在生化分析、环境分析、食品和医药等领域的应用研究取得了较大的进展，但其选择性和灵敏度有待提高。过渡金属离子（如铜离子、锌离子、镍离子等）因为能与凝血酶一类的生物分子中的羰基和氨基等基团形成配位键稳定结构，对于生物体环境具有非常重大的意义。我们模拟这个生物结合过程制备金属离子-凝血酶配合物，利用金属离子配位作用和印迹膜特异性识别孔穴对目标分子的共识别能力，制备出结合能力强且选择性好的金属离子配位-印迹传感器。
为了提高分子印迹电化学传感器检测目标物的灵敏度，引入纳米材料如碳纳米管、金纳米粒子、石墨烯、纳米二氧化硅可有效增大分子印迹膜的比表面积而提高识别位点的数量，大大提高分子印迹电化学传感器的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是，为了建立灵敏度高、选择性高和稳定性好的测定非电活性物质凝血酶的方法，提供一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器检测凝血酶方法。
实现本发明的技术方案是，本发明选择石墨烯和金纳米粒子为电极的增敏纳米材料，然后通过Au-S键，将半胱氨酸修饰到电极表面，接着通过金属离子与半胱氨酸上的氨基及羰基进行配位将金属离子-凝血酶络合物结合到修饰电极上。最后在有机染料（如硫堇、甲苯胺蓝、耐尔兰）溶液里进行高电位阳极化并循环伏安扫描聚合形成聚合物膜。通过化学溶液洗脱金属离子-凝血酶后，制备出金属离子配位-分子印迹传感器。配位印迹传感器在金属离子溶液中结合后，再置于凝血酶溶液中孵育，利用金属离子和印迹孔穴的共识别效应，能增强传感器的识别能力。利用电聚合引入的电化学探针的指示作用，建立灵敏度高、选择性高和稳定性好的测定非电活性物质凝血酶的无试剂型金属离子配位-分子印迹电化学传感方法。
一种基于金属离子配位-分子印迹的传感器凝血酶检测方法，所述方法利用石墨烯/金纳米粒子复合纳米材料的增敏作用，金属离子配位作用和分子印迹形成的特异性孔穴的识别作用，分子印迹膜电化学探针的指示作用，将金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对凝血酶的高灵敏检测。
所述金属离子配位-分子印迹修饰电极制备方法的具体步骤如下：
（1）以石墨粉为原材料，通过Hummers 氧化法制得氧化石墨烯；
（2）将0.1～2.0mg/mL的氧化石墨烯2～20μL 滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干；然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8~ 0.4 V范围扫描5~40圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极；
（3）将还原石墨烯修饰玻碳电极置于0.2-1.0mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速20~200mV/s，电位范围为-1.1~0.2V，扫描5-50圈，得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极；
（4）取50~100μL浓度为0.05~0.5mg/mL的凝血酶与5~50μL浓度为0.01~0.10mol/L的过渡金属溶液混合，孵育0.5~5小时，得到过渡金属-凝血酶配合物；
（5）金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极置于2~20mmol/L的半胱氨酸溶液中浸泡6~30小时后冲洗干净；然后，将此修饰电极置于（4）的过渡金属-凝血酶配合物中反应2-20小时，取出冲洗并晾干；
（6）将（5）得到的修饰电极置于含有0.1~2.0mmol/L有机染料的磷酸缓冲溶液中（pH 5.0~ pH 8.0），在1.7~1.2 V阳极化200~800s，然后在0.2~-0.6V范围内聚合5~50圈；接着将修饰电极在5~50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐中洗脱5~50分钟，然后在0.01~0.1mol/LNaOH中洗脱5~50分钟，制得金属离子配位-分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。
所述传感器用于检测凝血酶的线性范围为2.0pg/mL～0.50ng/mL，检测限为0.80pg/mL。利用同一根玻碳电极制备三次传感器，测定其对凝血酶的响应电流，其相对标准偏差为3.4%，利用3根玻碳电极平行制备的分子印迹传感器对凝血酶测定的相对标准偏差为4.2%，说明该电极具有良好的重现性。该传感器置于4 ℃的环境中考察其稳定性，两周后，仍保留响应电流值的90%以上，表明该电极具有良好的稳定性。
所述有机染料为硫堇、耐尔兰或甲苯胺蓝。
本发明基于金属离子配位-分子印迹电化学传感器检测凝血酶的方法如下：
本发明利用金属离子与凝血酶的配位作用、分子印迹膜中与凝血酶相匹配的孔穴，对凝血酶的特异性结合后，导致电化学探针聚有机染料的电流变化，实现对凝血酶的检测，将前述的金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，即可实现对凝血酶的检测。
本发明的有益效果是，本发明金属离子配位作用和通过电聚合形成的聚有机染料分子印迹膜在石墨烯、金纳米粒子修饰的玻碳电极表面制备传感器，由于石墨烯/金纳米粒子复合纳米粒子的信号放大作用和聚有机染料的电化学探针作用，提供了一种基于金属离子配位、分子印迹的电化学传感器灵敏地检测非电活性物质凝血酶的方法。
本发明适用于金属离子配位-分子印迹的无试剂型电化学传感器测定凝血酶。
附图说明
图1为金属离子配位-分子印迹修饰电极制备流程图；
图2为不同修饰电极循环伏安曲线，（a）金属离子配位-分子印迹修饰电极洗脱前，（b）金属离子配位-分子印迹修饰电极洗脱后，（c）在凝血酶溶液中孵育后的金属离子配位-分子印迹修饰电极；
图3为传感器对过氧化氢的差分脉冲伏安曲线；
图4为传感器的响应电流对凝血酶浓度的校准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但决不限制本发明的保护范围。
实施例1
基于石墨烯/金纳米粒子的金属离子配位-分子印迹的传感器的制备，制备步骤如图1所示。
（1）以石墨粉为原材料，通过Hummers 氧化法制得氧化石墨烯。
（2）将0.1mg/mL的氧化石墨烯5μL 滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干。然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8~ 0.4V范围扫描20圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极。
（3）将还原石墨烯修饰玻碳电极置于0.2-1.0mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速20mV/s，电位范围为-1.1~0.2V，扫描20圈，得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极。
（4）取50μL浓度为0.2mg/mL的凝血酶与5μL浓度为0.01mol/L的硝酸锌溶液混合，孵育0.5小时，得到锌离子-凝血酶配合物。
（5）金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极置于4mmol/L的半胱氨酸溶液中浸泡15小时后冲洗干净。然后，将此修饰电极置于（4）的锌离子-凝血酶配合物中反应10小时，取出冲洗并晾干。
（6）将（5）得到的修饰电极置于含有0.2mmol/L耐尔兰的磷酸缓冲溶液中（pH6.0），在1.7~1.2V阳极化200s，然后在0.2~-0.6V范围内聚合10圈。接着将修饰电极在10mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐中洗脱10分钟，然后在0.1mol/L NaOH中洗脱5分钟，制得金属离子配位-分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。
实施例2
基于石墨烯/金纳米粒子的金属离子配位-分子印迹的传感器的制备。
（1）以石墨粉为原材料，通过Hummers 氧化法制得氧化石墨烯。
（2）将1.0mg/mL的氧化石墨烯3μL 滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干。然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8~0.4V范围扫描40圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极。
（3）将还原石墨烯修饰玻碳电极置于0.2mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速50mV/s，电位范围为-1.1~0.2V，扫描5圈，得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极。
（4）取50μL浓度为0.5mg/mL的凝血酶与5μL浓度为0.10mol/L的硝酸镍溶液混合，孵育1小时，得到镍离子-凝血酶配合物。
（5）金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极置于10 mmol/L的半胱氨酸溶液中浸泡6 小时后冲洗干净。然后，将此修饰电极置于（4）的镍离子-凝血酶配合物中反应20小时，取出冲洗并晾干。
（6）将（5）得到的修饰电极置于含有0.1mmol/L甲苯胺蓝的磷酸缓冲溶液中（pH5.0），在1.7~1.2V阳极化200s，然后在0.2~-0.6V范围内聚合10圈。接着将修饰电极在5mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐中洗脱50 分钟，然后在0.1mol/L NaOH中洗脱5分钟，制得金属离子配位-分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。
实施例3
基于石墨烯/金纳米粒子的金属离子配位-分子印迹的传感器的制备。
（1）以石墨粉为原材料，通过Hummers 氧化法制得氧化石墨烯。
（2）将0.5mg/mL的氧化石墨烯6μL 滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干。然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8~0.4V范围扫描20圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极。
（3）将还原石墨烯修饰玻碳电极置于0.5mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速50mV/s，电位范围为-1.1~0.2V，扫描15圈，得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极。
（4）取80μL浓度为0.2mg/mL的凝血酶与15μL浓度为0.05mol/L的硫酸铜溶液混合，孵育2小时，得到铜离子-凝血酶配合物。
（5）金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极置于10mmol/L的半胱氨酸溶液中浸泡24 小时后冲洗干净。然后，将此修饰电极置于（4）的铜离子-凝血酶配合物中反应10小时，取出冲洗并晾干。
（6）将（5）得到的修饰电极置于含有1.0mmol/L硫堇的磷酸缓冲溶液中（pH 6.0），在1.5V阳极化450s，然后在0.2~-0.6V范围内聚合40圈。接着将修饰电极在20mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐中洗脱15 分钟，然后在0.05mol/L NaOH中洗脱20分钟，制得金属离子配位-分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。
实施例4
将实施例3得到的传感器用于电化学测试：
（1）不同修饰电极的循环伏安测试。
分别将金属离子配位-分子印迹修饰电极洗脱前、金属离子配位-分子印迹修饰电极洗脱后、在凝血酶溶液中孵育后的金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）；扫描速度为0.1V/s。循环伏安图见图2，从图2可见，聚硫堇膜在约-0.2V处有一对氧化还原峰；在乙二胺四乙酸二钠盐和氢氧化钠溶液中洗脱后，聚硫堇的峰电流信号明显增大，因为印迹膜中的模板分子凝血酶被洗脱，留下特异性的识别孔穴，使得聚硫堇更容易与基底玻碳电极发生电子交换；洗脱后的金属离子配位-分子印迹的修饰电极在硫酸铜溶液中浸泡后，再浸入凝血酶溶液中孵育后，聚硫堇的峰电流又变小，因为一部分特异性识别孔穴与结合凝血酶结合而被占据，阻碍了聚硫堇在电极上的反应。
（2）传感器对凝血酶的差分脉冲伏安测试。将金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极；底液为0.2 mol/L PBS（pH 6.0）；扫描电位范围0.0～-1.0V，电位增量0.004V，振幅0.05 V，脉冲宽度0.05s，采样宽度0.02s，脉冲周期0.2s；将金属离子配位-分子印迹修饰电极置于差分脉冲测试底液中，扫描得到空白电流I 0，然后再将金属离子配位-分子印迹修饰电极在硫酸铜溶液中孵育结合后，置于一定浓度的凝血酶溶液中孵育后，再扫描得到电流I，则传感器的响应电流为ΔI=I- I 0，测定结果见图3和图4。测定凝血酶的线性范围为2.0pg/mL～0.50ng/mL，检测限为0.80 pg/mL。该传感器置于4℃的环境中，两周后，仍保留响应电流值的90%以上。

Claims (4)

1.一种基于金属离子配位-分子印迹传感器的凝血酶检测方法，其特征在于，所述方法将金属离子配位-分子印迹修饰电极为工作电极，参比电极为Ag/AgCl电极，辅助电极为铂电极，组成三电极体系，实现对凝血酶的高灵敏检测；
所述金属离子配位-分子印迹修饰电极制备方法的具体步骤如下：
(1)以石墨粉为原材料，通过Hummers氧化法制得氧化石墨烯；
(2)将0.1～2.0mg/mL的氧化石墨烯2～20μL滴至干净的玻碳电极表面，室温下自然晾干；然后将此修饰电极置于0.1mol/L KCl溶液中，在-1.8～0.4V范围扫描5～40圈，得到还原石墨烯修饰玻碳电极；
(3)将还原石墨烯修饰玻碳电极置于0.2-1.0mmol/L的HAuCl4溶液中，以扫速20～200mV/s，电位范围为-1.1～0.2V，扫描5-50圈，得到金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极；
(4)取50～100μL浓度为0.05～0.5mg/mL的凝血酶与5～50μL浓度为0.01～0.10mol/L的过渡金属溶液混合，孵育0.5～5小时，得到过渡金属-凝血酶配合物；
(5)金纳米粒子/还原石墨烯修饰玻碳电极置于2～20mmol/L的半胱氨酸溶液中浸泡6～30小时后冲洗干净；然后，将此修饰电极置于(4)的过渡金属-凝血酶配合物中反应2-20小时，取出冲洗并晾干；
(6)将(5)得到的修饰电极置于含有0.1～2.0mmol/L有机染料的磷酸缓冲溶液中，在1.7～1.2V阳极化200～800s，然后在0.2～-0.6V范围内聚合5～50圈；接着将修饰电极在5～50mmol/L乙二胺四乙酸二钠盐中洗脱5～50分钟，然后在0.01～0.1mol/L NaOH中洗脱5～50分钟，制得金属离子配位-分子印迹修饰电极，即为检测凝血酶的传感器。
2.根据权利要求1所述基于金属离子配位-分子印迹传感器对凝血酶检测方法，其特征在于，所述传感器用于检测凝血酶的线性范围为2.0pg/mL～0.50ng/mL，检测限为0.80pg/mL。
3.根据权利要求1所述基于金属离子配位-分子印迹传感器对凝血酶检测方法，其特征在于，所述有机染料为硫堇、耐尔兰或甲苯胺蓝。
4.根据权利要求1所述基于金属离子配位-分子印迹传感器对凝血酶检测方法，其特征在于，所述磷酸缓冲溶液的pH值为5.0～8.0。
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