KR100294665B1

KR100294665B1 - 글루타메이트측정용센서

Info

Publication number: KR100294665B1
Application number: KR1019980020640A
Authority: KR
Inventors: 박제균
Original assignee: 구자홍; 엘지전자 주식회사
Priority date: 1998-06-03
Filing date: 1998-06-03
Publication date: 2001-12-12
Also published as: KR20000000791A

Abstract

본 발명은 글루타메이트 측정용 센서로서, 뇌조직내 시냅스부위에서 분비되는 글루타메이트의 농도를 생체내에서 측정할 수 있는 센서에 관한 것이다.

본 발명에 의한 글루타메이트 측정용 센서는 전기화학적 전처리가 되있고, 또한 효소와 비전도성 고분자 중합막을 공유결합시킨 효소막으로 표면이 처리되어 있는 카본화이버를 전극물질로 사용하고 있다. 본 발명에 의하여 뇌조직내 시냅스부위에서 분비되는 글루타메이트의 농도를 신속, 정확히 측정할 수 있는 글루타메이트 측정용 센서를 제공되어질 수 있다.

Description

글루타메이트 측정용 센서{glutamate biosensor}

본 발명은 글루타메이트 측정용 센서로서, 보다 상세하게는 뇌조직내 시냅스부위에서 분비되는 글루타메이트의 농도를 측정할 수 있는 센서에 관한 것이다.

최근 21세기 미개척분야인 두뇌과학을 공학적, 과학적으로 접근하려는 노력이 활발히 전개되고 있는 데, 이 경우 그 기초적 분석도구로서 신경전달물질을 생체내 상태(in vivo)에서 직접 측정할 수 있는 센서기술은 대단히 중요하므로 뇌조직에 직접 삽입할 수 있는 센서에 대한 연구가 최근 활발히 진행중이다.

특히 글루타메이트 센서의 경우 두뇌손상과 관련한 신경장애등 신경과학분야에서 중요성이 매우 높아 생체내에서 측정가능한 글루타메이트 센서에 대한 요구가 증대되고 있다. 필수 아미노산중의 하나로 알려진 글루타메이트(L-glutamic acid)는 뇌속에 존재하는 대표적인 신경전달물질중의 하나로서 시냅스에서의 자극전달과정에 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히 시냅스 부위에서의 항상성(plasticity) 및 단위 신경세포인 뉴론(neuron)의 성장과 퇴화 등에 깊은 관련이 있다.

최근, 글루타메이트는 NMDA (N-methyl-D-aspartic acid)리셉터와 결합하여 체내의 칼슘이온(Ca²⁺)농도를 증가시켜 결국 NO(nitric oxide)을 생성시키는 효소인 NO 합성효소(NO syntase)의 활성화와 관계된다는 연구 결과가 보고된 바 있다.

NO는 포유동물의 몸에 편재되어있는 자유라디칼로서 발견되며 아르기닌( arginine)으로부터 합성되는 분자이다. 상기 NO는 뉴로트랜스미션(neurotransmission), 혈관확장, 마크로파지의 세포내 독소에 의한 세포파괴와 혈소판 응집의 억제 등의 다양하면서 많은 생물학적 활성에 참여하는 분자로서, 결과적으로는 신경장애를 일으킬 수 있는 물질이다.

이와 같이 두뇌손상과 관련된 신경장애에 글루타메이트가 깊게 관계되고 있어 신경과학(neuroscience)분야를 중심으로 뇌속에 존재하는 글루타메이트의 농도를 측정하려는 많은 노력이 기울여 왔다.

이와 관련한 대표적인 노력으로 마이크로다이알리시스(microdialysis)를 사용하여 체외에서 고성능 액체 크로마토그래피(High performance liquid chromatograpy ;HPLC)등과 같은 분석기기로서 글루타메이트를 정량하는 방법이 있다.

그러나 마이크로다이알리시스 방법을 이용하여 채취한 시료의 경우 실시간적으로 글루타메이트의 농도 변화를 추적하기는 어려운 단점이 있다. 일반적으로 글루타메이트와 같은 신경전달물질의 경우 그 농도변화가 미비하고 측정이 까다로운 어려움이 존재한다.

한편, 다른 신경전달물질인 카테콜아민(catecholamine)류, 즉 도파민(dopamine), 노르에피네프린(norepinephrine), 에피네프린(epinephrine)과 비교하면 글루타메이트는 그 자체적으로는 전기화학적으로 산화/환원될 수 없는 물질이다.

따라서 일반적으로는 글루타메이트의 농도 변화를 측정하기 위해서는 다음과 같은 효소반응을 이용할 수 있다.

글루타메이트의 농도 변화 측정에 이용가능한 효소로서는 글루타메이트산화효소(glutamate oxidase), 글루타메이트탈수소효소(glutamate dehydrogense), 글루타메이트탈탄산효소(glutamate decarboxylase) 그리고 글루타민합성효소(glutamine syntase)가 있으며 이들이 촉매로서 사용되는 글루타메이트의 생화학 반응을 이용하여 글루타메이트를 정량한다.

글루타메이트를 정량하는 방법으로서,

그 하나가 글루타메이트산화효소가 이용되는 하기의 반응식 1에 의한 반응에 의해 생성되는 과산화수소(H₂O₂) 혹은 소모되는 산소(O₂)의 농도를 측정하므로써 글루타메이트의 양을 측정하는 것이 있다.

L-글루타메이트 + O₂+ H₂O ---------> α- 케토글루타레이트 + NH₃+ H₂O₂

글루타메이트산화효소

또한, 위와 같은 글루타메이트산화효소 반응에 의해 생성된 α-케토글루타레이트(α-ketoglutarate)에서 연쇄적으로 글루타메이트탈수소효소(glutamate dehydrogenase)를 촉매로 사용한 반응식 2에 따른 반응을 이용하여 글루타메이트를 다시 생성시킴으로 인해 결과적으로 글루타메이트 정량의 측정감도를 높이는 연구도 보고된 바 있다.(타란타(Talanta ; 논문명) 38(1): 49-55, 1991)

L-글루타메이트+NAD(P)⁺+H₂O<----------->α-케토글루타레이트+NH₄ ⁺+NAD(P)H

글루타메이트탈수소효소

한편, 글루타메이트탈탄산효소(glutamate decarboxylase) 반응식 3에 의한 반응을 통하여 생성되는 이산화탄소의 양을 광섬유프로브를 이용하여 측정하고, 그 측정양을 통하여 글루타메이트를 정량하는 방법이 있다.

L-글루타메이트 --------------->γ-아미노부티레이트(aminobutyrate) + CO₂

글루타메이트탈탄산효소

또다른 방법으로, pH전극이나 ISFET(ion-selective field effect transistor)상에 글루타민합성효소(glutamine syntase)를 고정하여 글루타메이트를 정량하는 기술이 보고된 바 있다.

이와 같은 글루타메이트 정량법을 이용한 글루타메이트 측정용 센서의 개발연구는 간의 손상 및 간염 또는 간기능 저하를 판별해내는 임상진단용 센서나,또는 글루타메이트가 식품의 풍미를 증진시켜주는 대표적인 식품첨가제로서 사용되므로 이에 관련하여 식품관리용 센서에 주로 치중되어 왔다.

임상용이나 식품용으로 개발된 글루타메이트 센서의 경우, 플라티눔(platinum) 전극 또는 용존산소전극, ISFET 등을 트랜스듀서로 활용하여 이들 트랜스듀서의 감응부위에 상술한 글루타메이트산화효소, 글루타메이트탈수소효소, 글루타메이트탈탄산효소 그리고 글루타민합성효소 등을 고정화한 막을 부착시킨 형태로 개발되었다.

상기 임상용이나 식품용으로 개발된 센서의 경우 그 외형상 전극 크기가 너무 커서 뇌조직에 직접 삽입할 수 없으므로 뇌연구용으로는 적합하지 않다.

따라서, 상기 센서와 마이크로다이알리시스를 접목하여 체외에서 글루타메이트의 농도를 검출하고자 하는 노력도 기울여지고 있으나, 근본적으로 체외에서 측정되는 글루타메이트의 농도는 실제 체내에서 분비되는 글루타메이트의 빠른 농도변화를 대별해주지 못하는 단점이 있다. 더우기 다이얼리시스 튜빙(dialysis tubing)을 통한 완충용액의 농도 등은 글루타메이트의 실제 농도에 영향을 미쳐 정확한 농도 측정을 방해한다.

따라서 뇌연구용 센서의 경우, 보다 마이크로한 전극물질의 사용이 요구된다고 할 것이나 이로 인한 적은 양의 효소 사용에 대한 문제와 함께 전극간섭물질의 배제, 전극물질의 생체 적합성(生體適合性, biocompatibility) 및 그 사용기간 등에 대한 문제가 발생할 수 있다.

뇌조직에 직접 삽입할 수 있는 센서로 개발된 일례로는 미국 칸사스 대학에서는 글루타메이트산화효소와 아스코베이트산화효소(ascorbate oxidase)를 직경 250μm인 백금/이리디움(Pt/Ir)전선상에 고정화 시킨 마이크로전극이 있다.(Brain Research 659 : 117-125, 1994) 그러나 상기 센서의 경우 두가지 효소반응을 이용해야 하는 번거로움과 트랜스듀서로 사용한 백금/이리디움(Pt/Ir) 전극의 생체 적합성(生體適合性, biocompatibility) 정도가 아직 검증되지 못하여 그 단점으로 지적되고 있다.

생체시료의 신경전달물질을 측정하는 데 사용되는 전극물질로는 카본화이버가 많이 연구되고 있는 데, 카본화이버 전극은 전극특성이 우수하고 생체삽입이 용이하며 생체 적합성(生體適合性, biocompatibility)이 좋다. 따라서 카본화이버 전극의 표면을 나피온(nafion)으로 처리하여 도파민과 같은 카테콜아민류의 신경전달물질의 측정에 사용되고 있으나, 글루타메이트의 경우에는 몇몇 대학을 중심으로 연구가 진행중인 실정이다.

상기 카본화이버 전극을 이용하여 글루타메이트를 측정하는 데에는 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 글루타메이트 농도 측정의 경우 전술한 바와 같이 글루타메이트산화효소 등의 효소를 카본화이버 전극의 표면에 고정화시켜야 하는 데 이러한 효소의 고정화가 어렵다.

둘째, 생체시료중에 존재하는 다른 전극활성물질에 의한 신호간섭효과를 배제시켜야 한다. 왜냐하면 카본화이버 전극은 뇌조직과 같은 생체관련 시료에 많이 존재하는 아스코빅산이나 도파민과 같은 물질과도 반응하는 데, 이러한 반응으로 글루타메이트 양의 정확한 측정이 이루어지지 않게 되기 때문이다.

셋째, 글루타메이트산화효소 반응을 이용하여 글루타메이트의 농도를 측정하는 경우, 전술한 반응에서 생성되는 과산화수소(H₂O₂)에 대한 응답특성을 높이는 것이 요구된다. 상기 과산화수소에 대한 응답특성은 글루타메이트센서의 감도를 높이는 데 가장 중요한 기본 요소기술이나, 카본화이버전극이 아스코빅산이나 도파민과 같은 카테콜아민류등에는 잘 반응하지만 과산화수소에 대한 응답은 상대적으로 좋지 않으므로 과산화수소에 대한 응답특성을 향상시킬 필요가 있다.

본 발명은, 상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 뇌조직내 시냅스부위에서 분비되는 글루타메이트의 농도를 신속, 정확히 측정할 수 있는 글루타메이트 측정용 센서를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 의한 글루타메이트 측정용 센서의 개략도이다.

도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1...커넥터

3...유리피펫

5...구리선

7...절연성 에폭시

9...카본화이버

11...효소/고분자중합막으로 이루어진 감지부위

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 글루타메이트 측정용 센서는 전기화학적 전처리가 되있고, 또한 효소와 비전도성 고분자 중합막을 공유결합시킨 효소막으로 표면이 처리되어 있는 카본화이버를 전극물질로 사용한다.

이때, 상기 카본화이버는 푸루시안블루를 사용하여 전기화학적으로 수식될 수 있다.

상기 효소는 글루타메이트산화효소일 수 있다.

상기 비전도성 고분자 중합막은 m-페닐렌디아민(m-phenylenediamine)과 레조시놀(resorcinol)로 이루어진 중합막으로 구성된 중합막일 수 있다.

또한, 상기 글루타메이트 측정용 센서의 제조방법은 다음과 같다.

즉, (a)카본화이버전극을 전기화학적으로 전처리하는 단계와;

(b)상기 전기화학적으로 전처리된 카본화이버전극의 표면에 효소와 비전도성고분자 중합막의 공유결합막을 형성시키는 단계;

로 이루어진 제조방법이다.

이때, 상기 제조방법에는, 전술한 전기화학적으로 전처리된 카본화이버전극을 푸루시안블루를 사용하여 전기화학적으로 수식하는 단계를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 효소는 글루타메이트산화효소일 수 있으며, 또한 상기 비전도성 고분자 중합막은 m-페닐렌디아민과 레조시놀의 중합막일 수 있다.

이하, 본 발명의 구성에 대한 작용을 상세히 설명한다.

생체시료중의 글루타메이트는 글루타메이트산화효소반응에 의해 알파케토글루타레이트(α-ketoglutarate)를 생성함과 동시에 시료중에 녹아 있는 산소가 과산환수소(H₂O₂)로 전환되는 반응이 일어난다.

이때 글루타메이트의 정량은 일정 전압이 인가되어 있는 전극상에서 글루타메이트 산화효소에 의해 생성된 과산화수소가 산화될 때 변하는 전류를 측정하므로써 가능하게 된다.

따라서, 적절한 글루타메이트의 측정을 위해서는 글루타메이트산화효소를 카본화이버의 표면에 고정시키고, 뇌조직 등의 생체관련 시료에 존재하는 아스코빅산이나 도파민과 같은 글루타메이트 이외의 전극활성물질에 의한 간섭을 없애야 한다. 또한 전술한 바와 같이 글루타메이트의 정량이 상기 반응에 의해 생성된 과산화수소가 산화 혹은 환원될 때의 전류변화 측정을 통하여 이루어지므로, 전극물질의 과산화수소에 대한 응답특성을 높이는 것이 필요하다.

본 발명은 비전도성고분자(non-conducting polymer)인 m-페닐렌디아민과 레조시놀이 카본화이버 표면에서 전기화학적으로 중합될 때 일정량의 글루타메이트산화효소를 함께 첨가하여, 상기 효소분자가 m-페닐렌디아민과 레조시놀의 고분자중합막에 공유결합되어진 미세전극(microelectrode)을 제공함으로써 상기와 같은 문제를 해결한다.

상기 m-페닐렌디아민과 레조시놀의 고분자중합막은 카본화이버전극에서 효소를 고정시키는 결합체의 역할을 한다.

또한 상기 고분자중합막은 고분자막의 특성상 분자량이 작은 물질만 선택적으로 투과시킬 수 있다. 실험에 의하면 분자량이 비교적 큰 아스코빅산이나 도파민과 같은 카테콜아민류의 투과가 감소하였다. 따라서 m-페닐렌디아민과 레조시놀의 고분자중합막은 전기화학적으로 전처리시킨 카본화이버 전극이 아스코빅산이나 도파민과 같은 카테콜아민류 등에 잘 반응하는 반면. 과산화수소에 대한 응답은 상대적으로 좋지 않았던 종래의 단점을 해소할 수 있도록 전극간섭물질을 제거해주는 기능을 제공해줄 수 있다.

또한 본 발명에서는 상기 전극물질의 과산화수소 그 자체에 대한 응답특성을 향상시키기 위해 전극물질인 카본화이버를 푸루시안블루(prussian blue)로서 수식하였다. 이러한 수식은 또한, 적정한 측정전압(polarizing voltage)을 결정하는 데에도 도움을 준다.

본 발명의 m-페닐렌디아민과 레조시놀의 고분자중합막의 사용은, 나아가 종래의 신경전달물질 측정용 센서에서 생체시료를 오랜시간 측정하는 동안 시료중에 존재하는 단백질이나 전극생성물질에 의하여 전극표면이 오염되었던 문제점을 해소시킬 수 있게 하였다.

이하에서, 본 발명의 실시예를 통하여 글루타메이트 측정용 센서의 제조방법을 설명한다. 하기의 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위한 것이며 본 발명의 범위가 그에 한정되는 것은 아니다.

(실시예)

카본화이버 전극의 제작

직경 8-30μm의 카본화이버를 5cm정도의 크기로 잘라서 본 발명의 기본전극으로 사용하였다. 전극지지대로 사용된 유리관(외경 : 1.5mm, 내경 : 1mm)은 마이크로파이펫 풀러(micropipette puller)를 사용하여 미세가공한 후 카본화이버 외경보다 약간 크게 조절하였다.

카본화이버 한쪽 끝은 전도성 은(Ag)페이스트를 이용하여 전도성 구리선과 연결하여 측정장치와 연결될 수 있는 커넥터를 형성하고 100℃에서 10분간 소결하였다. 다음으로, 카본화이버를 미리 형성시켜 놓은 유리미세관에 삽입시키고 유리관 안쪽을 적당량의 에폭시(epoxy)로서 처리하여 소결, 절연시켰다. 유리미세관 끝에 외부로 노출된 카본화이버는 그 팁(tip)의 길이가 약 100-500μm정도가 되도록 현미경하에서 절단해서 카본화이버전극을 완성하였다.(제1도참조)

완성된 카본화이버 전극은 불순물이 그 표면에 존재할 수 있기 때문에 전기화학적으로 산화시켜 그 표면을 전처리하였다. 즉, 아세톤과 증류수로 전극표면을 번갈아 세척시킨 다음, 기준전극(Ag/AgCl), 백금선(platinum wire)으로 된 대전극(counter electrode), 그리고 카본화이버 전극을 지시전극(working electrode)으로하여 구성한 삼전극계를 사용하여 pH 7.4 인산완충용액(0.1M phosphate buffered saline)에서 Ag/AgCl 기준전극 대비 +3V에서 20초간, +2.4V에서 15초간, 마지막으로 +1.8V에서 10초간 70Hz 의 전원을 연속적으로 인가하여 전기화학적으로 전처리하였다. 전처리된 카본화이버전극은 전기화학적으로 안정하고, 재현성있는 전극특성을 얻을 수 있었다.

푸루시안블루(prussian blue)를 사용한 카본화이버 전극수식

과산화수소에 대한 응답 특성을 향상시키기 위하여 카본화이버를 푸루시안블루로서 다음과 같이 수식하였다.

기준전극(Ag/AgCl), 백금선으로 된 대전극 그리고 카본화이버전극을 지시전극으로 하여 구성한 삼전극계를 사용하여 1mM K₃[Fe(CN)₆]와 1mM HCl에 녹인 Fe(NO₃)₃가 1mM이 되도록 녹인 용액을 섞은 용액상에서 0~+2V가지 스캔 율(scan rate) 50mV/s로서 전압을 인가하여 시클릭 볼타메트리(cyclic voltammetry)를 수행한 후, 3mM HCl이 함유된 0.1M KCl 전해질 하에서 0~+0.4V 까지 스캔 율 50mV/s로서 전압을 인가하여 푸루시안블루 막을 형성하였다.

푸르시안블루가 수식된 카본화이버 전극은 +0.2V정도에서 과산화수소의 환원반응이, 그리고 +0.9V정도에서 과산화수소의 산화반응이 일어남을 알 수 있었다.

전기화학적 중합반응을 사용한 글루타메이트 산화효소의 고정화

효소는 스트렙토마이시스(streptomyces)에서 추출한 글루타메이트 산화효소(glutamate oxidase EC 1.4.3.11)를 사용한다. 글루타메이트 산화효소200mg을 인산완충용액 1ml에 녹인 후 여기에 카본화이버 전극을 이용하여 전기화학적으로 5mA/cm²의 전류원으로서 효소를 푸루시안블루가 수식된 카본화이버 표면에 흡착시킨다. 다음, 전기화학중합반응을 위한 고분자용액으로 m-페닐렌디아민과 레조시놀을 각각 3mM이 되도록 미리 용존산소를 제거시킨 인산완충용액상에서 제조한 후 이를 1:1로 섞은 후, 효소가 흡착된 카본화이버 전극을 고분자 용액에 담가 전기화학적 중합반응을 시켜 고분자-효소간의 공유결합층을 형성한다. 전기화학 중합반응은 Ag/AgCl 기준전극 대비 +900mV를 10분간 카본화이버 전극에 인가하므로서 이루어진다.

효소고정화의 다른 방법으로 효소의 흡착반응없이 일정용액의 효소액과 고분자 혼합액을 동시에 섞은 상태에서 같은 조건으로 전기화학 중합반응을 할 수 있다. 단, 이 경우 효소의 농도를 조절하는 것이 매우 중요하다.

또 다른 방법으로는 상기에서 제조한 글루타메이트산화효소액을 0.1% 나피온(Nafion)용액과 함께 푸루시안블루가 수식된 카본화이버 표면에 흡착시킨 다음 역시 같은 방법으로 전기화학적 중합반응을 시켜 고분자-효소간의 공유결합층을 형성할 수 있다.

전기화학중합반응이 끝난 전극은 증류수로 두세번 세척한 후 +4℃에서 보관하면서 글루타메이트 측정실험에 사용한다.

글루타메이트의 측정에 있어, 과산화수소의 환원반응을 이용하는 경우는 pH 7.4 인산완충용액(0.1M phosphate buffered saline)을 사용하여 37℃ 글루타메이트 표준용액의 센서표준검정곡선을 구할 수 있는 데, 기준전극 대비 +0.2V 정도의 전압하에서 과산화수소의 환원반응을 측정함으로서 글루타메이트의 농도를 구할 수 있다.

또한, 과산화수소의 산화반응을 이용하는 경우는 기준전극 대비 +0.9V 정도의 전압하에서 과산환수소의 산화반응을 측정함으로서 글루타메이트의 농도를 구할 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 의하면, 전기화학적 측정방법을 이용한글루타메이트 측정용 센서에 있어서 전극물질에 효소를 적절히 고정시키고, 다른 전극활성물질에 의한 신호간섭효과를 배제하며, 전극의 과산화수소에 대한 응답특성을 높여 결과적으로 글루타메이트센서의 감도를 높일 수 있다.

Claims

전기화학적으로 전처리되어 있는 카본화이버 전극;

상기 카본화이버 전극 표면에 형성된 글루타메이트 산화효소, 글루타메이트 탈수소효소, 글루타메이트 탈탄산효소 및 글루타메이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소와, m-페닐렌 디아민 및 레조시놀로 이루어진 비전도성 중합고분자가 공유결합하여 구성된 중합막; 및

상기 중합막에 고정된 효소들이 대상 분자와 반응하는 동안 발생하는 전기화학적 변화량을 직접 또는 간접적으로 측정하는 전기화학적 장치를 포함함을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 센서.
제1항에 있어서, 상기 카본화이버는 푸루시안블루를 사용하여 전기화학적으로 수식된 카본화이버 전극임을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 센서.
제1항에 있어서, 상기 효소는 글루타메이트 산화효소임을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 센서.
(a) 카본화이버 전극을 전기화학적으로 전처리하는 단계;

(b) 상기 전기화학적으로 전처리된 카본화이버 전극의 표면에 글루타메이트 산화효소, 글루타메이트 탈수소효소, 글루타메이트 탈탄산효소 및 글루타메이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 효소와, m-페닐렌 디아민 및 레조시놀로 이루어진 비전도성 중합고분자가 공유결합된 중합막을 형성시키는 단계; 및

(c) 상기 형성된 전극을 전기화학적 장치에 연결시키는 단계를 포함하는 글루타메이트 측정용 센서의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 전기화학적으로 전처리된 카본화이버 전극에 푸루시안블루를 사용하여 전기화학적으로 수식하는 단계를 더욱 포함하는 글루타메이트 측정용 센서의 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 효소는 글루타메이트 산화효소임을 특징으로 하는 글루타메이트 측정용 센서의 제조방법.