CN106950270A - 一种cea浓度检测探针及其制备方法与应用，及cea浓度检测生物传感器 - Google Patents

一种cea浓度检测探针及其制备方法与应用，及cea浓度检测生物传感器 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种CEA浓度检测探针，所述CEA浓度检测探针包括CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子，所述CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子通过交联剂复合在一起，所述CEA适配体含有5’‑ATACCAGCTTATTCAATT‑3’的核苷酸序列且5’端修饰了5’‑NH2，所述羟基磷灰石纳米粒子为表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子。所述CEA浓度检测探针所包含的羟基磷灰石和适配体能分别与钼酸钠反应产生电化学信号，实现双重信号放大，提高检测的灵敏度。将所述CEA浓度检测探针应用于制备用于检测CEA浓度的生物传感器时，具有检测灵敏度高、检测限低，检测范围广的优点。

Description

一种CEA浓度检测探针及其制备方法与应用，及CEA浓度检测 生物传感器
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及癌胚抗原(CEA)浓度的检测领域，尤其涉及一种CEA浓度检测探针及其制备方法与应用、一种CEA浓度检测生物传感器及其制备方法。
背景技术
癌胚抗原(CEA)是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预后估计是一个较好的肿瘤标志物。97％的健康成人血清CEA浓度在2.5μg/L以下，45％～80％的原发性结肠癌患者血清CEA浓度会升高。除原发性结肠癌以外，50％～70％的胰腺癌、胆管癌、胃癌、食管癌、腺癌、肺癌、乳腺癌和泌尿系统肿瘤患者的血清CEA浓度也会升高。因此，人体血清中CEA浓度指标可被用于间接表征和预示某种癌症疾病，通过获取人体血清中CEA浓度指标可与其它参数指标结合间接用于针对某些癌症疾病，不一定与诊断结果构成一一对应的关系。
传统的测定CEA的方法有荧光免疫分析、放射免疫法，酶联免疫检测法等。这些检测方法虽然在一定程度上灵敏有效，但对技术要求高，耗时耗力，且对仪器有一定的要求，各自具有一定的局限性。相比以上方法，电化学检测法具有仪器简单、操作方便以及灵敏度高等优点。但是，现有的电化学检测法主要采用单重信号检测方式，仍存在灵敏度检测较低、检测限较高，检测范围窄等问题。
发明内容
针对现有技术采用传统方法检测CEA浓度存在的不足，本发明的目的在于提供一种选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽的CEA浓度的检测电极的制备方法及该CEA浓度检测电极在检测CEA浓度时的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种CEA浓度检测探针，所述CEA浓度检测探针包括CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子，所述CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子通过交联剂复合在一起，所述CEA适配体含有5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’的核苷酸序列，且5’端修饰了5’-NH2，所述羟基磷灰石纳米粒子为表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子。
进一步的，所述交联剂为戊二醛。
羟基磷灰石纳米粒子，具有比表面积大的优点，能结合大量适配体分子，促进信号放大，增强了灵敏度，降低检测限。制备的CEA浓度检测探针所包含的羟基磷灰石和适配体能分别与钼酸钠反应产生电化学信号，实现双重信号放大，提高检测的灵敏度。
所述交联剂分别与壳聚糖膜中的氨基和CEA适配体中5’-NH2发生反应，使CEA适配体与表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子复合在一起。
为实现本发明的目的，本发明还提供一种CEA浓度检测探针的制备方法，包括如下步骤：将表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子加入交联剂中，在室温下，反应0.5h～1h，经离心洗涤后，将得到的羟基磷灰石纳米粒子与CEA适配体溶液混合，在室温条件下，反应2h～3h，经离心洗涤去除未反应的CEA适配体后，即得所述CEA浓度检测探针。按CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子的质量比为0.12:1～1.2:1(m/m)将羟基磷灰石纳米粒子与CEA适配体溶液混合，使用的CEA适配体应适当过量，确保羟基磷灰石纳米粒子表面负载满CEA适配体。优选的，所述交联剂为体积百分比为0.25％～1％的戊二醛溶液。
进一步的，所述表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子是通过如下方法制备得到的：将羟基磷灰石纳米粒子分散在壳聚糖溶液中，在室温条件下，反应2～4h，经离心洗涤，得到所述表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子。壳聚糖通过物理吸附到羟基磷灰石表面，壳聚糖容易在粒子表面形成一层膜。
为实现本发明的目的，本发明还提供一种CEA浓度检测生物传感器，所述CEA浓度检测生物传感器包括本发明所述的CEA浓度检测探针和与所述CEA浓度检测探针配套使用的CEA浓度检测用电极，所述CEA浓度检测用电极是通过如下方法制备得到的：将CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液直接滴加到玻碳电极表面后，采用牛血清白蛋白中对所述玻碳电极进行封闭，得到所述CEA浓度检测电极。
进一步的，所述CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液是通过如下方法制备得到的，将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液与氧化石墨烯溶液混合，在室温条件下，活化反应1～3h，经离心分离后，将经活化的氧化石墨烯分散在水中，配置得到活化氧化石墨烯溶液，将CEA抗体溶液与活化氧化石墨烯溶液混合，反应2～4小时后，将未反应的CEA抗体分离后，配置得到所述CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液。反应中，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺可以活化氧化石墨烯中的羧基，羧基使氧化石墨烯与CEA抗体上的氨基发生共价交联。作为优选的举例，本发明的CEA抗体购自Abcam公司的ab4451。
进一步的，将玻碳电极浸泡在质量分数为0.5％～1％牛血清白蛋白中0.5～1h对所述玻碳电极进行封闭，得到CEA浓度检测用电极。
为实现本发明的目的，本发明还提供一种本发明所述CEA浓度检测探针在制备用于检测CEA浓度的生物传感器中的应用，包括：(1)将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液与氧化石墨烯溶液混合，在室温条件下，活化反应1～3h，经离心分离后，将经活化的氧化石墨烯分散在水中，配置得到活化氧化石墨烯溶液，将CEA抗体溶液与活化氧化石墨烯溶液混合，将未反应的CEA抗体分离后，配置得到CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液；(2)将CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液直接滴加到玻碳电极表面后，采用牛血清白蛋白中对所述玻碳电极进行封闭，得到CEA浓度检测用电极；(3)取不同浓度的标准CEA溶液分别滴加至所述步骤(2)得到的各个CEA浓度检测用电极表面，制备得到结合了CEA的电极；(4)将所述CEA浓度检测探针配置得到CEA浓度检测探针溶液，将所述CEA浓度检测探针溶液滴加至步骤(3)得到的各个结合了CEA的电极的表面，得到电极表面从里至外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层夹心式结构电极；(5)向步骤(4)得到的各个三层夹心式结构电极表面滴加钼酸钠溶液，得到CEA浓度检测标准电极；(6)用方波伏安法分别对步骤(5)得到的各个CEA浓度检测标准电极进行检测，得到CEA浓度检测标准电极的方波伏安曲线，将方波伏安曲线中的峰电流与对应的标准CEA浓度绘制成标准曲线；(7)取待测CEA溶液替换标准CEA溶液，按所述步骤(1)至(5)，得到待测CEA浓度检测电极，采用方波伏安法进行测定，得到待测CEA浓度待测电极的方波伏安曲线，并依据步骤(6)得到的标准曲线，即得待测CEA溶液的浓度。
进一步的，所述步骤(3)中，将CEA溶液加到CEA浓度检测用电极表面，在25℃～37℃温度条件下，水浴反应1～2h，使CEA与CEA抗体之间发生结合反应，采用缓冲溶液冲洗电极表面除去未结合上的CEA，得到结合了CEA的电极。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述步骤(3)中，将所述CEA浓度检测探针溶液滴加到电极表面，在25℃～37℃温度条件下，水浴反应1～2h，使CEA与CEA适配体之间发生结合反应，用缓冲溶液冲洗电极表面未反应结合的适配体-羟基磷灰石复合物，得到电极表面从内至外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层夹心式结构电极。所述缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液。
进一步的，所述步骤(4)中，所述标准CEA溶液的浓度分别可以为1pg/mL、5pg/mL、10pg/mL、100pg/mL、1ng/mL、和10ng/mL。
进一步的，所述步骤(4)中，将所述CEA浓度检测探针配置成浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL的CEA浓度检测探针溶液。
进一步的，所述步骤(5)中，在温度为25℃～37℃条件下，将浓度为1mmol/L～5mmol/L的钼酸钠溶液滴加到所述三层夹心式结构电极表面，反应时间为20～30min。所述羟基磷灰石纳米粒子与所述CEA适配体中的磷酸根将与钼酸钠反应生成有电化学活性的磷钼酸钠盐沉淀，在采用方波伏安法进行测定时，将产生双重氧化还原电流，实现信号的双重放大，提高检测的灵敏度。
进一步的，所述步骤(6)和(7)中，所述方波伏安法的具体测定条件为：以0.5mol/L～1mol/L的硫酸溶液为电解液，在0V～0.5V电压范围内，以15Hz～25Hz的频率进行测定。
本发明的制备得到的CEA浓度检测电极，以羟基磷灰石纳米粒子为构建了电极表面从内之外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石复合物的三层夹心式结构，将所述CEA浓度检测电极用于检测CEA浓度，具有选择性好、灵敏度高、检测限低，且检测范围宽等优点。
采用本发明的CEA浓度检测电极对CEA浓度进行检测，首先，采用壳聚糖对羟基磷灰石表面进行修饰，将5’端修饰了5’-NH2的CEA适配体通过戊二醛交联结合到壳聚糖修饰的羟基磷灰石表面，制备得到电化学探针；将CEA抗体修饰的氧化石墨烯固定到电极表面，用牛血清白蛋白对电极表面进行封闭，防止在电极表面发生非特异性吸附；然后在电极表面滴加CEA，使电极上CEA抗体能与CEA进行特异性识别并结合；进一步在电极上加入CEA适配体-羟基磷灰石复合物电化学探针，被CEA抗体捕获的CEA能与羟基磷灰石上的适配体发生特异性结合；继续在电极上滴加钼酸钠，在电极表面反应生成磷钼酸钠盐沉淀；以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0V～0.5V电压范围内，进行测定方波伏安曲线，曲线峰电流与CEA浓度在一定范围内呈线性关系，从而实现CEA溶液浓度的检测。
本发明的CEA适配体作为CEA捕获分子和信号分子，通过羟基磷灰石纳米粒子与CEA适配体结合，实现双重信号放大方式，提高了检测灵敏度。通过加入不同浓度CEA经电化学测量处理后得到标准曲线，该标准曲线为一条直线，CEA浓度越大电流值越大；再加入未知浓度CEA测得电流值，将该电流值与标准曲线进行比较得到未知浓度CEA的浓度。本发明的技术方案利用羟基磷灰石纳米粒子大的比表面积，能结合大量适配体分子，促进信号放大，增强了灵敏度，降低了检测限。
与现有技术相比，本发明技术方案的优点在于：
(1)本发明的CEA适配体与羟基磷灰石复合的CEA浓度检测探针，在应用过程中，形成了CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层结构，羟基磷灰石纳米粒子比表面积大，增加了适配体负载量，且与CEA适配体结合使用，CEA适配体可促进信号放大，实现双重信号，进而提高检测灵敏度，降低检测限，检测范围广。
(2)本发明的技术方案可测浓度为0.1pg/mL-10ng/mL的CEA，而人类正常血清中CEA的浓度为2.5ng/mL，当患者可能患有相关肿瘤时，CEA浓度可能异常增高，因此，通过本发明的技术方案对经过稀释后患者血清具有足够高的检测灵敏度。当然，这种异常增高只是其中一个指标参数的反应，并不表示有严格、直接的一一对应关系，应当说CEA浓度增高也可能是其他身体条件的反应。
(3)本发明同时采用CEA适配体作为捕获分子和信号分子，大大简化了传感器制备方法和检测步骤。相比于传统的抗体，适配体具有价格便宜，合成方便等优点。传统的传感器制备中，适配体只是作为捕获分子，并不能产生信号。本发明技术方法检测范围宽，无需借助精密仪器设备，并且可推广至其他传感器，用于对不同蛋白或小分子的浓度进行检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的CEA浓度检测探针应用原理图。
图2为羟基磷灰石纳米粒子原料的TEM图。
图3为本发明的CEA浓度检测探针微观结构示意图。
图4为本发明的CEA适配体在电极表面与钼酸钠反应后的循环伏安图。
图5为羟基磷灰石纳米粒子在电极表面与钼酸钠反应后的循环伏安图。
图6为实施例1中各不同标准浓度CEA对应的方波伏安曲线图。
图7为实施例1中各不同标准浓度CEA的标准曲线图。
图8为实施例1中待测血清溶液CEA浓度检测结果与ELISA检测浓度对照图。
附图标记：CEA适配体1、羟基磷灰石纳米粒子2。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本文发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施例的CEA浓度检测探针的制备方法包括：将1mg羟基磷灰石纳米粒子分散在0.1％的壳聚糖溶液中，在室温下反应2h；离心洗涤后，将获得的羟基磷灰石纳米粒子分散于0.25％的戊二醛溶液中反应1h；离心洗涤后，得到将羟基磷灰石纳米粒子与10μM适配体溶液反应1h；离心洗涤去掉未反应的适配体后，得到本发明的CEA浓度检测探针。其中，图2为羟基磷灰石纳米粒子原料的TEM图。图3为CEA浓度检测探针的微观结构示意图，CEA浓度检测探针包括CEA适配体1、羟基磷灰石纳米粒子2。
本实施例的CEA浓度检测传感器包括CEA浓度检测探针和CEA浓度检测用电极。其中，CEA浓度检测用电极是通过如下方法制备得到的：将1mL浓度为1mg/mL氧化石墨烯溶液与100μL包含的100mM/L(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和100mM/L的N-羟基琥珀酰亚胺溶液混合，在25℃～37℃条件下，活化反应2h，经离心分离后，配置得到活化氧化石墨烯溶液，将CEA抗体溶液与活化氧化石墨烯溶液混合，将未反应的CEA抗体分离后，配置得到CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液；将得到的5μL抗体修饰氧化石墨烯直接滴加到玻碳电极表面得到抗体修饰电极；将玻碳电极浸泡在1％牛血清白蛋白中0.5h对所述玻碳电极进行封闭，得到CEA浓度检测用电极。依此方法，共制备得到10个CEA浓度检测用电极。
本实施例的CEA浓度检测探针在制备用于检测CEA浓度的生物传感器中的应用，其技术原理图如图1所示；图2羟基磷灰石纳米粒子原料的TEM图；分别将本发明的CEA适配体和羟基磷灰石纳米粒子在玻碳电极表面与钼酸钠反应后进行测定，图4为CEA适配体在电极表面与钼酸钠反应后的循环伏安图，图5为羟基磷灰石纳米粒子在电极表面与钼酸钠反应后的循环伏安图，图4和图5说明羟基磷灰石纳米粒子和CEA适配体配合可以实现双重信号放大。
包括如下步骤：
(1)将浓度分别为5pg/mL、10pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL和10ng/mL的标准CEA溶液分别滴加到本实施例的8个CEA浓度检测用电极表面，在37℃水浴条件下，反应1h，采用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面3次，除去未结合上的CEA，得到结合了8个不同标准浓度的CEA的电极；
(2)将本实施例的CEA浓度检测探针配置得到的5μL浓度为1mg/ml的CEA浓度检测探针溶液滴加到8个结合了不同CEA标准浓度的电极表面，在37℃水浴条件下反应1h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面3次，除去未反应掉的CEA浓度检测探针，得到8个从里至外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层夹心式结构电极；
(3)向8个三层夹心式结构的电极表面滴加1mM钼酸钠溶液，在25℃条件，反应20min，得到CEA浓度检测标准电极；
(4)以0.5mol/L的硫酸溶液为电解液，在0-0.5V电压范围内，以15Hz的频率进行测定，得到各CEA浓度检测标准电极的峰电流值，然后将各CEA浓度检测标准电极的峰电流值与对应的CEA浓度作标准曲线，如图6、图7所示；
(5)取CEA浓度未知的血清溶液，滴加剩余4个CEA浓度检测用电极表面，在37℃水浴条件下，反应1h，用磷酸盐缓冲溶液冲洗电极表面3次，将本实施例的CEA浓度检测探针配置得到的5μL浓度为1mg/ml的CEA浓度检测探针溶液滴加到4个结合不同待测浓度的CEA的电极表面，在37℃水浴条件下反应1h，用缓冲溶液冲洗电极表面3次除去未结合上的CEA，得到4个从里至外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层夹心式结构电极；向4个三层夹心式结构的电极表面滴加1mM钼酸钠溶液，在25℃条件，反应20min；用方波伏安法测峰电流值，与标准曲线比对得到测量浓度值，测量浓度值与ELISA分析结果相比有很好的一致性，相关系数为0.993，如图8所示。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种CEA浓度检测探针，其特征在于，所述CEA浓度检测探针包括CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子，所述CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子通过交联剂复合在一起，所述CEA适配体含有5’-ATACCAGCTTATTCAATT-3’的核苷酸序列且5’端修饰了5’-NH2，所述羟基磷灰石纳米粒子为表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的CEA浓度检测探针，其特征在于，所述交联剂为戊二醛。
3.一种如权利要求1或2所述CEA浓度检测探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子加入交联剂溶液中，在室温下，反应0.5h～1h，经离心洗涤后，将得到的羟基磷灰石纳米粒子与CEA适配体溶液混合，在室温条件下，反应2h～3h，经离心洗涤去除未反应的CEA适配体后，即得所述CEA浓度检测探针。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子是通过如下方法制备得到的：将羟基磷灰石纳米粒子分散在壳聚糖溶液中，在室温条件下，反应2h～4h，经离心洗涤，得到所述表面覆盖有壳聚糖膜的羟基磷灰石纳米粒子。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，按CEA适配体与羟基磷灰石纳米粒子的质量比为0.12:1～1.2:1，将羟基磷灰石纳米粒子与CEA适配体溶液混合。
6.一种CEA浓度检测生物传感器，其特征在于，所述CEA浓度检测生物传感器包括权利要求1或2所述的CEA浓度检测探针和与所述CEA浓度检测探针配套使用的CEA浓度检测用电极，所述CEA浓度检测用电极是通过如下方法制备得到的：将CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液直接滴加到玻碳电极表面后，采用牛血清白蛋白中对玻碳电极进行封闭，得到所述CEA浓度检测电极。
7.根据权利要求6所述的CEA浓度检测生物传感器，其特征在于，所述CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液是通过如下方法制备得到的：将氧化石墨烯溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液混合，在室温条件下，活化反应1～3h，离心分离后，配置得到活化氧化石墨烯溶液，将CEA抗体溶液与活化氧化石墨烯溶液混合，反应2～4小时后，将未反应的CEA抗体分离，得到所述CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液。
8.一种如权利要求1或2所述CEA浓度检测探针在制备用于检测CEA浓度的生物传感器中的应用，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将氧化石墨烯溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液混合，在室温条件下，活化反应1～3h，离心分离后，配置得到活化氧化石墨烯溶液，将CEA抗体溶液与活化氧化石墨烯溶液混合，反应2～4小时后，将未反应的CEA抗体分离，得到所述CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液；
(2)将CEA抗体修饰的氧化石墨烯溶液直接滴加到玻碳电极表面后，采用牛血清白蛋白中对所述玻碳电极进行封闭，得到CEA浓度检测用电极；
(3)取不同浓度的标准CEA溶液分别滴加至所述步骤(2)得到的各CEA浓度检测用电极表面；
(4)将所述CEA浓度检测探针配置成CEA浓度检测探针溶液滴加至步骤(3)得到的各结合了CEA溶液的电极的表面，得到电极表面从里至外依次为CEA抗体、CEA、CEA适配体-羟基磷灰石的三层夹心式结构电极；
(5)向步骤(4)得到的各三层夹心式结构电极表面滴加钼酸钠溶液，得到CEA浓度检测标准电极；
(6)用方波伏安法分别对步骤(5)得到的各CEA浓度检测标准电极进行检测，得到CEA浓度检测标准电极的方波伏安曲线，将方波伏安曲线中的峰电流与对应的标准CEA浓度绘制成标准曲线；
(7)取待测CEA溶液替换标准CEA溶液，按所述步骤(1)至(5)，得到待测CEA浓度检测电极，采用方波伏安法进行测定，得到待测CEA浓度待测电极的方波伏安曲线，并依据步骤(6)得到的标准曲线，即得待测CEA溶液的浓度。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤(4)中，将所述CEA浓度检测探针配置成浓度为0.5mg/mL～1.5mg/mL的CEA浓度检测探针溶液。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述步骤(6)和步骤(7)中，所述方波伏安法的测定条件为：以0.5mol/L～1mol/L的硫酸溶液为电解液，在0V～0.5V电压范围内，以15Hz～25Hz的频率进行测定。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107677715A (zh) * 2017-09-20 2018-02-09 青岛大学 一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器
CN109239173A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 中南大学 一种检测细菌活性及浓度的电化学方法
CN111175506A (zh) * 2020-02-05 2020-05-19 山西大同大学 基于杂交链式反应和核酶的传感器及癌胚抗原检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106093160A (zh) * 2016-06-07 2016-11-09 中南大学 一种羟基磷灰石基电化学探针构建方法和测定bace1活性以及抑制性的方法
CN106226374A (zh) * 2016-08-18 2016-12-14 中南大学 一种人类表皮生长因子受体‑2浓度的检测方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106093160A (zh) * 2016-06-07 2016-11-09 中南大学 一种羟基磷灰石基电化学探针构建方法和测定bace1活性以及抑制性的方法
CN106226374A (zh) * 2016-08-18 2016-12-14 中南大学 一种人类表皮生长因子受体‑2浓度的检测方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LANSHUANG HU ET AL.: "DNA Generated Electric Current Biosensor", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *
YAXUN HUANG ET AL.: "Signal amplification strategy for electrochemical immunosensing based on a molybdophosphate induced enhanced redox current on the surface of hydroxyapatite nanoparticles", 《MICROCHIM ACTA》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107677715A (zh) * 2017-09-20 2018-02-09 青岛大学 一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器
CN107677715B (zh) * 2017-09-20 2019-10-01 青岛大学 一种基于石墨烯信号放大作用用于凝血酶检测的超灵敏均相电化学适体传感器
CN109239173A (zh) * 2018-09-21 2019-01-18 中南大学 一种检测细菌活性及浓度的电化学方法
CN109239173B (zh) * 2018-09-21 2019-12-20 中南大学 一种检测细菌活性及浓度的电化学方法
CN111175506A (zh) * 2020-02-05 2020-05-19 山西大同大学 基于杂交链式反应和核酶的传感器及癌胚抗原检测方法
CN111175506B (zh) * 2020-02-05 2023-10-27 山西大同大学 基于杂交链式反应和核酶的传感器及癌胚抗原检测方法

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