CN109030584A - 基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法及传感器 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于单(6‑巯基‑6‑去氧)‑β‑环糊精的L‑半胱氨酸的检测方法及传感器，将单(6‑巯基‑6‑去氧)‑β‑环糊精(HS‑β‑CD)修饰在栅极延长出来的金电极的金膜层表面上，形成一种简易的HS‑β‑CD自组装延长栅金电极(G‑GE)，利用场效应晶体管原位信号的放大作用对L‑半胱氨酸(L‑Cys)实现灵敏检测，其中，HS‑β‑CD通过分子间作用力吸附结合L‑Cys，使电极表面的膜电位发生改变，从而实现对L‑Cys的超分子选择性识别。该传感器对L‑半胱氨酸具有良好的能斯特响应关系，线性范围为1.0×10‑7—1.0×10‑4mol/L，响应灵敏度为65.29mV·pc‑1(25℃)，检出限为5.7×10‑8mol/L。其制备过程简单便捷，响应时间快，具有潜在的应用前景。

Description

基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法 及传感器
技术领域
本发明属于化学/生物传感技术领域，具体涉及一种基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法及传感器，即一种选择性膜电位型传感器，适用于健康养殖与生命科学方面的在线检测。
背景技术
半胱氨酸(Cysteine，Cys)是人体的条件必需氨基酸和生糖氨基酸，其化学名称为2-氨基-3-巯基丙酸，是一种脂肪族含巯基的极性α-氨基酸，具有两种不同的立体构型(D-型、L-型)。L-半胱氨酸(L-Cysteine，L-Cys)在细胞中蛋白质折叠和代谢、翻译后修饰、解毒以及对重金属的亲和力等生理过程中起着至关重要的作用。L-半胱氨酸除了在细胞过程中的作用之外，还是生物体许多病理疾病的生物标志物，如肝损伤，心脏病，皮肤病变，脱色素，败血症，艾滋病，胱氨酸尿症以及帕金森病和阿尔茨海默氏病，因此被广泛用于如抗生素和皮肤疾病治疗配方等的制药产品研究。此外，人体内L-半胱氨酸介导所引发的降血糖作用和中枢神经损伤已作为兴奋性中毒的机理被研究。因此，L-半胱氨酸传感器的研究变得至关重要，并逐渐引起了众多学者尤其是化学、生物学、医学工作者的兴趣。
目前，检测L-半胱氨酸的常用方法有比色分析法、分光光度法、拉曼光谱法、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、荧光分析法、光电化学分析法(PECA)等。然而，他们往往需要昂贵的精密仪器、复杂的样品制备流程，不方便实地实时使用。因此，现场环境实时检测方法、移动实验室和便携式检测仪器等具有更广泛的研究前景，而电化学传感分析法具有现场实时检测优势。目前用于L-半胱氨酸检测的电化学方法主要是电流型电化学传感器，如Sophia Selvarajan等人将NH2官能化的BaTiO3纳米颗粒悬浮在琼脂糖(Ag)膜的三维基质，通过电流-电压技术创建了一个自供电的L-半胱氨酸传感器，并通过非侵入性方法对尿液中的L-半胱氨酸进行传感器性能的实时分析，具有良好的选择性和线性范围，检测下限达到10×10-6mol·L-1。MohammadK.Amini等人通过将Cobalt(II) salophen结合到碳糊基质中而构建的碳糊电极，采用安培和差分脉冲伏安法测定半胱氨酸，线性范围为2—10×10-6mol·L-1，检测下限为1×10- 6mol·L-1。徐静娟等人制备了α-二氧化锰纳米线修饰玻碳电极(GC)，选择性检测L-半胱氨酸，该电极对L-半胱氨酸显示出优异的电催化氧化作用，最大的测定范围达到0.5—630×10-6mol·L-1，检测下限为7×10-8mol·L-1。尽管这些电流型传感器的电化学响应不断提高，仍然存在复杂的操作流程、不能微型化和难以实现实时检测的缺点。
与电流型电化学传感分析方法相比，电位型电化学传感器具有易于微型化、实时监测、成本低等特点，且适用于生物体内和现场分析，对测定无机离子和含氮有机小分子有很好的应用前景。2001年Saeed Shahrokhian描述了一种基于铅酞菁聚氯乙烯膜涂覆的石墨电极，可对L-半胱氨酸进行选择性检测，线性范围为1×10-6～5×10-2mol·L-1，检测下限为1×10-6mol·L-1。但目前用于高选择性、高灵敏性测定L-半胱氨酸的电位型传感分析方法仍然极具挑战性，还很少有报道。
β-环糊精(β-Cyclodextrin，简称β-CD)是直链淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的由七个吡喃葡萄糖单元组成的环状低聚糖。由于β-环糊精的外缘(Rim)亲水而内腔(Cavity)疏水的特殊筒状结构，因而可以与许多无机离子(Cu2+、Ca2+、Zn2+等)、生物药物分子以及有机小分子如有机溴化物、芳香族化合物、咪唑基化合物、有机酯类化合物、有机醇类化合物等结合形成一种主-客体包合物，使其受到了许多研究工作者的关注。然而，目前还没有发现有报道基于β-环糊精检测L-半胱氨酸的电位型电化学传感器。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法及传感器。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法包括如下步骤：
(1)在场效应晶体管的Si基底层(1)上植入p阱(2)和N型衬底(3)，采用热蒸发和磁控溅射技术在p阱(2)处构建源电极(4)和漏电极(5)，然后在被植入p阱(2)和N型衬底(3)并构建有源电极(4)和漏电极(5)的Si基底层(1)上构建二氧化硅层(6)，再采用热蒸发和磁控溅射技术在多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)，最后在多晶硅栅极(7)的基底层和二氧化硅层(6)上构建氮化硅层(11)；将栅极部分延长0.1—500mm的距离，制得具有栅极金电极的延长栅场效应晶体管；
(2)制备单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液，并将抛光和清洗后的延长栅场效应晶体管的栅极金电极浸泡于其中，然后洗净浸泡后的栅极金电极，制得单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜(12)修饰的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极；
(3)将参比电极、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极与延长栅场效应晶体管的电极接口相连形成双高阻差分放大电路，将参比电极、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极插入PBS缓冲溶液中，将延长栅场效应晶体管的电源接口分别与稳压电源的正负极相连，将延长栅场效应晶体管的信号输出接口与万用电表的测试端口相连，由此构成一个完整的传感检测回路；利用场效应晶体管的原位信号放大作用，可灵敏检测体系的电位变化；作为工作电极的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极在PBS缓冲溶液的电位会随着时间的增加而逐渐趋向于稳定，待电位稳定后加入含有不同浓度L-半胱氨酸(13)的待测样品，进而获得相应的电位响应数据，完成待测样品中L-半胱氨酸(13)的检测。
优选地，步骤(1)中，用热蒸发和磁控溅射技术在多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)时，采用Si3N4进行钝化；铝铜合金层(8)包括如下重量份的组分：Al 40—68、Cu 30—60、Ni 2—12、Fe 1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铬钯合金层(9)包括如下重量份的组分：Cr 40—80、Pd 10—40、Ni 2—12、Fe 1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铝铜合金层(8)的厚度为20—600nm，铬钯合金层(9)的厚度为20—600nm，金膜层(10)的厚度为20—1000nm。
优选地，步骤(2)中是制备1.0—20.0mmol/L的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.01—1.0mol/L。步骤(2)中是依次用超纯水和无水乙醇清洗延长栅场效应晶体管的栅极金电极。步骤(2)中栅极金电极浸泡于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液中的时间为1—48h。步骤(2)中是用无水乙醇和超纯水洗净浸泡后的栅极金电极，并进行干燥、保存。
优选地，步骤(3)中的参比电极为双盐桥饱和甘汞电极或内置饱和KCl溶液的Ag/AgCl电极，工作电极为单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极。步骤(3)中的PBS缓冲溶液为pH3.0—9.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液，pH值优选为6.0，其配制方法是先将氯化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于超纯水，然后加盐酸通过pH计校正其pH值。
本发明还提供了一种检测L-半胱氨酸的传感器，所述传感器包括场效应晶体管，所述场效应晶体管上设有栅极延长的金电极，所述栅极延长的金电极中，所述栅极部分延长0.1—500mm的距离，金电极的金膜层(10)表面组装有单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜(12)。
其中，所述场效应晶体管包括Si基底层(1)和设于Si基底层(1)上的多晶硅栅极(7)；所述Si基底层(1)上植入p阱(2)和N型衬底(3)，所述p阱(2)处设有源电极(4)和漏电极(5)，被植入p阱(2)和N型衬底(3)并构建有源电极(4)和漏电极(5)的Si基底层(1)上设有二氧化硅层(6)；所述多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)；在多晶硅栅极(7)的基底层和二氧化硅层(6)上还设有氮化硅层(11)。所述铝铜合金层(8)的厚度为20—600nm，铬钯合金层(9)的厚度为20—600nm，金膜层(10)的厚度为20—1000nm。
所述传感器对L-半胱氨酸(13)具有良好的能斯特响应关系，线性范围为1.0×10-7—1.0×10-4mol/L，响应灵敏度为65.29mV·pc-1(25℃)，检出限为5.7×10-8mol/L。
下面对本发明作进一步说明：
本发明将场效应晶体管(FET)的栅极金电极(G-GE)延长一定距离，如延伸0.1—500mm，在G-GE表面自组装上单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精(HS-β-CD)，形成一种可检测L-半胱氨酸的新型传感器。传感界面的SEM表征、电化学测试、XPS分析表明，HS-β-CD通过氢键的分子间作用力吸附结合L-半胱氨酸的巯基、氨基或者羧基，使电极表面的膜电位发生改变，达到一种对L-半胱氨酸的超分子选择性识别作用，从而实现对L-半胱氨酸的定量分析。实验表明，该电极在pH＝6.0的PBS缓冲液中对L-半胱氨酸有良好的电位响应性能，线性范围为1.0×10-7～1.0×10-4mol·L-1，响应斜率为65.29mV·pc-1(25℃)，检出限达到5.7×10-8mol·L-1；电极响应速度较快，抗干扰能力强。此外，将该电极用于实际猪血清和猪尿液样品中L-半胱氨酸含量的测定，回收率分别为98.53—104.7％、94.99—104.7％，表明该新型电极在生命科学、健康绿色养殖等领域有着重要的应用前景。
总之，本发明开发了一种简便的选择性膜电位型电化学传感器，提供了一种新的L-半胱氨酸的检测方法，即将单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精(HS-β-CD)修饰在栅极延长出来的金电极的金膜层表面上，形成一种简易的HS-β-CD自组装延长栅金电极(G-GE)，利用场效应晶体管原位信号的放大作用对L-半胱氨酸实现灵敏检测，其中，HS-β-CD通过分子间作用力吸附结合L-Cys，使电极表面的膜电位发生改变，从而实现对L-Cys的超分子选择性识别。实验测试结果显示，该传感器在L-半胱氨酸浓度为1.0×10-7—1.0×10-4mol/L范围内表现出良好的能斯特响应，而且其制备过程简单便捷，响应时间快，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为延长栅极场效应晶体管的设计示意图；图中：1、Si基底层，2、源电极，3、漏电极，4、p阱，5、N型衬底，6、二氧化硅层，7、多晶硅栅极，8、铝铜合金层，9、铬钯合金层，10、金膜层，11、氮化硅层，12、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜；
图2为G-GE/HS-β-CD电极检测L-半胱氨酸前后的电极表面形貌SEM表征图；图2a是裸金电极表面的扫描电镜图，图2b是电极表面自组装HS-β-CD后的图，图2c是当电极检测L-半胱氨酸后的表面图；
图3为HS-β-CD分子结合L-半胱氨酸分子的识别响应原理示意图；图中：10、金膜层，12、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜，13、L-半胱氨酸；
图4：图4A和图4B分别为电极在铁氰化钾溶液(含有5.0mmol/L K3[Fe(CN)6]，5.0mmol/L K4[Fe(CN)6]，0.5mol/L Na2SO4)中的循环伏安图和交流阻抗图；图4A和图4B中：a、G-GE，b、G-GE/HS-β-CD，c、G-GE/HS-β-CD/L-cys；
图5为不同电极表面的XPS全谱图；图中：a、G-GE，b、G-GE/HS-β-CD，c、G-GE/HS-β-CD/L-cys；
图6：图6A为HS-β-CD修饰时间对电极斜率的影响关系曲线；图6B为G-GE/HS-β-CD电极在不同修饰时间结合不同浓度L-半胱氨酸后得到的电位响应曲线图；
图7为HS-β-CD修饰G-GE电极在PBS缓冲液(pH＝6.0)中检测L-Cys的电位随浓度变化的响应曲线及线性关系曲线图；其中，内插图为线性拟合关系曲线；
图8：图8A表示在PBS缓冲液(pH＝6.0)中HS-β-CD修饰G-GE电极对不同浓度L-Cys的动态响应曲线图；图8B表示HS-β-CD修饰G-GE电极对浓度为1.0×10-4mol·L-1的L-Cys的典型动态响应曲线图；
图9：图9A为G-GE/HS-β-CD电极对L-半胱氨酸检测的选择性关系图；图9B为常见氨基酸共存时对G-GE/HS-β-CD电极检测L-半胱氨酸的影响。
具体实施方式
一、实验过程
1、G-GE/HS-β-CD电极的制备
将金电极先在超纯水中超声清洗5min，再依次在1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3粉打磨抛光。再依次在乙醇和超纯水中超声清洗5min，自然晾干后放置于Piranha溶液中浸泡2min，再依次在超纯水、乙醇和超纯水中超声清洗，自然晾干。随后，将打磨好的金电极浸泡在5.0mmol·L-1的HS-β-CD的氢氧化钠溶液(0.1M)中24h。最后将HS-β-CD自组装膜修饰的金电极取出分别用乙醇和超纯水洗净，干燥保存，得到单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精(HS-β-CD)自组装膜金电极。
2、延长栅极场效应晶体管的设计及栅极金电极的制备
图1是延长栅极场效应晶体管的设计示意图，即结合金属-氧化物-半导体场效应晶体管(MOSFET)的基本结构，在场效应晶体管的Si基底层1上植入p阱2和N型衬底3，采用热蒸发和磁控溅射技术在p阱2处构建源电极4和漏电极5，然后在被植入p阱2和N型衬底3并构建有源电极4和漏电极5的Si基底层1上构建二氧化硅层6，再采用热蒸发和磁控溅射技术在多晶硅栅极7的基底层上依次镀上铝铜合金层8、铬钯合金层9和金膜层10，最后在多晶硅栅极7的基底层和二氧化硅层6上构建氮化硅层11；铝铜合金层8包括如下重量份的组分：Al40—68、Cu 30—60、Ni 2—12、Fe 1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铬钯合金层9包括如下重量份的组分：Cr 40—80、Pd 10—40、Ni 2—12、Fe 1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铝铜合金层8的厚度为20—600nm，铬钯合金层9的厚度为20—600nm，金膜层10的厚度为20—1000nm；将栅极部分的金电极延长200mm的距离，并且利用SiO2和Si3N4钝化场效应晶体管晶片，目的是防止晶片除Au外的部分与溶液接触，从而形成延长栅极场效应晶体管(EGFET)。对EGFET的延长栅极金电极(G-GE)膜表面进行不同的物理/化学修饰处理，形成敏感膜以实现对待测目标物的灵敏检测。按前述方法，将单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精(HS-β-CD)自组装在栅极金电极的表面，制得单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜12修饰的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极(G-GE/HS-β-CD)。
3、自组装膜栅极金电极的测试
以5.0mmol·L-1的K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]和0.5mol·L-1的Na2SO4缓冲液为氧化还原电解质溶液，采用交流阻抗和循环伏安法(CV)检测自组装膜修饰电极的性能。以双盐桥饱和甘汞电极为参比电极，HS-β-CD修饰的金电极为工作电极，通过对一系列已知浓度的L-半胱氨酸标准溶液的测试得出相应的电位值，以电位值对浓度值做工作曲线，然后测试未知浓度L-半胱氨酸样品溶液的电位值，通过所得工作曲线求出样品溶液中L-半胱氨酸的浓度值或含量。其中，所用缓冲溶液为pH范围为3.0—9.0的PBS溶液(0.1mol/L)，其配制方法是先将氯化钠、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠溶于超纯水，然后加盐酸通过pH计校正其pH值。
4、电极的恢复方法
在L-半胱氨酸测试实验完成后，经Piranha溶液浸泡清洗2min的G-GE先用超纯水清洗，再在1μm、0.3μm、0.05μm的Al2O3混合粉末打磨抛光，接着在乙醇和超纯水中超声清洗5min，然后在0.1mol·L-1的硫酸中以100mV·s-1的速度于-0.3—1.5V电位范围内扫描10次以上，再用超纯水超声洗净，即可用于下一次自组装和实验测试。
二、实验结果与分析
1、G-GE/HS-β-CD的SEM表征
对G-GE/HS-β-CD电极检测L-半胱氨酸前后电极表面的形貌特征进行了SEM表征测试，同样也对裸金电极的表面形貌特征进行了SEM测试，如图2所示。从图中可以发现，裸金电极的表面形态十分的平整光滑(如图2A)，当自组装HS-β-CD后电极表面变得粗糙且出现了一层模糊的薄层物质(如图2B)，说明HS-β-CD与金电极之间通过Au-S键的作用力形成了一层自组装薄膜，而在检测L-半胱氨酸后电极表面的粗糙程度加大(如图2C)，说明L-半胱氨酸与HS-β-CD自组装膜之间发生结合作用而使膜表面发生变化。
2、G-GE/HS-β-CD的响应原理及电化学表征
HS-β-CD是一种环状的巯基化合物，且一端含有巯基，另一端是口腔状的环状结构，口腔环的内部缩水，外部亲水。其中一端的巯基可以与Au形成Au-S键而自组装在金电极表面上，另一端的口腔环处亲水的羟基(-OH)可以通过氢键的分子间作用力与L-半胱氨酸的巯基(-SH)、氨基(-NH2)或者羧基(-COOH)作用，从而引起电极表面膜电位的变化，实现G-GE/HS-β-CD电极对L-半胱氨酸的超分子选择性识别，其响应识别过程如图3所示。
为了佐证自组装金电极膜表面与L-半胱氨酸的相互作用关系，本发明分别通过采用循环伏安和交流阻抗的方法考察了上述不同电极表面的电化学行为，如图4所示。图4(A)和4(B)中a代表裸金电极，电流值较大，且对应的阻抗值很小，说明预处理后的裸金电极具有强传递电子能力。b代表HS-β-CD修饰金电极，图4(A)中明显可看出其电流值相比a变小，相应的图4(B)中高频部分出现半圆，阻抗值明显增大，说明HS-β-CD通过一端的巯基在金表面上形成了不导电的单分子自组装膜层，阻碍了[Fe(CN)6]3-/4-在电极表面的电子传导。结合L-半胱氨酸(1.0×10-4mol·L-1)后，电极的电流值变大，阻抗值相应地减小(如曲线c)，这是由于HS-β-CD通过另一端的口腔环和L-半胱氨酸发生强超分子识别作用而吸附了带电荷的L-半胱氨酸，增强了电子传导性，界面阻抗减小，从而产生电化学传导电信号。其阻抗的变化趋势从相应的循环伏安行为中得到印证(如图4(A)所示)，表明该方法用于L-半胱氨酸的识别检测具有可行性。
3、G-GE/HS-β-CD的XPS表征
通过X-射线光电子能谱(XPS)对G-GE、G-GE/HS-β-CD、G-GE/HS-β-CD/L-cys等三种电极的表面进行定性分析，从XPS能谱图(如图5)中分析其元素组成验证修饰电极与目标离子之间的相互作用情况。如图5可知，相比裸金电极(a曲线)，经自组装HS-β-CD后的金电极(b曲线)Au4f、Au4d峰的强度有明显的下降，这是由于电极经自组装HS-β-CD后形成了不导电的薄膜。由于自组装的超分子HS-β-CD中S元素的相对原子质量占比很小，且形成的自组装膜不导电，导致修饰后的电极b曲线相比裸金电极的a曲线的上S元素的峰出现有减弱的现象，说明HS-β-CD成功修饰在电极表面。而检测了L-Cys后的电极c曲线相比自组装后电极的b曲线的N元素的峰高更高，这是由于结合L-半胱氨酸后，L-半胱氨酸与HS-β-CD以氢键的作用力结合在薄膜上面，从而证明了G-GE/HS-β-CD电极中HS-β-CD对L-半胱氨酸的超分子识别作用。
4、G-GE/HS-β-CD最佳修饰时间的选择
实验探讨了该修饰电极在修饰时间分别为4h、8h、12h、24h、36h、48h时，在pH＝6.0的条件下，电极电位随L-半胱氨酸加入浓度的变化关系图(如图6(B)所示)，并依次求出其响应斜率，并做出响应斜率与修饰时间的关系图(如图6(A)所示)。从图6(B)中可看出，该修饰电极在修饰时间为8h、12h、24h时其具有较高线性拟合度；而从6(A)可以看出，在修饰时间为8h、24h时具有较低的误差棒，但在修饰时间为24h时误差棒最小，且此时其斜率值约为65.29mV·pc-1(25℃)，呈能斯特响应，具有较高的线性拟合度R2＝0.9922；因此本实验电极选择24h作为后续实验过程中工作电极的最佳修饰时间。
5、G-GE/HS-β-CD最佳pH选择
实验分别探讨了该修饰电极在PBS缓冲溶液(pH分别为3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0)的条件下，电极电位随L-半胱氨酸加入浓度的变化关系，并依此求出响应斜率，其中在pH＝6.0时，其斜率值为65.29±1mV·pc-1(25℃)，接近能斯特响应斜率的理论值(59mV·pc-1)，电极响应斜率的误差棒最小，性能最稳定。所以，实验选择的最佳pH值为6.0。
6、G-GE/HS-β-CD响应性能
实验探讨了G-GE/HS-β-CD电极对L-半胱氨酸的电位响应性能，图7为电极在PBS缓冲溶液(pH＝6.0)条件下，对浓度为1.0×10-10—1.0×10-4mol·L-1的L-半胱氨酸检测后得到的电位随浓度变化响应曲线图。由图可知，随着L-半胱氨酸浓度的增加，电极电位也逐渐降低，说明修饰电极表面键合的L-半胱氨酸增加，且该电极在pH＝6.0的PBS缓冲溶液中对L-半胱氨酸离子在1.0×10-7—1.0×10-4mol·L-1的浓度范围内有较好的线性响应关系(如图7内插图可知)，采用最小二乘法拟合得线性方程为ΔE＝-65.29log(c)-464.5，根据作图法可得到其检测下限为5.7×10-8mol·L-1。
7、响应时间、稳定性和重现性的测定
实验探讨了G-GE/HS-β-CD电极对不同浓度L-半胱氨酸检测所产生电位信号随响应时间的动态变化及其稳定性情况。图8(A)是在PBS缓冲溶液中加入不同浓度L-半胱氨酸后的动态电位变化曲线图，即通过从低浓度到高浓度在1.0×10-7—1.0×10-4mol·L-1范围内进行连续测量并记录随时间变化的电位值，如图8(A)可以看出，在整个浓度范围内电极电位每次达到电位平衡的反应时间都比较短，以达到电位响应最大值的90％来计算(如图(8B))，其响应时间为63s，表明该电极对L-半胱氨酸具有较快的响应速度；当电位随着时间的增加而逐渐趋向于稳定时，加入下一个浓度进行检测，同时也说明电极的响应性能稳定。随后，将该电极对浓度为1.0×10-6mol·L-1的L-半胱氨酸样品连续监测30min，电位漂移<±1.0mV，电位数据的相对标准偏差为1.73％(n＝5)，表明该电位传感器具有好的稳定性。将该电极对L-半胱氨酸样品连续测试30d，其响应斜率下降了18.56％，说明该电位传感器可以使用至少一个月，具有较长的使用寿命。
实验也探讨了G-GE/HS-β-CD电极对不同浓度L-半胱氨酸样品的电位响应的重现性的实验，即对1.0×10-6mol·L-1和1.0×10-5mol·L-1的L-半胱氨酸样品来回测定它们的电位响应值，分别测试6次(如表1所示)。通过对数据的分析与处理，发现其标准偏差分别为±0.7528和±1.049，相对标准偏差分别为0.535％和1.308％。结果显而易见，两者的相对标准偏差都比较小，说明该电极具有良好的重现性。
表1 在PBS缓冲液(pH＝6.0)中HS-β-CD修饰G-GE电极对浓度为1.0×10-5mol·L-1和1.0×10-6mol·L-1 L-Cys的重现性检测
8、G-GE/HS-β-CD的选择性
对于离子选择性电化学传感器来说，选择性是评价其传感性能的一个重要参数，也是判断其是否能用于实际应用的一个重要因素。如图9(A)是G-GE/HS-β-CD电极分别对浓度为1.0×10-6mol·L-1的L-半胱氨酸和浓度为1.0×10-4mol·L-1的L-Val、L-Try、L-Phe等十五种氨基酸检测后的电位值变化图，可看出，L-半胱氨酸的响应值达到-80mV，其它氨基酸基本无电位变化，但对L-胱氨酸的响应值到达22mV，一是由于在二硫键与Au共同存在的情况下，L-胱氨酸的二硫键与金电极表面的Au原子发生置换反应，从而产生较弱的电位信号；二是在酸性条件下L-胱氨酸会发生水解生成L-半胱氨酸，从而生成的L-半胱氨酸与工作电极作用产生电位信号，但由于其水解程度较弱，从而所产生的电位信号也相对较弱。图9(B)是考察了在G-GE/HS-β-CD电极对1.0×10-6mol·L-1浓度的L-半胱氨酸检测的电位值稳定后，再分别加入1.0×10-4mol·L-1的L-Val、L-Try、L-Phe、L-Leu、L-Thy、L-Ala、L-Iso、L-Gly、L-Arg、L-Pro、L-Cystine、L-Met、L-His、L-Lys等十五种氨基酸后的电位值变化情况图，如图9(B)可看出，仅当在加入L-胱氨酸时电位值升高了22±2mV，而加入其他氨基酸时电位值基本没有发生变化，不干扰电极的测定，说明该电极具有良好的选择性。
9、回收率的测定与分析应用
在最佳实验条件下，考察了G-GE/HS-β-CD电极对实际样品中如猪尿液样品和猪血清样品中L-半胱氨酸含量的检测应用。采用标准加入法，即在预处理过的猪尿液样品和猪血清样品中分别加入不同已知浓度的L-半胱氨酸，用修饰电极测出其电位的变化量，对照工作曲线找出浓度，并计算出回收率，其中，测得猪血清样品的回收率在98.53—104.7％之间，测得猪尿液样品的回收率在94.99—101.6％，说明该自组装电化学传感器具有较好的准确性、实用性强，可以用于实际样品中L-半胱氨酸含量的测定分析，在生命科学、生物医学和农畜产品安全检测等领域中具有重要的应用价值。
总之，本发明中，单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精修饰栅极金电极，形成一种新型的生物传感器，对L-半胱氨酸显示出优异的超分子识别作用，将之应用于猪血清及猪尿样品中L-Cys的检测，显示出良好的稳定性、重现性、选择性和灵敏性，在生命科学、生物医学和农畜产品安全检测等领域具有很好的应用前景。

Claims (10)

1.基于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的L-半胱氨酸的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)在场效应晶体管的Si基底层(1)上植入p阱(2)和N型衬底(3)，采用热蒸发和磁控溅射技术在p阱(2)处构建源电极(4)和漏电极(5)，然后在被植入p阱(2)和N型衬底(3)并构建有源电极(4)和漏电极(5)的Si基底层(1)上构建二氧化硅层(6)，再采用热蒸发和磁控溅射技术在多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)，最后在多晶硅栅极(7)的基底层和二氧化硅层(6)上构建氮化硅层(11)；将栅极部分延长0.1—500mm的距离，制得具有栅极金电极的延长栅场效应晶体管；
(2)制备单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液，并将抛光和清洗后的延长栅场效应晶体管的栅极金电极浸泡于其中，然后洗净浸泡后的栅极金电极，制得单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜(12)修饰的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极；
(3)将参比电极、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极与延长栅场效应晶体管的电极接口相连形成双高阻差分放大电路，将参比电极、单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极插入PBS缓冲溶液中，将延长栅场效应晶体管的电源接口分别与稳压电源的正负极相连，将延长栅场效应晶体管的信号输出接口与万用电表的测试端口相连，由此构成一个完整的传感检测回路；利用场效应晶体管的原位信号放大作用，可灵敏检测体系的电位变化；作为工作电极的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极在PBS缓冲溶液的电位会随着时间的增加而逐渐趋向于稳定，待电位稳定后加入含有不同浓度L-半胱氨酸(13)的待测样品，进而获得相应的电位响应数据，完成待测样品中L-半胱氨酸(13)的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，用热蒸发和磁控溅射技术在多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)时，采用Si3N4进行钝化；铝铜合金层(8)包括如下重量份的组分：Al 40—68、Cu 30—60、Ni 2—12、Fe1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铬钯合金层(9)包括如下重量份的组分：Cr 40—80、Pd10—40、Ni 2—12、Fe 1—8、Ti 1—6、Nb 0.01—0.50；铝铜合金层(8)的厚度为20—600nm，铬钯合金层(9)的厚度为20—600nm，金膜层(10)的厚度为20—1000nm。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中是制备1.0—20.0mmol/L的单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液，所述氢氧化钠溶液的浓度为0.01—1.0mol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中栅极金电极浸泡于单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精的氢氧化钠溶液中的时间为1—48h。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的参比电极为双盐桥饱和甘汞电极或内置饱和KCl溶液的Ag/AgCl电极，工作电极为单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜栅极金电极。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的PBS缓冲溶液为pH3.0—9.0、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲溶液。
7.一种检测L-半胱氨酸的传感器，所述传感器包括场效应晶体管，所述场效应晶体管上设有栅极延长的金电极，其特征在于，所述栅极延长的金电极中，所述栅极部分延长0.1—500mm的距离，金电极的金膜层(10)表面组装有单(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精膜(12)。
8.如权利要求7所述的传感器，其特征在于，所述场效应晶体管包括Si基底层(1)和设于Si基底层(1)上的多晶硅栅极(7)；所述Si基底层(1)上植入p阱(2)和N型衬底(3)，所述p阱(2)处设有源电极(4)和漏电极(5)，被植入p阱(2)和N型衬底(3)并构建有源电极(4)和漏电极(5)的Si基底层(1)上设有二氧化硅层(6)；所述多晶硅栅极(7)的基底层上依次镀上铝铜合金层(8)、铬钯合金层(9)和金膜层(10)；在多晶硅栅极(7)的基底层和二氧化硅层(6)上还设有氮化硅层(11)。
9.如权利要求8所述的传感器，其特征在于，所述铝铜合金层(8)的厚度为20—600nm，铬钯合金层(9)的厚度为20—600nm，金膜层(10)的厚度为20—1000nm。
10.如权利要求7至9任一项所述的传感器，其特征在于，所述传感器对L-半胱氨酸(13)具有良好的能斯特响应关系，线性范围为1.0×10-7—1.0×10-4mol/L，响应灵敏度为65.29mV·pc-1(25℃)，检出限为5.7×10-8mol/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112079943A (zh) * 2020-08-31 2020-12-15 天津大学 一种用于苯丙氨酸快速手性识别传感器的改性环糊精及传感器制备方法

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