CN105158319B - 一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法及应用 - Google Patents
一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种电化学技术领域的检测方法，具体是利用金纳米-甲酰基咪唑修饰还原石墨烯和钴钯纳米粒子构建一种快速检测凝血酶的夹心型电化学适配体传感器，属于新型功能材料及生物传感分析技术领域。用于凝血酶的检测，线性范围为0.010～2.00ng·mL-1，检测限为0.0032ng·mL-1。
Description
技术领域
本发明涉及一种电化学技术领域的检测方法，具体是利用金纳米-甲酰基咪唑修饰还原石墨烯和钴钯纳米粒子构建一种快速检测凝血酶的夹心型电化学适配体传感器，属于新型功能材料及生物传感分析技术领域。
背景技术
凝血酶Tb是一种由凝血酶前体形成的蛋白质水解酶，可以促使纤维蛋白原转化为纤维蛋白，它是哺乳动物中普遍存在的一种丝氨酸蛋白质，其增多会导致血栓的形成而减少则会导致出血。在临床上，凝血酶适用于结扎止血困难的下血管、毛细血管以及实质性脏器出血的止血，适用于外伤、手术、口腔、耳鼻喉、泌尿、烧伤、骨科等出血的止血。凝血酶的在生物体中的含量多少，会导致一些疾病的发生。凝血酶在人体中的含量甚少，一般的检测方法难以对其进行准确检测。
目前对于凝血酶的检测，主要集中在应用生物传感器的方法，与文献中所报道的各种检测方法相比，本发明用于凝血酶的检测具有选择性好、灵敏度高、简便快速等优势。
发明内容
本发明的目的在于设计一种灵敏度高、特异性强的凝血酶夹心型电化学适配体传感器。
1. 一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法
（1）选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Apt1和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2；（2）合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI；称取质量比为1 : 1
~ 1.2的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH＜2，搅拌至少30 min，逐滴加入40~60 mmol•L-1的NaBH4溶液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
（3）钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将3~5 mg、粒径7~9
nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到1.5~2.5
mL浓度为0.05 mol•L-1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30
min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120
μL的1 mg•mL-1的亲和素， 37 ℃下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs；再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120μL 的10 μg•mL-1生物素修饰的Apt2，在37 ℃下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2；重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg•mL-1 的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 ℃下备用；
（4）Au@GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
1）用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol•L-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV；
2）将金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI超声分散处理，制得分散性好的Au@ GS-FI溶液；
3）将分散好的Au@ GS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4）在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Apt1，置于4 ℃下晾干；
5）将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4 ℃下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6）在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4 ℃下晾干；
7）滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4 ℃下晾干，制得Au@ GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
2. 凝血酶的测定
（1）将Au@
GS-FI -Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（2）设置计时电流参数，测量电位为-0.4
V，在10 mL底液为pH
7.4的PBS缓冲溶液中测定，用微量注射器加入10 μL、5mol•L-1的H2O2溶液，记录计时电流信号；
（3）根据所测定的计时电流信号的变化值与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
本发明的有益成果
（ 1 ）本发明电化学适配体传感器的第一层为Au@GS-FI，利用GS-FI大的比表面积和优良的电子传递能力，以及金纳米粒子比表面积大和良好的生物相容性，有效地提高了传感器的灵敏度。
（ 2 ）甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI，活性基团含量约为7.2wt%，固定生物分子效果优异，含量非常高。
（ 3 ）本发明在凝血酶报告探针上修饰了CoPdNPs，其特征是利用了Co、Pd的协同作用，对H2O2的催化能力更强，进一步增强了电化学的响应信号，从而降低了检测的检测限。
具体实施方式
实施例 1一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法
（1）选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Apt1和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2；（2）合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI；称取质量比为1 : 1的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH＜2，搅拌至少30 min，逐滴加入40 mmol•L-1的NaBH4溶液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
（3）钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将3 mg、粒径7 nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到1.5 mL浓度为0.05 mol•L-1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30
min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80 μL的1 mg•mL-1的亲和素， 37 ℃下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs；再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80μL 的10 μg•mL-1生物素修饰的Apt2，在37 ℃下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2；重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg•mL-1 的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 ℃下备用；
（4）Au@GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
1）用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol•L-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV；
2）将金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI超声分散处理，制得分散性好的Au@ GS-FI溶液；
3）将分散好的Au@ GS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4）在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Apt1，置于4 ℃下晾干；
5）将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4 ℃下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6）在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4 ℃下晾干；
7）滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4 ℃下晾干，制得Au@ GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
实施例 2 一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法
（1）选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Apt1和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2；（2）合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI；称取质量比为1 : 1
~ 1.1的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH＜2，搅拌至少30 min，逐滴加入50 mmol•L-1的NaBH4溶液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
（3）钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将4 mg、粒径8 nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到2.0 mL浓度为0.05 mol•L-1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30
min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入100 μL的1 mg•mL-1的亲和素， 37 ℃下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs；再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入100 μL 的10 μg•mL-1生物素修饰的Apt2，在37 ℃下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2；重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg•mL-1 的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 ℃下备用；
（4）Au@GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
1）用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol•L-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV；
2）将金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI超声分散处理，制得分散性好的Au@ GS-FI溶液；
3）将分散好的Au@ GS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4）在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Apt1，置于4 ℃下晾干；
5）将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4 ℃下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6）在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4 ℃下晾干；
7）滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4 ℃下晾干，制得Au@ GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
实施例 3 一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法
（1）选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Apt1和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2；（2）合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI；称取质量比为1 :
1.2的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH＜2，搅拌至少30 min，逐滴加入60 mmol•L-1的NaBH4溶液至氯金酸全部还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
（3）钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将5 mg、粒径9 nm左右的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到2.5 mL浓度为0.05 mol•L-1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30
min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入120 μL的1 mg•mL-1的亲和素， 37 ℃下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs；再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入120μL 的10 μg•mL-1生物素修饰的Apt2，在37 ℃下，振荡孵育30 min，离心以除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2；重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg•mL-1 的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 ℃下备用；
（4）Au@GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
1）用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol•L-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV；
2）将金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI超声分散处理，制得分散性好的Au@ GS-FI溶液；
3）将分散好的Au@ GS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4）在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Apt1，置于4 ℃下晾干；
5）将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4 ℃下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6）在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4 ℃下晾干；
7）滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4 ℃下晾干，制得Au@ GS-FI
-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
实施例 4 凝血酶的测定
（1）将Au@
GS-FI -Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（2）设置计时电流参数，测量电位为-0.4
V，在10 mL底液为pH
7.4的PBS缓冲溶液中测定，用微量注射器加入10 μL、5mol•L-1的H2O2溶液，记录计时电流信号；
（3）根据所测定的计时电流信号的变化值与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线; 凝血酶的线性范围为0.010～2.00 ng·mL-1，检测限为0.0032ng·mL-1。
Claims (2)
1.一种快速检测凝血酶的电化学适配体传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）选择巯基修饰的凝血酶捕获探针Apt1和生物素修饰的凝血酶报告探针Apt2；
（2）合成金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI
称取质量比为1 : 1 ~ 1.2的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯GS-FI和氯金酸，用水分散24 h，离心去除上清液，重新用水分散，并用盐酸调节pH＜2，搅拌至少30 min，逐滴加入40~60 mmol·L-1的NaBH4溶液至氯金酸全部被还原，最后，离心并用超纯水洗三次，在真空干燥箱中烘干；
（3）钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2的制备
将3~5 mg、粒径7~9 nm的钴钯纳米粒子CoPdNPs，加入到1.5~2.5 mL浓度为0.05 mol·L-1的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB溶液中，超声30 min，将油溶性的钴钯纳米粒子CoPdNPs改性为水溶性，离心除去多余的十六烷基三甲基溴化铵CTMAB，将离心后的钴钯纳米粒子CoPdNPs重新分散于pH 7.4的PBS缓冲溶液中；向钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120 μL的1 mg·mL-1的亲和素，37 ℃下振荡孵育120 min，离心除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的亲和素，制得亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs；再向亲和素化的钴钯纳米粒子CoPdNPs溶液中加入80~120μL 的10 μg·mL-1生物素修饰的Apt2，在37 ℃下，振荡孵育30 min，离心除去未与钴钯纳米粒子CoPdNPs结合的Apt2；重新分散于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液中，制得2 mg·mL-1 的钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，储存在4 ℃下备用；
（4）Au@GS-FI-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2夹心型电化学适配体传感器的制备
1）用氧化铝粉对玻碳电极进行预处理，无水乙醇超声清洗，将电极置于5 mmol·L-1铁氰化钾溶液中，在-0.2～0.6 V电位下扫循环伏安，峰电位差小于110 mV；
2）将金纳米粒子修饰的甲酰基咪唑修饰还原石墨烯Au@GS-FI超声分散处理，制得分散性好的Au@GS-FI溶液；
3）将分散好的Au@GS-FI溶液滴涂到玻碳电极表面，置于红外灯下烤干；
4）在电极上滴涂上凝血酶捕获探针Apt1，置于4 ℃下晾干；
5）将6-巯基己醇滴涂电极上，置于4 ℃下晾干，用于封闭非特异性活性位点；
6）在电极上滴涂一定浓度的凝血酶，置于4 ℃下晾干；
7）滴涂钴钯纳米粒子CoPdNPs修饰的凝血酶报告探针CoPdNPs-Apt2溶液，置于4 ℃下晾干，制得Au@GS-FI-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器。
2.如权利要求1所述的制备方法制备的适配体凝血酶电化学传感器用于凝血酶的测定，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将Au@GS-FI-Apt1/Tb/CoPdNPs-Apt2电化学适配体传感器作为工作电极，饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝电极作为对电极，连接到电化学工作站上；
（2）设置计时电流参数，测量电位为-0.4 V，在10 mL底液为pH 7.4的PBS缓冲溶液中测定，用微量注射器加入10 μL、5mol·L-1的H2O2溶液，记录计时电流信号；
（3）根据所测定的计时电流信号的变化值与凝血酶浓度的线性关系，绘制工作曲线。
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