CN107543850A - 检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和在检测胰蛋白酶中的应用,该生物传感器包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2,磁纳米颗粒的表面修饰有羧基,多肽链2的表面加载有银纳米颗粒,多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA,多肽链1中含有精氨酸残基;磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附磁纳米颗粒,多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上,所多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。制备方法为:合成多肽链1‑磁纳米复合材料;合成加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液;组装生物传感器。本发明可实现对胰蛋白酶的特异性定性或定量检测,且检测限低,线性范围宽。
Description
技术领域
本发明属于生物生物传感器技术领域,具体涉及一种检测胰蛋白酶的生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
胰蛋白酶是特异性最强的一种蛋白酶,在胰脏中是胰蛋白酶的前体胰蛋白酶原被合成后,作为胰液的成分而分泌,受肠激酶,或胰蛋白酶的限制分解成为活化胰蛋白酶,是肽链内切酶,它能把多肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。胰蛋白酶有着消化酶的功能,并且能够起活化的作用,例如限制分解一些酶的前体,磷脂酶原、糜蛋白酶原、羧肽酶原等。测定血清胰蛋白酶对诊断急性胰腺炎有一定意义。
随着纳米技术的快速发展,纳米材料特别是磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,MNPs)在生物医学领域引起了人们极大的研究兴趣。磁性纳米颗粒是一类智能型的纳米磁性材料,既具有纳米材料所特有的性质如粒径小、比表面积大、偶连容量高,又具有磁响应性及超顺磁性,可以在恒定磁场下聚集和定位、在交变磁场下吸收电磁波产热。利用这些特性磁性纳米颗粒被应用于生物标记与分离、核磁共振成像(MRI)、组织修复、药物载体以及疾病诊断与治疗等方面。
多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质,是介于氨基酸和蛋白质之间的一类化合物,由多种氨基酸按照一定的排列顺序通过肽键结合而成。由于多肽链段上氨基酸残基具有不同的化学结构,多肽可以利用其肽键间氢键作用以及氨基酸残基之间的氢键作用、静电作用、疏水性作用以及π-π堆积作用等有效实现分子自组装,通过非共价作用形成具有特定排列顺序的多肽聚集体。
由于胰蛋白酶的特异性,可以针对蛋白质的序列中的某个片段进行定位切割,在实验中起着举足轻重的作用。因此,有望利用胰蛋白酶的上述特异性,构建多肽-磁性纳米颗粒生物生物传感器,检测血清中胰蛋白酶。但是目前还没有相关报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种基于多肽-磁性纳米颗粒检测胰蛋白酶的生物生物传感器及其制备方法和应用,可实现对目标物胰蛋白酶的特异性定性或定量检测,且检测限低,线性范围宽。
为解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
一种检测胰蛋白酶的生物传感器,包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2,所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基,所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒,所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA,所述多肽链1中含有精氨酸残基;所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒,所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上,所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。
本发明检测胰蛋白酶的原理为:
当体系中没有目标物胰蛋白酶时,表面加载有银纳米颗粒的多肽链2可以与固定在磁性金电极表面的修饰有磁纳米颗粒(MNPs)的多肽链1通过末端序列VIA自组装连接,进而有很强的电化学信号。当体系中存在胰蛋白酶时,胰蛋白酶可以催化裂解多肽链1中的精氨酸残基的C端,使多肽链1含末端序列VIA的一段连同表面加载有银纳米颗粒的多肽链2一起脱离电极表面,电极上只剩下了经过切割后的多肽链1的部分序列,因而得到的电化学信号就降低了很多,且随着目标物浓度的增加,电化学信号逐渐降低。因此采用这样一个“信号降低”的方式可以实现胰蛋白酶的精确检测。
优选的,所述多肽链1的序列为GGGAGRGVIA。
优选的,所述多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL。
优选的,所述磁纳米颗粒包括四氧化三铁磁纳米颗粒。
作为一个总的发明构思,本发明还提供一种上述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)在表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,反应15~60min后,将反应液磁分离,去除上清液,加入溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液,反应1~5h后,将反应液磁分离,去除上清液,清洗后得到多肽链1-磁纳米复合材料;
(2)避光条件下,在AgNO3溶液中加入多肽链2,磁力搅拌反应15~60min后,缓慢加入用冰水溶解的NaBH4,再反应5~30min,得到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液;
(3)在磁性金电极的检测端滴加步骤(1)所得的多肽链1-磁纳米复合材料,待表面干燥后,浸入到步骤(2)所得的加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液中进行自组装反应,得到检测胰蛋白酶的生物传感器。
优选地,所述步骤(1)中,所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液由以下方法制得:
在70~90℃水浴及搅拌条件下,在除氧后的NaOH溶液中逐滴加入含FeSO4、FeCl3和HCl的混合溶液,持续除氧和搅拌15~60min后,迅速加入柠檬酸三钠溶液,并将水浴温度再升温5~20℃,持续除氧和搅拌30~90min后,将反应液磁分离,所得沉淀物清洗后用超纯水溶解,得到表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液。
优选地,NaOH溶液、混合溶液、柠檬酸三钠溶液和超纯水的体积比为90mL∶9mL∶10mL∶50mL;所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.5M,所述混合溶液中,FeSO4的摩尔浓度为0.5M,FeCl3的摩尔浓度为1M,HCl的摩尔浓度为0.4M,柠檬酸三钠溶液的摩尔浓度为1.94M。
优选地,所述步骤(1)中,所述溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液中,多肽链1的浓度为2μM;所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液与溶解有多肽链1的三氟乙醇溶液的体积比为900μL∶100μL。
优选地,在检测溶解有无目标物胰蛋白酶的缓冲溶液的条件下,磁纳米颗粒最佳的浓度为2mg/ml,多肽链1-磁纳米复合材料的最佳浓度为2μm。
优选地,所述步骤(3)中,所述自组装反应在金属浴条件下进行,金属浴温度为30~40℃,自组装时间为1~5h。
作为一个总的发明构思,本发明还提供一种上述的检测胰蛋白酶的生物传感器或上述的制备方法所制备的检测胰蛋白酶的生物传感器在检测血清中胰蛋白酶中的应用,具体操作方法包括以下步骤:以所述的检测胰蛋白酶的生物传感器作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,建立三电极系统,将所述三电极系统与电化学工作站连接,将工作电极的检测端置于稀释的含有胰蛋白酶的血清溶液中,反应30~90min后,通过电化学工作站检测出血清溶液中进行电化学反应时的电流大小,然后根据胰蛋白酶浓度对数值与还原电流变化的线性回归方程,即可定性或定量地测定血清溶液中的胰蛋白酶;
所述胰蛋白酶浓度与还原电流变化的线性回归方程为:
P=5.469-0.712lgC(1)
式(1)中,P为胰蛋白酶检测时的电流变化值,单位为nA;lgC为血清溶液中胰蛋白酶的浓度对数值,单位为μM;相关系数为R2=0.996。
优选地,胰蛋白酶检测线性范围为1ng/mL~100mg/mL,检测下线为0.032ng/mL。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
本发明的的检测胰蛋白酶的生物传感器,可实现对目标物胰蛋白酶的特异性定性或定量检测,且具有较宽的检测范围,较低的检出限,可以应用于稀释后的血清样品分析,并可用于空白血清中胰蛋白酶的加标回收检测,具有很大的医疗检测应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1的检测胰蛋白酶的生物传感器的组装过程示意图。
图2为本发明实施例1的检测胰蛋白酶的生物传感器检测胰蛋白酶的原理图。
图3为反应体系中有无目标物胰蛋白酶时电化学电流值大小的区别曲线图。
图4为电化学信号随MNPs浓度的变化曲线图。
图5为电化学信号随多肽链1浓度的变化曲线图。
图6为电化学信号随多肽链1和2自组装时间的变化曲线图。
图7为电化学信号随胰蛋白酶反应时间的变化曲线图。
图8为本发明实施例1的生物传感器检测胰蛋白酶时,胰蛋白酶浓度与响应电流的曲线图。
图9为本发明实施例1的生物传感器检测胰蛋白酶时,胰蛋白酶浓度对数值与响应电流的线性图。
图10为本发明实施例1的生物传感器对胰蛋白酶的特异性分析结果图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例1:
一种本发明的检测胰蛋白酶的生物传感器,包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2,所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基,所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒,所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA,所述多肽链1中含有精氨酸残基;所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒,所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上,所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。
本实施例中,所述多肽链1的序列为GGGAGRGVIA。
所述多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL。
所述磁纳米颗粒为直径约为15nm的四氧化三铁磁纳米颗粒。
上述本实施例的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,如图1所示,包括以下步骤:
(1)制备多肽链1-磁纳米复合材料
(1.1)采用共沉淀法制备磁纳米颗粒(MNPs):首先,将90mL浓度为0.5M的NaOH溶液倒入三颈瓶中,水浴加热至80℃,并持续除氧和搅拌。然后,将9mL含0.5M FeSO4、1M FeCl3和0.4M HCl混合溶液逐滴加入到上述NaOH溶液中,80℃水浴下,持续除氧和搅拌30分钟。之后,在迅速加入10mL浓度为1.94M柠檬酸三钠溶液,并将水浴温度上升至90℃,持续除氧和搅拌60分钟后,将混合液中磁分离得到的沉淀物用超纯水洗3次并磁分离,将最后的沉淀物用50mL超纯水溶解,即得到羧基化的四氧化三铁磁性纳米颗粒(MNPs)溶液。柠檬酸盐化合物与三价铁离子之间有很强的亲和力,因此本发明合成的MNPs表面会包裹一层柠檬酸三钠,由于其带有羧基基团,可以和很多带有氨基的化合物相结合。
(1.2)合成多肽链1-磁纳米复合材料:将900μL步骤(1.1)所得的MNPs溶液加入100μL的EDC和NHS组成的混合物(以9∶1体积比混合),EDC和NHS是羧氨反应中常用的两种试剂,前者用于羧基的活化,后者用于羧氨反应催化;在室温羧氨反应30分钟后,将混合溶液磁分离后去上清,定溶至900μL,再加入100μL的20mM的用溶解多肽链1的三氟乙醇,室温反应3小时之后,将混合溶液磁分离去上清,用超纯水清洗2次后即得多肽链1-磁纳米复合材料(P1-MNPs)。
(2)合成加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液
多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL,设计成具有两个特殊功能的部分,末端序列VIA可以使多肽发生自组装,GASLWWSEKL可以促使生物模拟合成银纳米颗粒。合成加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液的步骤如下:首先将1.2mL的水加入一个5mL的小烧杯中,再加入500μL浓度为5mM的AgNO3,避光处理,再加入100μL浓度为100ng/mL的多肽链2,在磁力搅拌器上反应20分钟之后,缓慢地加入200μL用冰水溶解的NaBH4,再反应10分钟左右,待溶液的颜色变成浅黄色,即得到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液。
(3)制备检测胰蛋白酶的生物传感器
首先,磁性金电极分别在3000目和5000目的细刚玉砂纸上打磨,接着依次用1μm,0.3μm和0.05μm的氧化铝粉与水的混合物在丝绸和麂皮上抛光之镜面。然后,金电极在乙醇和双蒸水中各超声5分钟。再用水虎鱼(H2SO4︰H2O2=3︰1)净化5分钟以除去电极表面的杂质,双蒸水冲去后用氮气吹干,将电极置于0.5M H2SO4中,于0~1.6V电位范围内进行循环伏安扫面至稳定后,备用于多肽链1的固定。在电极表面上滴加10μL的预先修饰好的多肽链1-MNPs,待其表面干燥,加入到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液中,在37℃金属浴中反应让其发生自组装。水溶性的三肽VIA可以通过分子内氢键自组装形成直的无分枝的多肽纳米纤维β-折叠结构。因此本发明设计的多肽链1和2序列中都含有VIA,故可以通过两个多肽链末端的VIA氨基酸序列自组装的方式把能产生电化学信号的银纳米颗粒连接到磁性金电极表面。自组装反应3h后,得到本实施例的检测胰蛋白酶的生物传感器。
本实施例的检测胰蛋白酶的生物传感器检测胰蛋白酶的原理为:
如图2和3所示,当体系中没有目标物胰蛋白酶时,表面加载有银纳米颗粒的多肽链2可以与固定在磁性金电极表面的修饰有磁纳米颗粒(MNPs)的多肽链1通过末端序列VIA自组装连接,进而有很强的电化学信号。当体系中存在胰蛋白酶时,胰蛋白酶可以催化裂解多肽链1中的精氨酸残基的C端,使多肽链1含末端序列VIA的一段连同表面加载有银纳米颗粒的多肽链2一起脱离电极表面,电极上只剩下了经过切割后的多肽链1的部分序列,因而得到的电化学信号就降低了很多,且随着目标物浓度的增加,电化学信号逐渐降低。因此采用这样一个“信号降低”的方式可以实现胰蛋白酶的精确检测。
实验条件的优化:
为获得最佳检测结果,对体系中修饰多肽链1的磁纳米颗粒的浓度以及修饰多肽1的浓度,多肽链1和2自组装的时间的优化,以及目标物胰蛋白酶反应时间进行优化。结果如图4~7所示。
如附图4所示,随着MNPs浓度的增加,电化学信号逐渐增加最后趋于平稳,所以选取MNPs最佳的浓度为2mg/mL。图5显示随着多肽链1浓度的增加电流值也逐渐增加最后趋于平稳,故多肽链1选用最佳的浓度为2μM。该体系是利用多肽自组装的方式来实现信号的表征,所以要对自组装的时间条件进行优化,如附图6所示,最佳时间为金属浴37℃,3小时。酶反应时间是影响酶反应效果的重要参数,如附图7所示,随着胰蛋白酶反应时间的加大,得到的检测信号越低,当达到1小时时,检测信号趋于平稳,说明反应已经达到平衡。为保证酶反应充分和检测效率,选取60分钟为最佳反应时间。
本实施例的检测胰蛋白酶的生物传感器定量检测胰蛋白酶的应用:
以本实施例的检测胰蛋白酶的生物传感器作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,建立三电极系统,将该三电极系统与电化学工作站660c连接,对待测溶液中的胰蛋白酶进行检测。
由图8和9可知,胰蛋白酶浓度对数值与还原电流变化的线性回归方程为:
P=5.469-0.712lgC(1)
式(1)中,P为胰蛋白酶检测时的电流变化值,单位为nA;lgC为血清溶液中胰蛋白酶的浓度对数值,单位为μM;相关系数为R2=0.996。
胰蛋白酶检测线性范围为1ng/mL~100mg/mL,检测下线为0.032ng/mL。
为了证明本发明的生物传感器可以应用于复杂的生物液体样品中胰蛋白酶的检测,本实施例利用人体血清来检测胰蛋白酶的活性。用稀释10倍的血清来溶解样品胰蛋白酶,具体为:在10%的空白血清样品中,加入4个不同浓度1μg/mL,0.1μg/mL,0.01μg/mL,0.001μg/mL的胰蛋白酶,再用本实施例的生物传感器来分别检测产生的电化学信号。以扫速设置为100mV/s在-0.2-0.3V电压范围内进行线性扫描伏安法(LSV)来表征电化学信号。通过电化学工作站检测出血清溶液中进行电化学反应时的电流大小,利用式(1)的标准曲线计算出相对应的胰蛋白酶的浓度,并计算出回收率以及RSD,试验结果如表1所示:
表1采用本发明的生物传感器检测血清样品中胰蛋白酶的数据表
从表1可以看出,本发明的生物传感器可以应用于稀释后的血清样品中胰蛋白酶的检测分析,具有很大的医疗检测应用前景。
本实施例的生物传感器对胰蛋白酶的特异性检测分析:
选用浓度均为1mg/mL的蛋白BSA、Hb、Mb,蛋白酶HRP、GO,和胃蛋白酶(Pep)作为对照物来验证本发明对胰蛋白酶的选择性。从附图10可见,在对照物1mg/mL的情况下,这些蛋白得到的电化学信号依然要远大于100μg/mL的胰蛋白酶的信号,说明本发明对胰蛋白酶具有良好的选择性。
最后有必要在此说明的是:以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明,不能理解为对本发明保护范围的限制,本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种检测胰蛋白酶的生物传感器,其特征在于,包括磁性金电极、磁纳米颗粒、多肽链1和多肽链2,所述磁纳米颗粒的表面修饰有羧基,所述多肽链2的表面加载有银纳米颗粒,所述多肽链1和多肽链2的一个末端序列均为VIA,所述多肽链1中含有精氨酸残基;所述磁性金电极的检测端表面通过磁性吸附所述磁纳米颗粒,所述多肽链1通过末端的氨基与磁纳米颗粒表面修饰的羧基反应固定在磁纳米颗粒上,所述多肽链2通过末端序列VIA自组装在多肽链1上。
2.根据权利要求1所述的检测胰蛋白酶的生物传感器,其特征在于,所述多肽链1的序列为GGGAGRGVIA。
3.根据权利要求1或2所述的检测胰蛋白酶的生物传感器,其特征在于,所述多肽链2的序列为VIAGASLWWSEKL。
4.根据权利要求3所述的检测胰蛋白酶的生物传感器,其特征在于,所述磁纳米颗粒包括四氧化三铁磁纳米颗粒。。
5.一种如权利要求1~4任一项所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)在表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺,反应15~60min后,将反应液磁分离,去除上清液,加入用三氟乙醇溶解的多肽链1,反应1~5h后,将反应液磁分离,去除上清液,清洗后得到多肽链1-磁纳米复合材料;
(2)避光条件下,在AgNO3溶液中加入多肽链2,磁力搅拌反应15~60min后,缓慢加入用冰水溶解的NaBH4,再反应5~30min,得到加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液;
(3)在磁性金电极的检测端滴加步骤(1)所得的多肽链1-磁纳米复合材料,待表面干燥后,浸入到步骤(2)所得的加载有银纳米颗粒的多肽链2溶液中进行自组装反应,得到检测胰蛋白酶的生物传感器。
6.根据权利要求5所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)中,所述表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液由以下方法制得:
在70~90℃水浴及搅拌条件下,在除氧后的NaOH溶液中逐滴加入含FeSO4、FeCl3和HCl的混合溶液,持续除氧和搅拌15~60min后,迅速加入柠檬酸三钠溶液,并将水浴温度再升温5~20℃,持续除氧和搅拌30~90min后,将混合液磁分离,所得沉淀物清洗后用超纯水溶解,得到表面修饰有羧基的磁纳米颗粒溶液。
7.根据权利要求5所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,其特征在于,在检测溶解有无目标物胰蛋白酶的缓冲溶液的条件下,磁纳米颗粒最佳的浓度为2mg/ml,多肽链1-磁纳米复合材料的最佳浓度为2μm。
8.根据权利要求5所述的检测胰蛋白酶的生物传感器的制备方法,其特征在于,所述步骤(3)中,所述自组装反应在金属浴条件下进行,金属浴温度为30~40℃,自组装时间为1~5h。
9.一种如权利要求1~4任一项所述的检测胰蛋白酶的生物传感器或权利要求5~8任一项所述的制备方法所制备的检测胰蛋白酶的生物传感器在检测血清中胰蛋白酶中的应用,具体操作方法包括以下步骤:以所述的检测胰蛋白酶的生物传感器作为工作电极,饱和甘汞电极作为参比电极,铂丝电极作为对电极,建立三电极系统,将所述三电极系统与电化学工作站连接,将工作电极的检测端置于稀释的含有胰蛋白酶的血清溶液中,反应30~90min后,通过电化学工作站检测出血清溶液中进行电化学反应时的电流大小,然后根据胰蛋白酶浓度对数值与还原电流变化的线性回归方程,即可定性或定量地测定血清溶液中的胰蛋白酶;
所述胰蛋白酶浓度与还原电流变化的线性回归方程为:
P=5.469-0.712lgC(1)
式(1)中,P为胰蛋白酶检测时的电流变化值,单位为nA;lgC为血清溶液中胰蛋白酶的浓度值,单位为μM;相关系数为R2=0.996。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,胰蛋白酶检测线性范围为1ng/mL~100mg/mL,检测下线为0.032ng/mL。
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