CN108344783A - 一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用。该电化学细胞传感器的制备，包括以下步骤：按照现有方法合成了氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子，其具有大的比表面积和良好的生物相容性。其用于固载适配体（aptamer），通过癌细胞与特定适配体的特异性结合作用，捕获目标癌细胞。同时也合成了多孔的钯金核壳纳米粒子（Pd@Au NPs），与伴刀豆球蛋白A（Con A）结合，形成纳米探针，与目标癌细胞结合。形成“三明治”的夹心结构。将传感器修饰在玻碳电极表面，并结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测和对细胞表面N‑聚糖动态评价。本发明的传感器特异性强，重复性好，灵敏度高，操作简单，检测限低。

Description

一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞检测技术领域，具体涉及一种电化学细胞器及其制备方法和应用，更具体涉及一种通过合金纳米粒子催化底物过氧化氢产生还原电流，从而检测循环肿瘤细胞个数和动态评价细胞表面N-聚糖的变化，属于超灵敏的电化学细胞传感器的制备技术。
背景技术
近年来，癌症已成为全球人类死亡的主要原因之一。90％以上的癌症相关死亡是由癌症转移引起的。当癌细胞从原发肿瘤部位转移到外周血或淋巴系统时，它们将成为循环肿瘤细胞(CTC)，被认为是癌症生长和转移的关键因素。因此，早期发现CTC对癌症的有效治疗具有重要意义。然而，早期癌症患者中CTC的数量极少，导致难以分离和定量检测。为了提高检测灵敏度，建立了包括荧光传感、成像，X射线照相术，聚合酶链式反应，流式细胞术和螺旋计算机断层扫描术在内的与CTC富集，捕获和检测有关的各种发展方法。但是，现有的大多数方法在实验程序或复杂的仪器上都会花费大量的时间和成本。因此，开发敏感，快速，准确的CTC检测方法对临床分析具有重要意义。
细胞表面的糖在许多细胞过程(包括细胞间通讯，分化，信号传导，细胞粘附，免疫识别/反应和病理过程)中发挥重要作用。通常将聚糖表位用作表面标记来检测和识别特定类型的细胞，例如肿瘤细胞和干细胞。细胞表面上的聚糖表达是取决于细胞状态和条件的动态过程。与Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc组成的共有五糖核心结构的N-连接糖基化(N-聚糖)的聚糖参与调节生物分子相互作用的过程；例如，表皮生长因子上β1.6GlcNAc分支N-聚糖的动态变化与Mgat5表达的变化有关，影响细胞运动和肿瘤转移；N-聚糖内细胞表面甘露糖的异常表达也在肿瘤发生，脑老化和分化过程中观察到。因此，细胞表面N-聚糖的动态分析在疾病发展和临床诊断中的作用是重要的。
目前，已有多种方法应用于聚糖分析，包括质谱(MS)，高效液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)。然而，由于其破坏性的操作步骤，这些方法中的一些不适合于活细胞的原位聚糖分析，并且耗时耗力。
由于电化学生物传感器具有灵敏度高，成本低，操作方便，检测快速等特点，因此广泛应用于癌细胞的检测。为了提高电化学生物传感器的高灵敏度，已经通过不同的方法进行信号放大。其中，由于酶的特异性和高效性，酶催化的放大策略引起了广泛的关注。而酶的使用和选择存在一些缺点，如稳定性差，固定复杂，对温度和pH敏感性高等，这也限制了其应用。为了克服上述缺陷，基于纳米材料的无酶电化学细胞传感器提供了一种可能。据报道，各种金属和金属氧化物纳米材料已被开发为电催化剂，因为它具有内在的过氧化物酶样活性，因此可以制作灵敏的电化学生物传感器。贵金属基纳米粒子，特别是Au，Pt和Pd，由于其良好的生物相容性和良好的催化作用，以及大的比表面积，具有广泛的应用前景。最近，由于协同作用和电子效应，已经证明具有核壳纳米结构的双金属纳米颗粒表现出优于相应的单金属纳米材料的催化性能。它们的催化性能不仅归因于形状和大小，而且归因于组成和结构。越来越多的关注在高度树枝状/多孔结构的双金属纳米粒子的合成。由于它们的高比表面积和丰富的表面原子，树枝状/多孔纳米结构有利于提高催化性能。
发明内容
发明目的：本发明要解决的技术问题是提供了一种灵敏度高、检测速度快，检测循环肿瘤细胞和动态评价细胞表面N-聚糖的电化学细胞传感器。
本发明还要解决的技术问题是提供了该电化学细胞传感器的制备方法。
本发明还要解决的技术问题是提供了该电化学细胞传感器的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明是通过以下方案来实现的：一种电化学细胞传感器，所述电化学细胞传感器是通过适配体(aptamer)修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子特异性结合循环肿瘤细胞，再连接伴刀豆球蛋白A(Con A)修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子形成的电化学夹心式细胞传感器。该电化学夹心式细胞传感器为“三明治”的夹心结构。
本发明所述的循环肿瘤细胞包括但不仅限于乳腺癌细胞(MCF-7细胞)，其他循环肿瘤细胞也适应于本发明。
本发明中所述的MCF-7细胞适配体为氨基修饰的SYL3C适配体，其序列为：5′-NH2-CAC TAC AGA GGT TGC GTC TGT CCC ACG TTG TCA TGG GGG GTT GGC CTG-3′
SYL3C适配体可以特异性识别循环肿瘤细胞表面过度表达的上皮细胞黏附分子(EpCAM)从而捕获循环肿瘤细胞。SYL3C适配体氨基化之后，可以通过戊二醛与氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子结合。
其中，ConA可以识别细胞表面的N-聚糖中的三甘露糖片段从而结合循环肿瘤细胞。
其中，所述适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备方法如下：
1)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子(Fe3O4@SiO2-NH2NPs)悬浮在PBS中，并与戊二醛溶液混合得到混合物A；
2)将混合物A在室温下反应，接着用PBS在外加磁场下洗涤除去未反应的戊二醛得到样品；
3)将获得的样品再分散在PBS中得到溶液，将溶液与氨基修饰的适配体混合，轻轻摇动孵育得到混合物B，然后，使用PBS将得到的混合物B清洗数次，用外部磁场分离得到固体混合物，固体混合物用PBS悬浮得到溶液A；
4)然后，将牛血清白蛋白溶液加入到步骤3)的溶液A中以封闭非特异性结合位点得到溶液B；
5)溶液B在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS中得到Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物。
其中，所述ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备方法如下：
1)氯金酸水溶液、四氯钯酸钠和氯化十六烷基吡啶溶于二次水中，并充分混合得到溶液，将新配制的抗坏血酸溶液快速加入溶液中反应后得到多孔的Pd@Au核壳纳米粒子；
2)取多孔的Pd@Au核壳纳米粒子与Con A水溶液混合到超纯水中，慢慢振荡过夜，离心除去上清液，沉淀用超纯水清洗数次，再用含有Mn2+和Ca2+的PBS重新悬浮即得ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子。
其中，所述氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的粒径为296-472nm。
其中，所述Con A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子粒径为60～70nm。
本发明内容还包括上述的电化学细胞传感器的制备方法，包括以下步骤：
1)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子和多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备；
2)适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备；
3)ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备；
4)适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子特异性结合循环肿瘤细胞，再连接Con A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子得到所述电化学细胞传感器。
其中，所述步骤2)中的适配体为氨基修饰的SYL3C适配体(NH2-SYL3C aptamer)，所述适配体的终浓度为2～2.2μM。
其中，所述步骤3)中的Con A的终浓度为0.15～0.2mM。
本发明中使用的PBS为0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲溶液。
本发明内容还包括上述的电化学细胞传感器在检测循环肿瘤细胞或动态评价细胞表面N-聚糖方面的应用。
其中，所述应用是指将所述电化学传感器修饰在玻碳电极表面，采用计时安培法结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测和/或动态评价细胞表面的N-聚糖的表达。
有益效果：相对于现有技术，本发明的优点如下：
(1)本发明的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子具有好的生物相容性和大的比表面积；
(2)利用生物活性稳定、催化性质良好的多孔的核壳Pd@Au纳米粒子作为催化剂，催化过氧化氢，产生还原电流；
(3)多孔的Pd@Au核壳纳米粒子具有高导电性，同时放大了还原电流，起到放大信号作用；
(4)本发明利用计时安培法进行测定，操作快速简单，反应及结果均由仪器自动完成和记录，避免了主观因素的影响，并保证有很好的重复性。
附图说明
图1为本发明构建的电化学细胞传感器示意图。
图2多孔的核壳Pd@Au纳米粒子的表征图。图2A，2B和2C分别为多孔的Pd@Au核壳纳米粒子在不同放大倍数下的透射电子显微镜图；图2D为多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的扫描电子显微镜图；图2E为多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的能量色散X射线光谱图；图2F为多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的X射线衍射谱图。
图3为Fe3O4@SiO2纳米粒子的表征图。图3A，3B分别为Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子在不同放大倍数下的透射电子显微镜图；图3C为Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的扫描电子显微镜图；图3D为Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的粒径分布图。
图4为适配体修饰的Fe3O4@SiO2纳米粒子的表征图；图4A为紫外可见光谱图：曲线a，b，c分别是适配体NH2-SYL3C，Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子，适配体修饰的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的紫外可见光谱图；图4B为zeta电位图：a，b，c分别是是Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子，适配体NH2-SYL3C，适配体NH2-SYL3C修饰的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的zeta电位；图4C为FITC标记的适配体NH2-SYL3C修饰的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的共聚焦荧光成像图。
图5为不同的修饰电极(A：Pd纳米粒子；B：Au纳米粒子；C：多孔的Pd@Au核壳纳米粒子)在氮气饱和的PBS中含有(曲线a)和不含有(曲线b)5mM H2O2的循环伏安曲线。
图6为本发明中电化学检测条件优化结果；其中图6A为适配体NH2-SYL3C浓度的优化；图6B为细胞培养时间的优化；图6C为加入信号探针不同量的优化；图6D为探针孵育时间的优化；
图7为本发明所述电化学细胞传感器对MCF-7细胞的检测结果分析图；其中图7A中曲线a到f分别为MCF-7细胞浓度为100，400，1×103，1×104，1×105，和1×106cells mL-1时的计时安培电流曲线，图7B为电流与细胞浓度对数值的线性相关图；
图8A为本发明所述细胞传感器在1×104cells mL-1的不同细胞系的溶液中的计时安培电流响应。图8B为本发明所述细胞传感器的重复性研究；
图9A为本发明未用(曲线a)及所用(曲线b)12μM衣霉素处理MCF-7细胞随不同培养时间催化电流强度变化图；图9B为经衣霉素处理48小时的MCF-7细胞、图9C为未经处理的MCF-7细胞的共聚焦荧光图。
具体实施方式
以下实施例中用到的试剂和仪器：氯化十六烷基吡啶(HDPC)，柠檬酸三钠(Na3Cit)，氯化铁(FeCl3)，乙二醇(EG)，氯金酸四水合物(HAuCl4·4H2O)，无水乙酸钠(NaAc)，过氧化氢(H2O2)和氨水(NH3·H2O)购自于国药集团化学试剂有限公司。抗坏血酸(AA)，(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷(APTES)，正硅酸四乙酯(TEOS)和戊二醛(GA)从阿拉丁试剂公司获得。四氯钯酸钠(Na2PdCl4)，伴刀豆球蛋白A(Con A)和异硫氰酸荧光素标记的伴刀豆球蛋白(FITC-Con A)购自Sigma-Aldrich西格玛-奥德里奇上海贸易有限公司本研究中的SYL3C适配体由上海生工生物技术有限公司合成并纯化。电化学工作站(CHI660E,上海辰华仪器有限公司)，紫外可见光谱仪(UV-2450,Tokyo,Japan)，透射电子显微镜(JEM-2100,JEOL Ltd.)均为市面上购买。
实施例1适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备
(1)四氧化三铁纳米粒子的制备：将4mmol氯化铁和0.28mmol柠檬酸三钠在搅拌下溶解于28mL乙二醇中以形成均匀溶液。接着，在剧烈搅拌下向溶液中加入1.20g无水乙酸钠，剧烈搅拌混合物30分钟，然后转移到高压釜中在200℃下加热并保持10小时。接着，将高压釜冷却至室温。黑色产物用乙醇和超纯水经磁力洗涤三次后，制备的产物在50℃下干燥即得。
(2)Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备：将0.05g四氧化三铁纳米粒子超声溶于35mL乙醇和6mL水中，用氨水将pH调至9，然后加入200μL正硅酸四乙酯(TEOS)，大力搅拌10小时。产物用乙醇和超纯水经磁力洗涤三次后，制备的产物在50℃下干燥即得。将Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子进行表征得到结果，参见图3A～3D。
(3)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备：将0.05gFe3O4@SiO2核壳纳米粒子超声溶于35mL乙醇和6mL水中，用氨水将pH调至9，然后加入20μL正硅酸四乙酯(TEOS)和100μL三乙氧基硅烷(APTES)，大力搅拌8小时。产物用乙醇和超纯水经磁力洗涤三次后，制备的产物在50℃下干燥即得。
(4)适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备：将5mg氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子悬浮在7.5mL的PBS(pH 7.4，0.01M)中，并与2.5mL的戊二醛溶液(2.5wt％)混合。将混合物在室温下搅拌6小时。接着用PBS(pH 7.4，0.01M)洗涤三次以除去未反应的戊二醛。将获得的样品再分散在10mL PBS(pH 7.4，0.01M)中。将1mL上述样品(0.5mg mL-1)与NH2-SYL3C aptamer(50μL，20μM)混合，轻轻摇动孵育12小时。然后，使用PBS(pH 7.4，0.01M)将得到的混合物清洗数次，用磁铁分离得到固体混合物，固体混合物用PBS悬浮得到溶液A；将100μL的1％BSA溶液加入到上述溶液A中1小时以封闭非特异性结合位点得到溶液B；溶液B在外部磁场下用PBS(pH 7.4，0.01M)洗涤3次分离制备得到Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物，最后再分散于0.5mL PBS(pH 7.4，0.01M)中得到Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA复合物悬浮液，4℃保存备用。分别将适配体NH2-SYL3C、Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子，适配体NH2-SYL3C修饰的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子进行表征结果见图4。
如图4A所示，氨基化的Fe3O4@SiO2纳米颗粒在紫外-可见光区域没有明显的紫外吸收峰(曲线b)。然而，单独的适配体在265nm处有一个明显的紫外吸收峰(曲线a)。氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子与适配体共同孵育后，在263nm处出现明显的的吸收峰。这些结果证明了适配体NH2-SYL3C已成功固定在了氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子的表面。
图4B显示了制备的适配体NH2-SYL3C修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米颗粒的ζ电位。由于氨基化的Fe3O4纳米粒子的表面带有大量的氨基，因此在中性pH条件下带正电，测得的ζ电位值为26.7mV。当纳米粒子表面修饰了带负电的适配体后，结果显示ζ电位值从26.4降低到4.3mV。这表明与单独的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米颗粒相比，适配体NH2-SYL3C修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2带有较少的正电荷。ζ电位值的变化表明了适配体NH2-SYL3C已成功修饰在了氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子的表面。
同时获得了共聚焦荧光图像(图4C)，证实了适配体NH2-SYL3C与氨基化的Fe3O4@SiO2纳米颗粒表面的结合。用FITC标记的适配体与纳米颗粒结合，使其能够在488nm处激发产生绿色荧光。如图2C所示，通过共焦荧光显微镜观察亮绿色荧光点。结果表明适配体与氨基化的Fe3O4@SiO2纳米复合物的成功偶联。
实施例2ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备
(1)多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备：将0.5mL 10mM氯金酸水溶液，2mL 10mM四氯钯酸钠和0.1g氯化十六烷基吡啶溶于25mL二次水中，并充分混合。将新配制的1.5mL0.1M的抗坏血酸溶液快速加入上述溶液中，在35℃下反应三个小时。最后，将得到的黑色多孔的Pd@Au纳米粒子离心，用蒸馏水和乙醇洗涤三次，在60℃下真空干燥24小时。将制备好的多孔Pd@Au纳米颗粒(0.02g)分散于4.0mL的二次水中，得到多孔的Pd@Au核壳纳米粒子悬浮液(5mgmL-1)。
(2)制备Pd@Au-ConA纳米探针即ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备：取500μL制得的Pd@Au NPs悬浮液，与100μLConA水溶液(2mM)混合到10mL超纯水中，在4℃下慢慢振荡过夜。离心除去上清液，沉淀用超纯水清洗数次，再用含有1mM Mn2+和Ca2+的1.0mLPBS(pH 7.4，0.01M)重新悬浮，4℃保存备用。表征结果见图2。该ConA修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子粒径在60～70nm之间波动。
实施例3Pd NPs，Au NPs和多孔的Pd@Au NPs电催化行为的表征
将6μLPd核壳纳米粒子(Pd NPs)，Au核壳纳米粒子(Au NPs)和多孔的Pd@Au NPs(1mg mL-1)溶液分别滴在电极表面。干燥后，得到三组相应的修饰电极。将这三组修饰电极分别在PBS(pH 7.4，0.01M)和含有5mMH2O2的PBS(pH 7.4，0.01M)中，用电化学工作站及三电极体系从0.3V～-0.6V进行循环伏安扫描，结果如图5所示，三组修饰电极在不含有H2O2的PBS(pH 7.4，0.01M)中几乎没有电流响应，而在含有5mM H2O2的PBS(pH 7.4，0.01M)中有催化电流响应。并且用多孔的Pd@Au NPs修饰电极观察到最大的还原电流。表明在多孔的Pd@Au NPs存在着协同作用。在本研究中，多孔的Pd@Au NPs与单独的Pd NPs和Au NPs相比，具有更好的催化性能。因此我们选择多孔的Pd@Au核壳纳米粒子。
实施例4电化学夹心式细胞传感器的制备
将实施例1制备的100μL1mg mL-1Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA复合物悬浮液与含有不同浓度的MCF-7细胞(100，400，1×103，1×104，1×105，和1×106cells mL-1)的100μLPBS(pH 7.4，0.01M)混合，并在37℃孵育90分钟。三次磁性分离后，用结合缓冲液洗涤，除去游离细胞得到Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物。随后，将Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物进一步与60μL实施例2制备得到的Pd@Au-ConA纳米探针混合，并在37℃孵育60分钟。经磁性分离，用PBS(pH 7.4，0.01M)洗涤三次，除去过量的Pd@Au-Con A纳米探针得到电化学细胞传感器。最后，将电化学细胞传感器重新悬浮于200μL的PBS(pH 7.4，0.01M)中得到电化学夹心式细胞传感器，并保存在4℃备用。
实施例5电化学检测方法
(1)玻碳电极的预处理。玻碳电极依次被0.3μm和0.05μm氧化铝粉抛光。在乙醇和超纯水中超声处理后，用二次水吹干备用。
(2)取6μL实施例4制备好的电化学细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位，因为这样低的电位将有利于降低背景电流并使常见干扰物质的响应最小化。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2溶液(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。
实施例6电化学检测条件的优化
1)NH2-SYL3C aptamer浓度的优化
i.37℃下，将五份相同的1mL实施例1制备的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子(0.5mgmL-1)分别与五份50μL不同浓度的NH2-SYL3C aptamer(10μM，15μM，20μM，25μM，30μM)混合，轻轻摇动孵育12h得到五组混合物。
ii.使用PBS(pH7.4，0.01M)将得到的五组混合物清洗数次，用磁铁分离得到固体混合物，固体混合物用PBS悬浮得到五组溶液A；
iii.将100μL1％BSA溶液分别加入到上述五组溶液A中1小时以封闭非特异性结合位点得到五组溶液B；
iv.五组溶液B分别在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS缓冲液中分别得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物；
v.将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100μg mL-1，和链霉素100μgmL-1)的RPIM1640培养基中的MCF-7细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，其浓度为0.01M，pH为7.4)中得到均匀细胞悬液，使细胞悬液浓度为1×104cells mL-1；
vi.分别将五组100μL所述细胞悬液加入到100μL步骤iv中的五组捕获细胞的纳米复合物Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物中37℃下孵育90min，以孵育缓冲液冲洗去除未捕获的细胞得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物。
vii.取五份60μL实施例2中的Pd@Au-ConA纳米探针分别与五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物在37℃下孵育60min，得到电化学夹心式细胞传感器。
viii.分别取6μL上述具有1×104cells mL-1浓度的五组的电化学夹心式细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于电化学夹心式细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。(实验结果请参见图6A。)
2)细胞捕获时间的优化
i.在37℃下，将五份相同的1mL实施例1制备的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子(0.5mg mL-1)与五份相同的50μL NH2-SYL3C aptamer(20μM)混合，轻轻摇动孵育12h得到五组混合物；
ii.使用PBS将得到的混合物清洗数次，用磁铁分离得到固体混合物，固体混合物用PBS缓冲液悬浮得到五组溶液A；
iii.将100μL的1％BSA溶液加入到上述溶液A中1h以封闭非特异性结合位点得到五组溶液B；
iv.溶液B分别在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS缓冲液中得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物；
v.将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100μg mL-1，和链霉素100μgmL-1)的RPIM 1640培养基中的MCF-7细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，其浓度为0.01M，pH为7.4)中得到均匀细胞悬液，使细胞悬液浓度为1×104cells mL-1；
vi.分别将五组100μL所述细胞悬液加入到100μL步骤iv中的五组捕获细胞的纳米复合物Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物中37℃下孵育分别孵育30，60，90，150，200min，以孵育缓冲液冲洗去除未捕获的细胞得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物。
vii.取五份60μL实施例2中的Pd@Au-ConA纳米探针分别与五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物在37℃下孵育60min，得到电化学夹心式细胞传感器。
viii.分别取6μL上述具有1×104cells mL-1浓度的五组的电化学夹心式细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于电化学夹心式细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。(实验结果参见图6B。)
3)优化Pd@Au-ConA纳米探针体积，对纳米探针识别能力进行优化
i.37℃下，将五份相同的1mL实施例1制备的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子(0.5mgmL-1)分别与五份50μL相同浓度的NH2-SYL3C aptamer(20μM)混合，轻轻摇动孵育12h得到五组混合物。
ii.使用PBS将得到的五组混合物清洗数次，用磁铁分离得到固体混合物，固体混合物用PBS缓冲液悬浮得到五组溶液A；
iii.将100μL 1％BSA溶液分别加入到上述五组溶液A中1h以封闭非特异性结合位点得到五组溶液B；
iv.五组溶液B分别在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS缓冲液中分别得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物；
v.将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100μg mL-1，和链霉素100μgmL-1)的RPIM 1640培养基中的MCF-7细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，其浓度为0.01M，pH为7.4)中得到均匀细胞悬液，使细胞悬液浓度为1×104cells mL-1；
vi.分别将五组100μL所述细胞悬液加入到100μL步骤iv中的五组捕获细胞的纳米复合物Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物中37℃下孵育90min，以孵育缓冲液冲洗去除未捕获的细胞得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7复合物。
vii.取五份实施例2中不同体积的Pd@Au-ConA纳米探针(10，20，40，60，80，100uL)分别与五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物在37℃下孵育60min，得到电化学夹心式细胞传感器。
viii.分别取6μL上述具有1×104cells mL-1浓度的五组的电化学夹心式细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于电化学夹心式细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。(实验结果参见图6C。)
4)优化Pd@Au-ConA纳米探针孵育的时间
i.在37℃下，将五份相同的1mL实施例1制备的氨基化的Fe3O4@SiO2纳米粒子(0.5mg mL-1)与五份相同的50μL NH2-SYL3C aptamer(20μM)混合，轻轻摇动孵育12h得到五组混合物；
ii.使用PBS将得到的混合物清洗数次，用磁铁分离得到固体混合物，固体混合物用PBS缓冲液悬浮得到五组溶液A；
iii.将100μL的1％BSA溶液加入到上述溶液A中1h以封闭非特异性结合位点得到五组溶液B；
iv.溶液B分别在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS缓冲液中得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物；
v.将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100μg mL-1，和链霉素100μgmL-1)的RPIM 1640培养基中的MCF-7细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液中，其浓度为0.01M，pH为7.4)中得到均匀细胞悬液，使细胞悬液浓度为1×104cells mL-1；
vi.分别将五组100μL所述细胞悬液加入到100μL步骤iv中的五组捕获细胞的纳米复合物Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物中37℃下孵育分别孵育90min，以孵育缓冲液冲洗去除未捕获的细胞得到五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物。
vii.取五份60μL实施例2中的Pd@Au-ConA纳米探针分别与五组Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA/MCF-7 cell复合物在37℃下孵育30，45，60，75，90min，得到电化学夹心式细胞传感器。
viii.分别取6μL上述具有1×104cells mL-1浓度的五组的电化学夹心式细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于电化学夹心式细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2(10μL，5M)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。(实验结果参见图6D)
从实验结果图6A～6D所示，最佳检测条件为修饰适配体浓度20μM，细胞捕获时间90min，信号探针体积60μL，探针孵育时间60min。
实施例7对MCF-7细胞的量化检测实验
1)将处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100ug mL-1，和链霉素100ugmL-1)的RPIM1640培养基中的MCF-7细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液，其浓度为0.01M，pH为7.4)中得到均匀细胞悬液，通过细胞计数器计数，分别使细胞悬液浓度为100，400，1×103，1×104，1×105，和1×106cells mL-1。
2)将6μL上述实施例4制备的具有不同浓度的电化学夹心式细胞传感器滴在预处理的玻碳电极上。对于电化学夹心式细胞传感器的电流测量，选择-0.4V作为检测电位。在背景电流稳定后，在温和搅拌下将H2O2(10μL,5mol L-1)注入PBS(pH7.4，10mL)中，记录电流变化。
3)分析结果如图7所示，在MCF-7细胞浓度为100cells mL-1到1×106cells mL-1区间内，计时电流信号大小与细胞浓度对数值呈线性相关，其相关系数为0.998，检测限为30cells mL-1。
实施例8构建电化学细胞传感器特异性检测实验
大多数循环肿瘤细胞表面都会过度表达上皮细胞粘附分子(EpCAM)，而SYL3C适配体可以特异性地识别EpCAM从而捕获CTCs。由于MCF-7细胞高表达EpCAM，我们选取这种细胞作为CTCs的模型细胞，控制组的细胞选取低表达EpCAM的MB-MDA-231和MCF-10A细胞，阴性对照组细胞选取不表达EpCAM的HEK-293T细胞。
将分别处于对数生长期的培养在含有血清、双抗(青霉素100ug mL-1，和链霉素100ug mL-1)的RPIM 1640培养基中的MCF-7，MB-MDA-231和MCF-10A，HEK-293T细胞以1000转每分钟的速度离心5分钟进行分离后，重新分散于结合缓冲液(4.5g L-1葡萄糖，5mM MgC12，0.1mg L-1tRNA和1mg mL-1BSA溶于含钙镁离子的杜氏磷酸盐缓冲液，其浓度为0.01M，pH为7.4)，将分别获得均匀的细胞悬液(1×104cells mL-1)，与Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA孵育90min，再与ConA修饰的Pd@Au NPs纳米探针识别，按照实施例5所述方法进行检测。
建立的电化学细胞传感器的特异性通过检测到的计时电流评估。将计时电流传感器的响应信号(EpCAM高表达的MCF-7细胞)的模型组与包括(EpCAM低表达的MCF-10A，MB-MDA-231细胞)的控制组和(EpCAM不表达的HEK-293T细胞)的阴性对照组进行比较。由图8A可知，相对于模型组细胞，观察到可忽略的(阴性对照组细胞)或极小电流响应(控制组细胞)，证明所提出的传感器可以有效区分MCF-7细胞和其他对照细胞，具有良好的选择性和结合能力(图8A)。为了评估所提出的方法对复杂细胞混合物中MCF-7细胞的可行性，使用相同浓度的MCF-7，MCF-10A，MB-MDA-231和HEK-293T细胞(最终细胞浓度为1×104cell mL-1)。如比较图(图8A)所示，在细胞混合物中获得的响应表现出轻微的偏差。响应电流与单独MCF-7细胞的反应几乎相似，这表明所提出的传感器对于复杂基质中的MCF-7细胞的测定也是可行的。优异的特异性可能是因为SYLC3-适配体对EpCAM-高表达MCF-7细胞显示出强亲和力，而对EpCAM阴性细胞(HEK-293T)，低表达EpCAM的癌细胞(MCF-10A，MB-MDA-231)低的结合力，因此EpCAM阴性和EpCAM低表达细胞可以容易地从中区分出来。
实施例9评估电化学生物传感器的重复性
将实施例4中获得五组相同的MCF-7细胞悬液(1×104cells mL-1)，与Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA孵育90min，再与Con A修饰的Pd@Au NPs纳米探针识别，修饰在同一根电极上按照实施例5所述方法进行五组测量，每组测三次。结果如图8B所示，表明构建的细胞传感器表现出良好的重现性。图8B中的相对标准偏差RSD为2.61％。
实施例10动态监测细胞表面N-聚糖表达对衣霉素的响应
1)将实施例4中获得均匀的MCF-7细胞悬液(1×105cells mL-1)，加入衣霉素使其浓度为12μM，取经过衣霉素处理及未处理的MCF-7细胞悬液(1×105cells mL-1)。37℃下以不同的孵育时间进行孵育、洗涤后，与Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA孵育90min，再与Con A修饰的Pd@Au NPs纳米探针识别，按照实施例5所述方法进行检测，通过催化电流信号大小分析细胞表面N-聚糖在外界药物作用下的动态表达。
2)分析结果表明，未经过衣霉素处理的细胞，随培养时间的增加，计时电流信号不变；而经过衣霉素处理的细胞随培养时间的增加，计时电流信号降低，即衣霉素抑制N-聚糖表达效果逐渐增加。这是因为衣霉素能够抑制细胞N-聚糖生物合成的第一步，从而使细胞表面N-聚糖含量减少。在处理48h后电流改变值约为41.4％，表明了衣霉素能显著抑制N-聚糖在MCF-7细胞表面的表达，如图9A所示。同时将经衣霉素处理48小时的MCF-7细胞与未经处理的的MCF-7细胞经离心、清洗后重新分散于500μL冷的PBS中，经FITC-标记的ConA识别后，以共聚焦荧光显微镜在激发波长为488nm处进行检测，用TM处理后，其荧光强度减少38.2％，与之前所得现象几乎一致。未作处理的MCF-7细胞作为阴性对照，评价自体荧光，表征结果说明，经衣霉素处理的MCF-7细胞其对FITC-标记的Con A的结合能力得到了降低，如图9B和9C所示。值得注意的是，在研究糖的表达分析中，电化学传感的方法比共聚焦成像的方法更灵敏，这主要是基于适配体对细胞的高亲和性结合以及纳米材料的双重信号放大。
序列表
<110> 东南大学
<120> 一种电化学细胞传感器及其制备方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(SYL3C aptamer)
<400> 1
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48

Claims (10)

1.一种电化学细胞传感器，其特征在于，所述电化学细胞传感器是通过适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子特异性识别循环肿瘤细胞，再连接伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子形成的电化学夹心式细胞传感器。
2.根据权利要求1所述的电化学细胞传感器，其特征在于，所述适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备方法如下：
1)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子悬浮在PBS中，并与戊二醛溶液混合得到混合物A；
2)将混合物A在室温下反应，接着用PBS在外部磁场下分离洗涤除去未反应的戊二醛得到样品；
3)将获得的样品再分散在PBS中得到溶液，将溶液与氨基修饰的适配体混合，轻轻摇动孵育得到混合物B，然后，使用PBS将得到的混合物B在外部磁场下清洗数次并分离得到固体混合物，固体混合物用PBS悬浮得到溶液A；
4)然后，将牛血清白蛋白溶液加入到步骤3)的溶液A中以封闭非特异性结合位点得到溶液B；
5)将溶液B在外部磁场下用PBS洗涤3次，最后再分散于PBS中得到Fe3O4@SiO2-NH2/aptamer/BSA偶联物。
3.根据权利要求1所述的电化学细胞传感器，其特征在于，所述伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备方法如下：
1)氯金酸水溶液、四氯钯酸钠和氯化十六烷基吡啶溶于二次水中，并充分混合得到溶液，将新配制的抗坏血酸溶液快速加入溶液中反应后得到多孔的Pd@Au核壳纳米粒子；
2)取多孔的Pd@Au核壳纳米粒子与ConA溶液混合到超纯水中，慢慢振荡过夜，离心除去上清液，沉淀用超纯水清洗数次，再用含有Mn2+和Ca2+的PBS缓冲溶液中重新悬浮即得伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子。
4.根据权利要求1所述的电化学细胞传感器，其特征在于，所述氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的粒径为296-472nm。
5.根据权利要求1所述的电化学细胞传感器，其特征在于，所述伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子粒径为60～70nm。
6.权利要求1～5任一项所述的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子和多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备；
2)适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子的制备；
3)伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子的制备；
4)适配体修饰的氨基化的Fe3O4@SiO2核壳纳米粒子特异性结合循环肿瘤细胞，再连接伴刀豆球蛋白A修饰的多孔的Pd@Au核壳纳米粒子得到所述电化学细胞传感器。
7.根据权利要求6所述的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的适配体为氨基修饰的SYL3C适配体，所述适配体的终浓度为2～2.2μM。
8.根据权利要求6所述的电化学细胞传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中的伴刀豆球蛋白A的终浓度为0.15～0.2mM。
9.权利要求1～5任一项所述的电化学细胞传感器在检测循环肿瘤细胞和/或动态评价细胞表面的N-聚糖的表达方面的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用是指将所述电化学传感器修饰在玻碳电极表面，采用计时安培法结合电化学工作站对循环肿瘤细胞进行检测和/或动态评价细胞表面的N-聚糖的表达。
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