CN111505067B

CN111505067B - 一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法

Info

Publication number: CN111505067B
Application number: CN202010129225.2A
Authority: CN
Inventors: 王如海; 唐昊冶; 徐仁扣; 钱薇; 洪志能; 韩恩
Original assignee: Institute of Soil Science of CAS
Current assignee: Institute of Soil Science of CAS
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2020-02-28
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-02-28
Also published as: CN111505067A

Abstract

一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，在聚苯乙烯‑丙烯酸纳米球上自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。本发明检测线性范围宽、灵敏度高、稳定性强。

Description

一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法

技术领域

本发明专利属于生物检测技术领域，具体涉及免疫电化学分析方法在土壤/水界面研究中的应用，尤其涉及一种检测大肠杆菌的电化学方法。

背景技术

土壤中含有的大量微生物并不都是以游离态存在于土壤中，大约80–90%的微生物被束缚在固相表面。在土壤和水生环境中，细菌与土壤矿物之间的相互作用对细菌的转运和最终命运产生重要影响，并且它们的相互作用对土壤的物理、化学和生物学性质都具有重要的影响，例如矿物形成与风化、有机物质分解和团聚体形成。

粪源性有机肥施入土壤中，往往有大肠杆菌的引入，为了评估大肠杆菌与土壤之间的相互作用，开展大肠杆菌在土水界面上的分配研究十分必要。在界面研究过程中，需要分离检测游离的大肠杆菌。检测大肠杆菌的传统方法主要有平板计数法、分光光度比浊法等。

平板计数需要培养细菌，方法操作复杂，需要专业操作人员等缺点，不适合在研究大肠杆菌与土壤相互作用研究的测定中。分光光度比浊法，需要首先通过使用密度梯度离心法，运用蔗糖溶液分离游离态和矿物结合态细菌，游离部分的细菌全部转移后通过紫外可见分光光度法测定。但是由于分离过程中溶液体积发生变化和大肠杆菌与土壤胶体分离不清，同时土壤矿物在溶液中散射作用，因此传统方法测定具有一定的弊端。特别是在高浓度的未吸附的大肠杆菌与土壤胶体密度相差不大，界面不易分离，通过全部转移后定容，损失了分离不清的未吸附的大肠杆菌，从而导致传统方法测定浓度偏低；而电化学检测法作为一种高效，简单，准确，快速的分析方法，在分析领域引起了广泛关注。大肠杆菌可以与制备的电化学传感器进行免疫后，通过电信号的变化来进行大肠杆菌的定量检测。电化学方法可以直接测定的为上层未吸附的大肠杆菌的浓度，从而提高了测定准确度。本发明公开一种检测大肠杆菌的电化学方法并应用于检测土水界面中大肠杆菌，具有非常重要的科研意义和应用价值。

发明内容

解决的技术问题：本发明公开了一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法。以壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极构建传感平台，自组装大肠杆菌抗体，通过大肠杆菌抗体与大肠杆菌免疫作用，捕获溶液中的大肠杆菌，进而通过葡萄糖氧化酶和抗-大肠杆菌抗体功能化聚苯乙烯-丙烯酸功能化纳米探针进行信号放大。本方法为线性范围宽、灵敏度高、稳定性强的大肠杆菌检测方法，并将这种大肠杆菌传感器运用在大肠杆菌在土壤/水界面研究中。

技术方案：一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，步骤为：a.功能纳米探针的制备：在聚苯乙烯-丙烯酸纳米球上层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；b.电化学免疫传感平台的构建：利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；c.检测土水界面大肠杆菌：当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测。

上述聚苯乙烯-丙烯酸纳米球的制备方法为：按比例，首先在容器中加入80 mL超纯水，在氮气气氛中200 rpm油浴搅拌；持续充入N₂ 45 min后，将0.4 g 丙烯酸和4 g 苯乙烯加入到容器中并加热；当温度达到70 ℃后，向容器中加入20 mL 0.01 g·mL^-1的过硫酸铵回流6.5 h，然后在13000 rpm下离心20 min得聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，用超纯水清洗聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，最后用超纯水定容到12 mL并放于4 ℃下保存。

上述带正电的质子化的壳聚糖的制备步骤为：称取0.5 g壳聚糖后滴加50mL 1%冰醋酸得到1%壳聚糖溶液，再用纯水稀释10倍，得到0.1%壳聚糖溶液。

上述带负电的金纳米粒子的制备步骤为：称取0.0210 g氯化金溶于210mL超纯水中，加热到沸腾，加入9.45 mL 1%柠檬酸三钠，继续沸腾10分钟，颜色经过蓝色，红色，橙红三个过程，得到0.01% 金纳米粒子。

上述层层自组装的步骤为：按比例，将5 mL 0.1%壳聚糖溶液与150 μL 聚苯乙烯-丙烯酸纳米球溶液混合搅拌30 min，然后在8000 rmp下离心20 min，得到固体后加入5 mL0.01% 金纳米粒子溶液搅拌30 min，然后在8000 rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，最后用超纯水定容至6 mL，并放于4 ℃下保存。

上述探针的具体制备步骤为：向1 mL 组装了壳聚糖和金纳米粒子的纳米球溶液中加入50 μL 5 g L^-1的葡萄糖氧化酶和50 μL 100 μg mL^-1大肠杆菌抗体混合搅拌1小时；最后在8000 rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，并用超纯水定容至1 mL，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针，置于4℃冰箱中保存。

上述电化学免疫传感平台的构建，具体步骤为：首先在经过预处理过的玻碳电极表面滴加10 μL 0.1%壳聚糖溶液壳聚糖后晾干，再滴加10 μL 0.06 g L^-1二茂铁二甲酸后晾干，再滴加10 μL 0.01%的金纳米粒子后凉干；再滴加10 μL 100 µg/mL大肠杆菌抗体。

上述经过预处理过的玻碳电极的制备步骤为：打磨玻碳电极表面至镜面后，使用1:1稀释的HNO₃溶液、95% 的乙醇、18.2 MΩ.cm 超纯水分别超声清洗5 min；然后用0.5 MH₂SO₄对电极进行循环伏安扫描，直至电极的循环伏安图稳定；最后再分别用95% 的乙醇、超纯水超声清洗5 min，最后用氮气吹干备用。

上述检测土水界面大肠杆菌的步骤为：滴加20 μL待测液或者大肠杆菌标准曲线溶液，在37 ℃的培养箱中保温免疫30 min；滴加10 μL合成的功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米探针进行信号放大，在37℃的培养箱中保温二次免疫30 min；采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测大肠杆菌；以修饰过的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以含有5 mmol/L葡萄糖的PBS缓冲电解质液中为检测底物，应用电化学工作站，以扫描速度为50 mV/s，在扫描电位范围0.1-0.6 V下进行检测，观察峰型变化，记录电流值，表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。

上述土水界面大肠杆菌的分离方法为：在土壤与土壤表面溶液的溶液达到吸附平衡后，通过4000 rpm下离心5 min分离土水界面。

有益效果：通过大肠杆菌抗体与大肠菌的免疫作用，进而通过葡萄糖氧化酶和抗-大肠杆菌抗体功能化聚苯乙烯-丙烯酸功能化纳米探针进行信号放大，提高检测灵敏度；同时通过将二茂铁二甲酸修饰固定在玻碳电极的表面，与二茂铁二甲酸修饰在液体或悬液中相比，结合力更强，可提供更为稳定的催化平台。通过部分分离游离的大肠杆菌溶液就可以准确测定体系中的游离大肠杆菌的溶度，相对传统梯度离心法，提高了操作的便捷性。本方法为线性范围宽、灵敏度高、稳定性强的大肠杆菌检测方法，在研究大肠杆菌与土壤或者矿物相互作用，该方法可以广泛应用，为土壤与细菌作用研究提供了一个便捷可靠的技术手段。

附图说明

图1为功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米球合成路线示意图；

图2为检测土水界面大肠杆菌的电化学传感器的构建图；

图3为PSA纳米球的透射电镜表征图，其中图A是PSA纳米球的透射电镜表征；B是PSA纳米球倍数放大的透射电镜图；图C是PSA纳米球的扫描电镜表征；图D是通过壳聚糖组装金纳米粒子后的扫描电镜图；

图4为传感器表面电化学特性示意图，其中(a)是裸电极；(b)是壳聚糖修饰后的电极；(c)是壳聚糖、二茂铁和纳米金粒子修饰的电极；(d)是固载了抗体后的电极；(e)是加上大肠杆菌后的电极；

图5为不同修饰电极的循环伏安图，其中(a)是裸电极；(b)是未修饰探针的电极；(c)是修饰探针后的电极；

图6为二茂铁二甲酸用量对传感器响应电流的影响图；

图7为金纳米粒子用量对传感器响应电流的影响图；

图8为抗体浓度对传感器响应电流的影响图；

图9为大肠杆菌和固载在电极上的抗体的作用时间对传感器响应电流的影响图；

图10为大肠杆菌与固载在探针上的抗体的作用时间对传感器响应电流的影响图；

图11为大肠杆菌与大肠杆菌抗体作用温度对传感器响应电流的影响图；

图12为传感器扫描电位对传感器响应电流的对应关系图；

图13为大肠杆菌浓度对数值与传感器响应电流值的线性关系图；

图14为电化学方法测定土水界面大肠杆菌与传统方法与的比较图；

图15为电化学传感器检测大肠杆菌的特异性比较图，其中（a）含有1.2×10⁵CFU/mL大肠杆菌；（b）含有1.2×10⁵ CFU/mL大肠杆菌和1.2×10² CFU/mL金黄色葡萄球菌；（c）含有1.2×10⁵ CFU/mL大肠杆菌和1.2×10³ CFU/mL金黄色葡萄球菌；(d) 含有1.2×10⁵ CFU/mL大肠杆菌和1.2×10⁴ CFU/mL金黄色葡萄球菌；(e) 含有1.2×10⁵ CFU/mL大肠杆菌和1.2×10⁵ CFU/mL金黄色葡萄球菌；（f）含有1.2×10⁵ CFU/mL金黄色葡萄球菌。

具体实施方式

以下具体实施方式不以任何形式限制本发明的技术方案，凡是采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案均落在本发明的保护范围。实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

本发明公开了一种测定大肠杆菌的生物电化学方法。本实施例说明检测土水界面大肠杆菌的电化学传感器的构建:利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰电极构建电化学免疫传感平台，并结合葡萄糖氧化酶和抗-大肠杆菌抗体功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米球合成功能化纳米探针进行信号放大，实现土壤/水界面中大肠杆菌的高灵敏检测。

试剂准备：称取0.5 g壳聚糖后滴加50 mL 1 %冰醋酸得到1 %壳聚糖溶液，再用纯水稀释10倍，得到0.1%壳聚糖溶液。称取0.0210 g氯化金溶于210mL超纯水中，加热到沸腾，加入9.45 mL 1%柠檬酸三钠，继续沸腾10分钟，颜色经过蓝色，红色，橙红三个过程，得到0.01% 金纳米粒子。

玻碳电极表面进行预处理：打磨玻碳电极表面至镜面后，使用1:1 的HNO₃溶液、95% 的乙醇、超纯水(18.2 MΩ.cm )分别超声清洗5 min；然后用0.5 M H₂SO₄对电极进行循环伏安扫描，直至电极的循环伏安图稳定；最后再分别用95 % 的乙醇、超纯水超声清洗5min，最后用氮气吹干备用。

如图1，合成功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米探针:（1）首先合成聚苯乙烯-丙烯酸纳米球。在三颈烧瓶中加入80 mL超纯水，通入氮气，在35 ℃的油浴中，以200 rpm的速度持续搅拌45 min。将4 g 苯乙烯和0.4 g 丙烯酸加至三颈烧瓶中，升高温度达到70 ℃后，向烧瓶中加入20 mL 0.01 g mL^-1的过硫酸铵回流6.5 h。然后在13000 rpm下离心20 min，将固体物质用超纯水清洗三次，最后用超纯水定容到12 mL得到聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，并放于4 ℃下保存。（2）接着，通过层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球。将5 mL 0.1%壳聚糖溶液与150 μL 聚苯乙烯-丙烯酸纳米球溶液混合搅拌30 min，然后在8000 rmp下离心20 min。得到固体后加入5 mL 0.01% 金纳米粒子溶液搅拌30 min，然后在8000 rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，最后用超纯水定容至6 mL，并放于4 ℃下保存。（3）最后，将葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步组装至上述纳米球。将1 mL 组装了壳聚糖和金纳米粒子的纳米球溶液中加入50 μL 5 g L^-1的葡萄糖氧化酶和50 μL 100 μg mL^-1大肠杆菌抗体混合搅拌1小时。最后在8000 rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，并用超纯水定容至1 mL，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针，置于4℃冰箱中保存。

如图2，构建检测大肠杆菌的电化学传感器：（1）组装免疫平台，首先在经过预处理过的玻碳电极表面滴加10 μL 0.1%壳聚糖溶液壳聚糖后晾干，再滴加10 μL 0.06 g L^-1二茂铁二甲酸后晾干，再滴加10 μL 0.01%的金纳米粒子后凉干。（2）滴加10 μL 100 µg/mL大肠杆菌抗体。（3）滴加20 μL待测液或者大肠杆菌标准曲线溶液，在37℃的培养箱中保温免疫30 min。（4）滴加10 μL合成的功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米探针进行信号放大，在37℃的培养箱中保温二次免疫30 min。采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测大肠杆菌。以修饰过的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以含有5 mmol/L葡萄糖的PBS缓冲电解质液中为检测底物，应用电化学工作站，以扫描速度为50 mV/s，在扫描电位范围0.1-0.6 V下进行检测，观察峰型变化，记录电流值，表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线。

分离土水界面大肠杆菌：在土壤与土壤表面溶液的溶液达到吸附平衡后，通过4000 rpm下离心5 min分离土水界面，吸取上层溶液20 μL，使用电化学传感器测定其浓度。因为电化学方法分析需要的样品量非常少，只需要部分分离，取得上层溶液，因此不需要完全分离。通过细菌加入量与吸附平衡液中未被吸附的细菌量之间的差值计算土壤对细菌的吸附量。

功能化聚苯乙烯-丙烯酸(PSA)纳米探针的表面结构表征。图3，传感器表面形貌结构表征： A是PSA纳米球的透射电镜表征，B是PSA纳米球倍数放大的透射电镜图， C是PSA纳米球的扫描电镜表征， D是通过壳聚糖组装金纳米粒子后的扫描电镜图。由图中可以看出，合成的PSA纳米球形貌均一，粒径约为180 nm，粒径约为13 nm 的金纳米粒子（Au_NPs）成功通过壳聚糖的连接到PSA纳米球上，可以作为酶和抗体的载体，构建电化学免疫传感纳米探针。

电化学传感器的电化学特性表征。图4，不同修饰程度的电极在含有5.0 mM Fe(CN)₆ ^4-/3-和0.1M KCl的混合液的PBS (0.01 M, pH 7.4)中进行了交流阻抗的研究。（a）是裸电极，（b）是壳聚糖修饰后的电极，（c）是壳聚糖、二茂铁二甲酸和纳米金粒子修饰的电极，（d）是固载了抗体后的电极，（e）是加上大肠杆菌后的电极。由该阻抗图可以看出：裸电极的阻抗约为200 Ω，修饰了壳聚糖后阻抗增大到500 Ω左右，再修饰上二茂铁和金纳米粒子后阻抗下降到略高于裸电极的程度，约为240 Ω，而抗体和大肠杆菌修饰到电极上后，电极的阻抗均是变大的，可见蛋白质的不导电性对电极阻抗的影响。而加上后阻抗的明显变化，也在一定程度上说明了该传感器的成功构建。

图5根据不同修饰电极的循环伏安图，（a）是裸电极，（b）是未修饰探针的电极，（c）是修饰探针后的电极，由该循环伏安图可以看出，未修饰探针的电极CV图中可以观察到的响应电流，而修饰了探针后，探针中的葡萄糖氧化酶催化了底物葡萄糖产生过氧化氢，过氧化氢促进二茂铁氧化峰电流增大，可以很明显的看出探针对传感器信号的放大作用。

影响电化学传感器检测性能的条件优化。图6，随着二茂铁二甲酸加入量的增加，响应电流也随之增加，但是可以看到在二茂铁的量超过0.6 μg时，响应电流非但没有增加，反而开始减少。因为随着起到固定二茂铁作用的壳聚糖不断减少，致使具有水溶性的二茂铁二甲酸在测量的过程中流失，有效量反而下降。因此，我们最优化二茂铁二甲酸的加入量为0.6 μg。

图7，开始时响应电流随着金纳米粒子的增加而变大，在金纳米粒子的体积到了10μL之后，响应电流增加的趋势变缓。因此，我们最优化金纳米粒子的体积为10 μL。

图8显示抗体浓度在10~100 µg/mL时，电流值随浓度增大而增大，当抗体浓度超过100 µg/mL时，免疫传感器检测到的电流值增加变缓。因此，我们最优化抗体浓度为100 µg/mL。

图9是大肠杆菌和固载在电极上的抗体的作用时间t₁对传感器响应的影响，图10是大肠杆菌与固载在探针上的抗体的作用时间t₂对传感器响应的影响。随着作用时间的延长，响应电流也在不断变大，但是在30 min后响应电流增加的趋势变缓，出于优化传感器整体检测时间的考虑，因此，我们最优化两次作用时间均定为30 min。

图11显示免疫反应温度也是影响实验结果的重要因素之一，随着温度的升高，电流响应值也随之增大，并在37℃时达到最大值，而当温度高于37℃时，电流响应值随即开始下降，这是因为生物分子的活性受高温的影响，因此，我们最优化免疫温度定为37℃。

在最优条件下检测大肠杆菌的电化学方法的标准曲线检测。用制备的免疫传感器对分别为1.2×10²、1.2×10³、1.2×10⁴、1.2×10⁵、1.2×10⁶、1.2×10⁷CFU/mL的大肠杆菌进行检测。图12显示不同浓度的大肠杆菌在传感器扫描的具有特征电位为0.4V。图13是以大肠杆菌细菌浓度的对数值为横坐标，以对应电流响应值为纵坐标而得到的标准曲线图，可以标准曲线法测定未知大肠杆菌的浓度。随着大肠杆菌浓度的增加，免疫传感器的电流响应值也在不断线性增加。使用这种方法检测的线性范围为1.2×10²-- 1.2×10⁷CFU/mL，由校准曲线可知，线性方程为y=0.7257x+ 0.1768。

实施例2

使用实施例1制备电化学传感器测定土水界面大肠杆菌与传统方法的比较。

将100 mg采集自海南澄迈（19°46′N, 110°00′E）的砖红壤置于50 mL 塑料离心管中，然后向离心管中加入20 ml 不同浓度的大肠杆菌悬液（菌种编号: 1.2389，购买自中国微生物菌种保藏中心），其中含有1 mmol L^-1 NaCl，加入1 mmol L^-1 NaCl 溶液使溶液总体积为20 mL。用0.1 M HCl 或NaOH 调节溶液pH 5.5，在25℃条件下旋转反应1 h。在达到吸附平衡后，分别是用传统测定方法和电化学测定方法测定大肠杆菌浓度，比较二者的测定结果。

传统测定方法：吸附完成后，往离心管底部加入3 mL蔗糖溶液（60%质量浓度），利用梯度离心的方法分离未吸附的细菌。在4000 rpm下离心5 min，吸取全部上层溶液，定容后，用分光光度计测定未被吸附的细菌量。通过细菌加入量与吸附平衡液中未被吸附的细菌量之间的差值计算土壤对细菌的吸附量。

电化学测定方法：因为电化学方法分析需要的样品量非常少，因此不需要全部分离。通过4000 rpm下离心5 min分离土水界面，吸取上层溶液20 μL，使用电化学方法测定大肠杆菌浓度。通过细菌加入量与吸附平衡液中未被吸附的细菌量之间的差值计算土壤对细菌的吸附量。

对传统测定方法和电化学测定方法测定大肠杆菌的结果进行分析。将传统方法测定浓度为横坐标，电化学方法测定的浓度为纵坐标，通过图14比较发现，在较高大肠杆菌浓度下，电化学方法测定的大肠杆菌浓度高于传统方法测定的大肠杆菌浓度。这主要是因为在高浓度的未吸附的大肠杆菌与土壤胶体密度相差不大，界面不易分离，通过全部转移后定容，损失了分离不清的未吸附的大肠杆菌，从而导致传统方法测定浓度偏低；而电化学方法为直接测定的为上层未吸附的大肠杆菌的浓度，从而提高了测定准确度。

实施例3

本实施例说明电化学传感器检测特异性研究。图15，（a）表示浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的大肠杆菌的响应电流值，并以（a）样品的检测值作为单位标准，记作100%，（b）表示浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的大肠杆菌和浓度为1.2×10² CFU/mL的金黄色葡萄球菌的混合，（c）表示浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的大肠杆菌和浓度为1.2×10³ CFU/mL的金黄色葡萄球菌的混合，(d)为浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的大肠杆菌和浓度为1.2×10⁴ CFU/mL的金黄色葡萄球菌的混合(e)表示浓度为1.2×10⁵CFU/mL的大肠杆菌和浓度为1.2×10⁵ CFU/mL金黄色葡萄球菌的混合，（f）表示浓度为1.2×10⁵ CFU/mL的金黄色葡萄球菌，用制备的电化学免疫传感器分别对上述6个样品进行检测。混合的响应电流值与单独的大肠杆菌响应电流值接近，可以看出金黄色葡萄球菌对测试结果几乎没有影响。单独添加金黄色葡萄球菌样品的响应电流极低。证明了传感器可以对大肠杆菌实现高特异性检测。

Claims

1.一种检测土水界面大肠杆菌的电化学方法，其特征在于步骤为：

a.功能纳米探针的制备：在聚苯乙烯-丙烯酸纳米球上层层自组装带正电的质子化的壳聚糖和带负电的金纳米粒子功能化纳米球；接着用葡萄糖氧化酶和大肠杆菌抗体进一步功能化上述纳米球，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针；所述聚苯乙烯-丙烯酸纳米球的制备方法为：按比例，首先在容器中加入80 mL超纯水，在氮气气氛中200 rpm油浴搅拌；持续充入N₂ 45 min后，将0.4 g 丙烯酸和4 g 苯乙烯加入到容器中并加热；当温度达到70 ℃后，向容器中加入20 mL 0.01 g·mL^-1的过硫酸铵回流6.5 h，然后在13000 rpm下离心20 min得聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，用超纯水清洗聚苯乙烯-丙烯酸纳米球，最后用超纯水定容到12 mL并放于4 ℃下保存；所述带正电的质子化的壳聚糖的制备步骤为：称取0.5 g壳聚糖后滴加50 mL 1%冰醋酸得到1%壳聚糖溶液，再用纯水稀释10倍，得到0.1%壳聚糖溶液；所述带负电的金纳米粒子的制备步骤为：称取0.0210 g氯化金溶于210 mL超纯水中，加热到沸腾，加入9.45 mL 1%柠檬酸三钠，继续沸腾10分钟，颜色经过蓝色，红色，橙红三个过程，得到0.01% 金纳米粒子；所述层层自组装的步骤为：按比例，将5mL 0.1%壳聚糖溶液与150 μL 聚苯乙烯-丙烯酸纳米球溶液混合搅拌30 min，然后在8000rmp下离心20 min，得到固体后加入5 mL 0.01% 金纳米粒子溶液搅拌30 min，然后在8000rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，最后用超纯水定容至6 mL，并放于4 ℃下保存；所述探针的具体制备步骤为：向1 mL 组装了壳聚糖和金纳米粒子的纳米球溶液中加入50 μL5 g L^-1的葡萄糖氧化酶和50 μL 100 μg mL^-1大肠杆菌抗体混合搅拌1小时；最后在8000rmp下离心20 min，并用超纯水清洗三次，并用超纯水定容至1 mL，从而得到多酶功能化的具有免疫识别能力的功能纳米探针，置于4℃冰箱中保存；

b.电化学免疫传感平台的构建：利用壳聚糖/二茂铁二甲酸/金纳米粒子修饰玻碳电极，自组装捕获大肠杆菌抗体构建电化学免疫传感平台；具体步骤为：首先在经过预处理过的玻碳电极表面滴加10 μL 0.1%壳聚糖溶液壳聚糖后晾干，再滴加10 μL 0.06 g L^-1二茂铁二甲酸后晾干，再滴加10 μL 0.01%的金纳米粒子后凉干；再滴加10 μL 100 µg/mL大肠杆菌抗体；所述经过预处理过的玻碳电极的制备步骤为：打磨玻碳电极表面至镜面后，使用1:1稀释的HNO₃溶液、95% 的乙醇、18.2 MΩ.cm 超纯水分别超声清洗5 min；然后用0.5 MH₂SO₄对电极进行循环伏安扫描，直至电极的循环伏安图稳定；最后再分别用95% 的乙醇、超纯水超声清洗5 min，最后用氮气吹干备用；

c.检测土水界面大肠杆菌：当大肠杆菌通过电极上的大肠杆菌抗体被捕获，并进一步通过免疫识别，将多酶功能化纳米探针识别到电极表面时，可以检测到由于纳米探针上大量酶催化底物葡萄糖产生过氧化氢从而显著提高二茂铁在电极上的电化学信号，最终实现大肠杆菌的高灵敏检测；具体步骤为：滴加20 μL待测液或者大肠杆菌标准曲线溶液，在37℃的培养箱中保温免疫30 min；滴加10 μL合成的功能化聚苯乙烯-丙烯酸纳米探针进行信号放大，在37℃的培养箱中保温二次免疫30 min；采用差分脉冲伏安法(DPV)进行检测大肠杆菌；以修饰过的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，以含有5 mmol/L葡萄糖的PBS缓冲电解质液中为检测底物，应用电化学工作站，以扫描速度为50 mV/s，在扫描电位范围0.1-0.6 V下进行检测，观察峰型变化，记录电流值，表征不同浓度大肠杆菌连接电极的差分脉冲伏安曲线；所述土水界面大肠杆菌的分离方法为：在土壤与土壤表面溶液的溶液达到吸附平衡后，通过4000 rpm下离心5 min分离土水界面。