CN110794017B - 一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及,一种铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,属于电化学免疫传感器领域。本发明以铂纳米粒子功能化的花状氧硫化铜作为基底材料,以含有双氧水的磷酸缓冲溶液作为底液,采用电化学传感器的层层修饰方法,构建了信号减弱型电化学免疫传感器,实现了在1.0 fg/mL~50.0 ng/mL线性范围内对降钙原的灵敏检测,检测限为0.33 fg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法。具体是采用铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜作为传感平台,获得了一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,属于电化学免疫传感领域。
背景技术
降钙素原( Procalcitonin,PCT) 是无激素活性的降钙素前肽糖蛋白,在严重系统感染特别是细菌感染的条件下,释放到患者循环系统的可溶性蛋白。正常生理状态下,CALC-1基因转录表达的PCT局限于甲状腺C细胞及肺的神经内分泌细胞κ细胞上,PCT在健康人体内浓度非常低,且男性体内PCT水平高于女性。PCT反映了全身炎症反应的活跃程度,影响PCT水平的因素包括被感染器官的大小和类型、细菌的种类、炎症的程度和免疫反应的状况。 PCT浓度的升高出现严重休克、全身性炎症反应综合征(SIRS)和多器官功能紊乱综合征(MODS)等一系列症状。PCT是诊断是监测细菌炎性疾病感染的一个重要参数。因此,准确检测血清中PCT对炎症的早期诊断至关重要并且对进一步指导治疗具有重要意义,如何实现对降钙素原高效准确的检测是目前急需解决的问题。
电化学免疫传感器通常是用于解决超痕量重要疾病标记物和环境污染物等的检测手段。免疫传感器是基于抗原和抗体之间的特异性结合。它是一种用来分析或确定一种特定的物质的化学测试手段。其中分析物通常是在血液或者是体液中。这种结合分析具有较高的敏感性和较好的特异性。铂纳米粒子作为一种贵金属纳米粒子其具有一系列优良特性,如小尺寸、生物相容性好、导电性好和催化活性优异等。这一系列优点使其在电化学免疫传感器中得到了越来越多的应用。并且铂纳米粒子可以直接和抗体通过化合建相结合,操作简单。氧硫化铜作为载体是一种纳米材料其具有许多优点,其中花状的氧硫化铜具有褶皱的形貌,这种褶皱形貌可以固载更多的铂纳米粒子从而增加了抗体的固载而提高信号。因此,铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜作为基底材料构建电化学免疫传感器对提高传感器的性能具有重要作用。本发明采用无标记型电化学免疫传感器,结合放大技术,提高了传感器灵敏度和检测限,实现了对降钙素原的快速高效检测。
发明内容
本发明的目的之一是合成花状氧硫化铜纳米材料,在合成的过程中通过调节三水合硝酸铜、硫代乙酰胺和肼的量合成不同形貌的花状氧硫化铜纳米材料。
本发明的目的之二是合成具有优异催化性能的铂纳米粒子作为抗体的载体,其中铂纳米粒子具有均匀尺寸和大量催化位点的等优异的催化性能,从而增大催化信号。
本发明的目的之三是合成铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜纳米材料,其中在合成的过程中通过调节铂纳米粒子溶液的浓度可合成不同浓度的铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜纳米材料。
本发明的目的之四是以铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜作为基底材料大量固载捕获抗体,以降钙素原抗原作为目标分析物,利用抗原-抗体之间的免疫反应,构建信号减弱型电化学免疫传感器,根据降钙素原抗原固定在在电极表面前后电化学信号的变化,实现对降钙素原的定量检测。
为了实现上述目的,本发明采用的技术方案如下:
1. 本发明所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,所述电化学免疫传感器。制备步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面,再用超纯水洗涤干净;
(2)铂纳米粒子功能化氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h,离心,溶解于2 mL的去离子水;
(3)将6 µL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面,室温保存至干燥;
(4)继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面,4ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(5)继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(6)继续将6 μL、浓度为1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗。
2. 本发明所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,所述花状氧硫化铜和铂纳米粒子以及铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜纳米材料的制备方法,步骤如下:
(1)花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下,将4.0 g~5.0 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中。再将1.0 g~2.0 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中。30 min后,该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.1~0.2 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体,用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h,研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料。
(2)铂纳米粒子的制备
铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮,40 mg~60 mg的抗坏血酸和400 mg~600 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC,并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含40 mg~60 mg的四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液中,并且将这一反应在80 ºC保持3 h,洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中;
(3) 铂纳米粒子功能化氧硫化铜纳米材料的制备
将400 μL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中,在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子,再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。
3. 所述的1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液为1 mg/mL的降钙素原溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。
4. 一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,降钙素原的检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器为工作电极,在10 mL的pH为4.0~9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化;
(2)电化学工作站参数设置为,循环伏安扫描电位为-0.6~0.2 V,扫描速率设置为0.1 V/s;
(3)使用含10 μL浓度为5 mmol/L过氧化氢的10 mL磷酸盐缓冲溶液作为底液,通过计时电流方法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学电流信号强度;所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4,用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制;
(4)根据所得电流差值与降钙素原浓度呈线性关系,绘制工作曲线;
(5)依据工作曲线的绘制方法进行样品中降钙素原的检测,检测结果从工作曲线中查得。
本发明的有益成果
(1)花状氧硫化铜可以通过控制三水合硝酸铜、硫代乙酰胺和肼的量而合成不同褶皱形貌的氧硫化铜,从而可以负载不同量的铂纳米粒子。
(2)花状氧硫化铜具有大的比表面积和催化活性位点,其作为基底材料能够催化过氧化氢的分解产生更多的活性中间体,从而实现信号的放大。
(3)花状氧硫化铜可作为铂纳米粒子的载体,其中铂纳米粒子可以通过化学键均匀的分散在氧硫化铜的表面,能够固载更多的抗体而催化双氧水产生强的信号。
(4)将铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜与降钙素原标记物检测抗体直接孵化,利用贵金属的生物相容性和较高的催化性能,实现了对降钙素原的高灵敏度检测,避免了因酶的失活所带来的影响,提高了免疫传感器的重现性和稳定性。
(5)本发明制备的电化学免疫传感器用于降钙素原标志物的检测,响应时间短,检测限低,线性范围宽,可以实现简单、快速、高灵敏和特异性检测。在1.0 fg/mL~50.0 ng/mL浓度范围内实现了对降钙素原的高选择性和高灵敏检测,检测限低至0.33 fg/mL。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法
(1)将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面,再用超纯水洗涤干净;
(2)铂纳米粒子功能化氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h,离心,溶解于2 mL的去离子水;
(3)将将6 µL、浓度为1.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面,室温保存至干燥;
(4)继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面,4ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(5)继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(6)继续滴涂6 μL、浓度为1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗。
实施例2一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法
(1)将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面,再用超纯水洗涤干净;
(2)铂纳米粒子功能化氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h,离心,溶解于2 mL的去离子水;
(3)将将6 µL、浓度为2.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面,室温保存至干燥;
(4)继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面,4ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(5)继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(6)继续滴涂6 μL、浓度为1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗。
实施例3一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法
(1)将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面,再用超纯水洗涤干净;
(2)铂纳米粒子功能化氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h,离心,溶解于2 mL的去离子水;
(3)将将6 µL、浓度为3.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面,室温保存至干燥;
(4)继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面,4ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(5)继续滴涂3 μL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(6)继续滴涂6 μL、浓度为1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗。
实施例4花状氧硫化铜和铂纳米粒子以及铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜的制备
(1)花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下,将4.0 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中。再将0.8 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中。30 min后,该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.1 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体,用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h,研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料。
(2)铂纳米粒子的制备
铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮,40 mg的抗坏血酸和400 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC,并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含40 mg四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液中,并且将这一反应在80 ºC保持3 h,洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中;
(3) 铂纳米粒子功能化氧硫化铜纳米材料的制备
将400 μL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中,在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子,再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。
实施例5花状氧硫化铜和铂纳米粒子以及铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜的制备
(1)花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下,将4.5 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中。再将1.8 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中。30 min后,该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.15 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体,用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h,研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料;
(2)铂纳米粒子的制备
铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮,50 mg的抗坏血酸和500 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC,并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含50 mg四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液中,并且将这一反应在80 ºC保持3 h,洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中;
(3) 铂纳米粒子功能化氧硫化铜纳米材料的制备
将400 μL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中,在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子,再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。
实施例6花状氧硫化铜和铂纳米粒子以及铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜的制备
(1)花状氧硫化铜的制备
在磁力搅拌的条件下,将5.0 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中。再将2.0 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中。30 min后,该溶液加热到90 ºC。接下来再加入0.2 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体,用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物。将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h,研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料。
(2)铂纳米粒子的制备
铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的。将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮,60 mg的抗坏血酸和600 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC,并且保持10 min。然后用滴管逐滴加入含50 mg的四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液,并且将这一反应在80 ºC保持3 h,洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中;
(3) 铂纳米粒子功能化氧硫化铜纳米材料的制备
将400 μL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中,在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子,再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。
实施例7 降钙素原的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器为工作电极,在10 mL的pH为4.0~9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化;
(2)电化学工作站参数设置为,循环伏安扫描电位为 -0.6 V,扫描速率设置为0.1V/s;
(3)使用含10 μL浓度为5 mmol/L过氧化氢的10 mL磷酸盐缓冲溶液作为底液,通过计时电流方法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学电流信号强度;所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4,用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制;
(4)根据所得电流差值与降钙素原浓度呈线性关系,绘制工作曲线;
(5)依据工作曲线的绘制方法进行样品中降钙素原的检测,检测结果从工作曲线中查得。
实施例8 降钙素原的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器为工作电极,在10 mL的pH为4.0~9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化;
(2)电化学工作站参数设置为,循环伏安扫描电位为 -0.4 V,扫描速率设置为0.1V/s;
(3)使用含10 μL浓度为5 mmol/L过氧化氢的10 mL磷酸盐缓冲溶液作为底液,通过计时电流方法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学电流信号强度;所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4,用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制;
(4)根据所得电流差值与降钙素原浓度呈线性关系,绘制工作曲线;
(5)依据工作曲线的绘制方法进行样品中降钙素原的检测,检测结果从工作曲线中查得。
应用实施例1和2构建的传感器按照实施例7和8的检测方法对降钙素原抗原溶液进行了检测,测得传感器的线性检测范围为1.0 fg/mL~50 ng/mL,检测限为0.33 fg/mL。
Claims (3)
1.一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,电化学免疫传感器的制备包括以下步骤:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极分别用0.05、0.3和1.0 mm氧化铝粉打磨抛光至镜面,再用超纯水洗涤干净;
(2)铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜是利用400 µL铂纳米粒子和2 mL的2.0 mg/mL氧硫铟化铜室温下振荡24 h,离心,溶解于2 mL的去离子水;
(3)将6 µL、浓度为1.0 ~ 3.0 mg/mL的铂纳米粒子功能化氧硫化铜溶液滴涂到电极表面,室温保存至干燥;
(4)继续滴涂6 μL、浓度为10 μg/mL的降钙素原抗体标准溶液于玻碳电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(5)继续滴涂3 µL、质量分数为1%的牛血清白蛋白溶液来封闭非特异性活性位点,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
(6)继续将6 µL、浓度为1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液滴涂在电极表面,4 ºC冰箱中保存至干燥,超纯水清洗;
其中,花状氧硫化铜的制备步骤为:
在磁力搅拌的条件下,将4.0 g~5.0 g 三水合硝酸铜加入到500 mL水溶液中;再将1.0 g~2.0 g硫代乙酰胺加入到500 mL溶液中;30 min后,将该溶液加热到90 ºC;接下来再加入0.1~0.2 mL肼搅拌2 h后得到沉淀固体,用去离子水洗涤直至洗涤液的pH为7后再用乙醇清洗数次去除有机物;将所得固体样品放在真空干燥箱中50 ºC下干燥24 h,研磨后得到花状氧硫化铜纳米材料;
铂纳米粒子的制备步骤为:
铂纳米粒子是通过将四氯铂酸钾溶液加入到抗坏血酸和溴化钾的溶液中还原制备的;将105 mg的聚乙烯吡咯烷酮,40 mg~60 mg的抗坏血酸和400 mg~600 mg的溴化钾溶解在去离子水中, 将该溶液用油浴加热到90 ºC,并且保持10 min;然后用滴管逐滴加入含40mg~60 mg的四氯铂酸钾的3.0 mL水溶液中,并且将这一反应在80 ºC保持3 h,洗涤离心后将其溶解在10 mL的去离子水中;
铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜纳米材料的制备步骤为:
将400 µL的铂纳米粒子溶液加入到 2 mL的2.0 mg/mL的氧硫化铜溶液中,在室温下振荡24 h, 离心分离后的产物经多次水洗去除多余的铂纳米粒子,再分散于2 mL去离子水中得到铂纳米粒子功能化花状氧硫化铜溶液。
2.如权利要求1所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,所述的1.0 fg/mL~50.0 ng/mL的一系列不同浓度的降钙素原抗原标准溶液为1 mg/mL的降钙素原溶液用磷酸盐缓冲溶液稀释得到。
3.如权利要求1所述的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器的制备方法,其特征在于,降钙素原的检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为对电极,所制备的一种检测降钙素原的电化学免疫传感器为工作电极,在10 mL的pH 为4.0~9.0磷酸盐缓冲溶液中测定其电流变化;
(2)电化学工作站参数设置为,循环伏安扫描电位为-0.6~0.2 V,扫描速率设置为0.1V/s;
(3)使用含10 µL浓度为5 mmol/L过氧化氢的10 mL磷酸盐缓冲溶液作为底液,通过计时电流方法检测不同浓度的降钙素原产生的电化学电流信号强度;所述磷酸盐缓冲溶液,其pH为7.4,用0.1 mol/L磷酸氢二钠和0.1 mol/L磷酸二氢钾配制;
(4)根据所得电流差值与降钙素原浓度呈线性关系,绘制工作曲线;
(5)依据工作曲线的绘制方法进行样品中降钙素原的检测,检测结果从工作曲线中查得。
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