CN106324060A - 一种基于AuNPs/Cu‑MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

一种基于AuNPs/Cu‑MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速、灵敏检测原降钙素抗原的电化学免疫传感器的制备领域，特别是涉及一种基于AuNPs/Cu‑MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用。AuNFs比表面积大、导电性好、且具有好的生物相容性，作为基底材料，可以捕获大量的一抗，同时可以促进电子传递；AuNPs/Cu‑MOF标记二抗，可以提供灵敏的电化学信号，根据AuNPs/Cu‑MOF电化学信号强度变化与抗原的浓度关系，实现原降钙素抗原的快速、灵敏检测。

Description

一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备 方法及应用
技术领域
本发明涉及电化学免疫传感技术领域，特别是涉及一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用。具体涉及一种AuNFs作为抗体捕获基底，AuNPs/Cu-MOF标记的第二抗体作为氧化还原探针的电化学免疫传感器的构建方法。
背景技术
PCT属于一种降钙素前肽物质，无激素活性，在血清中的水平升高是由于严重的细菌、真菌、寄生虫的感染破坏以及脓毒症和多脏器功能衰竭而致，PCT在自身免疫、过敏和病毒感染时，含量不会升高。因此PCT可以对细菌、真菌引起的系统性感染作出诊断，PCT将会被视为全身性细菌感染和脓毒症辅助以及鉴别诊断的常规指标。目前对PCT抗原的检测手段主要有放射免疫学分析法、双抗夹心免疫化学发光法(ILMA)、胶体金比色法、透射免疫浊度法。这些方法具有较高的灵敏度和选择性，但检测过程需要昂贵的专用仪器，需要复杂的前处理且操作繁琐、样品消耗量较大，不适宜快速检测。电化学免疫分析因具有特异性好、选择性高、便于携带、廉价、操作简单等优点，可以实现对样品的快速检测。本发明基于电化学免疫传感器的优点制备了一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器，实现PCT的灵敏检测。
本发明中AuNFs作为抗体捕获基底，由于其良好的生物相容性和大的比表面积可以捕获更多抗体，而优异的导电性则可以促进蛋白质和电极之间的电子传递。AuNPs/Cu-MOF作为电化学检测时的氧化还原探针用于第二抗体的标记，可以提供灵敏的电化学信号。基于抗原抗体之间良好的特异性结合，该传感器用于检测PCT。在本发明中构建的电化学免疫传感器具有成本低，稳定性好，制备过程简单，灵敏度高等优点，有效克服了目前PCT检测方法的不足。
发明内容
本发明的目的之一是以AuNPs/Cu-MOF为电化学氧化还原探针，构建一种简单、快速、灵敏度高的电化学免疫传感器。
本发明的目的之二是将该电化学免疫传感器用于PCT的检测。
本发明的技术方案为：
1. 一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法：
(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干，取6~10 μL AuNFs分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNFs，得AuNFs/GCE；
(2)取10 μL 6~10 μg/mL的原降钙素第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到电极表面，4 ℃下孵化过夜，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得Ab1/AuNFs/GCE；
(3)取10 μL 质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得BSA/ Ab1/AuNFs/GCE；
(4)滴加10 μL浓度为0.001~10 ng/mL的一系列不同浓度的原降钙素原抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE；
(5) 滴加6~10 μL AuNPs/Cu-MOF标记的PCT第二抗体(Ab2/AuNPs/Cu-MOF)，37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器(Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE)。
上述的AuNFs分散液的制备：
2 μL 0.5 %的nafion和10 μL 1 %的HAuCl4加入到100 μL含有20 mM多巴胺（DA）的去离子水中，常温下搅拌1 h，直到变成亮红色，用去离子水洗涤，重新分散到2 mL去离子水中，得AuNFs分散液。
上述的Ab2-AuNPs/Cu-MOF的制备：
(1)Cu-MOF的制备
取0.20 g PVP溶解在4 mL DMF和4 mL乙醇的混合溶液中，将4 mL含有18.12 mg Cu(NO3)2和5.43 mg二氨基-对苯二甲酸的DMF溶液加入到上述混合溶液中，超声分散15 min，将上述溶液转移到高压釜中，100 °C反应5 h；将产物分散到20 mL的DMF中，100 °C加热反应8 h，离心洗涤，除去未反应的试剂，重新分散到2 mL去离子水中，得Cu-MOF分散液；
(2) AuNPs/Cu-MOF的制备
滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，搅拌1 h，离心洗涤，分散到2 mL去离子水中，得AuNPs/Cu-MOF；
(3) Ab2-AuNPs/Cu-MOF的制备
将200 μL 100 μg/mL的PCT二抗加入到2 mL AuNPs/Cu-MOF溶液中，4 ℃下搅拌12 h，获得Ab2-AuNPs/Cu-MOF。
PCT的检测：
(1) Ab2-PCT/BSA/Ab1/AuNPs/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，pH 7.4 PBS为底液，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度PCT标准溶液特异性结合PCT的电极进行检测，扫描电位区间为-0.5-0.3 V，扫描速度为100 mV/s，记录DPV曲线图，根据所得的电流值和PCT浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
本发明的有益成果
(1)本发明以AuNFs作为基底，可以负载更多的抗体，同时可以促进蛋白质和电极之间的电子传递，提高传感器的灵敏度； AuNPs/Cu-MOF用于标记二抗，不仅可以增加第二抗体的负载量，而且可以提供灵敏的电化学信号；
(2)本发明制备的电化学免疫传感器用于PCT的检测，具有简单、快速、高灵敏检测的优势，线性范围为1 pg/mL~10.0ng/mL，检出限为0.5 pg/mL。
附图说明：
图1所示为不同浓度PCT的差分脉冲伏安图。
图2所示为本发明峰电流差值与lgc线性关系图。
其中，图1中由1到7的氧化峰图分别代表PCT的浓度为0, 1.0×0-9, 1.0×10-8,5.0×10-8, 1.0×10-7, 1.0×10-6, 1.0×10-5 mg/mL；
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此。
实施例1一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法
(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干，取6 μL AuNFs分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNFs，得AuNFs/GCE；
(2)取10 μL 6 μg/mL的原降钙素第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到电极表面，4 ℃下孵化过夜，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得Ab1/AuNFs/GCE；
(3)取10 μL 质量分数为1%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得BSA/ Ab1/AuNFs/GCE；
(4)滴加10 μL浓度为0.001~10 ng/mL的一系列不同浓度的原降钙素原抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE；
(5) 滴加6 μL AuNPs/Cu-MOF标记的PCT第二抗体(Ab2/AuNPs/Cu-MOF)，37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器(Ab2-PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE)。
实施例2一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法
(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干，取8 μL AuNFs分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNFs，得AuNFs/GCE；
(2)取10 μL 8 μg/mL的原降钙素第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到电极表面，4 ℃下孵化过夜，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得Ab1/AuNFs/GCE；
(3)取10 μL 质量分数为2%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得BSA/ Ab1/AuNFs/GCE；
(4)滴加10 μL浓度为0.001~10 ng/mL的一系列不同浓度的原降钙素原抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE；
(5) 滴加8 μL AuNPs/Cu-MOF标记的PCT第二抗体(Ab2/AuNPs/Cu-MOF)，37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器(Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE)。
实施例3一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法
(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干，取10 μL AuNFs分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNFs，得AuNFs/GCE；
(2)取10 μL 10 μg/mL的原降钙素第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到电极表面，4 ℃下孵化过夜，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得Ab1/AuNFs/GCE；
(3)取10 μL 质量分数为3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得BSA/ Ab1/AuNFs/GCE；
(4)滴加10 μL浓度为0.001~10 ng/mL的一系列不同浓度的原降钙素原抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE；
(5) 滴加10 μL AuNPs/Cu-MOF标记的PCT第二抗体(Ab2/AuNPs/Cu-MOF)，37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器(Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE)。
实施例4 上述的AuNFs的制备
2 μL 0.5 %的nafion和10 μL 1 %的HAuCl4加入到100 μL含有20 mM多巴胺（DA）的去离子水中，常温下搅拌1 h，直到变成亮红色，用去离子水洗涤，重新分散到2 mL去离子水中，得AuNFs分散液。
实施例5上述的Ab2-AuNPs/Cu-MOF的制备
(1)Cu-MOF的制备
取0.20 g PVP溶解在4 mL DMF和4 mL乙醇的混合溶液中，将4 mL含有18.12 mg Cu(NO3)2和5.43 mg二氨基-对苯二甲酸的DMF溶液加入到上述混合溶液中，超声分散15 min，将上述溶液转移到高压釜中，100 °C反应5 h；将产物分散到20 mL的DMF中，100 °C加热反应8 h，离心洗涤，除去未反应的试剂，重新分散到2 mL去离子水中，得Cu-MOF分散液；
(2) AuNPs/Cu-MOF的制备
滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，搅拌1 h，离心洗涤，分散到2 mL去离子水中，得AuNPs/Cu-MOF；
(3) Ab2-AuNPs/Cu-MOF的制备
将200 μL 100 μg/mL的PCT二抗加入到2 mL AuNPs/Cu-MOF溶液中，4 ℃下搅拌12 h，获得Ab2-AuNPs/Cu-MOF。
实施例6 PCT的检测
(1) Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，pH 7.4 PBS为底液，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度PCT标准溶液及未特异性结合PCT的电极进行检测，扫描电位区间为-0.5-0.3 V，扫描速度为100 mV/s，记录DPV曲线图，所得结果见图1，根据所得的峰电流值(不同浓度PCT标准溶液的电极的峰电流记为I，未特异性结合PCT的电极的峰电流记为I 0)和PCT浓度的关系，绘制工作曲线；
(3)得到的峰电流差值ΔI p即I 0-I与PCT浓度的对数(lgc)的线性关系见图2，由图2可知，PCT在1 pg/mL~10 ng/mL浓度范围内，ΔI p与PCT浓度的对数呈良好的线性相关，线性方程为ΔI p = 3.78lgc + 14.31，c是浓度，单位是g/mL，线性相关系数为0.978，检出限为0.5pg/mL；
(4)将待测样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。

Claims (4)

1.一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用1.0 μm、0.3 μm、0.05 μm的Al2O3抛光粉依次打磨直径为4 mm的玻碳电极(GCE)，分别在乙醇和超纯水中超声清洗3 min，氮气吹干，取6~10 μL AuNFs分散液滴涂到电极表面，室温下晾干成膜，用PBS (pH 7.4) 缓冲溶液冲洗以除去未键合的AuNFs，得AuNFs/GCE；
(2)取10 μL 6~10 μg/mL的原降钙素第一抗体(Ab1)标准溶液滴涂到电极表面，4 ℃下孵化过夜，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗，得Ab1/AuNFs/GCE；
(3)取10 μL 质量分数为1~3%的牛血清白蛋白(BSA)溶液滴涂到电极表面，在37℃下孵化1 h，封闭非特异性结合的位点，用PBS (pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得BSA/ Ab1/AuNFs/GCE；
(4)滴加10 μL浓度为0.001~10 ng/mL的一系列不同浓度的原降钙素原抗原标准溶液用于与抗体特异性识别，在37 ℃下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，得PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE；
(5) 滴加6~10 μL AuNPs/Cu-MOF标记的PCT第二抗体(Ab2/AuNPs/Cu-MOF)，37 °C下孵育60 min，用PBS(pH 7.4)缓冲溶液冲洗电极表面，制得一种基AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器(Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE)。
2.根据权利要求1所述的一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用，所述的AuNFs分散液，其特征在于，制作步骤如下：
2μL 0.5%的nafion和10μL 1 %的HAuCl4加入到100 μL含有20 mM多巴胺（DA）的去离子水中，常温下搅拌1 h，直到变成亮红色，用去离子水洗涤，重新分散到2 mL去离子水中，得AuNFs分散液。
3.根据权利要求1所述的一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用，所述的Ab2-AuNPs/Cu-MOF，其特征在于，制作步骤如下：
(1)Cu-MOF的制备
取0.20 g PVP溶解在4 mL DMF和4 mL乙醇的混合溶液中，将4 mL含有18.12 mg Cu(NO3)2和5.43 mg二氨基-对苯二甲酸的DMF溶液加入到上述混合溶液中，超声分散15 min，将上述溶液转移到高压釜中，100 °C反应5 h；将产物分散到20 mL的DMF中，100 °C加热反应8 h，离心洗涤，除去未反应的试剂，重新分散到2 mL去离子水中，得Cu-MOF分散液；
(2) AuNPs/Cu-MOF的制备
滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，搅拌1 h，离心洗涤，分散到2 mL去离子水中，得AuNPs/Cu-MOF；
(3) Ab2-AuNPs/Cu-MOF的制备
将200 μL 100 μg/mL的PCT二抗加入到2 mL AuNPs/Cu-MOF溶液中，4 ℃下搅拌12 h，获得Ab2-AuNPs/Cu-MOF。
4.根据权利要求1所述的制备方法制备的一种基于AuNPs/Cu-MOF标记的PCT电化学免疫传感器的制备方法及应用，其特征在于，用于PCT的检测，检测步骤如下：
(1) Ab2-AuNPs/Cu-MOF/PCT/BSA/Ab1/AuNFs/GCE为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，pH 7.4 PBS为底液，使用电化学工作站进行测试；
(2)用差分脉冲伏安法对一系列不同浓度PCT标准溶液特异性结合PCT的电极进行检测，扫描电位区间为-0.5-0.3 V，扫描速度为100 mV/s，记录DPV曲线图，根据所得的电流值和PCT浓度的对数呈线性关系，绘制工作曲线；
(3)将待测样品溶液代替PCT标准溶液进行检测。
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