CN107525834A - 一种Cu‑MOF标记的DNA适配体传感器用于检测啶虫脒的方法 - Google Patents

一种Cu‑MOF标记的DNA适配体传感器用于检测啶虫脒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种铜金属有机框架化合物（Cu‑MOF）标记的DNA适配体传感器用于电化学检测啶虫脒的方法，包括修饰电极的基底材料的合成，信号探针DNA的标记，传感体系的建立等步骤。由于信号探针DNA（pDNA）上的标记物Cu‑MOF靠近电极端，电极易于产生灵敏的电化学信号，一定浓度范围内，电化学信号随啶虫脒浓度的增大而增大。构建的电化学传感器可用于灵敏地检测啶虫脒，节省了样品的预处理时间和劳动量，检测仪器成本较低。本发明灵敏快速，所需样品体积小，适用于环境和多种食品样品中啶虫脒残留的检测。

Description

一种Cu-MOF标记的DNA适配体传感器用于检测啶虫脒的方法
技术领域
本发明涉及一种Cu-MOF标记的适配体传感器用于电化学检测啶虫脒的方法，包括修饰电极的基底材料的合成，信号探针DNA的标记，传感体系的建立等步骤。反应后由于Cu-MOF位于信号探针DNA的近电极端，从而使电极产生灵敏的电化学信号，一定浓度范围内，电化学信号随啶虫脒浓度的增大而增大。构建的电化学传感器可用于灵敏地检测啶虫脒，节省了样品的预处理时间和劳动量，检测仪器成本较低。本发明灵敏快速，样品体积小，实验过程易操作，适用于环境和多种食品样品中啶虫脒残留的检测。
背景技术
啶虫脒是一种刺激神经的广泛使用的新烟碱类农药，尼古丁的衍生物。新烟碱类药物在九十年代初期被引入用于叶类蔬菜，水果，和茶树中控制多种昆虫，最近已经发展成为广泛散布的占到全球农药市场的24%的份额。啶虫脒对于暴露于啶虫脒环境中的人表现出高毒性存在潜在的危险。对于哺乳动物，表现出慢性毒性，作为乙酰胆碱受体兴奋药，可引起肌无力甚至死亡。环境和食物中的啶虫脒残留问题近年来引起广泛的关注。为保障食品安全和人类身体健康需要建立灵敏检测啶虫脒的方法。
啶虫脒传统的检测方法包括，色谱分析法和质谱分析法等。然而这些方法需要复杂的样品前处理步骤，使用昂贵的仪器，不适用于原位测量。因此需要建立一种灵敏的，有选择性的，快速的检测啶虫脒的方法。
适配体是一种单链DNA或RNA，能够特异性捆绑相应的目标分子，可以显著提高传感器的选择性。铜-金属有机框架化合物Cu-MOF具有良好的电化学活性，利用其标记信号探针DNA可以获得灵敏的电化学信号。基于此，我们建立了一种Cu-MOF标记信号探针DNA的适配体电化学生物传感器用于定量检测啶虫脒残留。
发明内容
本发明利用金/还原氧化石墨烯（Au/rGO）修饰玻碳电极，利用铜-金属有机框架化合物（Cu-MOF）连接信号探针DNA（pDNA），反应后由于Cu-MOF位于信号探针DNA的近电极端，从而使电极产生灵敏的电化学信号，构建的适配体传感器用于选择性检测啶虫脒。
本发明的技术方案为：
1. Au/rGO， Cu-MOF的制备，具体步骤为：
（1） Au/rGO的制备：
使用改进的Hummers法制备rGO, 5 ml含EDOT(22.5 mM)的乙醇溶液中加入70 mlHAuCl4 (0.65 mM)水溶液，在室温下快速搅拌，使3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）聚合成聚3,4-乙烯二氧噻吩（PEDOT），持续搅拌4 h后，加入5 mlGO溶液（0.5 mg/ml），形成Au-PEDOT-rGO，获得的Au-PEDOT-rGO超声2 h使Au-PEDOT-rGO和GO彻底的分散。缓慢加入5.5 ml(0.16 M)的NaBH4后，搅拌6 h，分别用去离子水和乙醇清洗产物，将获得固体加入50 ml的去离子水中使其分散，得到Au/rGO;
（2）Cu-MOF的制备：
用分析天平称取0.9981 g的均苯三酸溶于50 ml去离子水中，逐滴滴加1 M的NaOH将溶液pH调至7；在另一个烧杯中，用分析天平称取0.6342 g的Cu（NO3）2溶于50 ml的去离子水中；将制备的金属溶液置于分液漏斗中，在1000 rpm搅拌下逐滴将金属溶液滴加至含均苯三酸的溶液中，缓慢出现蓝色沉淀MOF，放置12 h后，6000 rpm离心，并用乙醇清洗数次，70℃下干燥5 h，再100 ℃干燥48 h，得Cu-MOF。
2. 利用Au/Cu-MOF连接信号探针DNA，具体步骤为：
（1）滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，持续搅拌1 h后，6000rpm离心15 min，去离子水洗涤2-3次得到Au/Cu-MOF，将其分散到2 mL去离子水中。
（2）信号探针DNA（pDNA）溶液（500 μL, 10-7 M）添加到所制备的500 uL的Au/Cu-MOF液中培养过夜，然后用NaCl（100 μL, 2 M）培养24 h，在13000 rpm下离心10 min，用移液管吸取上清液中游离的信号探针pDNA。将沉淀物冲洗和离心两次，再分散在10 mL 50 mMTris-HCl缓冲液中，信号探针DNA标记成功，记为pDNA/Au/Cu-MOF。
3. 适配体电化学传感体系的建立，具体步骤为：
（1）将合成的Au-PEDOT-rGO复合物超声使其分散均匀，用移液枪移取10 μL的Au-PEDOT-rGO复合物滴涂于裸玻碳电极（GCE）表面，常温晾干得Au-PEDOT-rGO/GCE；然后取5 μL 1.0×10-7 M的捕获DNA（cDNA）溶液滴涂在修饰电极表面并置于40 ℃下孵育3.5 h，用pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗除去未结合捕获cDNA，并在常温下晾干得cDNA/Au-PEDOT-rGO/GCE；用移液枪移取5 uL 10 μM的环己醇(MCH)溶液滴涂在修饰电极表面，用来封闭修饰电极表面的非特异性结合位点，孵化1 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，并常温干燥得MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；最后取5 uL 1.0×10-7 M的啶虫脒适配体(apt)滴涂在该修饰电极表面，置于40 ℃下孵育2 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；
（2）在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加不同浓度的啶虫脒农药，40 ℃下孵育2 h并用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极，最后滴加5 uL 1.0×10-7 M的pDNA/Au/Cu-MOF溶液于电极表面，孵育40 min后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得测试用的电极；
（3）传统的三电极体系，以上述所得测试用的电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mL pH7.0 PBS缓冲液中进行差分脉冲伏安扫描，扫描的电位区间是-0.8～0.8 V，记录扫描曲线，差分脉冲伏安扫描的峰电流Ip与啶虫脒浓度的对数logc呈现良好的线性关系，线性方程为IP（μA）=-51.406 logc（mol/L）-762.096，c是浓度，单位是mol/L，线性相关系数r=0.9909，检出限为3.0×10-16 mol/L;
（4）利用上述线性方程检测未知液中啶虫脒样品的浓度：在含10ml pH7.0的PBS的电解池中，在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加未知浓度的啶虫脒农药，按照（2）步骤得测试用的电极作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；使用CHI760e电化学工作站进行实验，利用其附属的计算机软件进行实验数据的采集和处理；在-0.8～0.8 V电位范围内进行差分脉冲伏安扫描，记录示差脉冲伏安图，得峰电流值Ip，将Ip带入上述线性方程，计算出待测液中啶虫脒的浓度。
本发明的有益效果为：
1. 本发明利用Au/rGO修饰玻碳电极，增加了电极的导电性，由于石墨烯比表面积较大，负载的金纳米粒子多，使得连接的捕获DNA较多，保证检测的线性范围宽；
2. 本发明利用比表面积大的Au/Cu-MOF标记信号探针pDNA，反应后联结信号探针pDNA的Cu-MOF靠近电极端，使得电极产生灵敏的电化学信号，显著提高了电化学灵敏度。
3. 本发明具有制备步骤简单，检测线性范围广，灵敏度高的特点。
附图说明：
图1所示为不同浓度的啶虫脒制备的最终修饰电极在pH7.0 PBS中的示差脉冲伏安图。
图2 所示为啶虫脒的线性关系曲线
图1中从1到10分别表示含啶虫脒标准样品的浓度(1) 0 ，(2) 10-15，(3) 10-14，(4)10-13，(5) 1.0×10-12，(6) 10-11，(7) 10-10，(8) 10-9，(9) 10-8，(10) 10-7 mol/L。
具体实施方式：
为更好地理解本发明，下面结合具体实例来进一步说明本发明的技术方案，但是不能以下述具体事例来限定本发明的保护范围。
实施例1
1. Au-PEDOT-rGO的制备
使用改进的Hummers法制备还原氧化石墨烯（rGO）, 5 ml含3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）(22.5 mM)的乙醇溶液中加入70 ml HAuCl4 (0.65 mM)水溶液，在室温下快速搅拌，使EDOT聚合成聚3,4-乙烯二氧噻吩（PEDOT），持续搅拌4 h后，加入5 ml GO溶液（0.5 mg/ml），形成金-聚3,4-乙烯二氧噻吩-还原氧化石墨烯（Au-PEDOT-rGO），获得的Au-PEDOT-rGO超声2 h使Au-PEDOT-rGO和rGO彻底的分散，缓慢加入5.5 ml(0.16 M)的NaBH4后，搅拌6 h，分别用去离子水和乙醇清洗产物，将获得固体加入50 ml的去离子水中使其分散;
2.Cu-MOF的制备
用分析天平称取0.9981 g的均苯三酸溶于50 ml去离子水中，逐滴滴加1 M的NaOH将溶液pH调至7；在另一个烧杯中，用分析天平称取0.6342 g的Cu(NO3)2溶于50 ml的去离子水中；将制备的金属溶液置于分液漏斗中，在1000 rpm搅拌下逐滴将金属溶液滴加至含均苯三酸的溶液中，缓慢出现蓝色沉淀Cu-MOF，放置12 h后，6000 rpm离心，并用乙醇清洗数次，70 ℃下干燥5 h，再100 ℃干燥48 h，得Cu-MOF。
3.制备Au/Cu-MOF复合材料并利用Au/Cu-MOF标记信号探针DNA，具体步骤为：
(1)滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，持续搅拌1 h后，6000rpm离心15 min，去离子水洗涤2-3次得到Au/Cu-MOF，将其分散到2 mL去离子水中。
(2)信号探针DNA（pDNA）溶液（500 μL, 10-7 M）添加到所制备的500 uL的Au/Cu-MOF液中培养过夜，然后用NaCl（100 μL, 2 M）培养24 h，在13000 rpm下离心10 min，用移液管吸取上清液中游离的信号探针pDNA。将沉淀物冲洗和离心两次，再分散在10 mL 50 mMTris-HCl缓冲液中，信号探针DNA标记成功，记为pDNA/Au/Cu-MOF。
4.适配体电化学传感器构建，具体步骤为：
(1)将合成的Au-PEDOT-rGO复合物超声使其分散均匀，用移液枪移取10 μL的Au-PEDOT-rGO复合物滴涂于裸玻碳电极（GCE）表面，常温晾干得Au-PEDOT-rGO/GCE；然后取5 μL 1.0×10-7 M的捕获DNA（cDNA）溶液滴涂在修饰电极表面并置于40 ℃下孵育3.5 h，用pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗除去未结合捕获cDNA，并在常温下晾干得cDNA/Au-PEDOT-rGO/GCE；用移液枪移取5 uL 10 μM的环己醇(MCH)溶液滴涂在修饰电极表面，用来封闭修饰电极表面的非特异性结合位点，孵化1 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，并常温干燥得MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；最后取5 uL 1.0×10-7 M的啶虫脒适配体(apt)滴涂在该修饰电极表面，置于40 ℃下孵育2 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；
(2)在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加不同浓度的啶虫脒农药，40 ℃下孵育2 h并用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极，最后滴加5 uL 1.0×10-7 M的pDNA/Au/Cu-MOF溶液于电极表面，孵育40 min后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得测试用的电极；
(3)传统的三电极体系，以（2）中所得测试用的电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mL pH7.0 PBS缓冲液中进行差分脉冲伏安扫描，扫描的电位区间是-0.8～0.8 V，记录扫描曲线，差分脉冲伏安扫描的峰电流Ip与啶虫脒浓度的对数logc呈现良好的线性关系，线性方程为IP（μA）=-51.406 logc（mol/L）-762.096，c是浓度，单位是mol/L，线性相关系数r=0.9909，检出限为3.0×10-16 mol/L;
(4)利用上述线性方程检测未知液中啶虫脒样品的浓度：在含10ml pH7.0的PBS的电解池中，在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加未知浓度的啶虫脒农药，按照（2）的步骤得测试用的电极。将其作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；使用CHI760e电化学工作站进行实验，利用其附属的计算机软件进行实验数据的采集和处理；在-0.8～0.8 V电位范围内进行差分脉冲伏安扫描，记录示差脉冲伏安图，得峰电流值Ip，将Ip带入上述线性方程，计算出待测液中啶虫脒的浓度。
由于啶虫脒广泛使用而在环境中普遍存在，其残留对生物体具有慢性、持久的健康威胁，传统的的检测方法需要冗杂的预处理步骤和使用大型昂贵的仪器，不便于现场检测，且成本较高。本发明灵敏度高，检测限低，使用样品体积小，易操作，成本较低，适用于推广，可用于灵敏快速地检测多种样品中的啶虫脒的残留量。

Claims (4)

1.一种铜金属有机框架化合物（Cu-MOF）标记的DNA适配体传感器用于电化学检测啶虫脒的方法，其特征在于利用金/还原氧化石墨烯（Au/rGO）修饰玻碳电极（GCE），利用金/铜-金属有机框架(Au/Cu-MOF)标记信号探针DNA（pDNA），由于pDNA标记物Cu-MOF靠近电极端，可产生灵敏的电化学信号，构建的DNA适配体传感器用于选择性检测啶虫脒。
2.根据权利要求1所述的利用Au/rGO修饰玻碳电极，利用Cu-MOF标记pDNA，其特征在于，具体步骤为：
(1) Au-PEDOT-rGO的制备：
使用改进的Hummers法制备还原氧化石墨烯（rGO）, 5 ml含3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）(22.5 mM)的乙醇溶液中加入70 ml HAuCl4 (0.65 mM)水溶液，在室温下快速搅拌，使EDOT聚合成聚3,4-乙烯二氧噻吩（PEDOT），持续搅拌4 h后，加入5 ml GO溶液（0.5 mg/ml），形成金-聚3,4-乙烯二氧噻吩-还原氧化石墨烯（Au-PEDOT-rGO），获得的Au-PEDOT-rGO超声2 h使Au-PEDOT-rGO和rGO彻底的分散，缓慢加入5.5 ml(0.16 M)的NaBH4后，搅拌6 h，分别用去离子水和乙醇清洗产物，将获得固体加入50 ml的去离子水中使其分散;
(2) Cu-MOF的制备：
用分析天平称取0.9981 g的均苯三酸溶于50 ml去离子水中，逐滴滴加1 M的NaOH将溶液pH调至7；在另一个烧杯中，用分析天平称取0.6342 g的Cu(NO3)2溶于50 ml的去离子水中；将制备的金属溶液置于分液漏斗中，在1000 rpm搅拌下逐滴将金属溶液滴加至含均苯三酸的溶液中，缓慢出现蓝色沉淀Cu-MOF，放置12 h后，6000 rpm离心，并用乙醇清洗数次，70 ℃下干燥5 h，再100 ℃干燥48 h，得Cu-MOF。
3.根据权利要求1所述的一种Cu-MOF标记的DNA适配体传感器用于电化学检测啶虫脒的方法,其特征在于，制备Au/Cu-MOF复合材料并利用Au/Cu-MOF标记信号探针DNA，具体步骤为：
(1)滴加20 μL 1%的HAuCl4和2 mL 2 mM NaBH4到Cu-MOF溶液中，持续搅拌1 h后，6000rpm离心15 min，去离子水洗涤2-3次得到Au/Cu-MOF，将其分散到2 mL去离子水中；
(2)信号探针DNA（pDNA）溶液（500 μL, 10-7 M）添加到所制备的500 uL的Au/Cu-MOF液中培养过夜，然后用NaCl（100 μL, 2 M）培养24 h，在13000 rpm下离心10 min，用移液管吸取上清液中游离的信号探针pDNA；将沉淀物冲洗和离心两次，再分散在10 mL 50 mM Tris-HCl缓冲液中，信号探针DNA标记成功，记为pDNA/Au/Cu-MOF。
4.根据权利要求1-3任一权利要求所述的一种Cu-MOF标记的DNA适配体传感器用于电化学检测啶虫脒的方法，其特征在于适配体电化学传感体系的建立，反应后由于Cu-MOF位于（pDNA）的近电极端，从而使电极产生灵敏的电化学信号，具体步骤为：
(1)将合成的Au-PEDOT-rGO复合物超声使其分散均匀，用移液枪移取10 μL的Au-PEDOT-rGO复合物滴涂于裸玻碳电极（GCE）表面，常温晾干得Au-PEDOT-rGO/GCE；然后取5 μL 1.0×10-7 M的捕获DNA（cDNA）溶液滴涂在修饰电极表面并置于40 ℃下孵育3.5 h，用pH8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗除去未结合捕获cDNA，并在常温下晾干得cDNA/Au-PEDOT-rGO/GCE；用移液枪移取5 uL 10 μM的环己醇(MCH)溶液滴涂在修饰电极表面，用来封闭修饰电极表面的非特异性结合位点，孵化1 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，并常温干燥得MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；最后取5 uL 1.0×10-7 M的啶虫脒适配体(apt)滴涂在该修饰电极表面，置于40 ℃下孵育2 h后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得到apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE；
(2)在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加不同浓度的啶虫脒农药，40 ℃下孵育2 h并用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗电极，最后滴加5 uL 1.0×10-7 M的pDNA/Au/Cu-MOF溶液于电极表面，孵育40 min后用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液冲洗，得测试用的电极；
(3)传统的三电极体系，以（2）中所得测试用的电极为工作电极，铂电极为对电极，Ag/AgCl电极为参比电极，在含10mL pH7.0 PBS缓冲液中进行差分脉冲伏安扫描，扫描的电位区间是-0.8～0.8 V，记录扫描曲线，差分脉冲伏安扫描的峰电流Ip与啶虫脒浓度的对数logc呈现良好的线性关系，线性方程为IP（μA）=-51.406 logc（mol/L）-762.096，c是浓度，单位是mol/L，线性相关系数r=0.9909，检出限为3.0×10-16 mol/L;
(4)利用上述线性方程检测未知液中啶虫脒样品的浓度：在含10ml pH7.0的PBS的电解池中，在apt/MCH/DNA1/Au-PEDOT-rGO/GCE电极表面滴加未知浓度的啶虫脒农药，按照（2）的步骤得测试用的电极；将其作为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；使用CHI760e电化学工作站进行实验，利用其附属的计算机软件进行实验数据的采集和处理；在-0.8～0.8 V电位范围内进行差分脉冲伏安扫描，记录示差脉冲伏安图，得峰电流值Ip，将Ip带入上述线性方程，计算出待测液中啶虫脒的浓度。
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