CN110186972B - 一种可再生啶虫脒电化学传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及电化学生物传感器技术领域，特别是涉及一种可再生的对农药残留啶虫脒检测的电化学生物传感器制备方法，包括啶虫脒电化学生物传感器的制备步骤、使用该传感器测定啶虫脒的操作方法和再生方法等，这种可再生的啶虫脒电化学传感器，制作简便，传感器易于再生，可重复使用，重现性好，无毒，不污染环境，并且本测定方法选择性好，灵敏度高。

Description

一种可再生啶虫脒电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及电化学生物传感器技术领域，特别是涉及一种可再生的对农药残留啶虫脒检测的电化学生物传感器制备方法，包括啶虫脒电化学生物传感器的制备步骤、使用该传感器测定啶虫脒的操作方法，和再生方法等。
背景技术
有机农药在为农业生产提供保障的同时，其残留物也对环境和人类健康造成危害。农药残留不仅会污染土壤、水体等，造成环境恶化，更严重的是会直接危及人们的身体健康甚至生命安全。因此，发展高灵敏度、高稳定性且对农药及其代谢物有特异性响应的快速检测技术对国民健康和经济发展无疑具有重要意义。
在农残传统分析方法中，色谱法及其联用技术具有较高的灵敏度并且能够实现多组分测定，依然占有重要地位。而且随着多技术联用和样品预处理技术的突破，这些检测技术正朝着减少溶剂、微型化及自动化方向发展。近年来，基于酶抑制的酶传感器、免疫传感器、DNA传感器等生物传感器在农残监测中获得了长足的进步，由于方法快速、选择性好、信号检测手段多样化等特点，无需大型的仪器设备，适合于现场检测及大量样品的筛选，在农残筛选中获得了人们的青睐。电化学传感器是各种检测方法中较简便的一类，具有灵敏度高、选择性好、易与现代微组装技术兼容、易实现小型化、廉价、低能耗、适宜现场实时检测等优点。因此电化学生物传感器成为研究最为活跃领域。
目前，啶虫脒电化学生物传感器，特别是电化学适配体传感器已经有许多报道。但是，所报道的电化学生物传感器普遍具有传感界面修饰过程繁琐、条件较苛刻等缺陷，特别是传感器难以再生，不能重复使用，成本较高。
发明内容
本发明的目的就是针对上述测定中的缺点，构建一种可再生的高灵敏检测农药残留啶虫脒的电化学生物传感器。本发明要解决的技术问题是通过DNA序列和结构的特殊设计，将DNA链牢固的固载到电极表面，同时使传感器具有识别和信号双重功能；特别重要的是使传感器识别啶虫脒后可以快速恢复原始状态，具备再生重复使用的特点。本发明设计了一种特殊结构的“T”型DNA链，构建了啶虫脒电化学生物传感器，具有检测速度快，灵敏度高，选择性好；传感器制备简捷，使用简便，体积小便于携带；特别是这种传感器能够更新再生，可重复使用，稳定性、重现性好，无毒，不污染环境。
本发明的技术方案为：所述可再生啶虫脒电化学传感器，是利用一段具有识别和信号双重功能的“T”型DNA链，该“T”型DNA链具有不对称发夹结构：5'MB-TGCAGACAAATTACA-3'-T(C6-SH)-5'-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3'。DNA中啶虫脒适配体作为识别链，与适配体部分互补的5’端标记有亚甲基蓝MB的DNA作为信号链。识别链5’端和信号链3’端通过胸腺嘧啶T连接，而胸腺嘧啶T再接枝巯基基团；该“T”型DNA链通过巯基基团固载在纳米金修饰玻碳电极表面。当存在啶虫脒时，“T”型DNA链中识别链适配体与啶虫脒作用，破坏原有的DNA双螺旋结构，信号链被释放出来，使得标记在信号链5’端的亚甲基蓝MB贴近于电极表面，使电流信号变大，据此可灵敏检测啶虫脒。检测完成后的传感器在HCl溶液中可以释放出啶虫脒，使识别链重新与信号链结合，恢复传感器原始状态，达到传感器再生更新的目的，可累次重复使用。具体方案为：
1.一种可再生啶虫脒电化学传感器
金修饰玻碳电极上固载“T”型DNA链，实现对啶虫脒的超灵敏检测，传感器可再生，能重复使用；
所述“T”型DNA链，具有识别和信号双重功能的不对称发夹结构，啶虫脒适配体作为识别链，与适配体部分互补的DNA作为信号链；
所述信号链5’端以亚甲基蓝MB标记；
所述识别链5’端和信号链3’端通过胸腺嘧啶T连接，胸腺嘧啶T接枝巯基；
2.如上所述的一种可再生啶虫脒电化学传感器，制备方法如下：
在金修饰玻碳电极Au/GCE上，滴加5mL 0.01μM的“T”型DNA链，置于40℃的真空干燥箱中孵化1h；以5mL、10mM的6-巯基己醇封闭非特异性结合位点，用0.1M、pH 7.4的PBS溶液冲洗三次，制得DNA/Au/GCE电极，在冰箱4℃下保存，备用；
所述玻碳电极Au/GCE，制备步骤如下：
将处理好的玻碳电极作为工作电极，置于含有2.5mM HAuCl4、0.5M H2SO4、150mM乙二胺的电解液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在0.0V下进行恒电位沉积600s；
3.可再生啶虫脒电化学传感器再生方法如下：
将每次完成检测后的电极，浸入0.01mol/L的HCl溶液中，5min后取出，以0.1M pH7.4的PBS溶液反复冲洗，备用；
4.如上所述的可再生啶虫脒电化学传感器用于检测啶虫脒
(1)在DNA/Au/GCE电极表面滴涂5mL啶虫脒溶液，置于60℃的真空干燥箱中孵化1h,拿出冷却后，用0.1M pH 7.4的PBS溶液反复冲洗，备用；
(2)以孵化了啶虫脒的DNA/Au/GCE为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-0.6～0.2V电位区间，进行DPV扫描，记录峰电流；
(3)根据所述啶虫脒电化学传感器再生方法，将使用过的电极再生，备用。
本发明有益效果：
(1)这种可再生的啶虫脒电化学生物传感器，所用“T”型DNA链具有识别和信号双重功能，而且易于恢复原始结构；通过胸腺嘧啶T接枝的巯基可牢固负载到电极表面，传感器制作简便；
(2)传感器可进行再生更新，恢复原始状态，利于累次反复使用，克服了目前大部分生物传感器用后即丢，不能再生的缺陷；
(3)传感器稳定性、重现性好；使用成本低廉、无毒、不污染环境；
(4)传感器检测速度快，灵敏度高，选择性好。啶虫脒的线性范围是10-7～10-14mol/L，检测限为3.33×10-15mol/L；
(5)传感器再生速度快，体积小便于携带，利于现场实时检测。
附图说明：
图一所示为传感器检测和再生过程示意图。
具体实施方式：
为了更好地理解本发明，下面用具体实例来详细说明本发明的技术方案，但是本发明并不局限于此：
实施例1啶虫脒电化学生物传感器所用“T”型DNA结构
“T”型DNA链是具有识别和信号双重功能的不对称发夹结构，啶虫脒适配体作为识别链，与适配体部分互补的DNA作为信号链，所述信号链5’端以亚甲基蓝MB标记；所述识别链5’端和信号链3’端通过胸腺嘧啶T连接，胸腺嘧啶T接枝巯基；其结构为：5'MB-TGCAGACAAATTACA-3'-T(C6-SH)-5'-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTATGAAGA-3'；
实施例2啶虫脒电化学生物传感器所用金修饰玻碳电极Au/GCE的制备
将玻碳电极用0.05μm Al2O3悬浊液在抛光布上研磨抛光，然后用去离子水超声清洗2次。将处理好的玻碳电极作为工作电极置于含有2.5mM HAuCl4、0.5M H2SO4、150mM乙二胺的电解液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在0.0V下进行恒电位沉积600s；
实施例3一种可再生的啶虫脒电化学生物传感器的制备
在金修饰玻碳电极Au/GCE上，滴加5mL 0.01μM的“T”型DNA链，置于40℃的真空干燥箱中孵化1h；以5mL 10mM的6-巯基己醇MCH封闭非特异性结合位点，用0.1M pH 7.4的PBS溶液冲洗三次，制得DNA/Au/GCE电极，在冰箱4℃下保存，备用；
实施例4电化学生物传感器应用于啶虫脒的检测方法
(1)在DNA/Au/GCE电极表面滴涂5mL一定浓度的啶虫脒标准溶液，置于60℃的真空干燥箱中孵化1h，拿出冷却后，用0.1M pH 7.4的PBS溶液反复冲洗，备用；
(2)以孵化了啶虫脒的DNA/Au/GCE为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-0.6～0.2V电位区间，进行DPV扫描，记录峰电流；
(3)将使用过的电极再生，备用；
(4)检测一系列不同浓度啶虫脒标准溶液的电极的峰电流，绘制工作曲线；同时测定传感器线性范围和检测限。啶虫脒线性范围为10-7～10-14mol/L，线性方程为Ip(μA)＝2.25+0.12lgc(mol/L)；检测限为3.33×10-15mol/L；
(5)将待测样品溶液代替啶虫脒标准溶液，按步骤(1)、(2)方法记录峰电流，根据线性方程计算待测样品中啶虫脒含量；
实施例5啶虫脒电化学传感器的再生方法和再生性测试
将孵化啶虫脒后的电极，浸入HCl溶液中一段时间后取出，以0.1M pH 7.4的PBS溶液反复冲洗，比较传感器与其孵化啶虫脒并浸入HCl后的峰电流的大小，测试电极再生性。实验了0.1～1.5mol/L的HCl溶液，30s～10min浸入时间对再生性的影响。实验表明，使用过的电极浸入1.0mol/LHCl溶液5min,峰电流可恢复原始电流的98％；随再生次数的增加，峰电流变化越大；重复再生10次后，电流响应变化率60％，电极不能再使用；
确定最优再生方法和条件为：在1.0mol/L HCl溶液中浸泡5min，以0.1M pH 7.4的PBS溶液反复冲洗，晾干备用，或在冰箱4℃下保存；
实施例6啶虫脒电化学传感器的使用条件的优化
本发明对啶虫脒农药的孵化时间、孵化温度进行了优化。孵化时间分别为30、45、60、75、90min，孵化温度分别为30、40、50、60、70℃。经过实验，确定最佳的孵化温度为60℃，孵化时间60min；
实施例7啶虫脒电化学生物传感器特异性、稳定性和重现性测试
用甲基对硫磷、草甘膦、甲胺磷、毒死蜱、马拉硫磷五种农药进行特异性实验，分别测定滴涂上述农药以及包含啶虫脒的各种农药混合液时峰电流，结果表明，该传感器对啶虫脒具有较高的选择性；
对啶虫脒浓度为10-10mol/L的5根修饰电极做平行实验，相对标准偏差为4.37％。表明传感器具有良好的重现性；
将制备的传感器重复扫描10次，峰电流几乎不变；传感器在4℃放置15天，测得的峰电流为放置前测得的电流的96％，表明该传感器具有较好稳定性、可长期保存。

Claims (1)

1.一种基于“T”型DNA链可再生的电化学传感器用于啶虫脒检测的方法，其特征在于，所述“T”型DNA链，是具有识别和信号双重功能的不对称发夹结构，啶虫脒适配体作为识别链，与适配体部分互补的DNA作为信号链；所述信号链5’端以亚甲基蓝MB标记；所述识别链5’端和所述信号链3’端通过胸腺嘧啶T连接，胸腺嘧啶T接枝巯基；所述啶虫脒检测方法的具体步骤为：
(1)金修饰玻碳电极Au/GCE：将处理好的玻碳电极作为工作电极，置于含有2.5mMHAuCl4、0.5M H2SO4、150mM乙二胺的电解液中，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在0.0V下进行恒电位沉积600s；
(2)在金修饰玻碳电极Au/GCE上，滴加5μL 0.01μM的“T”型DNA链，置于40℃的真空干燥箱中孵化1h；以5μL、10μM的6-巯基己醇封闭非特异性结合位点，用0.1M、pH 7.4的PBS溶液冲洗三次，制得DNA/Au/GCE电极，在冰箱4℃下保存，备用；
(3)在DNA/Au/GCE电极表面滴涂5μL啶虫脒溶液，置于60℃的真空干燥箱中孵化1h，拿出冷却后，用0.1M pH 7.4的PBS溶液反复冲洗，备用；
(4)以孵化了啶虫脒的DNA/Au/GCE为工作电极，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为辅助电极，在-0.6～0.2V电位区间，进行DPV扫描，记录峰电流；
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