CN103424448A

CN103424448A - 一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素a的方法

Info

Publication number: CN103424448A
Application number: CN2013103193355A
Authority: CN
Inventors: 王坤; 钱静; 杨兴旺
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-07-26
Filing date: 2013-07-26
Publication date: 2013-12-04
Anticipated expiration: 2033-07-26
Also published as: CN103424448B

Abstract

本发明涉及一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，属于电化学传感器技术领域。首先对金电极进行DNA修饰；然后通过碱基互补配对作用组装适配体，进而捕获金纳米粒子标记的DNA；再在金纳米粒子表面组装富含G的DNA，以俘获大量的亚甲基蓝（MB）构建信号放大策略。最后以差分脉冲伏安扫描为检测手段，对一系列OTA标准溶液进行测定，得到MB的还原峰电流和OTA浓度之间的响应关系，绘制标准曲线。本发明旨在提供一种操作简单、灵敏度高、特异性强的适配体传感器制备方法用于痕量OTA的灵敏检测。

Description

一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法

技术领域

本发明涉及一种用于痕量赭曲霉毒素A（OTA）检测的电化学传感器的制备方法，特点在于赭曲霉毒素A适配体应用和基于金纳米粒子与富含碱基G的DNA的信号放大策略构建，以及该检测方法的高特异性、高灵敏度及易操作性，属于电化学传感器技术领域。

背景技术

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，简称OTA）是赭曲霉属真菌产生的有毒代谢产物，属于典型的食源性真菌毒素。纯的OTA是稳定的无色结晶化合物，其化学式为C₂₀H₁₈ClNO₆，微溶于水，易溶于稀碳酸氢钠溶液。在极性有机溶剂中OTA能稳定存在，如OTA的乙醇溶液在冷藏条件下可稳定存在一年以上，但OTA在紫外线照射下很快就会分解。在动物体内OTA非常稳定、不易被代谢降解，而且OTA在多种动物体内存在毒性，研究发现其毒性主要是肾脏毒性、肝脏毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性。1993年，OTA被国际癌症研究机构定为2B类致癌物。OTA的产生主要来源于OTA产生菌，这些霉菌在粮谷类、干果、葡萄及葡萄酒、咖啡、中草药、调味品、罐头食品、油、橄榄、豆制品、啤酒、茶叶等多种农副产品的生产、加工过程中都有可能出现。另一方面，动物在进食受到OTA污染的饲料后，会因OTA的不易代谢降解而在体内蓄积。人在食用这些被OTA污染的动物组织后，对人的生命安全将会产生潜在的危害。美国、欧洲等发达国家已经初步确立了真菌毒素检测的法规和标准。例如，食品法典委员会规定了小麦、大麦、黑麦等谷物及其产品的OTA限量标准为5.0 μg/kg。欧盟委员会对谷物产品、葡萄酒等食品的OTA限量标准更为严格，要求谷物产品中的OTA≤3.0 μg/kg，葡萄酒中的OTA≤2.0 μg/kg。世界卫生组织还在1995年规定，OTA的每日摄入量为14 ng/kg，有报道更表示在长期饮用葡萄酒的地区，OTA的每日摄入量应低至0.15 ng/kg。

目前食品、饲料中真菌毒素的传统检测方法主要依靠生物鉴定法、化学分析法以及仪器分析法。生物鉴定法主要用于定性判断真菌毒素的存在性，由于专一性不强，灵敏度较低，费用较高，实验周期较长等缺点，目前仅作为化学分析方法的辅助方法。化学分析法最常用的为薄层层析法，优点是对设备和检验人员要求不高，但精确度低、操作过程复杂、分析结果的可重复性和再现性差，检出限只能达到10 μg/kg，目前仅用作半定量分析。较为常用的、检测精确度较高的仪器分析法是高效液相色谱法（HPLC），该方法具有灵敏度高、分离能力强、特异性好、测定结果可靠等优点。但HPLC仪器设备昂贵、操作技术水平要求高、常需要对样品进行衍生化、对样品的前处理要求严苛、具体操作所使用的化学药剂和处理途径差别很大，易对实验结果的精确度造成影响，因此难以推广普及。鉴于这些检测方法所存在的局限性，发展简便、快速、灵敏、高效的真菌毒素检测新方法与新技术已成为迫在眉睫的重要研究课题。

基于分子识别原理的酶联免疫检测（ELISA）技术是根据抗原与抗体反应后物理化学性质发生的变化，实现对抗原与抗体形成的免疫复合物进行测定的免疫标记分析法。因其灵敏度高，特异性强，快速、经济简便、无需对样品进行分离纯化等特点，格外受到研究者的青睐。ELISA检测中关键的一步是制备具有特异性高的单克隆抗体，而OTA是小分子物质，属于半抗原，即只有反应原性，无免疫原性，因此必须与大分子物质（如蛋白质等）结合后，利用大分子的T细胞表位刺激机体才能产生抗体特异性免疫应答，制备过程繁琐耗时、成本昂贵。核酸适配体（aptamer）是可以折叠成三维结构的、通过空间构型互补与靶分子高亲和性、高特异性结合的一段寡核苷酸序列。作为一种新型分子识别元件，与抗体相比有着显著的优势：靶分子范围更广，涵盖了蛋白质、核酸、细胞以及其它无机、有机分子；高识别特异性，能够分辨出靶分子结构上的细微差别；由于aptamer是人工合成的，故具有较高的纯度和加工精确性、重复性；可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子。因而发展以适配体为分子识别元件的传感器已经成为食源性真菌毒素检测领域的重点研究课题。

电化学传感器，是将分子识别元件通过化学修饰的方法固定在电极上而构建的电化学传感装置，具有操作简单、成本低廉、检测快速、易于实现微型化等特点，因而电化学传感器在生物分析检测领域得到了普遍应用。适配体电化学传感器是基于适配体的特异性作用，采用电化学的检测手段实现对目标物的定量分析的装置。但由于OTA在实际样品中的浓度较低，产生的电信号变化不是很明显，所以适配体电化学传感器的技术难点是寻求高效的信号放大构建方法进而实现对痕量OTA的灵敏检测。目前已有通过纳米粒子标记技术建立信号放大方法实现了对微量OTA的检测。例如，已报道的发明CN1011699277A（一种电化学传感器对微量赭曲霉毒素A进行检测的方法）采用玻碳电极作为基底电极，使用电沉积方法修饰对氨基苯磺酸，再通过PCl₅的活化作用下修饰氨基修饰的单链DNA，并通过碱基互补配对将适配体和GNPs修饰的单链DNA修饰在电极表面，以循环伏安扫描为电化学检测手段，利用亚甲基蓝（MB）的氧化还原信号和金纳米粒子（GNPs）加速电子传递作用实现了对微量OTA的检测。相对而言，本发明以金电极作为工作电极实现了对巯基功能化的单链DNA的一步修饰，大大简化了修饰单链DNA的操作过程；并且在DNA标记的GNPs加速电子传递作用的基础上，利用碱基互补配对作用捕获富含碱基G的单链DNA进而俘获大量的MB进行信号放大；再以灵敏度更高、响应更快的差分脉冲伏安法（DPV）为电化学检测手段，实现了对痕量OTA的灵敏检测。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种操作简单、能够有效放大检测信号的适配体传感器制备方法实现对痕量OTA的灵敏检测。首先，以金电极作为工作电极实现了对巯基功能化的单链DNA的一步修饰，简化单链DNA的修饰过程；其次在DNA标记的GNPs加速电子传递作用的基础上，利用碱基互补配对作用捕获富含碱基G的单链DNA进而俘获更多的MB进行信号放大；最后，以灵敏度更高、响应更快的差分脉冲伏安法作为电化学检测手段检测痕量OTA。

技术方案：一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法：通过Au-S键作用将DNA1自组装在预处理过的金电极表面；进而通过碱基互补配对反应修饰适配体（DNA2）；再通过碱基互补配对捕获GNPs标记的DNA3（DNA3-GNPs）；然后利用DNA3与富含碱基G的DNA4之间的杂化作用将DNA4修饰在电极表面，制得适配体传感器；最后利用MB标记适配体传感器上的DNA4中的碱基G，以适配体传感器为工作电极，结合传统的三电极体系，采用DPV为检测手段测定MB的还原峰电流，得到相应的检测信号，建立OTA浓度和峰电流之间的响应关系。其步骤为：

（1）DNA3-GNPs的制备：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子胶体溶液（金胶），取2 mL金胶加入30 μL 100 μM DNA3溶液温育12 h，接着加入0.2 mL 2 M NaCl溶液，继续温育24 h。反应完成后，所得溶液经过二次水洗，12000 r/min离心10 min，重复三次制得DNA3-GNPs。重新分散在600 μL Tris-HCl（pH 8.0）备用。

（2）金电极的预处理：首先将金电极依次用1 μm、0.5 μm、0.05 μm的氧化铝粉末打磨，并用K₃Fe(CN)₆作探针扫描峰电位差小于90 mV。接着将其置于0.5 M H₂SO₄溶液中，在-0.2~1.6 V的电位范围内进行扫循环伏安扫描至曲线稳定，淋洗并吹干备用。

（3）适配体传感器的制备：取5 μL 5 μM DNA1的Tris-HCl溶液滴涂于预处理的金电极表面，盖上电极帽防止溶液挥发，室温下反应16 h。反应结束后需用0.2 M NaCl的磷酸缓冲液（PBS pH 8.0）和二次水反复淋洗3次，洗脱电极表面未发生键和的DNA1。待电极干燥后，再滴加5 μL 5 μM的DNA2，反应1 h后淋洗。然后滴涂5 μL DNA3-GNPs，反应1 h后淋洗，再滴涂5 μL 5 μM 富含碱基G的DNA4，反应1 h后淋洗，即制得适配体传感器。

（4）建立OTA浓度和峰电流之间的响应关系的方法为：将适配体传感器依次置于浓度为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4 ng/mL的OTA标准溶液反应15 min，反应后用二次水淋洗3次。接着浸入80 μM的MB溶液中10 min，二次水淋洗后备用。以修饰的金电极为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在50 mM Tris-HCl溶液中，采用DPV在0～-0.4V电位范围内采集相应的MB还原峰电流信号，绘制标准曲线。整个适配体传感器的制备过程如图2所示。

所使用的DNA序列如下：

DNA1：5’-SH-TGT CCG ATG CTC-3’；DNA2（适配体）： 5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’；DNA3：5’-CCA CAC CCG ATC-SH-3’；DNA4：5’-GAT CGG GTG TGG AGG TGG CGG TGG CGG AGG TGG CGG TGG-3’。

所述的金纳米粒子粒径为15 nm左右。

所述适配体（DNA2）是能够特异性识别OTA的单链DNA片段。

所述的DNA1的巯基修饰部分与金电极通过Au-S作用组装在金电极表面，其碱基序列可以与DNA2的3’-端部分碱基发生互补配对反应。

所述的DNA3的全部碱基与适配体的5’-端部分碱基互补配对，同样通过Au-S作用共价键和金纳米粒子实现生物标记。

所述的DNA3的全部碱基能够与DNA4部分碱基互补配对作用。

所绘制的标准曲线是指适配体传感器与不同浓度的OTA标准样发生特异性识别作用后，再将MB捕获在电极表面进行DPV扫描，根据不同浓度的OTA对应的MB还原峰电流信号绘制标准曲线。

有益效果：本发明基于适配体与OTA的特异性识别作用，结合金纳米粒子标记放大技术、碱基互补配对作用、富含碱基G能吸附更多MB的信号放大策略，采用DPV为电化学检测手段，建立了一种电化学适配体传感器检测痕量OTA的方法，为痕量OTA检测提供了一种新的方法和途径。该方法较目前OTA检测方法，具有如下优点：

（1）该传感器的制备是基于适配体和OTA的特异性识别作用所构建的，与基于抗原抗体免疫反应的ELLSA方法相比有特异性高、长时间暴露不容易变性、对周围环境要求不高等特点。

（2）采用金电极为工作电极，利用Au-S键的作用实现了对巯基功能化的单链DNA的一步修饰，大大简化了单链DNA的修饰过程。

（3）在DNA标记的GNPs加速电子传递作用的基础上，利用碱基互补配对作用捕获富含碱基G的单链DNA进而俘获更多的MB进行信号放大；选择灵敏度更高、响应更快的差分脉冲伏安法为电化学检测手段有利于实现对痕量OTA的灵敏检测。

（4）传感器制备过程所用试剂量极小，检测仪器为电化学工作站，相对于传统的检测手段而言，该电化学传感器具操作简便灵活、分析速度快、检测成本低廉的特点。

附图说明

图1 为粒径约为15 nm的金纳米粒子的透射电镜图；

图2 为适配体传感器制备过程和信号放大策略示意图；

图3 为OTA标准溶液对应的DPV曲线（A）和OTA检测标准曲线（B）。

具体实施方式

实施例一：适配体传感器的制备

（1）制备DNA3-GNPs：取100 mL 0.01% HAuCl₄搅拌下加热至沸，接着加入10 mL 1%柠檬酸钠，继续加热搅拌反应半小时，然后停止加热，搅拌冷却至室温，得到金胶，其透射电镜图显示在图1中。取2 mL金胶加入30 μL 100 μM DNA3溶液温育12 h，接着加入0.2 mL 2 M NaCl溶液，继续温育24 h。反应完成后，所得溶液经过二次水洗，12000 r/min离心10 min，重复三次制得DNA3-GNPs。最后重新分散在600 μL Tris-HCl（pH 8.0）中备用。

（2）金电极预处理：首先将金电极依次用1 μm、0.5 μm、0.05 μm的氧化铝粉末打磨，并用K₃Fe(CN)₆作探针扫描峰电位差小于90 mV。接着置于0.5 M H₂SO₄溶液中，在-0.2~1.6 V的电位范围内进行扫循环伏安扫描至曲线稳定。

（3）适配体传感器的制备：取5 μL 5 μM DNA1的Tris-HCl溶液滴于预处理过的金电极表面，盖上电极帽，在室温下反应16 h。反应结束后需用0.2 M NaCl的PBS（pH 8.0）和二次水反复淋洗3次，洗脱电极表面未发生键和的DNA1。待电极干燥后，再滴加5 μL 5 μM适配体，反应1 h，淋洗后干燥。然后滴加5 μL DNA3-GNPs，反应1 h。淋洗干燥后，滴涂5 μL富含碱基G的DNA4（5 μM），室温下反应1 h，淋洗后即制得适配体传感器。

实施例二：适配体传感器对痕量OTA标准样的标准曲线绘制

将适配体传感器首先分别置于浓度依次为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4 ng/mL的OTA标准溶液反应15 min，之后用二次水淋洗3次。接着浸泡在80 μM MB溶液中10 min。二次水淋洗，然后以适配体传感器为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在50 mM Tris-HCl中，采用DPV在0~-0.4 V电位范围内采集相应的MB还原峰电流信号，绘制标准曲线，其结果显示在图3中。

Claims

1.一种电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，按照下述步骤进行：通过Au-S键作用将DNA1自组装在预处理过的金电极表面；进而通过碱基互补配对反应修饰适配体DNA2；再通过碱基互补配对捕获GNPs标记的DNA3得DNA3-GNPs；然后利用DNA3与富含碱基G的DNA4之间的杂化作用将DNA4修饰在电极表面，制得适配体传感器；最后利用MB标记适配体传感器上的DNA4中的碱基G，以适配体传感器为工作电极，结合传统的三电极体系，采用DPV为检测手段测定MB的还原峰电流，得到相应的检测信号，建立OTA浓度和峰电流之间的响应关系；

所使用的DNA序列如下：

DNA1：5’-SH-TGT CCG ATG CTC-3’；适配体DNA2： 5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’；DNA3：5’-CCA CAC CCG ATC-SH-3’；DNA4：5’-GAT CGG GTG TGG AGG TGG CGG TGG CGG AGG TGG CGG TGG-3’。

2.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于DNA3-GNPs的制备步骤为：采用柠檬酸钠还原法制备金纳米粒子胶体溶液，取2 mL金胶加入30 μL 100 μM DNA3溶液温育12 h，接着加入0.2 mL 2 M NaCl溶液，继续温育24 h，反应完成后，所得溶液经过二次水洗，12000 r/min离心10 min，重复三次制得DNA3-GNPs，重新分散在pH 8.0的600 μL Tris-HCl。

3.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于金电极的预处理方法为：首先将金电极依次用1 μm、0.5 μm、0.05 μm的氧化铝粉末打磨，并用K₃Fe(CN)₆作探针扫描峰电位差小于90 mV，接着将其置于0.5 M H₂SO₄溶液中，在-0.2~1.6 V的电位范围内进行扫循环伏安扫描至曲线稳定，淋洗并吹干。

4.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于适配体传感器的制备方法为：取5 μL 5 μM DNA1的Tris-HCl溶液滴涂于预处理的金电极表面，盖上电极帽防止溶液挥发，室温下反应16 h，反应结束后需用0.2 M NaCl的磷酸缓冲液（PBS pH 8.0）和二次水反复淋洗3次，洗脱电极表面未发生键和的DNA1；待电极干燥后，再滴加5 μL 5 μM的DNA2，反应1 h后淋洗；然后滴涂5 μL DNA3-GNPs，反应1 h后淋洗，再滴涂5 μL 5 μM 富含碱基G的DNA4，反应1 h后淋洗，即制得适配体传感器。

5.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于建立OTA浓度和峰电流之间的响应关系的方法为：将适配体传感器依次置于浓度为0、0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、4 ng/mL的OTA标准溶液反应15 min，反应后用二次水淋洗3次；接着浸入80 μM的MB溶液中10 min，二次水淋洗后备用；以修饰的金电极为工作电极，铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比电极，在50 mM Tris-HCl溶液中，采用DPV在0～-0.4V电位范围内采集相应的MB还原峰电流信号，绘制标准曲线。

6.根据权利要求3所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所述的金纳米粒子粒径为15 nm左右；所述适配体DNA2是能够特异性识别OTA的单链DNA片段；所述的DNA1的巯基修饰部分与金电极通过Au-S作用组装在金电极表面，其碱基序列可以与DNA2的3’-端部分碱基发生互补配对反应；所述的DNA3的全部碱基与适配体的5’-端部分碱基互补配对，通过Au-S作用共价键和金纳米粒子实现生物标记。

7.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所述的DNA3的全部碱基能够与DNA4部分碱基互补配对作用。

8.根据权利要求1所述的电化学适配体传感器检测痕量赭曲霉毒素A的方法，其特征在于所绘制的标准曲线是指适配体传感器与不同浓度的OTA标准样发生特异性识别作用后，再将MB捕获在电极表面进行DPV扫描，根据不同浓度的OTA对应的MB还原峰电流信号绘制标准曲线。