CN112540073A - 一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用 - Google Patents

一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物传感器技术领域，涉及一种基于Fc‑apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用；首先通过制备自增强电化学发光材料SiO2@Ru‑NGQDs，利用Nafion膜将球形SiO2@Ru‑NGQDs材料固定在干净的玻碳电极表面；然后将AuNPs组装在修饰的玻碳电极表面，并通过Au‑S共价作用，适配体互补链被固定；再引入被二茂铁标记的适配体，通过碱基互补配对组装，获得二茂铁电化学信号的同时也获得增强的电化学发光信号；最终，获得新型双模式电化学‑电化学发光生物传感器，是一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体检测AFB1的传感器，用于对实际样品灵敏、快速的分析。

Description

一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的 制备方法及其应用
技术领域
本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法及其应用。
背景技术
随着生活条件的改善和科学技术的发展，食品安全和环境保护日益受到世界各个国家的重视。霉菌毒素是真菌产生的有毒的次生代谢产物，可以感染多种食物并在其中繁殖。在霉菌毒素中，黄曲霉毒素(AF)是剧毒的天然化合物，引起了广泛关注，污染了包括坚果和玉米在内的多种重要农产品。AF有不同类型：AFB1，AFB2，AFM1，AFM2，AFG1和AFG2。其中，黄曲霉毒素B1(AFB1)是最具毒性的，也是最强的天然致癌物之一。
到目前为止，已经开发了几种AFB1的分析方法，例如液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，荧光(FL)，电致发光(ECL)，光电化学(PEC)和电化学传感。这些用于定量测定的方法在很大程度上依赖于单输出模式，受到背景信号高，假阳性信号，外部抗干扰能力差或不同实验环境的局限，从而影响检测结果的准确性。为了提高实验结果的准确性，基于多信号输出的双模式分析方法已成为研究热点。例如，Lin et al.提出利用Ru(phen)3 2+-DNA与MB-DNA分别作为电化学发光与电化学信号，构建适配体传感器并成功应用于对OTA的分析，准确度有提升，但是稳定性不高；因此，亟需研究一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体检测AFB1的传感器。
发明内容
本文旨在发明一种集高稳定性、高选择性、高灵敏度、低干扰等优点为一体的双模式电化学-电化学发光生物传感器直接检测AFB1；提出了一种新型双模式电化学-电化学发光生物传感器的构建方法，实现对AFB1的检测。
本发明介绍了一种自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs，利用Nafion膜将球形SiO2@Ru-NGQDs材料固定在干净的玻碳电极表面。然后将AuNPs组装在修饰的玻碳电极表面，并通过Au-S共价作用，适配体互补链被固定。进一步引入被二茂铁标记的适配体，通过碱基互补配对组装，获得二茂铁电化学信号的同时也获得增强的电化学发光信号。最终，获得新型双模式电化学-电化学发光生物传感器，用于对实际样品灵敏、快速的分析。
通过如下技术方案实现本发明的目的：
本发明首先提供一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，步骤如下：
(1)自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs的制备：
首先，将一定量的三联吡啶钌水溶液(Ru(bpy)3 2+)与石墨烯量子点水溶液(NGQDs)混合后，在黑暗环境中进行第一次搅拌，加入环己烷、曲拉通和己醇，进行第二次搅拌，在搅拌条件下加入硅酸四乙酯、氨水，然后再进行密封搅拌，所得混合溶液加入丙酮后进行离心，所得固体分别用超纯水、乙醇清洗，得到材料记为SiO2@Ru-NGQDs，将所得材料烘干称量，分散在超纯水中，得到SiO2@Ru-NGQDs水溶液，备用；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
(3)将步骤(1)制备的自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs水溶液修饰到步骤(2)处理后的玻碳电极表面，用Nafion膜固定，修饰后的玻碳电极记为SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(4)将金纳米粒子(AuNPs)修饰在步骤(3)所制得的SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的材料记为AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(5)取被巯基修饰的适配体互补链，记为cDNA；将cDNA固定在步骤(4)得到的AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，并进行孵育，孵育后的材料记为cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(6)二茂铁(Fc)标记的AFB1适配体，记为Fc-apt；将Fc-apt修饰在步骤(5)中cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，孵育后即得到基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器，记为Fc-apt/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE。
优选的，步骤(1)中，所述三联吡啶钌水溶液的浓度为10mM，石墨烯量子点水溶液的浓度为10mg·mL-1；所述三联吡啶钌水溶液与石墨烯量子点水溶液的体积比为1:5；所述三联吡啶钌水溶液、环己烷、曲拉通、己醇、硅酸四乙酯和氨水的用量比为170μL:7.5mL:1.77mL:1.8mL:100μL:60μL；所述离心的转速为8000rpm，时间为10～15min。
优选的，步骤(1)中，所述第一次搅拌的时间为12～14h；所述第二次搅拌的时间为30～40min；所述密封搅拌的时间为22～24h。
优选的，步骤(1)中，所述混合溶液与丙酮的体积比为1:2；所述SiO2@Ru-NGQDs水溶液的浓度为8mg/mL-14mg/mL。
优选的，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。
优选的，步骤(3)中，所述SiO2@Ru-NGQDs水溶液的用量为4～6μL。
优选的，步骤(4)中，AuNPs用量为5～7μL。
优选的，步骤(5)中，所述cDNA用量为6～8μL，浓度为5μM；所述孵育的温度为4℃，孵育时间为12～14h。
优选的，步骤(6)中，所述Fc-apt用量为6μL，浓度为5μM；所述孵育的温度为4℃，孵育的时间为80～100min。
本发明还涉及一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器检测AFB1的用途，步骤如下：
(1)在上述制得的Fc-apt/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE传感器表面依次修饰V1体积不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育时后用Tris-HCl(pH＝7.4)溶液对电极进行清洗，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号；在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。
进一步地，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为3×10-5ng/mL-3×103ng/mL；所述孵育时间为40-150min。
进一步地，步骤(1)和(3)中V1修饰的体积均为6μL。
本发明的有益效果：
(1)本发明的双模式电化学-电化学发光生物传感器可获得两个检测信号，信息量大，精准度、可信度高。
(2)本发明将Fc-apt作为放大电化学发光信号的材料，提高了传感器的灵敏度。
(3)本发明引入特异性识别元件AFB1的适配体，提高了双模式电化学-电化学发光生物传感器的选择性，降低了与AFB1同时存在毒素的干扰，实现对AFB1的特异性分析。
(4)本发明构建的双模式电化学-电化学发光生物传感器用于AFB1的检测，灵敏度高、选择性好、稳定性好，线性范围宽，为0.00003-3000ng·mL-1。
附图说明
图1中(A)为自增强材料SiO2@Ru-NGQDs的SEM图；(B)为不同材料的的荧光光谱图；其中a为Ru(bpy)3 2+、b为SiO2@Ru、c为SiO2@Ru-NGQDs、d为NGQDs。
图2为传感器构建过程的ECL信号变化图，其中a为SiO2@Ru-NGQDs/GCE、
b为AuNPs/SiO2@Ru-NGQDs/GCE、
c为cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQDs/GCE、
d为MCH/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQDs/GCE、
e为Fc-apt/MCH/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQDs/GCE、
f为AFB1/Fc-apt/MCH/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQDs/GCE。
图3为双模式电化学-电化学发光生物传感器对浓度为0ng·mL-1(a)、0.1ng·mL-1(b)、10ng·mL-1(c)AFB1的(A)DPV与(B)ECL响应的可行性图谱。
图4中(A)为电化学发光生物传感器对不同浓度AFB1的响应图；(B)为电化学生物传感器对不同浓度AFB1的响应图；(C)为AFB1浓度取对数分别与电化学发光信号变量关系图(a)电化学变量关系图(b)。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在本发明的技术方案为前提下进行，给出了详细实施步骤和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
(1)自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs的制备：
首先，将10mM的170μL的三联吡啶钌(Ru(bpy)3 2+)与10mg·mL-1 850μL石墨烯量子点(NGQDs)在黑暗环境中搅拌一夜(12h)，之后迅速加入7.5mL环己烷、1.77mL曲拉通和1.8mL己醇，并不断搅拌30min；然后快速加入100μL硅酸四乙酯、60μL氨水，密封搅拌24h，得到混合液；最后加入2倍混合液体积的丙酮进行分离，分别用超纯水水、乙醇洗3次，将所得材料分散在600μL超纯水中，冰箱4℃储存备用；
(2)将玻碳电极(d＝3mm，GCE)依次用0.3μm和0.05μm的三氧化二铝粉末打磨，分别在在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥；
(3)将步骤(1)制备的自增强电化学发光材料4μL SiO2@Ru-NGQDs水溶液修饰到步骤(2)所制得的玻碳电极表面，用Nafion膜固定，在室温下自然晾干，此时传感器表示为SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(4)将7μL AuNPs修饰在步骤(3)所制得的传感器表面，在室温下自然晾干，此时传感器表示为AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(5)被巯基修饰的适配体互补链浓度为5μM，用量为6μL，通过Au-S共价作用固定在步骤(4)电极表面，并在冰箱4℃孵育一夜，此时传感器表示为cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE。
(6)二茂铁(Fc)标记的AFB1适配体浓度为5μM，用量为6μL，通过碱基互补配对组装在步骤(5)传感界面，获得ECL信号增强的双模式电化学-电化学发光生物传感器，即基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器，记为Fc-apt/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE。
制得的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器作为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号，型号为MPI-EII的电化学发光仪器记录与检测电化学发光信号。在0.1M PBS(pH＝7.0)缓冲溶液中进行测试。
图1(A)为自增强材料SiO2@Ru-NGQD的TEM图，表明材料SiO2@Ru-NGQD是球形结构。图1(B)曲线a为Ru(bpy)3 2+荧光发射峰，曲线b为SiO2@Ru的荧光发射峰，曲线c为SiO2@Ru-NGQD荧光发射峰，曲线d为NGQD荧光发射峰；证明自增强材料SiO2@Ru-NGQD制备成功。
图2为传感器构建过程的ECL信号变化图，Fc-apt组装在被修饰的电极表面后，ECL信号迅速增强，证明Fc-apt对材料SiO2@Ru-NGQD的ECL信号有增强作用。
基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的后续研究；
(1)对制备的双模式电化学-电化学发光生物传感器的可行性进行研究：
将浓度为0.1ng·mL-1、10ng·mL-1的AFB1自组装在实施例1制备生物传感器表面，并在室温下进行孵育，并观察AFB1对EC、ECL信号的影响；如图3所示：其中(A)为不同浓度AFB1对电化学信号的影响；(B)为不同浓度AFB1对电化学发光信号的影响；通过图3可知，随着AFB1浓度的增大，EC、ECL信号呈现逐渐降低的变化，证明传感器可行。
(2)双模式电化学-电化学发光生物传感器的性能研究：
分别用3×10-5、1×10-4、1×10-3、1×10-2、1×10-1、1、10、1×102、1×103、3×103ng·mL-1的AFB1修饰实施例1所获得的双输出模式传感器，在最佳实验条件下，由型号为MPI-EII的电化学发光仪器记录与检测电化学发光信号的变化(图4A)，型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学峰电流的变化(图4B)，并得到两种信号(峰强度、峰电流)对不同浓度AFB1的响应。随着AFB1浓度的增加，电化学发光信号降低，并且在AFB1浓度为3×10-5-1×102ng·mL-1范围内与获得的电化学发光信号呈线性关系(图4A)；AFB1浓度为1×10-3-3×103ng·mL-1范围内与获得的电化学信号呈线性关系。具体的线性关系图如4C所示。证明双模式电化学-电化学发光生物传感器具有较宽的线性范围，可实现对AFB1的精准分析。
基于此线性关系，对实际样品花生中AFB1进行了分析：首先获取花生样品液，修饰样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度；实现未知样品中AFB1检测的用途。
分析结果如表1所示。
Figure BDA0002777970000000071
利用两种传感方法对实际样品花生中不同浓度的AFB1进行了分析，回收率分别在93.0-99.3％与85.0-99.1％之间。与国标方法HPLC-FL相比(75.8-99.0％)，提出的双模式电化学-电化学发光生物传感器对于实际样品花生中AFB1的分析可靠性较高。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

Claims (10)

1.一种基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs的制备：
首先，将一定量的三联吡啶钌水溶液与石墨烯量子点水溶液混合后，在黑暗环境中进行第一次搅拌，加入环己烷、曲拉通和己醇，进行第二次搅拌，在搅拌条件下加入硅酸四乙酯、氨水，然后再进行密封搅拌，所得混合溶液加入丙酮后进行离心，所得固体分别用超纯水、乙醇清洗，得到材料记为SiO2@Ru-NGQDs，将所得材料烘干称量，分散在超纯水中，得到SiO2@Ru-NGQDs水溶液，备用；
(2)将玻碳电极依次用不同粒径的三氧化二铝粉末打磨，分别在乙醇和水中超声30s后于空气中干燥，得到处理后的玻碳电极；
(3)将步骤(1)制备的自增强电化学发光材料SiO2@Ru-NGQDs水溶液修饰到步骤(2)处理后的玻碳电极表面，用Nafion膜固定，修饰后的玻碳电极记为SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(4)将金纳米粒子修饰在步骤(3)所制得的SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，在室温下自然晾干，修饰后的材料记为AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(5)取被巯基修饰的适配体互补链，记为cDNA；将cDNA固定在步骤(4)得到的AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，并进行孵育，孵育后的材料记为cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE；
(6)二茂铁标记的AFB1适配体，记为Fc-apt；将Fc-apt修饰在步骤(5)中cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE材料的电极表面，孵育后即得到基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器，记为Fc-apt/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE。
2.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述三联吡啶钌水溶液的浓度为10mM，石墨烯量子点水溶液的浓度为10mg·mL-1；所述三联吡啶钌水溶液与石墨烯量子点水溶液的体积比为1:5；所述三联吡啶钌水溶液、环己烷、曲拉通、己醇、硅酸四乙酯和氨水的用量比为170μL:7.5mL:1.77mL:1.8mL:100μL:60μL；所述离心的转速为8000rpm，时间为10～15min。
3.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一次搅拌的时间为12～14h；所述第二次搅拌的时间为30～40min；所述密封搅拌的时间为22～24h；所述混合溶液与丙酮的体积比为1:2；所述SiO2@Ru-NGQDs水溶液的浓度为8mg/mL-14mg/mL。
4.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述玻碳电极的直径d＝3mm；所用的三氧化二铝粉末的粒径依次为0.3μm、0.05μm。
5.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述SiO2@Ru-NGQDs水溶液的用量为4～6μL。
6.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，AuNPs用量为5～7μL。
7.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述cDNA用量为6～8μL，浓度为5μM；所述孵育的温度为4℃，孵育时间为12～14h。
8.根据权利要求1所述的基于Fc-apt放大电化学发光信号的双输出模式传感器的制备方法，其特征在于，步骤(6)中，所述Fc-apt用量为6μL，浓度为5μM；所述孵育的温度为4℃，孵育的时间为80～100min。
9.根据权利要求1-8任一项所述方法制备的传感器用于检测黄曲霉毒素B1的用途，其特征在于，步骤如下：
(1)在上述制得的Fc-apt/cDNA/AuNPs/SiO2@Ru-NGQD/GCE传感器表面依次修饰V1体积不同浓度的AFB1溶液；室温下孵育时后用pH＝7.4的Tris-HCl溶液对电极进行清洗，一个浓度的AFB1溶液对应修饰一个电化学生物传感器，浓度和电化学生物传感器呈一一对应关系；
(2)标准曲线的构建：以步骤(1)修饰后传感器为工作电极，饱和Ag/AgCl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，由型号为CHI750E的电化学工作站记录与检测电化学信号；在0.1M，pH＝7.0的PBS缓冲溶液中进行测试；扫描电压范围-0.8-0.8V，振幅为0.025V，频率为25Hz；每一个浓度的AFB1会对应一个电流值，根据电流值和AFB1浓度的对数构建得到标准曲线；
(3)样品中AFB1的检测：首先获取样品液，修饰V1体积的样品液于传感器表面，通过电化学测试得到相应的电流值；将电流值代入步骤(2)构建的标准曲线，即可获知样品中AFB1的浓度，实现未知样品中AFB1检测的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，步骤(1)中，所述AFB1溶液的浓度为3×10-5ng/mL-3×103ng/mL；所述孵育时间为40-150min；步骤(1)和(3)中V1修饰的体积均为6μL。
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