CN111721820B - 一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器及其制备方法,属于电化学传感器技术领域,包括工作电极,参比电极和对电极,所述工作电极为玻碳电极表面依次修饰石墨烯气凝胶‑二硫化钼/金纳米粒子的复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白,所述参比电极为饱和甘汞电极,所述对电极为铂片电极,以前列腺特异性抗体作为分子识别原件。本发明所构建的非标记型前列腺特异性抗原免疫传感器具有检测范围广、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点,其线性检测范围是0.00001ng/mL‑50ng/mL,最低检测下限为3fg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及电化学传感器技术领域,具体涉及一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器及其制备方法。
背景技术
前列腺癌是全世界男性最常见的恶性肿瘤之一。在早期前列腺癌的诊断和预后中,前列腺特异性抗原(PSA)被认为是主要的生物标志物。前列腺特异性抗原的分析方法有很多种,电化学免疫传感器相较于其他方法具有检测快速,灵敏度高,成本低等优点。而对于电化学免疫传感器来说,修饰于电极表面的材料的特性会影响传感器的检测性能。因此,制备一种具有优良性能的电极修饰材料,放大检测信号是至关重要的。
石墨烯气凝胶是一种具有3D多孔网络结构的新型多孔碳材料,不仅提供了大的比表面积,而且还增强了电解质的扩散,并提供了用于改善电子传递的多维导电通道,可作为电化学免疫传感器的修饰材料。但是,在制备石墨烯气凝胶的过程中,一些石墨烯片趋于团聚,从而降低了石墨烯气凝胶的比表面积。而将二硫化钼与石墨烯结合可以有效地抑制石墨烯的聚集,并进一步提高电导率,比表面积和电催化能力。另外,金纳米粒子具有很好的生物兼容性,且可以与前列腺特异性抗体(anti-PSA)通过Au-S键结合,有利于anti-PSA的固定。
因此,石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子复合材料具有较高的电导率,较大的比表面积和丰富的活性位点,可装载PSA抗体,可放大电化学信号,是制备高灵敏度的前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的优良材料。
发明内容
本发明提供一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器及其制备方法,利用石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料作为信号放大材料,前列腺特异性抗体作为分子识别原件,构建出一种新型非标记型免疫传感器,实现对前列腺特异性抗原的快速、灵敏检测。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器,包括工作电极,参比电极和对电极,其中,所述工作电极用石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料作为修饰材料,前列腺特异性抗体作为分子识别原件。
优选的,所述工作电极为玻碳电极表面依次修饰石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白。
优选的,所述参比电极为饱和甘汞电极,所述对电极为铂片电极。
本发明还提供一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料/金纳米粒子复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料;
(2)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作电极;
(3)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作曲线。
优选的,所述步骤(1)具体包括以下步骤:
①制备层状的MoS2
在容器中加入0.6g剥离前的MoS2粉末,4mL正丁基锂以及10mL超干正己烷,并在氮气保护及搅拌条件下,80℃反应48h,待自然冷却后,离心洗涤产物,去上清液,用正己烷洗涤3-4次,除去正丁基锂,得到的粉末产物加水超声1h,10000r/min离心30min后取上层的悬浮液,即为层状MoS2的水分散液;
②制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料
首先,取上述所得的4mL MoS2(1mg mL-1)分散液,加入16mL氧化石墨烯的水分散液(2mg mL-1),搅拌1h至其分散均匀,将混合液移入反应釜中,在180℃下,水热反应12h,最后,冻干产物,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料,即GAs-MoS2;
③制备石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子复合材料
将直径为3.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,分别依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗;将10μL、1mg/mL上述所得的GAs-MoS2复合材料分散液滴加到电极表面上,在空气中自然干燥,作为工作电极;使用电化学工作站以三电极体系沉积金纳米粒子,以饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在5.0mL、5mmol L-1的氯金酸溶液中,用时间-电流方法进行沉积,输入电压为-0.2V,运行时间为120s,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料。
优选的,所述步骤(2)具体包括以下步骤:
将6.0μL、21.994μg/mL的前列腺特异性抗体滴加到上述电极表面,在37℃水浴槽中孵育1.5小时;然后将6.0μL、0.1wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面,在37℃水浴槽中固定0.5小时,用以封闭非特异性活性位点,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,得到非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作电极。
优选的,所述步骤(3)具体包括以下步骤:
将一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液滴加在所述步骤(2)制备的工作电极表面,在37℃水浴槽中孵育1小时,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在含有0.1M KCl和5mM[Fe(CN)6]3-/4-且pH为7.0的磷酸缓冲液中,用差分脉冲阳极伏安法测固定抗原前后的工作电极的响应电流,得到二者电流差(ΔI)与初始电流(I)的关系,即抑制率,为ΔI/I,记录不同浓度下的抑制率与抗原浓度(CPSA),得到工作曲线,利用工作曲线法,得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
本发明的有益技术效果为:
(1)本发明通过新型石墨烯气凝胶-二硫化钼复合/金纳米粒子材料作为信号放大器,其中,石墨烯气凝胶-二硫化钼比表面积大,能大大提高检测分子在电极上的负载量,金纳米粒子可用于与抗体通过S-Au键结合,而将抗体固定在电极表面。石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子复合材料具有独特的结构,拥有大的比表面积,从而提高的前列腺特异性抗体的固定位点,为前列腺特异性抗原提供大量特异性结合位点,这种纳米复合材料充分发挥石墨烯气凝胶比表面积大的特性,有效的利用二硫化钼增大石墨烯气凝胶的比表面积,防止其发生自堆叠;另外,金纳米粒子有很好的结合特异性抗体的能力,能够充分发挥三者的协同效应,展现出优异的导电性能和生物相容性,从而有效地提高传感器的灵敏度,所构建的非标记型免疫传感器实现了对前列腺特异性抗原的定量检测,具有检测范围广、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点,为前列腺特异性抗原的早期诊断提供了一种可靠的检测手段;
(2)本发明所构建的非标记型电化学免疫传感器实现了精确定量检测前列腺特异性抗原的目的,其线性检测范围是0.00001ng/mL-50ng/mL,最低检测下限为3fg/mL。
附图说明
图1为本发明电化学免疫传感器的工作电极的制备原理流程图;
图2为本发明制备的GAs(图2,a),GAs-MoS2(图2,b)和GAs-MoS2/AuNPs(图2c)材料的扫描电镜(SEM)图;
图3为本发明GAs-MoS2/AuNPs修饰电极检测前列腺特异性抗原的线性图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器,包括工作电极,参比电极和对电极,其中,所述工作电极用石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料作为修饰材料,前列腺特异性抗体作为分子识别原件。所述工作电极为玻碳电极表面依次修饰石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白。所述参比电极为饱和甘汞电极,所述对电极为铂片电极。如图1所示为电化学免疫传感器的工作电极的制备原理流程图。
上述所述的一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料/金纳米粒子复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料,具体包括以下步骤:
①制备层状的MoS2
在容器中加入0.6g剥离前的MoS2粉末,4mL正丁基锂以及10mL超干正己烷,并在氮气保护及搅拌条件下,80℃反应48h,待自然冷却后,离心洗涤产物,去上清液,用正己烷洗涤3-4次,除去正丁基锂,得到的粉末产物加水超声1h,10000r/min离心30min后取上层的悬浮液,即为层状MoS2的水分散液;
②制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料
首先,取上述所得的4mL MoS2(1mg mL-1)分散液,加入16mL氧化石墨烯的水分散液(2mg mL-1),搅拌1h至其分散均匀,将混合液移入反应釜中,在180℃下,水热反应12h,最后,冻干产物,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料,即GAs-MoS2;
③制备石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子复合材料
将直径为3.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,分别依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗;将10μL、1mg/mL上述所得的GAs-MoS2复合材料分散液滴加到电极表面上,在空气中自然干燥,作为工作电极;使用电化学工作站以三电极体系沉积金纳米粒子,以饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在5.0mL、5mmol L-1的氯金酸溶液中,用时间-电流方法进行沉积,输入电压为-0.2V,运行时间为120s,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料。
如图2所示为制备的GAs(图2,A),GAs-MoS2(图2,B)和GAs-MoS2/AuNPs(图2,c)材料的扫描电镜(SEM)图,MoS2均匀分散在GAs表面,而石墨烯气凝胶未发生堆叠,表明二硫化钼可以有效的防止石墨烯发生自堆叠,而大的比表面积有利于金纳米粒子的附着与分散。
(2)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作电极,具体包括以下步骤:
将6.0μL、21.994μg/mL的前列腺特异性抗体滴加到上述电极表面,在37℃水浴槽中孵育1.5小时;然后将6.0μL、0.1wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面,在37℃水浴槽中固定0.5小时,用以封闭非特异性活性位点,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,得到非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作电极。
(3)制备非标记型检测前列腺特异性抗原电化学免疫传感器的工作曲线,具体包括以下步骤:
将一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液滴加在所述步骤(2)制备的工作电极表面,在37℃水浴槽中孵育1小时,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在含有0.1M KCl和5mM[Fe(CN)6]3-/4-且pH为7.0的磷酸缓冲液中,用差分脉冲阳极伏安法测固定抗原前后的工作电极的响应电流,得到二者电流差(ΔI)与初始电流(I)的关系,即抑制率,为ΔI/I,记录不同浓度下的抑制率与抗原浓度(CPSA),得到工作曲线,如图3所示,抑制率与log CPSA呈现良好的线形关系(R2=0.997),且具有较宽的线性范围(0.00001ng/mL-50ng/mL)和较高的灵敏度和低检测限(3fg/mL),充分表明该传感电极能够成功检测未知浓度的前列腺特异性抗原。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。
Claims (1)
1.一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器,包括工作电极,参比电极和对电极,其特征在于,其中,所述工作电极用石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料作为修饰材料,前列腺特异性抗体作为分子识别原件;所述工作电极为玻碳电极表面依次修饰石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料、前列腺特异性抗体、牛血清蛋白;所述参比电极为饱和甘汞电极,所述对电极为铂片电极;
所述的一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法,包括以下步骤:
(1)制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料/金纳米粒子复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料;
(2)制备非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作电极;
(3)制备非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作曲线;
步骤(1)具体包括以下步骤:
①制备层状的MoS2
在容器中加入0.6g剥离前的MoS2粉末,4mL正丁基锂以及10mL超干正己烷,并在氮气保护及搅拌条件下,80℃反应48h,待自然冷却后,离心洗涤产物,去上清液,用正己烷洗涤3-4次,除去正丁基锂,得到的粉末产物加水超声1h,10000r/min离心30min后取上层的悬浮液,即为层状MoS2的水分散液;
②制备石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料
首先,取4mL、1mg mL-1上述所得的MoS2分散液,加入16mL、2mg mL-1氧化石墨烯的水分散液,搅拌1h至其分散均匀,将混合液移入反应釜中,在180℃下,水热反应12h,最后,冻干产物,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼复合材料,即GAs-MoS2;
③制备石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子复合材料
将直径为3.0mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面,分别依次在超纯水、无水乙醇、超纯水中超声清洗;将10μL、1mg/mL所得的GAs-MoS2复合材料分散液滴加到电极表面上,在空气中自然干燥,作为工作电极;使用电化学工作站以三电极体系沉积金纳米粒子,以饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在5.0mL、5mmol L-1的氯金酸溶液中,用时间-电流方法进行沉积,输入电压为-0.2V,运行时间为120s,得到石墨烯气凝胶-二硫化钼/金纳米粒子的复合材料,即GAs-MoS2/AuNPs复合材料;
步骤(2)具体包括以下步骤:
将6.0μL、21.994μg/mL的前列腺特异性抗体滴加到步骤(1)制得的GAs-MoS2/AuNPs复合材料修饰的工作电极表面,在37℃水浴槽中孵育1.5小时;然后将6.0μL、0.1wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面,在37℃水浴槽中固定0.5小时,用以封闭非特异性活性位点,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,得到非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的工作电极;
步骤(3)具体包括以下步骤:
将一系列不同浓度的前列腺特异性抗原溶液滴加在步骤(2)制备的工作电极表面,在37℃水浴槽中孵育1小时,用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面,自然晾干,使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂片电极为对电极,在含有0.1MKCl和5mM[Fe(CN)6]3-/4-且pH为7.0的磷酸缓冲液中,用差分脉冲阳极伏安法测固定抗原前后的工作电极的响应电流,得到二者电流差ΔI与初始电流I的关系,即抑制率,为ΔI/I,记录不同浓度下的抑制率与抗原浓度CPSA,得到工作曲线,利用工作曲线法,得到待测样品中前列腺特异性抗原的浓度。
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CN108982630A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-12-11 | 山东理工大学 | 一种夹心型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
CN110618180A (zh) * | 2019-09-25 | 2019-12-27 | 江西科技师范大学 | 一种非标记型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
CN110687182A (zh) * | 2019-10-30 | 2020-01-14 | 云南大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法 |
CN111198222A (zh) * | 2020-01-13 | 2020-05-26 | 云南大学 | 一种检测前列腺特异性抗原的夹心型电化学免疫传感器的制备及使用方法 |
-
2020
- 2020-07-13 CN CN202010671904.2A patent/CN111721820B/zh active Active
Patent Citations (4)
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CN108982630A (zh) * | 2018-07-20 | 2018-12-11 | 山东理工大学 | 一种夹心型检测前列腺特异性抗原的电化学免疫传感器的制备方法及应用 |
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Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN111721820A (zh) | 2020-09-29 |
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