CN110702759B - 一种检测甲胎蛋白的zif-8复合材料电化学免疫传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种检测甲胎蛋白的zif-8复合材料电化学免疫传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于电催化剂和信号分子共同限域的ZIF‑8复合材料电化学免疫传感器的制备方法及应用。该电化学免疫传感器的制备方法包括甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF‑8复合材料的制备，以及电化学免疫传感器的制备两部分。制备得到的免疫传感器具有良好的催化性能，对甲胎蛋白（AFP）在0.01 pg mL−1至1 ng mL‑1范围内显示出良好的线性相关性，检测限低至3 fg mL‑1。应用该传感器可实现对人血清样品中AFP含量的检测。

Description

一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法及应用，属于电化学技术领域。
背景技术
金属有机骨架化合物（Metal Organic Frameworks，简称MOFs）是一种结构多样、易于修饰的多孔材料，由金属离子与有机配体构建，金属节点作为连接点，同时有机配体作为桥连分子组建成骨架。由于其具有巨大的比表面积、可调的孔径和超多的催化活性位点而被广泛关注，在催化、分离、传感器、气体吸附和储存等领域具有潜在的应用前景。MOF在化学领域最近的一项研究热点是利用MOF的“约束作用”用于封装各种纳米颗粒（NP），这些纳米颗粒包括Au，Ag，Pt，Co3O4，Fe3O4等。当将这些NP掺入MOF里形成NP@MOF复合材料时，这些NP将被限制在刚性框架内，以防止NP聚集，从而提供更加优良的催化性能。类沸石咪唑骨架材料（zeolitic imidazolate frameworks, ZIFs）是一类具有沸石结构的纳米多孔晶体材料。它以二价过渡金属离子（Zn2+、Co2+等）为配位点，咪唑环上的N原子通过桥联作用络合到金属离子上形成四面体结构单元，然后通过“交联-交联”作用形成最终的三维框架结构。通过调控金属离子和配体之间或者配体和配体之间的相互作用，可以合成多种具有不同组成和结构的ZIFs。ZIFs是目前在电化学领域应用范围最广的MOFs材料。Dong研究小组报道了一种共沉淀方法，该方法同时将NiPd NPs和葡萄糖氧化酶（GOx）封装在ZIF-8中，它们同时具有出色的NiPdNPs过氧化物酶的酶活性和GOx的酶活性（Q.Q. Wang, et al. Angew.Chem. Int. Ed. 56 (2017) 16082.）。Cheng研究小组开发了一种将Cu2O纳米立方体集成到ZIF-8中以形成复合材料Cu2O@ZIF-8的新方法，该复合材料具有出色的催化效率，并有望用于4-硝基苯酚的加氢循环（B. Li, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 57 (2018)6834.）。这些成功的例子表明了ZIF的“限制作用”对提高催化效率和酶稳定性在生物催化领域的巨大前景。
为了提高催化效率，本发明首次将电催化剂和信号分子共同包封在MOFs里，形成电催化剂和信号分子共同限域的MOFs复合材料，以此作为信号标签构建免疫传感器，实现对甲胎蛋白（AFP）的超灵敏检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种基于电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将上述方法制备的电化学传感器用于CEA的高灵敏、特异性检测。
本发明实现过程如下：
1. 一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备
首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器。
上述制备方法制备得到的电化学免疫传感器可用于检测甲胎蛋白。
一种甲胎蛋白的检测方法，包括以下步骤：
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备
首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器；
（C）甲胎蛋白的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，步骤（B）中制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(2)使用方波伏安法，在0.1 M pH 5.5的HAc-NaAc中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
上述步骤（B）中，将抛光的GCE浸入2 mL 1 %（wt）的 HAuCl4溶液中，并在−0.2 V下保持电沉积30 s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE。
上述步骤（B）中，将DpAu/GCE与一抗Ab1 在4 ℃下孵育16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极。
上述步骤（B）中，将10 μL 0.25%的BSA滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE。
上述步骤（B）中，将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 0.01 pg mL-1~50ng mL-1甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟。
上述步骤（B）中，将孵育好的电极与二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料在37 ℃下静置反应30 min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
本发明的优点和积极效果为：
(1)本发明将电催化剂和信号分子共同限域在ZIF-8里，赋予电催化剂对信号分子的高效催化能力；
(2)本发明将AuNPs负载复合材料中，提高了传感器的导电性；
(3)本发明将电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料作为信号放大标签构建免疫传感器，对AFP在0.01 pg mL−1至1 ng mL-1范围内显示出良好的线性相关性，检测限低至3 fg mL-1；
(4)用加标回收实验评估了该传感器在血清中测定AFP的实际应用能力，表现出良好的选择性和重现性。
附图说明
图1为（A）Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8的低分辨率和（B）高分辨率SEM图像，以及（C-H）Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8的元素映射图像；
图2为（A）模拟的ZIF-8（上）和制备的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8（下）的PXRD图；（B）Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8的红外光谱；
图3为通过使用不同的探针在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中0 ng mL-1 AFP（曲线a）和50 ng mL-1 AFP（曲线b）孵育制备的免疫传感器的SWV响应：（A）Au-Thi/Au/Ab2, (B)Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2 and (C) Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2；
图4为（A）免疫传感器分别孵育的不同浓度的AFP后的SWV响应：0 pg mL−1, 0.01pg mL−1, 0.1 pg mL−1, 1 pg mL−1, 0.01 ng mL−1, 0.1 ng mL−1, 1 ng mL−1, 10 ng mL−1and 50 ng mL−1, （B）免疫传感器检测AFP的标准曲线；
图5为（A）传感器的特异性；（B）10次间歇性SWV测量稳定性。
具体实施方式
以下实施例所用实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例所涉及的仪器为电化学工作站、扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱仪、X-射线粉末衍射仪。现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
一种基于电催化剂和信号分子共同限域的MOFs复合材料电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别用0.3和0.05 μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极（GCE），然后用蒸馏水超声处理，并在空气中干燥；
(2) 将抛光的GCE浸入2 mL 1 %HAuCl4溶液（wt）中，并在−0.2 V下保持电沉积30s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
(3) 将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 ℃下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
(4) 将10 μL 0.25%的BSA滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
(5) 在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
(6) 将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 0.01 pg mL-1~50 ng mL-1甲胎蛋白（AFP）抗原孵育30分钟；
(7) 将步骤6孵育好的电极与15 μL 二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8材料在37 °C下放置30 min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
一种二抗耦合的电催化剂和信号分子共同限域的MOFs复合材料的制备步骤如下：
(1) 电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的合成。首先采用金纳米微粒修饰电催化剂，然后通过NH2-Au键连接信号分子，将电催化剂和信号分子复合物加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；
(2) 二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的合成。依次在电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料上修饰PEI和纳米金，然后通过强NH2-Au亲和力制备二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，最后，用BSA封闭Ab2耦合物非特异性吸附位点。
一种甲胎蛋白的检测方法，包括以下步骤：
(1) 使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(2) 使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
(3)将待测样品溶液代替AFP的标准溶液进行检测。
实施例1：ZIF-8复合材料的制备
(1)Fe3O4NPs的合成。采用共沉淀法合成Fe3O4纳米粒子（Fe3O4NPs）。首先，在90 ℃搅拌下，将3 mM FeCl3·6H2O（0.811 g）和2.5 mM FeSO4·7H2O（0.695 g）混合到20 mL蒸馏水中。搅拌5分钟后，加入NH3·H2O（28%）并缓慢搅拌8 min以沉淀。随后，将7.5 mMNa3C6H5O7·2H2O（2.2 g）加入上述溶液中并加热90 ℃保持20 min。冷却至室温后，通过磁性分离得到Fe3O4NPs，并用乙醇和蒸馏水洗涤，并在60 ℃下干燥。
(2)Thi-Au-Fe3O4NPs的合成。（a）Au-Fe3O4NPs的制备过程如下：首先，将10 mgFe3O4NPs和L-半胱氨酸（L-Cys）（5 mL，10 mg mL-1）溶解于10 mL蒸馏水中超声2 h。 然后，通过磁性分离获得L-Cys修饰的Fe3O4NPs，并将其重新分散在10 mL蒸馏水中。然后，在剧烈搅拌下将10 mL HAuCl4（15 mM）和2.5 mL L-抗坏血酸（L-AA）（1 wt%）添加到上述10 mL L-Cys功能化的Fe3O4NPs溶液中合成Au-Fe3O4NPs。最后，通过磁性分离和用乙醇洗涤几次后得到最终产物（Au-Fe3O4NPs）。（b）合成Thi-Au-Fe3O4NPs 将上述得到的Au-Fe3O4NPs溶解在10mL 硫堇（Thi）（0.29 mM）中，并在4 ℃和缓慢搅拌的反应条件下反应过夜，以通过强Au-S亲和力形成Thi-Au-Fe3O4NPs。最后，通过在12000 rpm条件下离心5 min收集产物，并在60 ℃下干燥16 h。
(3)Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8的合成。首先将10 mg制备的Thi-Au-Fe3O4NPs溶于1.0 mL的10 mM Zn(NO3)2溶液中，并在30 ℃下搅拌15 min。随后，在搅拌的条件下将1.0 mL的60mM 2-甲基咪唑（2-MI）添加至上述溶液中反应30 min。之后，用水洗涤并反复离心后，在60℃下干燥12 h，得到同时包封生物活性电催化剂和氧化还原物质的2-甲基咪唑锌盐MAF-4（ZIF-8）复合材料 (Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8)。图1（A，B）为Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8 的SEM图像，（C-H）为元素映射图像。图2（A）为模拟的ZIF-8（上）和制备的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8（下）的PXRD图。（B）为Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8的红外光谱。
实施例2：二抗（Ab2）耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的合成
将10 mg的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8分散在1 mL含有40 μL 聚乙烯亚胺PEI（1%）蒸馏水中，并在搅拌条件下充分混合4 h，形成PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8。通过离心去除没有反应的PEI后，将PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8重新分散在1 mL PBS中。然后，加入3 mL纳米金溶液，缓慢搅拌反应4 h，通过强氨基-金亲和力得到Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au。之后，将合成的Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au分散在含有100 μL Ab2的1 mL PBS中，在4 °C下反应8 h。通过磁性分离收集制备的Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2），然后再分散在1 mL PBS缓冲溶液中。最后，用BSA封闭Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2）非特异性吸附位点。
实施例3：二抗（Ab2）耦合信号分子复合材料（Au-Thi/Au/Ab2）的合成
(1)Au-Thi的合成。将3 mL纳米金溶液溶解在10 mL Thi（0.29 mM）中，并在4 ℃缓慢搅拌的反应条件下反应过夜，以通过强Au-S亲和力形成Au-Thi。最后，在12000 rpm条件下离心5 min收集产物，并在60 ℃下干燥；
(2) 二抗（Ab2）耦合信号分子复合材料（Au-Thi/Au/Ab2）的合成：
将10 mg上述Au-Thi分散在3 mL纳米金溶液中，缓慢搅拌反应4 h，通过强Au-S亲和力得到Au-Thi/Au。之后，将合成的Au-Thi/Au分散在含有100 μL Ab2的1 mL PBS中，在4℃下反应8 h。通过磁性分离收集制备的Ab2耦合物（Au-Thi/Au/Ab2），然后再分散在1 mLPBS中。最后，用BSA封闭Ab2耦合物（Au-Thi/Au/Ab2）的非特异性吸附位点。
实施例4：二抗（Ab2）耦合电催化剂和信号分子复合材料（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2）的合成
(1)Thi-Au-Fe3O4NPs的合成见实施例1；
(2) 二抗（Ab2）耦合电催化剂和信号分子复合材料（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2）的合成：
将10 mg上述Thi-Au-Fe3O4分散在1 mL含有40 μL PEI（1%）的蒸馏水中，并在搅拌条件下充分混合4 h，形成PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4。通过离心去除没有反应的PEI后，将PEI修饰的Thi-Au-Fe3O4重新分散在1 mL PBS中。然后，加入3 mL纳米金溶液，缓慢搅拌反应4h，通过强氨基-金亲和力得到Thi-Au-Fe3O4/Au。之后，将合成的Thi-Au-Fe3O4/Au分散在含有100 μL Ab2的1 mL PBS中，在4 ℃下反应8 h。通过磁性分离收集制备的Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2），然后再分散在1 mL PBS中。最后，用BSA封闭Ab2耦合物（Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2）的非特异性吸附位点。
实施例5：实施例2、3和4中三种复合材料Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2、Au-Thi-Au/Ab2和Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2信号催化放大能力对比
(1)分别用0.3和0.05 μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极（GCE），然后用蒸馏水超声处理，并在空气中干燥；
(2)将抛光的GCE浸入2 mL HAuCl4溶液（1 wt%）中，并在−0.2 V下保持电沉积30s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
(3)将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 °C下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
(4)将10 μL的BSA（0.25%）滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
(5)在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
(6)将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL 50 ng mL-1）的甲胎蛋白（AFP）抗原孵育30分钟；
(7)将步骤6孵育好的电极与分别与15 μL Au-Thi-Au/Ab2、Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2和Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2在37 ℃下放置30 min，完成夹心型免疫反应；
(8)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(9)使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V。
采用电流差（ΔI）来评估信号放大策略的效果（将对零分析物的电流响应记录为曲线a，将对50 ng mL-1 AFP的电流响应记录为曲线b）。如图3 A所示， 对于Au-Thi/Au/Ab2复合材料修饰的电极，可以观察到微弱的电流信号（图3A，∆I = 6.76 μA）。而当Thi-Au-Fe3O4/Au/Ab2修饰电极后，电流有着明显的升高（图3B，ΔI = 10.79 μA）。与上述两种探针相比，当使用Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2时表现出最强的SWV响应（图3C，∆I = 16.31 μA），表明Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2具有出色的催化放大能力。
实施例6：检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法
（1）分别用0.3和0.05 μm的氧化铝粉末抛光玻碳电极（GCE），然后用蒸馏水超声处理，并在空气中干燥；
（2）将抛光的GCE浸入2 mL HAuCl4溶液（1 wt%）中，并在−0.2 V下保持电沉积30s，以在电极表面上形成导电的金纳米薄膜，修饰后的电极称为DpAu/GCE；
（3）将DpAu/GCE与15μL 一抗（Ab1）在4 ℃下孵育约16 h，通过强NH4-Au亲和力制备Ab1/DpAu/GCE电极；
（4）将10 μL的BSA（0.25%）滴在Ab1/DpAu/GCE电极表面0.5 h，以封闭电极表面的非特异性结合位点，获得修饰电极BSA/Ab1/DpAu/GCE；
（5）在每个修饰步骤之后，将所得电极用蒸馏水轻轻清洗，以除去物理吸附；
（6）将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与15 μL各种浓度（0.01 pg mL-1, 0.1 pgmL-1, 1 pg mL-1, 0.01 ng mL-1, 0.1 ng mL-1, 1 ng mL-1, 10 ng mL-1 和 50 ng mL-1）的甲胎蛋白（AFP）抗原孵育30分钟；
（7）将步骤6孵育好的电极与15 μL Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8/Au/Ab2在37 ℃下放置30min，完成夹心型免疫反应，将制备的免疫传感器在测量前存储在4 ℃下。
实施例7：甲胎蛋白（AFP）的检测
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的电化学免疫传感器为工作电极；
(2)使用差分脉冲伏安法，在0.1 M HAc-NaAc（pH 5.5）中进行检测，扫描电压范围是 -0.4 V 至0.1 V，绘制工作曲线。图4A显示，随着AFP浓度从0.01 pg mL-1增至50 ng mL-1，SWV的信号强度逐渐增加。SWV强度和AFP浓度的对数之间表现出理想的线性关系（图4B），回归方程I = 1.972 lgc/ng mL-1 + 20.71；
(3)将待测样品溶液代替AFP的标准溶液进行检测；
(4)AFP检测的线性范围为0.01 ～1 ng mL-1，检测限为3 fg mL-1。
实施例8：ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的特异性和稳定性
癌胚抗原（CEA），人血清蛋白（HSA）、牛血清白蛋白（BSA）和它们的混合物（50 ngmL-1的AFP中包含500 ng mL-1的CEA，HSA和BSA）作为干扰物，用来评估该免疫传感器的选择性。如图5A所示，浓度为10倍（500 ng mL-1）的干扰物的电流响应与AFP（50 ng mL-1）相比可以忽略不计，表明免疫传感器的高选择性。在与50 ng mL-1 AFP孵育后，使用同一电极进行10次间歇SWV扫描后，免疫传感器的SWV响应未显示明显的起伏(RSD = 0.99%)（图5B），结果表明该免疫传感器具有较好的稳定性。

Claims (2)

1.一种检测甲胎蛋白的ZIF-8复合材料电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）甲胎蛋白二抗耦合的电催化剂与信号分子共同限域的ZIF-8复合材料的制备
首先在电催化剂纳米Fe3O4表面修饰纳米金，然后通过NH2-Au键连接氧化还原信号分子硫堇Thi，形成电催化剂和信号分子的复合物Thi-Au-Fe3O4NPs；将Thi-Au-Fe3O4NPs加入到制备ZIF-8的反应液中，合成电催化剂和信号分子共同限域的复合物 Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8；再依次在Thi-Au-Fe3O4@ZIF-8表面修饰PEI和纳米金，然后加入甲胎蛋白二抗，利用强NH2-Au亲和力制备二抗Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料；最后，用BSA封闭ZIF-8复合材料表面的非特异性结合位点；
（B）电化学免疫传感器的制备
在抛光、干燥后的玻碳电极GCE上修饰导电的金纳米薄膜，修饰后的电极标记为DpAu/GCE；将DpAu/GCE与甲胎蛋白一抗Ab1孵育制备得到Ab1/DpAu/GCE电极，用BSA封闭电极表面的非特异性结合位点，得到BSA/Ab1/DpAu/GCE电极；将BSA/Ab1/DpAu/GCE电极在37 ℃下与甲胎蛋白AFP抗原孵育30分钟；然后在孵育好的电极上滴加步骤（A）制备的Ab2耦合的电催化剂和信号分子共同限域的ZIF-8复合材料，在37 ℃下放置30 min，得到电化学传感器。
2.权利要求1所述制备方法制备得到的电化学免疫传感器。
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