CN109991298A - 一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种Pt@MOF‑GO标记的电化学传感器的制备方法及应用，属于免疫分析和生物传感技术领域。本发明使用Au NPs作为基底材料，同时利用MOF‑GO复合材料负载Pt纳米粒子与检测抗体孵化作为信号标记以增强电化学传感器的催化性能，成功制备了Pt@MOF‑GO标记的电化学传感器，实现了对肿瘤标志物AFP、PSA的定量灵敏检测，具备检测限低，灵敏度高，重复性、选择性和稳定性好等优势，具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析、纳米材料和生物传感技术领域，提供了一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法及应用。具体是采用Pt@MOF-GO为检测抗体标记物，实现了对肿瘤标志物AFP、PSA的灵敏检测。
背景技术
在近些年中，随着生活水平的提高，随之而来的污染也在加剧，这导致肿瘤的发病率越来越高。肿瘤是从正常的细胞转化而来的异质增生细胞，可在人体的多个器官和组织出现，在早期的时候不易被人们察觉，由于肿瘤的生长和转移速度极快，当人们察觉时往往为时已晚，这严重损害人们的健康并且危及生命。开发一种灵敏检测相关生物标志物对许多的生物医学和诊断研究方面至关重要。目前来说，肿瘤标志物检测的方法有很多种，如酶联免疫吸附剂测定，荧光免疫分析，放射免疫法等，除了这些技术，电化学免疫传感器由于其灵敏性高、检测限低、检测速度快、操作简便而受到了广泛的关注。
电化学免疫传感器是将免疫分析技术和生物传感技术相结合，用于测量电流、电位的变化来进行分析的。电化学免疫传感器是抗原抗体特异性结合所引起的电化学信号变化反映的，一般分为有标记型电化学免疫传感器和无标记型电化学免疫传感器。有标记型电化学免疫传感器具有灵敏度高、检测限低、特异性高等优点，已广泛应用于多种领域。
Au NPs作为基底材料，不仅制备方法简便，而且是一种生物亲和性材料，可以结合更多的抗体，同时Au NPs导电性非常好，可以加快电子的转移和传输。Pt@MOF-GO作为检测抗体标记物，可以增加免疫反应传感器的灵敏度，并提高其催化性能。MOF-GO复合材料不仅具有极大的比表面积，为反应提供足够多的活性位点，而且良好的导电性和催化性能。Pt纳米粒子具有良好的催化性能，可以进一步提高电化学免疫传感器的灵敏度。本发明采用AuNPs作为基地材料，Pt@MOF-GO作为检测抗体标记物构建的标记型电化学免疫传感器，实现了对肿瘤标志物AFP的检测，具有检测限低，灵敏度高，重复性、选择性和稳定性好等优点，在临床应用中实现了对肿瘤标志物的精确检测。
发明内容
本发明提供了一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法及应用，实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的Pt@MOF-GO标记的电化学传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤。
1. 一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、1 ~ 3 mg/mL的Au NPs溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱干燥；
（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1 %的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封装电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 ℃冰箱晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱晾干；
（6）继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5mg/mL的检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液于电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗、晾干，制得一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器。
2. Au NPs溶液的制备，步骤如下：
将0.4 ~0.8 mmol的HAuCl4加入10 mL水中，搅拌下加热到90 ℃，逐滴加入柠檬酸钠20~ 40 mmol，溶液在3 min内由黄色逐渐变为蓝色，20 min后变为酒红色，制得分散均匀的AuNPs溶液。
3. 检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）GO的制备
将40 ~ 60 mL、浓度为98 %的浓硫酸加入到500 mL烧杯中，将烧杯置于0 ℃冰浴中并搅拌，缓慢加入1 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.3 ~ 0.7 g硝酸钠，继续缓慢加入5 ~ 8 g高锰酸钾，在0 ℃冰水浴下搅拌60 ~ 120 min后，移入50 ℃水浴，搅拌90 ~ 150 min后，将水浴温度升至55 ℃，搅拌2 ~ 3 h，逐滴加入25 ~ 50 mL超纯水后，继续缓慢加入100 mL的超纯水，搅拌10 ~ 20 min，然后匀速加入5 ~ 10 mL、30 %过氧化氢，搅拌10 ~ 15 min，在室温下静置12 h，下层沉淀离心，超纯水洗涤后，将沉淀物移入透析袋并密封，置于500 mL烧杯中，加入400 mL超纯水透析4 ~ 5天后，取1 g沉淀物，加入100 ~ 200 mL超纯水，超声20~ 30 min，在3000 rpm下离心5 ~ 10 min，将得到的上清液继续以4500 rpm离心2 ~ 5min，取上清液置于50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后，得到GO；
（1）MOF-GO的制备
称取均苯三酸0.05 g ~ 0.15 g，硝酸铜0.15 ~ 0.3 g，加入到盛有35 mL DMF的烧杯中，加入0.05 ~ 0.2 mL的三乙胺，超声5 min分散均匀，然后加入20 ~ 40 mg上述制备的GO，超声15min分散均匀，移入容量为50 mL的聚四氟乙烯的高压釜内，70 ℃反应20 ~24 h，冷却至室温，用DMF离心清洗三次，将洗涤后的固体浸泡在35 mL的二氯甲烷中，每24 h换一次新鲜的二氯甲烷，需更换三次，离心分离后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥10 ~ 14 h，制得MOF-GO，置于真空袋中备用；
（2）Pt@MOF-GO的制备
取0.05 g ~ 0.1 g的MOF-GO，在20 mL DMF溶液中超声分散20 min，然后加入5 ~ 15mL、2 mg/mL的H2PtCl6溶液，搅拌3 h后离心分离，室温干燥得到固体粉末，将粉末重新分散在40 mL的乙二醇中，超声分散10 min，加入40 mg/mL的NaOH调节pH至12 ~ 13，120 ℃下搅拌反应4 h，离心分离，在60 ℃的真空干燥箱中干燥10 ~ 14 h，制得Pt@MOF-GO；
（3）检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备
将1 ~ 3 mL、2 mg/mL的Pt@MOF-GO分散液加入到0.5 ~ 1.5 mL，10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2中，4 ℃恒温震荡箱中震荡孵化12 h，离心分离；重新分散至1 ~ 3 mL的pH为7.38的磷酸缓冲液中，制得检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液。
4. 肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁氰化钾溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肿瘤标志物进行检测，选择-0.4 V作为电流测量的检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH为7.38的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
上述所述肿瘤标志物选自下列之一：AFP、PSA。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
Au NPs作为基底材料，不仅可以增大传感器的比表面积而且其导电性强可以加快电子的转移和传输，另外Au NPs是一种生物亲和性材料，可以结合更多的抗体。Pt@MOF-GO作为检测抗体标记物，可以增加电化学传感器的灵敏度并提高其催化性能。MOF是过渡金属离子与有机配体通过自组装形成的周期性的多孔晶体材料，它具有高孔隙率、低密度、大比表面积、孔道规则、孔径可调等优点，它的高孔隙率使其更容易吸附分子，大的比表面积使其能为反应提供更多的活性位点。MOF-GO复合材料具有良好的生物相容性、良好的导电性和电子传输能力，两种材料复合后能进一步增大材料的比表面积,并且有较好的催化能力。Pt纳米粒子具有很强的催化性能，可以进一步提高电化学传感器的灵敏度。本发明采用金纳米粒子作为基底材料，Pt@MOF-GO作为检测抗体标记物构建的标记型电化学免疫传感器，实现了对肿瘤标志物AFP的检测，具有检测限低，灵敏度高，重复性、选择性和稳定性好等优点，在临床应用中实现了对肿瘤标志物的精确检测。
（2）一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器实现了对肿瘤标志物AFP、PSA的灵敏检测，对AFP的检测，其线性范围10 fg ~ 80 ng/mL，检测限最低3.33 fg/mL;对PSA的检测，其线性范围10 fg ~ 80 ng/mL，检测限最低3.33 fg/mL，表明一种基于Pt@MOF-GO标记的电化学传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1 一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、1 mg/mL的Au NPs溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱干燥；
（4）继续将3 µL、0.5 mg/mL、质量分数为1 %的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封装电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 ℃冰箱晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 fg/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱晾干；
（6）继续滴加6 µL、1.5 mg/mL的检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液于电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗、晾干，制得一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器。
实施例2一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、2 mg/mL的Au NPs溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱干燥；
（4）继续将3 µL、1 mg/mL、质量分数为1 %的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封装电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 ℃冰箱晾干；
（5）继续滴加6 µL、1 pg/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱晾干；
（6）继续滴加6 µL、2.5 mg/mL的检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液于电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗、晾干，制得一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器。
实施例3 一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、3 mg/mL的Au NPs溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4℃冰箱干燥；
（4）继续将3 µL、1.5 mg/mL、质量分数为1 %的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封装电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 ℃冰箱晾干；
（5）继续滴加6 µL、100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱晾干；
（6）继续滴加6 µL、3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液于电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗、晾干，制得一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器。
实施例4 所述Au NPs溶液的制备，步骤如下：
将0.4 mmol的HAuCl4加入10 mL水中，搅拌下加热到90 ℃，逐滴加入柠檬酸钠20mmol，溶液在3 min内由黄色逐渐变为蓝色，20 min后变为酒红色，制得分散均匀的Au NPs溶液。
实施例5 所述Au NPs溶液的制备，步骤如下：
将0.6 mmol的HAuCl4加入10 mL水中，搅拌下加热到90 ℃，逐滴加入柠檬酸钠30mmol，溶液在3 min内由黄色逐渐变为蓝色，20 min后变为酒红色，制得分散均匀的Au NPs溶液。
实施例6 所述Au NPs溶液的制备，步骤如下：
将0.8 mmol的HAuCl4加入10 mL水中，搅拌下加热到90 ℃，逐滴加入柠檬酸钠40mmol，溶液在3 min内由黄色逐渐变为蓝色，20 min后变为酒红色，制得分散均匀的Au NPs溶液。
实施例7 所述检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）GO的制备
将40 mL、浓度为98 %的浓硫酸加入到500 mL烧杯中，将烧杯置于0 ℃冰浴中并搅拌，缓慢加入1 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.3 g硝酸钠，继续缓慢加入5 g高锰酸钾，在0 ℃冰水浴下搅拌60 min后，移入50 ℃水浴，搅拌90 min后，将水浴温度升至55 ℃，搅拌2 h，逐滴加入25 mL超纯水后，继续缓慢加入100 mL的超纯水，搅拌10 20 min，然后匀速加入5mL、30 %过氧化氢，搅拌10 min，在室温下静置12 h，下层沉淀离心，超纯水洗涤后，将沉淀物移入透析袋并密封，置于500 mL烧杯中，加入400 mL超纯水透析4天后，取1 g沉淀物，加入100 mL超纯水，超声20 min，在3000 rpm下离心5 min，将得到的上清液继续以4500 rpm离心2 min，取上清液置于50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
（2）MOF-GO的制备
称取均苯三酸0.05 g，硝酸铜0.15 g，加入到盛有35 mL DMF的烧杯中，加入0.05 mL的三乙胺，超声5 min分散均匀，然后加入20 mg上述制备的GO，超声15min分散均匀，移入容量为50 mL的聚四氟乙烯的高压釜内，70 ℃反应20 h，冷却至室温，用DMF离心清洗三次，将洗涤后的固体浸泡在35 mL的二氯甲烷中，每24 h换一次新鲜的二氯甲烷，需更换三次，离心分离后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥10 h，制得MOF-GO，置于真空袋中备用；
（3）Pt@MOF-GO的制备
取0.05 g的MOF-GO，在20 mL DMF溶液中超声分散20 min，然后加入5 mL、2 mg/mL的H2PtCl6溶液，搅拌3 h后离心分离，室温干燥得到固体粉末，将粉末重新分散在40 mL的乙二醇中，超声分散10 min，加入40 mg/mL的NaOH调节pH至12，120 ℃下搅拌反应4 h，离心分离，在60 ℃的真空干燥箱中干燥10 h，制得Pt@MOF-GO；
（4）检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备
将1 mL、2 mg/mL的Pt@MOF-GO分散液加入到0.5 mL，10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2中，4 ℃恒温震荡箱中震荡孵化12 h，离心分离；重新分散至1 mL的pH为7.38的磷酸缓冲液中，制得检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液。
实施例8 所述检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）GO的制备
将50 mL、浓度为98 %的浓硫酸加入到500 mL烧杯中，将烧杯置于0 ℃冰浴中并搅拌，缓慢加入1 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.5 g硝酸钠，继续缓慢加入6 g高锰酸钾，在0 ℃冰水浴下搅拌90 min后，移入50 ℃水浴，搅拌120 min后，将水浴温度升至55 ℃，搅拌2.5 h，逐滴加入40 mL超纯水后，继续缓慢加入100 mL的超纯水，搅拌15 min，然后匀速加入8 mL、30 %过氧化氢，搅拌12 min，在室温下静置12 h，下层沉淀离心，超纯水洗涤后，将沉淀物移入透析袋并密封，置于500 mL烧杯中，加入400 mL超纯水透析4天后，取1 g沉淀物，加入150mL超纯水，超声15 min，在3000 rpm下离心8 min，将得到的上清液继续以4500 rpm离心4min，取上清液置于50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后，得到GO；
（2）MOF-GO的制备
称取均苯三酸0.1 g，硝酸铜0.2 g，加入到盛有35 mL DMF的烧杯中，加入0.1 mL的三乙胺，超声5 min分散均匀，然后加入30 mg上述制备的GO，超声15min分散均匀，移入容量为50 mL的聚四氟乙烯的高压釜内，70 ℃反应22 h，冷却至室温，用DMF离心清洗三次，将洗涤后的固体浸泡在35 mL的二氯甲烷中，每24 h换一次新鲜的二氯甲烷，需更换三次，离心分离后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥12 h，制得MOF-GO，置于真空袋中备用；
（3）Pt@MOF-GO的制备
取0.08 g的MOF-GO，在20 mL DMF溶液中超声分散20 min，然后加入10 mL、2 mg/mL的H2PtCl6溶液，搅拌3 h后离心分离，室温干燥得到固体粉末，将粉末重新分散在40 mL的乙二醇中，超声分散10 min，加入40 mg/mL的NaOH调节pH至12，120 ℃下搅拌反应4 h，离心分离，在60 ℃的真空干燥箱中干燥12 h，制得Pt@MOF-GO；
（4）检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备
将2 mL、2 mg/mL的Pt@MOF-GO分散液加入到1 mL，10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2中，4 ℃恒温震荡箱中震荡孵化12 h，离心分离；重新分散至2 mL的pH为7.38的磷酸缓冲液中，制得检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液。
实施例9所述检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备，步骤如下：
（1）GO的制备
将60 mL、浓度为98 %的浓硫酸加入到500 mL烧杯中，将烧杯置于0 ℃冰浴中并搅拌，缓慢加入1 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.7 g硝酸钠，继续缓慢加入8 g高锰酸钾，在0 ℃冰水浴下搅拌120 min后，移入50 ℃水浴，搅拌150 min后，将水浴温度升至55 ℃，搅拌3 h，逐滴加入50 mL超纯水后，继续缓慢加入100 mL的超纯水，搅拌20 min，然后匀速加入10mL、30 %过氧化氢，搅拌15 min，在室温下静置12 h，下层沉淀离心，超纯水洗涤后，将沉淀物移入透析袋并密封，置于500 mL烧杯中，加入400 mL超纯水透析5天后，取1 g沉淀物，加入200 mL超纯水，超声30 min，在3000 rpm下离心10 min，将得到的上清液继续以4500 rpm离心5 min，取上清液置于50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80 ℃下冷冻干燥后，得到GO；
（2）MOF-GO的制备
称取均苯三酸0.15 g，硝酸铜0.3 g，加入到盛有35 mL DMF的烧杯中，加入0.2 mL的三乙胺，超声5 min分散均匀，然后加入40 mg上述制备的GO，超声15min分散均匀，移入容量为50 mL的聚四氟乙烯的高压釜内，70 ℃反应24 h，冷却至室温，用DMF离心清洗三次，将洗涤后的固体浸泡在35 mL的二氯甲烷中，每24 h换一次新鲜的二氯甲烷，需更换三次，离心分离后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥14 h，制得MOF-GO，置于真空袋中备用；
（3）Pt@MOF-GO的制备
取0.1 g的MOF-GO，在20 mL DMF溶液中超声分散20 min，然后加入15 mL、2 mg/mL的H2PtCl6溶液，搅拌3 h后离心分离，室温干燥得到固体粉末，将粉末重新分散在40 mL的乙二醇中，超声分散10 min，加入40 mg/mL的NaOH调节pH至13，120 ℃下搅拌反应4 h，离心分离，在60 ℃的真空干燥箱中干燥14 h，制得Pt@MOF-GO；
（4）检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备
将3 mL、2 mg/mL的Pt@MOF-GO分散液加入到1.5 mL，10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2中，4 ℃恒温震荡箱中震荡孵化12 h，离心分离；重新分散至3 mL的pH为7.38的磷酸缓冲液中，制得检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液。
实施例10 肿瘤标志物AFP的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁氰化钾溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肿瘤标志物进行检测，选择-0.4 V作为电流测量的检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH为7.38的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
（4）测定样品中AFP样品的浓度，其线性范围为10 fg ~ 80 ng/mL，检测限为3.33fg/mL。
实施例11 肿瘤标志物PSA的检测
按照实施例10的方法对样品中PSA进行检测，其线性范围为10 fg ~ 80 ng/mL，检测限为3.33 fg/mL。
Claims (5)
1.一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，其特征在于，步骤如下：
（1）将直径4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面，超纯水清洗干净；
（2）将6 µL、1 ~ 3 mg/mL的Au NPs溶液滴涂于上述电极表面，室温下晾干，超纯水洗电极表面，晾干；
（3）继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面，超纯水冲洗，4 ℃冰箱干燥；
（4）继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1 %的牛血清蛋白溶液滴加到电极表面，用以封装电极表面的非特异性活性位点，超纯水冲洗电极表面，除去未结合的BSA，4 ℃冰箱晾干；
（5）继续滴加6 µL、10 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液，超纯水冲洗电极表面，4 ℃冰箱晾干；
（6）继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液于电极表面，置于4 ℃冰箱中孵化40 min，超纯水冲洗、晾干，制得一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器。
2.如权利要求1所述的一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，所述Au NPs溶液的制备，其特征在于，步骤如下：
将0.4 ~0.8 mmol的HAuCl4加入10 mL水中，搅拌下加热到90 ℃，逐滴加入柠檬酸钠20~ 40 mmol，溶液在3 min内由黄色逐渐变为蓝色，20 min后变为酒红色，制得分散均匀的AuNPs溶液。
3.如权利要求1所述的一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器的制备方法，所述检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备，其特征在于，步骤如下：
（1）GO的制备
将40 ~ 60 mL、浓度为98 %的浓硫酸加入到500 mL烧杯中，将烧杯置于0 ℃冰浴中并搅拌，缓慢加入1 g石墨粉，搅拌均匀后，加入0.3 ~ 0.7 g硝酸钠，继续缓慢加入5 ~ 8 g高锰酸钾，在0 ℃冰水浴下搅拌60 ~ 120 min后，移入50 ℃水浴，搅拌90 ~ 150 min后，将水浴温度升至55 ℃，搅拌2 ~ 3 h，逐滴加入25 ~ 50 mL超纯水后，继续缓慢加入100 mL的超纯水，搅拌10 ~ 20 min，然后匀速加入5 ~ 10 mL、30 %过氧化氢，搅拌10 ~ 15 min，在室温下静置12 h，下层沉淀离心，超纯水洗涤后，将沉淀物移入透析袋并密封，置于500 mL烧杯中，加入400 mL超纯水透析4 ~ 5天后，取1 g沉淀物，加入100 ~ 200 mL超纯水，超声20~ 30 min，在3000 rpm下离心5 ~ 10 min，将得到的上清液继续以4500 rpm离心2 ~ 5min，取上清液置于50 mL培养皿中，在-20 ℃冰箱中冷冻12 h后，放入冷冻干燥机中，-80℃下冷冻干燥后，得到GO；
（2）MOF-GO的制备
称取均苯三酸0.05 ~ 0.15 g，硝酸铜0.15 ~ 0.3 g，加入到盛有35 mL DMF的烧杯中，加入0.05 ~ 0.2 mL的三乙胺，超声5 min分散均匀，然后加入20 ~ 40 mg上述制备的GO，超声15 min分散均匀，移入容量为50 mL的聚四氟乙烯的高压釜内，70 ℃反应20 ~24 h，冷却至室温，用DMF离心清洗三次，将洗涤后的固体浸泡在35 mL的二氯甲烷中，每24 h换一次新鲜的二氯甲烷，需更换三次，离心分离后，置于60 ℃真空干燥箱中干燥10 ~ 14 h，制得MOF-GO，置于真空袋中备用；
（3）Pt@MOF-GO的制备
取0.05 ~ 0.1 g的MOF-GO，在20 mL DMF溶液中超声分散20 min，然后加入5 ~ 15 mL、2 mg/mL的H2PtCl6溶液，搅拌3 h后离心分离，室温干燥得到固体粉末，将粉末重新分散在40mL的乙二醇中，超声分散10 min，加入40 mg/mL的NaOH调节pH至12 ~ 13，120 ℃下搅拌反应4 h，离心分离，在60 ℃的真空干燥箱中干燥10 ~ 14 h，制得Pt@MOF-GO；
（4）检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液的制备
将1 ~ 3 mL、2 mg/mL的Pt@MOF-GO分散液加入到0.5 ~ 1.5 mL，10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2中，4 ℃恒温震荡箱中震荡孵化12 h，离心分离；重新分散至1 ~ 3 mL的pH为7.38的磷酸缓冲液中，制得检测抗体孵化物Pt@MOF-GO-Ab2溶液。
4.如权利要求1所述制备方法制备的一种Pt@MOF-GO标记的电化学传感器，用于肿瘤标志物的检测，步骤如下：
（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、含10 mmol/L铁氰化钾溶液中进行测试；
（2）用计时电流法对肿瘤标志物进行检测，选择-0.4 V作为电流测量的检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间300 s；
（3）当背景电流趋于稳定后，每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH为7.38的磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液，记录电流变化。
5.如权利要求1、2、3、4所述的肿瘤标志物，其特征在于，所述肿瘤标志物选自下列之一：AFP、PSA。
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