CN108226252A - 一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料的电化学免疫传感器的构建方法，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测乳腺癌特异性抗原中的应用。

Description

一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用
技术领域
本发明属于新型纳米材料、免疫分析和生物传感技术领域，提供了一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用，具体涉及一种基于负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料的电化学免疫传感器的构建方法，以及由该方法构建的电化学免疫传感器在检测乳腺癌特异性抗原中的应用。
背景技术
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，也是导致癌症死亡的第二大原因。乳腺癌是全球女性最严重的健康问题之一，为此，通过特异性和敏感性的生物标志物和分析工具进行早期的诊断，可以降低乳腺癌发生率，能有效的提高生存率。因此，能够在早期准确的检测乳腺癌具有重要意义。乳腺癌特异性抗原是一种重要的乳腺肿瘤标志物，它在血清中的浓度能够反映是否患有乳腺癌，能够准确检测血清中乳腺特异性抗原的浓度，为早期诊断提供了重要依据。因此，发展高灵敏的乳腺特异性抗原的定量检测方法对乳腺癌的早期诊断尤为重要
电化学免疫传感器是基于抗原和抗体特异性结合的一种分析方法，具有检测迅速、检出限低、灵敏度高、操作简单和制备成本低的优点。近年来，电化学免疫传感器备受关注，被广泛应用于肿瘤标志物的检测中。本发明利用自组装技术，利用负载钯纳米棒氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料作为基底信号放大平台，制备了一种检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器。氧化铜对H2O2的还原表现出了良好的催化性，但是由于氧化铜是一种半导体，其导电能力较弱。由于石墨烯具有较大的比表面积和优异的导电性，因此氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料具有优异的导电能力，能够加速电极表面电子转移，提高免疫传感器的灵敏度，而且还对双氧水的还原具有良好的催化性。我们通过负载了棒状的钯纳米材料，其不仅能够用于负载抗体，而且还能够和氧化铜共同催化双氧水的还原，能够实现对响应信号的放大。基于以上优点，所构建的免疫传感器实现了对乳腺癌特异性抗原的定量检测，具有检测范围广、检测下限低、灵敏度高、操作简单、检测速度快等优点，并且具有良好的重现性、稳定性和选择性，为乳腺癌的早期诊断提供了一种可靠的检测手段。
发明内容
本发明提供了一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用，所述电化学免疫传感器包括：工作电极、对电极和参比电极，所述工作电极的为玻碳电极，其表面利用依次修饰负载钯纳米棒氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料、乳腺癌特异性抗体、牛血清蛋白、乳腺癌特异性抗原。所述对电极为铂丝电极，所述参比电极为饱和甘汞电极。
本发明的目的之一是提供一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料的电流型免疫传感器用于乳腺癌特异性抗原的定量检测。
本发明的技术方案，包括以下步骤：
（1）制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料；
（2）制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料；
（3）制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极；
（4）制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线。
其中步骤（1）制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料包括：
①制备氧化石墨烯
将0.4 ~ 0.6 g石墨粉加入80.0 ~ 90.0 mL、98.0 wt%的浓硫酸和6.0 ~ 8.0 mL浓磷酸混合溶液中，持续搅拌25.0 min后，继续加入3.0 ~ 5.0 g高锰酸钾，持续搅拌均匀后，加热至50.0 ~ 70.0℃，反应12.0 h后，加入30.0 ~ 40.0 mL超纯水冻成的冰，继续加入0.4 ~0.6 mL、20.0 ~ 30.0 wt%的双氧水，持续搅拌20.0 min后离心，用25.0 ~ 35.0 mL超纯水洗涤，离心分离，将得到的上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；
②制备氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料
将0.1 ~ 0.3 g氧化石墨烯加入100.0 ml水中，继续加入0.5 ~ 1.5 g三水合硝酸铜，然后超声30.0 min后，加入10.0 ml氨水，搅拌20.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热到80.0 ℃，反应3.0 h后，离心、用超纯水洗涤，将所得的固体冷冻干燥得到氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料；
③制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将0.1 ~ 0.3 g氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料加入到20.0 ml乙二醇溶液中，继续加入1.0 ~ 3.0 mL氨水，超声25.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，加热到180.0 ℃，反应8.0 ~ 10.0 h后，过滤，然后用乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀物，离心，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥6.0 h，得到氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
其中步骤（2）制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料包括：
①制备棒状的钯纳米材料
将0.2 ~ 0.4 g的SBA-15粉末加入到0.5 ~ 1.5 mL、12.0 wt%的四氯钯酸钠溶液中，搅拌均匀，超声20.0 ~ 30.0 min后，置于25.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，然后继续加入3.0 ~ 4.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液，置于25.0 ℃真空干燥箱内还原2.0 h后，继续加入6.0 ~ 8.0 mL、20.0 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌2.0 ~ 4.0 h后，离心，超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到棒状的钯纳米材料；
②制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将10.0 ~ 20.0 mg氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料加入到10.0 ml超纯水中，然后继续加入6.0 ~ 10.0 mg棒状的钯纳米材料，超声1.0 h后，离心，用超纯水清洗后，将所得到的固体置于真空干燥箱内干燥，得到负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
其中步骤（3）制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，分别依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②将6.0 µL、0.5 ~ 3.0 mg/mL的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料分散液滴加到电极表面上，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
③继续将6.0 µL、4.0 ~ 8.0 µg/mL的乳腺癌特异性抗体滴加到电极表面，在4.0 ℃冰箱中干燥；
④然后将3.0 µL、0.7 ~ 1.4 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ~ 50.0 ng/mL的一系列不同浓度的乳腺癌特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4.0 ℃冰箱中晾干，制得检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
其中步骤（4）制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线包括：
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10.0 mL、50.0 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10.0 mL、50.0 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0腺癌特异性抗原所对应的电流值，绘制检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乳腺癌特异性抗原的浓度。
本发明所用的原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
（1）本发明通过负载钯纳米棒氧化铜功能化石墨烯复合材料作为基底信号放大平台，钯纳米棒和氧化铜功能化的石墨烯对双氧水的还原具有优异的催化性能，能够发挥协同催化效应，实现响应信号的放大；氧化铜功能化的石墨烯具有较高的导电性能够加速电子的转移，提高传感器的灵敏度，而且氧化铜功能化的石墨烯具有较大的比表面积，可以有效的负载钯纳米棒，因此，负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料具有优异的催化性能、高的导电性，能够放大响应信号，提高传感器的灵敏度；
（2）本发明所构建的电流型免疫传感器实现了精确定量检测乳腺癌特异性抗原的目的，其线性检测范围是0.0001 ~ 50ng/mL，最低检测下限为33.3 fg/mL；
（3）本发明的方法构建的电化学免疫传感器，操作简单、检测迅速，可用于实际样品的快速检测。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明，但不限于此。
实施例1制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备氧化石墨烯
将0.4 g石墨粉加入80.0 mL、98.0 wt%的浓硫酸和6.0 mL浓磷酸混合溶液中，持续搅拌25.0 min后，继续加入3.0 g高锰酸钾，持续搅拌均匀后，加热至50.0 ℃，反应12.0 h后，加入30.0 mL超纯水冻成的冰，继续加入0.4 mL、20.0 wt%的双氧水，持续搅拌20.0 min后离心，用25.0 mL超纯水洗涤，离心分离，将得到的上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；
②制备氧化铜杂化石墨烯纳米复合材料
将0.1 g氧化石墨烯加入100.0 ml水中，继续加入0.5 g三水合硝酸铜，然后超声30.0min后，加入10.0 ml氨水，搅拌20.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热到80.0 ℃，反应3.0 h后，离心、用超纯水洗涤，将所得的固体冷冻干燥得到氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料；
③制备氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料
将0.1 g氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料加入到20.0 ml乙二醇溶液中，继续加入1.0 mL氨水，超声25.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，加热到180.0 ℃，反应8.0 h后，过滤，然后用乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀物，离心，将所得到的固体置于30.0 °C真空干燥箱内干燥6.0 h，得到氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例2制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备氧化石墨烯
将0.5 g石墨粉加入70.0 mL、98.0 wt%的浓硫酸和7.0 mL浓磷酸混合溶液中，持续搅拌25.0 min后，继续加入4.0 g高锰酸钾，持续搅拌均匀后，加热至60.0 ℃，反应12.0 h后，加入35.0 mL超纯水冻成的冰，继续加入0.5 mL、25.0 wt%的双氧水，持续搅拌20.0 min后离心，用30.0 mL超纯水洗涤，离心分离，将得到的上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；
②制备氧化铜杂化石墨烯纳米复合材料
将0.2 g氧化石墨烯加入100.0 ml水中，继续加入1.0 g三水合硝酸铜，然后超声30.0min后，加入10.0 ml氨水，搅拌20.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热到80.0 ℃，反应3.0 h后，离心、用超纯水洗涤，将所得的固体冷冻干燥得到氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料；
③制备氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料
将0.2 g氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料加入到20.0 ml乙二醇溶液中，继续加入2.0 mL氨水，超声25.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，加热到180.0 ℃，反应9.0 h后，过滤，然后用乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀物，离心，将所得到的固体置于30.0 °C真空干燥箱内干燥6.0 h，得到氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例3制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备氧化石墨烯
将0.6 g石墨粉加入90.0 mL、98.0 wt%的浓硫酸和8.0 mL浓磷酸混合溶液中，持续搅拌25.0 min后，继续加入5.0 g高锰酸钾，持续搅拌均匀后，加热至70.0 ℃，反应12.0 h后，加入40.0 mL超纯水冻成的冰，继续加入0.6 mL、30.0 wt%的双氧水，持续搅拌20.0 min后离心，用35.0 mL超纯水洗涤，离心分离，将得到的上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；
②制备氧化铜杂化石墨烯纳米复合材料
将0.3 g氧化石墨烯加入100.0 ml水中，继续加入1.5 g三水合硝酸铜，然后超声30.0min后，加入10.0 ml氨水，搅拌20.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热到80.0 ℃，反应3.0 h后，离心、用超纯水洗涤，将所得的固体冷冻干燥得到氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料；
③制备氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料
将0.3 g氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料加入到20.0 ml乙二醇溶液中，继续加入3.0 mL氨水，超声25.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，加热到180.0 ℃，反应10.0 h后，过滤，然后用乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀物，离心，将所得到的固体置于30.0 °C真空干燥箱内干燥6.0 h，得到氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例4制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备棒状的钯纳米材料
将0.2 g的SBA-15粉末加入到0.5 mL、12.0 wt%的四氯钯酸钠溶液中，搅拌均匀，超声20.0 min后，置于25.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，然后继续加入3.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液，置于25.0 ℃真空干燥箱内还原2.0 h后，继续加入6.0 mL、20.0 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌2.0 h后，离心，超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到棒状的钯纳米材料；
②制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将10.0 mg氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料加入到10.0 ml超纯水中，然后继续加入6.0 mg棒状的钯纳米材料，超声1.0 h后，离心，用超纯水清洗后，将所得到的固体置于真空干燥箱内干燥，得到负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例5制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备棒状的钯纳米材料
将0.3 g的SBA-15粉末加入到1.0 mL、12.0 wt%的四氯钯酸钠溶液中，搅拌均匀，超声25.0 min后，置于25.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，然后继续加入3.5 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液，置于25.0 ℃真空干燥箱内还原2.0 h后，继续加入7.0 mL、20.0 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌3.0 h后，离心，超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到棒状的钯纳米材料；
②制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将15.0 mg氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料加入到10.0 ml超纯水中，然后继续加入8.0 mg棒状的钯纳米材料，超声1.0 h后，离心，用超纯水清洗后，将所得到的固体置于真空干燥箱内干燥，得到负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例6制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
①制备棒状的钯纳米材料
将0.4 g的SBA-15粉末加入到1.5 mL、12.0 wt%的四氯钯酸钠溶液中，搅拌均匀，超声30.0 min后，置于25.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，然后继续加入3.0 ~ 4.0 mL、1.0mol/mL的抗坏血酸溶液，置于25.0 ℃真空干燥箱内还原2.0 h后，继续加入6.0 ~ 8.0 mL、20.0 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌2.0 ~ 4.0 h后，离心，超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到棒状的钯纳米材料；
②制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将20.0 mg氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料加入到10.0 ml超纯水中，然后继续加入10.0 mg棒状的钯纳米材料，超声1.0 h后，离心，用超纯水清洗后，将所得到的固体置于真空干燥箱内干燥，得到负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
实施例7制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，分别依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②将6.0 µL、0.5 mg/mL的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料分散液滴加到电极表面上，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
③继续将6.0 µL、4.0 µg/mL的乳腺癌特异性抗体滴加到电极表面，在4.0 ℃冰箱中干燥；
④然后将3.0 µL、0.7 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ng/mL的一系列不同浓度的乳腺癌特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4.0 ℃冰箱中晾干，制得检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例8制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为4.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，分别依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②将6.0 µL、1.5 mg/mL的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料分散液滴加到电极表面上，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
③继续将6.0 µL、6.0 µg/mL的乳腺癌特异性抗体滴加到电极表面，在4.0 ℃冰箱中干燥；
④然后将3.0 µL、1.0 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、25.0 ng/mL的一系列不同浓度的乳腺癌特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4.0 ℃冰箱中晾干，制得检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例9制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极
①将直径为5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，分别依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②将6.0 µL、3.0 mg/mL的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料分散液滴加到电极表面上，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
③继续将6.0 µL、8.0 µg/mL的乳腺癌特异性抗体滴加到电极表面，在4.0 ℃冰箱中干燥；
④然后将3.0 µL、1.4 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、50.0 ng/mL的一系列不同浓度的乳腺癌特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4.0 ℃冰箱中晾干，制得检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
实施例10制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为5.3的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为5.3的磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下乳腺癌特异性抗原所对应的电流值，绘制检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乳腺癌特异性抗原的浓度。
实施例11制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为7.4的磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下乳腺癌特异性抗原所对应的电流值，绘制检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乳腺癌特异性抗原的浓度。
实施例12制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10 mL、50 mmol/L的pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10 mL、50 mmol/L的pH为8.0的磷酸盐缓冲溶液中注入10µL、5 mol/L的双氧水溶液，记录不同浓度下乳腺癌特异性抗原所对应的电流值，绘制检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乳腺癌特异性抗原的浓度。

Claims (5)

1.一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法及应用
一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法，所述方法包括：
（1）制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料；
（2）制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料；
（3）制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极；
（4）制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线。
2.如权利要求1所述一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料包括：
①制备氧化石墨烯
将0.4 ~ 0.6 g石墨粉加入80.0 ~ 90.0 mL、98.0 wt%的浓硫酸和6.0 ~ 8.0 mL浓磷酸混合溶液中，持续搅拌25.0 min后，继续加入3.0 ~ 5.0 g高锰酸钾，持续搅拌均匀后，加热至50.0 ~ 70.0℃，反应12.0 h后，加入30.0 ~ 40.0 mL超纯水冻成的冰，继续加入0.4 ~0.6 mL、20.0 ~ 30.0 wt%的双氧水，持续搅拌20.0 min后离心，用25.0 ~ 35.0 mL超纯水洗涤，离心分离，将得到的上清液冷冻干燥得到氧化石墨烯；
②制备氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料
将0.1 ~ 0.3 g氧化石墨烯加入100.0 ml水中，继续加入0.5 ~ 1.5 g三水合硝酸铜，然后超声30.0 min后，加入10.0 ml氨水，搅拌20.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中加热到80.0 ℃，反应3.0 h后，离心、用超纯水洗涤，将所得的固体冷冻干燥得到氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料；
③制备氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将0.1 ~ 0.3 g氧化铜杂化的石墨烯纳米复合材料加入到20.0 ml乙二醇溶液中，继续加入1.0 ~ 3.0 mL氨水，超声25.0 min后，将该溶液转入到聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，加热到180.0 ℃，反应8.0 ~ 10.0 h后，过滤，然后用乙醇和蒸馏水反复洗涤沉淀物，离心，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥6.0 h，得到氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
3.如权利要求1所述一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料包括：
①制备棒状的钯纳米材料
将0.2 ~ 0.4 g的SBA-15粉末加入到0.5 ~ 1.5 mL、12.0 wt%的四氯钯酸钠溶液中，搅拌均匀，超声20.0 ~ 30.0 min后，置于25.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，然后继续加入3.0 ~ 4.0 mL、1.0 mol/mL的抗坏血酸溶液，置于25.0 ℃真空干燥箱内还原2.0 h后，继续加入6.0 ~ 8.0 mL、20.0 wt%的氢氟酸溶液，持续搅拌2.0 ~ 4.0 h后，离心，超纯水洗涤，将所得到的固体置于30.0 ℃真空干燥箱内干燥24.0 h，得到棒状的钯纳米材料；
②制备负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料
将10.0 ~ 20.0 mg氧化铜功能化石墨烯纳米复合材料加入到10.0 ml超纯水中，然后继续加入6.0 ~ 10.0 mg棒状的钯纳米材料，超声1.0 h后，离心，用超纯水清洗后，将所得到的固体置于真空干燥箱内干燥，得到负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料。
4.如权利要求1所述一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）制备检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极包括：
①将直径为3.0 ~ 5.0 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉抛光成镜面，分别依次在无水乙醇、超纯水中超声清洗；
②将6.0 µL、0.5 ~ 3.0 mg/mL的负载钯纳米棒氧化铜功能化的石墨烯纳米复合材料分散液滴加到电极表面上，室温下晾干，用超纯水冲洗电极表面，在室温下晾干；
③继续将6.0 µL、4.0 ~ 8.0 µg/mL的乳腺癌特异性抗体滴加到电极表面，在4.0 ℃冰箱中干燥；
④然后将3.0 µL、0.7 ~ 1.4 wt%的牛血清白蛋白溶液滴加到电极表面，用以封闭非特异性活性位点，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，4.0 ℃冰箱中晾干；
⑤滴加6.0 µL、0.0001 ~ 50.0 ng/mL的一系列不同浓度的乳腺癌特异性抗原溶液，用pH为7.0的磷酸盐缓冲液冲洗电极表面，在4.0 ℃冰箱中晾干，制得检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作电极。
5.如权利要求1所述的制备方法制备的一种检测乳腺癌的电流型免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）制作检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线包括：
①使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，所制备的传感器为工作电极，在10.0 mL、50.0 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0的磷酸盐缓冲溶液中进行测试；
②用时间-电流法对分析物进行检测，输入电压为-0.4 V，取样间隔0.1 s，运行时间200 s；
③当背景电流趋于稳定后，向10.0 mL、50.0 mmol/L的pH为5.3 ~ 8.0腺癌特异性抗原所对应的电流值，绘制检测乳腺癌特异性抗原的电流型免疫传感器的工作曲线；
④利用工作曲线法，得到待测样品中乳腺癌特异性抗原的浓度。
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